rezumatul tezei de doctorat contribuŢii privind … · în fiziologia şi comportamentul celulelor...
Post on 25-Oct-2019
3 Views
Preview:
TRANSCRIPT
UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI
FACULTATEA DE CHIMIE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
CONTRIBUŢII PRIVIND UTILIZAREA COLAGENULUI CA
SUPORT ÎN FORMULĂRI FARMACEUTICE PENTRU
TRATAREA RĂNILOR
Conducător stiinţific
Prof. dr. Minodora Leca
Doctorand
Fiz. chim. Mincan (Brăzdaru) Lavinia
2015
CUPRINS
LISTA DE ABREVIERI
INTRODUCERE
1. CARACTERISTICILE DE BIOMATERIAL ALE COLAGENULUI
NEDENATURAT TIP I
1.1. Rolul colagenului în dezvoltarea celulară şi regenerarea tisulară
1.2. Caracterul antigenic
1.3. Biodegradabilitatea
1.4. Controlul biodegrabilităţii prin reticulare 1.4.1. Reticularea prin procedee fizice
1.4.2. Reticularea chimică
1.5. Rolul colagenului în managementul rănilor
1.5.1. Colagenul în vindecarea rănilor cronice
1.5.2. Pansamentele de colagen în managementul rănilor B i b l i o g r a f i e
2. ACIDUL TANIC
2.1. Structură şi proprietăţi
2.2. Utilizările acidului tanic în medicină
B i b l i o g r a f i e
3. DIGLUCONATUL DE CLORHEXIDINĂ
3.1. Structură şi proprietăţi
3.2. Mecanismele de acţiune antibacteriană
B i b l i o g r a f i e
4. MATERIALE ŞI METODE
4.1. Materiale
4.2. Metode de analiză 4.2.1. Metode fizico-chimice rapide
4.2.2. Metode spectroscopice
4.2.2.1. Spectroscopia de absorbţie în infraroşu
4.2.2.2. Dicroismul circular 4.2.3. Microscopia electronică de scanare
4.3.4. Metode reologice
4.2.4.1. Reologia staţionară
4.2.4.2. Reologia dinamică
4.2.5. Absorbţia apei
4.2.6. Degradarea enzimatică in vitro
4.2.7. Evaluarea cedării medicamentelor
B i b l i o g r a f i e 5. CARACTERZAREA HIDROGELURILOR DE COLAGEN INIŢIAL, CU ACID TANIC,
DIGLUCONAT DE CLORHEXIDINĂ ŞI AMESTECURI ALE ACESTORA
5.1. Hidrogelul iniţial
5.1.1. Metode rapide de analiză
5.1.2. Caracterizarea prin dicroism circular
5.2. Selectarea hidrogelului de colagen pentru prepararea biomaterialelor
5.3. Hidrogeluri cu acid tanic
5.3.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR
5.3.2. Caracterizarea prin pectroscopie UV-DC 5.3.2.1. Efectul concentraţiei colagenului asupra spectrului DC
5.3.2.2. Efectul deschiderii fantei
5.3.3. Caracterizarea prin comportare reologică staţionară
5.3.4. Caracterizarea prin comportare reologică dinamică 5.4. Hidrogeluri cu digluconat de clorhexidină
5.4.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR
4
5
8
9
13
17
20
20
21
22
23
24
26
35
35
37
40
43
43
45
46
48
48
48
49
49
49
51
51
53
53
55
55
56
57
57
59
60
60
61
62
67
68
75
76
79
83
89
92
93
5.4.2. Caracterizarea prin UV-DC
5.4.3. Caracterizarea prin comportare reologică staţionară
5.4.4. Caracterizarea prin comportare reologică dinamică
5.5. Hidrogeluri cu acid tanic şi digluconat de clorhexidină
5.5.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR
5.5.2. Caracterizarea prin spectroscopie UV-DC
5.5.3. Caracterizarea prin comportare reologică staţionară 5.5.4. Caracterizarea prin comportare reologică dinamică
5.6. Concluzii
B i b l i o g r a f i e
6. CARACTERIZAREA MATRICILOR POROASE CE CONŢIN ACID TANIC,
DIGLCONAT DE CLORHEXIDINĂ SAU AMESTECURI ALE ACESTORA
6.1. Matrici cu acid tanic
6.1.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR 6.1.2. Caracterizarea prin SEM
6.1.3. Caracterizarea prin absorbţia apei
6.1.4. Caracterizarea prin rezistenţă la digestia cu colagenază
6.2. Matrici cu digluconat de clorhexidină
6.2.1. Spectrele FT-IR 6.2.2. Caracterizarea prin SEM
6.3. Matrici cu acid tanic şi digluconat de clorhexidină
6.3.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR
6.3.2. Caracterizarea prin SEM
6.3.3. Caracterizarea prin absorbţia apei
6.3.4. Caracterizarea prin rezistenţă la digestia cu colagenază
6.4. Concluzii B i b l i o g r a f i e
7. ELIBERAREA ACIDULUI TANIC DIN MATRICI
7.1. Eliberarea din matrici care conţin numai acid tanic
7.2. Eliberarea din matrici care conţin acid tanic şi digluconat de clorhexidină
7.2.1. Eliberarea acidului tanic din matrici cu 5% acid tanic
7.2.2. Eliberarea acidului tanic din matrici cu 10% acid tanic
7.2.3. Eliberarea acidului tanic din matrici cu 15% acid tanic
7.3. Concluzii
B i b l i o g r a f i e
8. CONCLUZII GENERALE
LISTA DE LUCRARI
96
99
103
107
108
112
116
124
128
130
134
135
135
139
144
144
145
145
148
151
151
155
158
161
163
164
167
170
172
173
174
176
177
177
180
184
INTRODUCERE
Biomaterialele utilizate pentru tratarea rănilor trebuie să permită dezvoltarea celulelor şi
regenerarea tisulară, să fie biodegradabile şi bioresorbabile şi să nu aibă caracter antigenic.
Colagenul fibrilar tip I, îndeplinind toate condiţiile enumerate, este cel mai utilizat biomaterial
natural. În plus, formează compozite cu mulţi polimeri naturali şi sintetici, precum şi cu materiale ceramice.
Biomaterialele pe bază de colagen se utilizează ca: dispozitive medicale, schelete pentru regenerare
tisulară, implanturi artificiale, suporturi pentru eliberarea medicamentelor, factorilor de creştere şi celulelor,
precum şi în terapia genetică. Dar colagenul este şi principiu activ – hemostatic şi pansament în vindecarea
rănilor. Fiind proteină, este substrat şi pentru bacterii, deci trebuie asociat cu antibiotice şi/sau antiseptice.
Obiectivul tezei îl constituie obţinerea de biomateriale pe bază de colagen – hidrogeluri şi matrici
poroase – utilizabile ca sisteme de cedare topică pentru substanţele antimicrobiene acid tanic şi digluconat
de clorhexidină, conţinute individual sau ca amestecuri, în vederea tratării rănilor de diferite etiologii.
Pansamentele trebuie să fie suficient de elastice pentru a acoperi intim rănile, să adere dar să se
îndepărteze uşor pentru a nu vătăma ţesutul, să protejeze de microbii din mediu, să fie permeabile pentru
apă pentru a preveni deshidratarea sau acumularea de fluide, să prevină formarea de ţesut granular excesiv,
să poată avea orice dimensiune şi grosime, să fie neantigenice şi lipsite de toxicitate, să fie stabile la
stocare, să se poată steriliza, să constituie rezervoare de antibiotice şi să protejeze împotriva acţiunilor
mecanice.
Acidul tanic, compus antimicrobian vegetal, reduce durerea, produce stabilizare hemodinamică
rapidă, limitează infecţia secundară, diminuează ţesutul cicatricial şi, totodată, reticulează colagenul.
Digluconatul de clorhexidină, substanţă antiseptică cu administrare topică, se legagă de pereţii
celulelor bacteriene, având proprietatea unică de substantivitate. În plus, distruge fungii şi sporii. Absorbţia
sistemică şi toxicitatea sunt reduse, rănile se vindecă mai rapid şi compatibilitatea cu antibiotice este bună.
Este de aşteptat deci ca biomaterialele pe bază de colagen în care s-au încorporat acid tanic şi
digluconat de clorhexidină să fie utile pentru tratarea rănilor de diferite etiologii.
Capitolul 1 prezintă rolul colagenului în dezvoltarea celulară şi în regenerarea tisulară,
caracteristicile de biomaterial ale acestuia, procedeele de reticulare şi rolul său, precum şi al pansamentelor
poroase, în vindecarea rănilor cronice.
Capitolul 2 conţine structura, proprietăţile şi utilizările acidului tanic în domeniul medical.
Capitolul 3 prezintă structura digluconatului de clorhexidină, proprietăţile şi mecanismele prin care
acţionează pentru distrugerea bacteriilor.
Capitolul 4 descrie materialele şi metodele utilizate pentru caracterizarea hidrogelurilor şi
matricilor.
Capitolul 5 începe cu caracterizarea hidrogelului de colagen iniţial şi continuă cu a celor diluate,
cu 0,9, 1,1 şi 1,3% colagen şi pH 3,8 şi 7,4, în scopul selectării concentraţiei pentru prepararea
biomaterialelor. S-a găsit că 1,1% este cea mai convenabilă. Caracterizarea hidrogelurilor cu pH 3,8 şi 5, 10
şi 15% acid tanic, cu pH 3,8 şi 7,4 şi 1,82, 4,55 şi 9,09% digluconat de clorhexidină şi a celor cu
amestecurile celor două componente şi au pH 3,8 din punctele de vedere: structural – prin FT-IR şi UV-DC
şi reologic – prin metoda staţionară pentru determinarea proprietăţilor de curgere şi dinamică pentru
stabilirea celor elastice este discutată în paragr. 5.3-5.5.
Capitolul 6 cuprinde caracterizarea matricilor poroase obţinute prin lofilizarea hidrogelurilor din
cap. anterior prin FT-IR – pentru investigarea păstrării conformaţiei native a colagenului şi SEM –pentru
stabilirea morfologiei matricilor, care determină eliberarea medicamentelor şi permite creşterea şi migrarea
celulelor. Gradele de reticulare ale colagenului din matrici s-au apreciat prin absorbţia apei şi prin rezistenţa
la digestie cu colagenază din Clostridium histolyticum.
Capitolul 7 prezintă studiul eliberării in vitro a acidului tanic din matricile cu acid tanic şi din cele
care conţin toate amestecurile celor două componente antimicrobiene în condiţii fiziologice, utilizând ca
mediu de cedare soluţie tampon fosfat salină, utilizând un dispozitiv USP modificat (dispozitiv
„sandwich”). Concentraţia acidului tanic eliberat s-a determinat prin spectrofotometrie UV.
Pentru matricile care conţin doar acid tanic cea mai mare cantitate este cedată de matricea cu 10%
acid tanic şi cea mai mică de cea cu 5%, pe când pentru cele ce conţin amestecuri – de matricea care
conţine cantităţile minime de acid tanic şi digluconat de clorhexidină (5,00, respectiv 1,82%), adică de cea
mai slab reticulată.
Capitolul 8 conţine concluziile generale.
1. CARACTERISTICILE DE BIOMATERIAL ALE
COLAGENULUI NEDENATURAT TIP I
Biomaterialele trebuie să permită dezvoltarea celulelor, să producă regenerare tisulară, să fie foarte
slab antigenice sau neantigenice, biodegradabile şi bioresorbabile.
Colagenul nedenaturat tip I, probabil cel mai important biomaterial natural, se aplică în medicină,
farmacie, cosmetică, ingineria ţesuturilor şi organogeneză, datorită biocompatibilităţii remarcabile,
antigenităţii reduse [6,7], posibilităţii controlului biodegrării [7] şi formării de compozite cu alţi polimeri şi
cu materiale ceramice. [8,9]
Pentru a putea fi utilizat ca biomaterial, colagenul trebuie să aibă structura moleculară cât mai
apropiată de a celui nativ, de helix triplu, caracteristică moleculei de colagen.
Biomaterialele pe bază de colagen se pot găsi în diverse forme: hidrogeluri, membrane, matrici
poroase, fire, tuburi sau materiale compozite. [15, 16]
1.1. Rolul colagenului în dezvoltarea celulară şi regenerarea tisulară
Colagenul, singur sau asociat cu alte substanţe din matricea extracelulară (MEC), are rol important
în fiziologia şi comportamentul celulelor ţesutului conjunctiv. MEC este un amestec complex de proteine:
glicozaminoglicani (GAG) şi proteoglicani (PG) ai acestora, glicoproteine adezive (laminină, fibronectină,
tenascină, nidogen) şi proteine fibroase (colageni şi elastină), [17] aşa cum se poate vedea în figura 1.1.
Figura 1.1. Prezentare schematică a MEC: HA – acid
hialuronic, CS – condroitinsulfat, KS – cheratansulfat,
PG – proteoglicani, GAG – gligozaminoglicani
Colagenul este familia de proteine
caracterizată prin repetarea secvenţei Gly-X-Y în
lanţurile α-peptidice, (Gly – rest de glicină, X, Y –
rest de alt aminoacid). Capacitatea de a lega
substanţe îl face util ca suport pentru
medicamente, factori de creştere şi celule, iar
funcţia de ancorare contribuie la formarea
eşafodajului pentru repararea şi regenerarea
tisulară. [17, 21, 22] De asemenea, contribuie la
depozitarea locală şi eliberarea factorilor de
creştere, are rol în timpul dezvoltării organelor,
vindecării rănilor şi reparării ţesuturilor. [18, 25]
Calităţile de biomaterial pentru dezvoltare
celulară şi regenerare tisulară sunt susţinute şi
de următoarele particularităţi: biodegradabilitate,
imunogenitate scăzută şi posibilitatea de izolare pe scară largă în stare pură, ceea ce-l face indispensabil
pentru medicină, industria farmaceutică, cosmetică sau alimentară.
1.2. Caracterul antigenic
Colagenul este slab imunogen comparativ cu alte proteine. Determinanţii antigenici majori, situaţi
în regiunile telopeptidice ale moleculei de tropocolagen, [33-35] se pot îndepărta. Dar colagenul mai
conţine alte două tipuri de determinanţi antigenici: helixul triplu şi secvenţa aminoacizilor din lanţurile α de
pe suprafaţele fibrilelor. [36-40] Imunogenitatea mai redusă a colagenului din fibrile comparativ cu a celui
nativ se datorează reducerii accesului determinanţilor antigenici în timpul formării fibrilelor. [41, 42]
Antigenitatea telopeptidelor din tropocolagen se datorează compoziţiei în aminoacizi considerabil
diferită de a helixului triplu, acestea conţinând cantităţi mari de resturi de tirozină.
Colagenul este cel mai bine caracterizat antigen proteic, determinanţii antigenici ce mediază
formarea anticorpilor umorali fiind clar delimitaţi. [36,38,39,60] Preparat în condiţii aseptice prezintă
probleme speciale, iar la tărie ionică şi pH fiziologice tinde să se agrege la 37oC, forma stabilă în aceste
condiţii fiind starea denaturată.
Locurile responsabile de antigenitate în tropocolagen sunt vulnerabile la acţiunea proteazelor.
Acestea sunt situate în regiunile scurte, de dezordine din lanţ, care sunt, totodată, şi locuri de reticulare.
Localizarea activităţii antigenice în telopeptide furnizează posibilitatea investigării fibrilogenezei,
controlului hemostatic şi defectelor patologice ale colagenului.
1.3. Biodegradabilitatea
Colagenul, având stuctură proteică, este biodegradabil. În ţesuturi este degradat prin procese
catabolice ce includ degradarea cu colagenaze specifice şi fagocitoza. Colagenazele au capacitatea unică de
a rupe lanţurile α într-un singur loc. Clivând numai lanturile principale, biodegradarea cu colagenaze
permite evaluarea gradului de reticulare. Cantitatea de tripsină măsoară extinderea denaturării. Fibrilele
sunt degradate de la exterior, iar moleculele din interior devin accesibile proteazelor progresiv. [74]
Biodegradarea colagenului in vivo este un proces complex, cu particularităţi dependente de tipul de
colagen. Cea in vitro este stimulată de incubarea cu colagenază bacteriană, catepsină, pepsină ori tripsină,
teste ce permit compararea materialelor similare, dar corelarea cu degradarea in vivo este dificilă. [89-92]
1.4. Controlul biodegradabilităţii prin reticulare
Absorbţia şi viteza de biodegradare se reglează prin reticularea chimică suplimentară a colagenului,
[81, 93-98] efectuată pentru a mări timpul de viaţă al biomaterialulelor şi stabilitatea biologică.
Reticularea colagenului nativ şi a celui denaturat se realizează prin tratamente fizice sau chimice.
1.4.1. Reticularea prin procedee fizice
Metodele fizice de reticulare reduc riscurile de citotoxicitate, neimplicând compuşi chimici.
Radiaţiile ultraviolete produc radicali liberi, concentraţi în special în ciclurile aromatice ale
resturilor de tirosină şi fenilalanină, dar expunerea prelungită produce denaturarea colagenului. Metoda nu
permite obţinerea de biomateriale puternic reticulate. [100] În funcţie de prezenţa apei, radiaţiile γ produc
efecte diferite: în absenţă se rup lanţurile polipeptidice, iar în prezenţă – reticularea.[100]
Deshidratarea termică se efectuează prin încălzirea biomaterialelor solide în vacuum câteva zile
la 110oC şi 100 torr, [101] condiţii care elimină apa din molecule, conducând la legături între lanţuri.
1.4.2. Reticularea chimică
Reticularea chimică are următoarele avantaje: reduce antigenitatea biomaterialelor, îmbunătăţeşte
stabilitatea mecanică şi biologică şi, în unele forme de tratament, micşorează calcifierea. [101, 109]
Cei mai utilizaţi agenţi sunt aldehidele. Tratamentul reduce imunogenitatea materialelor [107] şi
măreşte rezistenţa la degradare enzimatică [50], dar creşte citotoxicitatea. [104, 108] Carbodiimidele
reticulează fără interpunerea agentului, deci colagenul nu conţine fragmente străine. [109, 110]
Alternativă la reticularea covalentă este cea prin legături ionice, care nu generează reziduuri
potenţial toxice. Polielectroliţi cationici ca chitosanul formează legături ionice între grupele sale amină şi
carboxil ale colagenului, formând complecşi care măresc rezistenţa mecanică. [113]
1.5. Rolul colagenului în managementul rănilor
Principala funcţie a tipurilor de colagen I-III este de schelet pentru formarea ţesuturilor conjunctive.
La începutul vindecării se depune întâi tipul III, iar cantitatea de tip I se măreşte pe parcurs. [114]
Colagenul tip I, pe lângă rolul de componentă principală a ţesutului cicatriceal, are rol cheie în:
[114] controlul răspunsului inflamator la injuriu şi reparare, influenţând mitogeneza celulară, diferenţierea
şi migrarea; sinteza proteinelor în matricea extracelulară; sinteza şi eliberarea citochinelor şi factorilor de
creştere; interacţiunea dintre enzimele care remodelează MEC, inclusiv metaloproteinaza matriceală.
1.5.1. Colagenul în vindecarea rănilor cronice
În rănile cronice ale pielii – răni care nu se închid în condiţii optime în şase săptămâni, [128]
procesul interactiv descris este degradat. Cauza cronicităţii este de obiciei infecţia, ce variază de la creşterea
colonizării microbiene până la creşterea critică a contaminării şi suprainfecţie.
Factori extrinseci (diabetul sau fumatul) şi intrinseci (presiunea oxigenului şi răspunsul inflamator
local excesiv) pot afecta direct metabolismul colagenului şi încetini vindecarea. [114]
1.5.2. Colagenul în vindecarea rănilor cronice
Pansamentele de colagen sunt avantajoase pentru tratarea rănilor datorită funcţiilor sale în
vindecare: [114, 131] inhibarea/dezactivarea metaloproteinezelor matriceale; mărirea producerii de
fibroblaste şi permeaţiei; aportul în preluarea şi biodisponinilitatea fibronectinei; ajutorul în protejarea
leucocitelor, macrofagelor, fibroblastelor şi celulelor epiteliale; ajutorul în menţinerea micromediului
chimic şi termic.
Pansamentele poroase sunt eficiente în vindecarea rănilor de diferite etiologii. [133-135] Utilizarea
materialelor colagenice pare să fie eficientă nu numai din punct de vedere clinic ci şi al costului. [136-139]
B i b l i o g r a f i e
6. M. Chvapil, Reconstituted collagen, în “Biology of collagen”, ed. A. Viidik şi J. Vuust, Academic Press, London, 1980.
7. K.P. Rao şi T. Josep, Collagen graft copolymers and their biomedical applications, în “Collagen Biotechnology”, ed. M. E.
Nimni, CRC Press, Boca Raton, 1988.
8. G. Goissis, L. Piccirili, J.C. Goes, A. M. De Guzzi Plepis şi D.K. Das-Gupta, Anionic collagen: polymer composites with
improved dielectric and rheological properties, Artificial Organs 22, 203-209, 1998.
9. S. Omura, N. Mizuki, S. Horimoto, R. Kawabe şi A. Fujita, A newly developed collagen/silicone bilayer membrane as a
mucosal substitute: a preliminary report, British J. Oral Maxillofacial Surg. 35, 85-91, 1997.
15. V. Trandafir, şi M.G. Albu, Achievement and Perspectives in the collagen-based biomaterials, International Symposium
Advanced Materials and Processes for Ecological Manufacturing of Leathers, Bucureşti, Nov. 2nd, 2007.
16. V. Trandafir, Z. Vuluga, V. Danciu, M.G. Albu, R. Truşcă şi C. Iancu, Collagen-based composite aerogels for medical
applications, International Symposium Advanced Materials and Processes for Ecological Manufacturing of Leathers,
Bucureşti, November 2, 2007.
17. D. Schuppan, M. Schmidt, R. Somasundaram, R. Ackermann, M. Ruehl, T. Nakamura şi E.O. Riecken, Collagens in the liver
extracellular matrix bind hepatocyte growth factor, Gastroenterology 114, 139-152, 1998.
18. Y. Yamaguchi, D.M.Mann şi E. Ruoslathi, Negative regulation of transforming growth factor-β by the proteoglycan decorin,
Nature 346, 281-284, 1990.
21. S.R. Frenkel, B. Toolan, D. Menche, M.I. Pitman şi J.M. Pachence, Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix
for cartilage repair, J. Bone Jt. Surg. 79-B, 831-836, 1997.
22. S. Wakitani, T. Kimura, A. Hirooka, T. Ochi, M. Yoneda, N. Yasui, H. Owaki şi K. Ono, Repair of rabbit articular surfaces
with allograft chondrocytes embedded in collagen gel, J. Bone Jt. Surg. 71-B, 74-80, 1989.
25. E.D. Hay, Extracellular matrix, J. Cell Biol. 91, 205-223, 1981.
33. F.O. Schmitt, L. Levine, M.P. Drake, A.L. Rubin, D. Pfahl şi P.F. Davison, The antigenicity of tropo-collagen, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 51, 493-497, 1964.
34. P.F. Davison, L. Levine, M.P. Drake, A. Rubin şi S. Bump, The serologic specificity of tropocollagen telopeptides, J. Exp.
Med. 126, 331-346, 1967.
35. C. Steffen, R. Timpl şi I. Wolff, Immunogenicity and specificity of collagen. V. Demonstration of three different antigenic
determinants on calf collagen. Immunol. 15, 135-144, 1968.
36. D. Michaeli, G.R. Martin, J. Kettman, E. Benjamini, D.Y. Leung şi B.A. Blatt, Localization of antigenic determinants in the
polypeptide chains of collagen, Sci. 166, 1522-1524, 1969.
37. H. Furthmayr, W. Beil şi R. Timpl, Different antigenic determinants in the polypeptide chains of human collagen, FEBS Lett.
12, 341–344, 1971.
38. H. Lindsley, M. Mannik şi P. Bornstein, The distribution of antigenic determinants in rat skin collagen, J. Exp. Med. 133, 1309-
1324, 1971.
39. R. Timpl, W. Beil, H. Furthmayr, W. Meigel şi B. Pontz, Characterization of conformation independent antigenic determinants
in the triple-helical part of calf and rat collagen, Immunol. 21, 1017-1030,1971.
40. H. Furthmayr şi R. Timpl, Immunochemistry of collagens and procollagens, Int. Rev. Connect. Tissue Res. 7, 61-99, 1976.
41. K.S. Weadock, E.J. Miller, E.L. Keuffel şi M.G. Dunn, Effect of physical crosslinking methods on collagen-fiber durability in
proteolytic solutions, J. Biomed. Mater. Res. 32, 221-226, 1996.
42. M.D. Harriger, A.P. Supp, G.D. Warden şi S.T. Boyce, Glutaraldehyde crosslinking of collagen substrates inhibits degradation
in skin substitutes grafted to athymic mice, J. Biomed. Mater. Res. 35, 137-145, 1997.
50. K.R. Meade şi F.H. Silver, Immunogenity of collagenous implants, Biomater. 11, 176-180, 1990.
60. R. Timpl, P.P. Fietzek, H. Furthmayr, W. Meigel şi K. Kűhn, Evidence for two antigenic determinants in the C-terminal region
of rat skin collagen, Fed. Eur. Biochem. Soc. (FEBS) Lett. 9, 11-17, 1970.
74. H.G. Welgus, J.J. Jeffrey, G.P. Stricklin, W.T. Roswit şi A.Z. Eisen, Characteristics of the action of human skin fibroblast
collagenase on fibrillar collagen, J. Biol. Chem. 255, 6806-6813, 1980.
81. M.E. Boon, J.M. Ruijgrok şi M.J. Vardaxis, Collagen implants remain supple not allowing fibroblast ingrowth, Biomater.16,
1089-1093, 1995.
89. A.M. Diamond, S.D. Gorham, D.J. Etherington, J.G. Robertson şi N.D. Light, The effect of modification on the susceptibility of
collagen to proteolysis: I. Chemical modification of amino acid side chains, Matrix 11, 321-329, 1991.
90. J. Megerman, E. Reddi. G.J. L'Italien, D.F. Warnock şi W.M. Abbott, A laboratory model to quantitate the resistance of
collagen vascular grafts to biodegradation, J. Biomed. Mater. Res. 25, 295-313, 1991.
91. I.V. Yannas, J.F. Burke, C. Huang şi P.L. Gordon, Correlation of in vivo collagen degradation rate with in vitro measurements,
J. Biomed. Mater. Res. 9, 623-628, 1975.
92. T. Okada, T. Hayashi şi Y. Ikada, Degradation of collagen suture in vitro and in vivo, Biomater. 13, 448-454, 1992.
93. R.F. Oliver, R.A. Grant, R.W. Cocs şi A. Cooke, Effect of aldehyde crosslinking on human dermal collagen implants in the rat,
Br. J. Exp. Path. 61, 544-549, 1980.
94. N. Olmo, J. Turnay, J. Herrera, J.G. Gavilanes şi A. Lizarbe, Kinetics of in vivo degradation of sepiolite-collagen complexes:
effect of glutaraldehyde treatment, J. Biomed. Mater. Res. 30, 77-84, 1996.
95. L.H.H. Olde Damink, P.J. Dijkatra, M.J.A. van Luyn, P.B. van Wachem, P. Nieuwenhuis şi J. Feijen, In vitro degradation of
dermal sheep collagen crosslinked using a water-soluble carbodiimide, Biomater. 17, 679-684, 1996.
96. L.H.H. Olde Damink, P.J. Dijkatra, M.J.A. van Luyn, P.B. van Wachem, P. Nieuwenhuis şi J. Feijen, Changes in the
mechanical properties of dermal sheep collagen during in vitro degradation, J. Biomed. Mater. Res. 29, 139-147, 1995.
97. L.H.H. Olde Damink, Structure and properties of crosslinked dermal sheep collagen, Ph. D. Thesis, University of Twente, The
Netherlands, 1992.
98. K. Anselme, H. Petite şi D. Herbage, Inhibition of calcification in vivo by acyl azide crosslinking of a collagen-
glycosaminoglycan sponge, Matrix 12, 264-273, 1992.
100. B. Chevallay şi D. Herbage, Collagen-based biomaterials as 3D scaffold for cell cultures: applications for tissue engineering
and gene therapy, Med. Biol. Eng. Comput. 38, 211-218, 2000.
101. K.S. Weadok, R.M. Olsen şi R.H. Silver, Evaluation of collagen crosslinking techniques, Biomater. Med. Dev. Artif. Org. 11,
294-318, 1984.
104. I. Rault, V. Frei, D. Herbage, N. Abdul-Malak şi A. Huc, Evaluation of different chemical methods for cross-linking collagen
gel, films and sponges, J. Mater. Sci.-Mater. Med. 7, 215-221, 1996.
107. K.R. Meade, şi F.H. Silver, Immunogenicity of collagenous implants, Biomater. 11, 176-180, 1990.
108. A. Jayakrishnan şi S.R. Jameela, Glutaraldehyde as a fixative in bioprosthetic and drug delivery matrices, Biomater. 17, 471-
84, 1996.
109. H.M. Powell şi S.T. Boyce, EDC cross-linking improves skin substitute strength and stability, Biomater. 27, 5821-5827, 2006.
110. H.M. Powell şi S.T. Boyce, Wound closure with EDC cross-linked cultured skin substitutes grafted to athymic mice,
Biomater. 28, 1084-1092, 2007.
113. F. Berthod, G. Saintigny, F. Chretien, D. Hayek, C. Collombel şi O. Damour, Optimization of thickness, pore size and
mechanical properties of a biomaterial designed for deep burn coverage, Clin. Mater. 15, 259–265, 1994.
114. A. Rangaraj, K. Harding şi D. Leaper, Role of collagen in wound management, Wounds UK 7, 54-63, 2011.
128. T.A. Mustoe, K. O’Shaughnessy şi O. Kloeters, Chronic wound pathogenesis and current treatment strategies: a unifying
131. D. Brett, A review of collagen and collagen-based dressings, Wounds 20, 347-353, 2008.
133. M.P. Curran şi G.L. Plosker, Bilayered bioengineered skin substitute (Apligraf). A review of its use in the treatment of venous
leg ulcers and diabetic foot ulcers, Biodrugs 16, 439-455, 2002.
134. H.P. Ehrlich, Understanding experimental biology of skin equivalent: from laboratory to clinical use in patients with burns and
chronic wounds, Am. J. Surg. 187, 29S-33S, 2004.
135. K.G. Harding, T. Kreig şi S.A. Eming, Efficacy and safety of the freeze-dried cultured human keratinocytes lysate,
LymphoDerm 0.9%, in the treatment of hard-to-heal venous leg ulcers, Wound Rep. Regen. 13, 138-147, 2005.
136. M. Ehrenreich şi Z. Ruszczak, Update on tissue-engineered biological dressings, Tissue Eng. 12, 1-18, 2006.
137. D.R. Baillie, P. Stawicki, N. Eustance, D. Warsaw şi D. Desai, Use of human and porcine dermal-derived bioprostheses in
complex abdominal wall reconstructions: a literature review and case report, Ostomy Wound Management 53, 30-39, 2007.
138. K.S. Jehle, A. Rohatgi şi MK Baig, Use of porcine dermal collagen graft and topical negative pressure on infected open
abdominal wounds, J. Wound Care 16, 3637, 2007.
139. D.M. Parker, P.J. Armstrong, J.D. Frizzi şi J.H. North, Porcine dermal collagen (Permacol) for abdominal wall reconstruction,
Curr. Surg. 63, 255-258, 2006.
2. ACIDUL TANIC
Taninii, produse vegetale larg raspândite, pot fi hidrolizabili şi condensaţi [1]. Taninii hidrolizabili
sunt esteri ai zaharurilor, în special ai glucozei, şi ai acizilor carboxilici fenolici, ca galic şi elagic.
Compusul model este acidul tanic (AT) – 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-D-glucoza. [2]
2.1. Structură şi proprietăţi
AT este forma comercială de tanin. [5] Acesta este o pentagaloilglucozidă – partea centrală a
moleculei – esterificată la grupele hidroxilice cu acid galic şi este un tanin hidrolizabil (figura 3.1). [6, 7]
Formula moleculară brută a AT este C76H52O46 şi are masa 1701,2 g.mol−1. [4]
Figura 3.1. Structura acidului tanic
Alte denumiri: acid gallotannic, digallic sau tanin
din coajă de stejar. [4]
Acizii tanici au următoarele proprietăţi fizice:
pudre amorfe albe, uşor gălbui sau uşor maronii, inodore
sau cu miros caracteristic slab şi gust puternic
astringent, foarte solubile în apă – 2850 g/L, solubile în
alcool şi acetonă, aproape insolubile în benzen, cloroform
şi eter, se descompun fără să se topească peste 200oC şi
sunt acizi slabi, cu valori ale pH-ului cuprinse între 3 şi 6.
Datorită grupelor hidroxil fenolic libere
formează legături de hidrogen puternice cu proteinele şi cu
carbohidraţii, cu formare de complecşi. [8] În plus, la formarea complecşilor cu proteine mai pot contribui
şi interacţiunile hidrofobe. [9]
2.2. Utilizările acidului tanic în medicină
În anii ‘20 AT s-a introdus pentru tratarea arsurilor grave. În anii următori a devenit terapie
standard pentru pacienţii cu arsuri, [10] datorită reducerii semnificative a gradului de toxemie şi reducerii
masive a ratei mortalităţii. [11] Utilizarea sa prezintă şi alte avantaje: precipitarea locală a proteinelor, ce
reduce sau elimină durerea; prevenirea pierderii de plasmă; limitarea infecţiei secundare şi diminuarea
cantităţii de ţesut cicatricial.
Activitatea antimicrobiană a AT este bine documentată: inhibă creşterea multor fungi, levuri,
bacterii şi viruşi. [14-17] AT prezintă şi altele efecte benefice: activitate antimutagenică şi anticancerigenă;
[14] inducerea apoptozei în celule animale; [18] implicarea în sistemul hilauronidazei, producându-i
distrugerea la fel ca echinaceea şi potenţându-i efectul, apărând celulele de invazia virală; [19] acţiune
antioxidantă [18] şi inhibarea activităţii colagenazei din Clostridium histolyticum, prevenind degradarea
colagenului din MEC. [20]
Biodegradabilitatea poate fi redusă prin reticulare. Aceasta îmbunătăţeşte proprietăţile mecanice şi
reduce degradarea enzimatică şi termică, reglînd timpul de viaţă al biomaterialului. [24]
Ţinând seama de structura AT şi de multitudinea grupelor funcţionale ale colagenului, între cele
două componente se formează legături de hidrogen, interacţiuni ionice, legături hidrofobe şi covalente. [27]
AT este taninul cu cea mai mare afinitate pentru colagen. [35, 36] Având grupe hidroxil şi
carboxil diferite, formează legăturile de hidrogen în mai multe puncte, dând stabilitate suplimentară
colagenului. [38]
Colagenul tip I reticulat cu acid tanic prezintă avantajele de a avea stabilitate enzimatică bună, iar
biocompatibilitatea şi viteza de vindecare a rănilor sunt semnificativ mai mari decât ale celui nativ. [41]
Dată fiind acţiunea AT de a inhiba acţiunea colagenazei în MEC, [19] este agent de reticulare
valoros, prezentând citotoxicitate redusă, precum şi proprietăţi antimicrobiene şi antiinflamatorii. [41]
B i b l i o g r a f i e
1. E. Haslam, ”Practical Polyphenolics: From Structure to Molecular Recognition and Physiological Action”, Cambridge
University Press, Cambridge, 1998.
2. J.D. Reed, Nutritional toxicology of tannins and related polyphenols in forage legumes, J. Anim. Sci. 73, 1516-1528, 1995.
5. E. Haslam, ”Chemistry of Vegetable Tannins”, Academic Press, London, 1966.
6. I. Mueller-Harvey, Analysis of hydrolysable tannins, Animal Feed Sci. Technol. 91, 3-20, 2001.
7. J.C. Isenburg, D.T. Simionescu şi N.R. Vyavahare, Tannic acid treatment enhances biostability and reduces calcification of
glutaraldehyde fixed aortic wall, Biomater. 26, 1237-1245, 2005.
8. E. Haslam, „Plant Polyphenols-Vegetable Tannins”, Revisited, Cambridge University Press, Cambridge, 1989.
9. H.I. Oh, J.E. Hoff, G.S. Armstrong şi L.A. Haff, Hydrophobic interaction in tannin-protein complexes, J. Agric. Food Chem.
28, 394-399, 1980.
10. E.C. Davidson, Tannic acid in the treatment of burns, Surg. Gynecol. Obstet. 41, 202-221, 1925.
11. S.B.A. Halkens, A.J.J. Van den Berg, M.J. Hoekstra, J.S. Du Point şi R.W. Kreis, The use of tannic acid in the local treatment
of burn wounds: intriguing old and new perspectives, Wounds 13, 144-158, 2001.
14. A. Scalbert, Antimicrobial Properties of Tannins, Phytochem. 30, 3875-3883, 1991.
15. K.-T. Chung, T. Y. Wong, C.-I Wei, Y.-W. Huang şi Y. Lin, Tannins and human health: a review, Critical Rev. Food Sci.
Nutr. 38, 421-464, 1998.
16. M.M. Covan, Plant Products as Antimicrobial Agents, Clin. Microbiol. Rev. 12, 564-582, 1999.
17. S.M. Colak, B.M. Yapici şi A. Yapici, Determination of antimicrobial activity of tannic acid in pickling process, Rom.
Biotechnolog. Lett. 15, 5325-5330, 2010.
18. N.S. Khan, A. Ahmad şi S.M. Hadi, Anti-oxidant, pro-oxidant properties of tannic acid and its binding to DNA, Chem.-Biol.
Interact. 125, 177-189, 2000.
19. http://www.appliedhealth.com/nutri/page8477.php
20. G. Krishnamoorthy, P.K. Sehgal, A.B. Mandal şi S. Sadulla, Studies on collagen-tannic acid-collagenase ternary system:
Inhibition of collagenase against collagenolytic degradation of extracellular matrix component of collagen, J. Enzyme Inhib.
Med. Chem. 2011 Aug 8; 21823836, (doi:10.3109/14756366.2011.596834).
24. R. Lanza, R. Langer şi J. Vacanti, ”Principles of Tissue Engineering” ed. 2-a, Elsevier, San Diego, 2000.
27. B. Madhan, V. Subramanian, J. Raghava Rao, B. Unni Nair şi T. Ramasami, Stabilization of collagen using plant polyphenoles:
Role of catechine, Int. J. Biol. Macromol. 37, 47-53, 2005.
35. Y. Fueaesaku, V. Mizuhira şi H. Nakamura, The new fixation method using tannic acid for electron microscopy and some
observations of biological specimens, Proceedings of the 4th International Congress on Histochemistry and Cytochemistry, ed.
T. Takeuchi, K. Ogawa şi S. Fujita, 155, 1972.
36. K. M. Meek, The use of glutaraldehyde to preserve reconstituted collagen for electron microscopy, Histochem. 73, 115-120,
1981.
38. B. Madhan, P. Thanikaivelan, V. Subramanian, J. Raghava Roa, B.U. Nair şi T. Ramasami, Molecular mechanics and
dynamics studies on the interaction of gallic acid with collagen like peptides, Chem. Phys. Lett. 346, 334-340, 2001.
41. V.Natarajan, N.Krithica, B.Madhan şi P.K. Sehgal, Wound healing potential of tannic acid crosslinked collagen scaffolds,
63rd Indian Pharmaceutical Congress, 16-18 December 2011, Bengaluru, India, lucr. AIII-54.
3. DIGLUCONATUL DE CLORHEXIDINĂ
3.1. Structură şi proprietăţi
Clorhexidina (CH), bisbiguanidă sintetică cu două cicluri 4-clorofenilice şi două grupe biguanidă
legate printr-un lanţ hexametilenic, [2] a fost descoperită în 1946 şi introdusă în practica clinică în 1954. [1]
Pudră cristalină albă, cu formula C22H30Cl2N10, masa 505,45 g/mol, temperatura de topire 134-
136oC, CH este foarte puţin solubilă în apă (0,8 g/L la 20oC) şi nu se poate utiliza ca atare pentru obţinerea
biomaterialelor colagenice. Fiind bază, este stabilă sub formă de săruri: [3] digluconat (DGCH), diacetat şi
diclorhidrat. În practica clinică se utilizează mai ales digluconatul, în special pentru antisepsia pielii. [4]
Antisepticele distrug microorganismele sau inhibă creşterea pe suprafeţele ţesuturilor vii şi în
interior [7, 8] şi se administrează doar topic. DGCH îndeplineşte condiţiile impuse unui antiseptic ideal.
DGCH este activ pe interval larg de pH, între 5 şi 8, [15] care include pH-ul fiziologic al pielii. Este
bază puternică la acest pH şi prezintă cea mai mare activitate. [16] Prin disociere formează dicationi cu
sarcinile pozitive pe atomii de azot din capetele punţii hexametilenice. [17, 18] Caracterul cationic face
posibilă legarea de pereţii celulelor bacteriene, [19] prezentând proprietatea unică de substantivitate. [3]
3.2. Mecanismele de acţiune antibacteriană
Fiind solubil în apă şi bază puternică la pH-ul fiziologic al pielii, DGCH disociază complet la acest
pH, eliberând dicationi CH. [20] Aceştia, fiind lipofili, interacţionează cu fosfolipidele şi lipopolizaharidele
din membranele celulelor bacteriilor la concentraţii mici, favorizând intrarea în celulele bacteriilor. [21]
Eficacitatea antimicrobiană se datorează deci interacţiunilor dicationilor CH cu grupele fosfat şi carboxil
din componenţa pereţilor celulelor microbiene. [22] Astfel echilibrul osmotic al celulelor este alterat,
permeabilitatea pereţilor celulari mărită şi dicationi pătrund în bacterii, [3] perturbând procesele metabolice.
Dicationii CH afectează indirect şi funcţia enzimatică a dehidrogenazei şi ATP-azei din pereţii celulari. [21]
La concentraţii mici DGCH are efect bacteriostatic, iar la concentraţii mari – bactericid.
DGCH este şi agent antifungic eficient, capabil să distrugă nu numai fungii, ci şi sporii. [8] Nu este
sporicid, însă previne dezvoltatrea sporilor, înhibându-le efectul, dar nu germinarea. [23]
B i b l i o g r a f i e
1. A.D. Russell, Introduction of biocides into clinical practice and the impact on antibiotic-resistant bacteria, J. Appl. Microbiol.
92 Suppl, 121S-135S, 2002.
2. G. Greenstein, C. Berman şi R. Jaffin, Chlorhexidine: an adjunct to periodontal therapy, J. Periodontol. 57, 370-376, 1986.
3. Z. Mohammadi, Chlorhexidine gluconate, its properties and applications in endodontics, Iranian Endodontic J. 1, 113-125,
2008.
4. T.J. Karpanen, T. Worthington, E.R. Hendry, B.R. Conway şi P.A. Lambert, Antimicrobial efficacy of chlorhexidine
digluconate alone and in combination with eucalyptus oil, tea tree oil and thymol against planktonic and biofilm cultures of
Staphylococcus epidermidis, J. Antimicrobial Chemotherapy 62, 1031-1036, 2008.
7. S.S. Block, Definition of terms, în ”Disinfection, Sterilization, and Preservation”, ed. S.S. Block, Lippincott Williams &
Wilkins, Philadelphia, 2001.
8. G. McDonell şi A.D. Russell, Antiseptics and disinfectants: activity, action, and resistance, Clin. Microbiol. Rev. 12, 147-179,
1999.
16. http://www.burmester-pharma.de/deutsch/analyse_datenblatt/a1929.pdf
17. A. Albert şi E.P. Sargeant, ”Ionization Constants of Acids and Bases”, Methuen, London, 1962.
18. C.G. Jones, Chlorhexidine: Is it still the gold standard?, Periodontology 15, 55-62, 2000.
19. W.J. Loesche, Chemotherapy of dental plaque infections, Oral Sci. Rev. 9, 65-107, 1976.
20. G. Greenstein, C. Berman şi R. Jaffin, Chlorhexidine: an adjunct to periodontal therapy, J. Periodontol. 57, 370-376, 1986.
21. B. Athanassiadis, P.V. Abbott şi L.J. Walsh, The use of calcium hydroxide, antibiotics and biocides as antimicrobial
medicaments in endodontics, Aust. Dent. J. 52, S64-S82, 2007.
22. B.P. Gomes, S.F. Souza, C.C. Ferraz, B.P. Teixeira, A.A. Zaia, L. Valdrighi şi F.J. Souza-Filho, Effectiveness of 2%
chlorhexidine gel and calcium hydroxide against Enterococcus faecalis in bovine root dentine in vitro, Int. Endod. J. 36, 267-
275, 2003.
23. A.D. Russell şi M.J. Day, Antibacterial activity of chlorhexidine, J. Hosp. Infect. 25, 229-238, 1993.
4. MATERIALE ŞI METODE
4.1. Materiale
Colagenul fibrilar tip I a fost furnizat de Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare Textile
Încălţăminte, sucursala Institutul de Cercetare Pielărie şi Încălţăminte, INTDTI-ICPI Bucureşti.
DGCH (soluţie apoasă cu concentraţia 20%) a fost achiziţionat de la firma Fargon, Germania.
AT a fost cumpărat de la firma Sigma-Aldrich, Germania.
AG (soluţie apoasă cu concentraţia 25%) a fost procurată de la firma Merck, Germania.
Colagenaza tip I din Clostridium histolyticum s-a achiziţionat de la Sigma-Aldrich, Germania.
4.2. Metode de analiză
Hidrogelurile de colagen s-au caracterizat prin metode fizico-chimice rapide, FT-IR, dicroism
circular, reologie staţionară şi dinamică, iar matricile poroase prin spectroscopie FT-IR, SEM şi absorbţia
apei. Matricile cu amestecuri de AT şi DGCH s-au supus degradării enzimatice şi evaluării eliberarării AT.
4.2.1. Metode fizico-chimice rapide
Metodele rapide pentru caracterizarea hidrogelurilor iniţiale de colagen cuprind determinarea
conţinuturilor de: substanţă uscată, cenuşă, azot total, substanţă proteică, substanţă grasă şi pH.
4.2.2. Spectroscopie FT-IR
FT-IR s-a utilizat pentru identificarea grupelor funcţionale, analiza structurii terţiare a colagenului
şi evidenţierea interacţiunilor cu alte substanţe (aparat IR 6000 cu sistem ATR de reflexie MKII Golden
Gate Single, Jasco, cu domeniul spectral 4000 şi 200 cm-1).
4.2.3. Dicroism circular
UV-DC s-a utilizat pentru evidenţierea structurii de helix triplu a colagenului din hidrogeluri.
Spectrele UV-DC s-au obţinut cu un spectropolarimetru Jasco J-810, în domeniul 250-195 nm.
4.2.4. Microscopie electronică de scanare cu baleiaj
Caracterizarea morfologică a matricilor s-a făcut prin microscopie electronică de scanare (SEM).
Imaginile s-au înregistrat cu un microscop Hitachi S-2600N cu rezoluţie de 4 nm (la 25 kV, în vid înaintat
în cazul utilizării detectorului de electroni secundari) şi tensiuni de accelerare de la 0,5 până la 30 kV.
4.2.5. Metode reologice
Viscozităţile, destructurarea şi restructurarea hidrogelurilor s-au determinat prin reologie staţionară,
iar comportarea viscoelastică prin reologie dinamică. Determinările staţionare s-au efectuat cu un
reoviscozimetru Haake VT 550 echipat cu sistemul de senzori MV1 pentru viscozităţi medii si software
RheoWin 4 Thermo Fischer Scientific. Măsurătorile dinamice s-au făcut cu microreometrul Micro Fourier
Transform Rheometer MFR 2100, GBC, Australia, care funcţionează în regim de curgere sub compresie.
4.2.6. Absorbţia apei
Aprecierea gradelor de reticulare a matricilor şi a capacităţii de a absorbi fluide biologice s-a făcut
prin absorbţia apei la temperatura camerei.
4.2.7. Degradarea enzimatică in vitro
Rezistenţa la digestia cu colagenază s-a studiat în condiţii fiziologice, prin incubarea probelor în
soluţie de colagenază 1µg/mL în soluţie tampon fosfat salină cu pH 7,4 la 370C, utilizând colagenază din
Clostridium histolyticum cu activitatea 125 U/mg. Degradarea a fost urmărită timp de 9 zile.
4.2.8. Evaluarea cedării medicamentelor
Cantităţile de AT eliberat din matrici s-au determinat cu dispozitivul USP cu celule “sandwich.
Concentraţia acidului tanic s-a determinat prin spectrofotometrie UV, la lungimea de undă de 276 nm.
5. CARACTERZAREA HIDROGELURILOR DE COLAGEN INIŢIAL, CU ACID TANIC,
DIGLUCONAT DE CLORHEXIDINĂ SAU AMESTECURI ALE ACESTORA
Hidrogelurile – sisteme coloidale semisolide cu fază dispersată aposă şi mediu de dispersie solid,
[1,2] sunt definite ca reţele tridimensionale ale polimerilor hidrofili capabile să absoarbă cantităţi mari de
apă sau fluide biologice. [3-5] Consistenţa moale şi conţinutul mare de apă fac proprietăţile asemănătoare
cu ale ţesuturilor. [8] Permeabile pentru moleculele dizolvate, sunt suporturi pentru eliberarea
medicamentelor. [9-11]
Soluţiile/gelurile consistente de colagen sunt reţele tridimensionale de fibrile interţesute la
întâmplare prin legături de hidrogen, interacţiuni ionice şi forţe hidrofobe. Datorită numeroaselor grupe
hidrofile înglobează cantităţi imense de apă [13] şi au proprietăi mecanice slabe. Îmbunătăţirea acestora se
obţine prin reticulare. Agenţii chimici produc însă citotoxicitate şi reducerea biocompatibilităţii. [14, 16-20]
Proprietăţile hidrogelurilor sunt determinate de integritatea moleculelor din fibrile. Deci pentru
obţinere de biomateriale trebuie să fie foarte pur, iar moleculele să aibă conformaţie cât mai apropiată de
cea nativă. Viscozitatea este foarte importantă, influenţând densitatea de reticulare, viteza de cedare a
medicamentelor şi dimensiunile porilor matricilor.
5.1. Hidrogelul iniţial
Hidrogelul iniţial, extras din piele crudă de viţel prin tratamente bazice şi acide, [23] s-a
caracterizat prin puritate – prin metodele rapide şi integritatea helixurilor triple ale moleculelor din fibrile.
5.1.1. Metode de analiză rapide
Metodele de caracterizare rapidă cuprind determinări de conţinuturi de: substanţă uscată (evaporare
la etuvă la 105oC până la masă constantă) – 2,67%, azot total (metoda Khjeldal) – 0,47/17,6*, substanţă
proteică – din azotul total (înmulţire cu 5,67 – factorul de transformare a azotului în proteine) –
2,64/98,88*, cenuşă (calcinare la 600-800oC până la masă constantă) – 0% şi grăsimi (extracţie cu eter de
petrol şi evaporare până la masă constantă) – 0%, la care se adaugă pH-ul. Valorile stelate sunt recalculate
pentru substanţa uscată.
5.1.2. Caracterizarea prin dicroism circular
Colagenul tip I are spectrul UV-DC asemănător cu al poli-L-prolinei II: minim intens la cca 200 nm
şi maxim mai slab şi mai larg între 220 şi 225 nm, atribuite structurii de helix triplu [24-27] (figura 5.1).
200 210 220 230 240 250
-200
-150
-100
-50
0
50
100
Elip
tic
ita
te, m
lgrd
Lungime de unda, nm
Figura 5.1. Spectrul UV-DC al
colagenului
Spectrul UV-DC al colagenului obţinut din hidrogelul iniţial cu
concentraţia 0,35% în acid acetic 0,1 M, la 22oC, utilizând cuvă de cuarţ
de 0,2 mm şi deschiderea fantei de 400 μm, are minimul situat la 204
nm, iar maximul la 221 nm, în concordanţă cu literatura. [24-27] Punctul
de elipticitate zero este 213,5 nm, dar raportul dintre intensitatea
maximului şi minimului, Rpn, este 0,35, mai mare ca valorile din
literatură obţinute în aceleaşi condiţii(0,10-0,13 [27]). Aceasta se poate
datora împachetării helicoidale mai avansate sau concentraţiei mai mari
a colagenului. Valorile arată că în decursul extracţiei conformaţia de
helix triplu a moleculelor de colagen nu a fost afectată, deci colagenul
poate fi utilizat pentru prepararea de biomateriale.
5.2. Selectarea concentraţiei hidrogelului de colagen pentru prepararea biomaterialelor
Polielectrolit amfoter, colagenul are sarcină netă pozitivă în mediu acid, negativă în mediu bazic şi
interval izoelectric între 4,5 şi 5,5. [28] Consistenţa hidrogelurilor şi interacţiunea cu alte substanţe depinde
de pH: viscozităţile, interacţiunile şi stabilităţile la forfecare sunt maxime la pH 2,5-3,5 şi la cca 7,5.
Pentru selectarea concentraţiei optime s-au preparat hidrogeluri cu concentraţia 0,9, 1,1 şi 1,3%
colagen (masă/ volum), cu pH acid (3,8) şi slab bazic (7,4).
Reogramele obţinute pentru hidrogelurile acide sunt reprezentate în figura 5.2.
Hidrogelurile se comportă pseudoplastic; viscozităţile aparente cresc cu concentraţia colagenului. Comportarea hidrogelurilor cu pH 7,4 este asemănătoare, dar valorile * sunt mai mici.
Reogramele arată că pentru 0,9% colagen panta se micşorează uşor la viteza de 17 s-1 la ambele pH-
uri, deci hidrogelurile se destructurează uşor. La pH 7,4 se întâmplă acelaşi lucru şi pentru 1,1% colagen.
0 5 10 15 20
10
20
30
40
50
60
70
Te
ns
iun
e d
e f
orf
ec
are
, P
a
Viteza de forfecare, s-1
c = 0,9%
c = 1,1%
c = 1,3%
Figura 5.2. Reogramele pentru hidrogelurile
acide cu concentraţiile menţionate
Parametrii ce descriu comportarea reologică a
hidrogelurilor s-au determinat cu modelele utilizate
frecvent pentru descrierea comportării pseudoplastice a
fluidelor: - Ostwald-de Waele, [31] pentru fluidele care nu
prezintă tensiune limită de curgere:
= K. n (5.1)
unde este viteza de forfecare, K – indicele de
consistenţă, iar n – indicele de curgere şi
- Herschel-Bulkley: [32]
= o + K. n (5.2)
unde o este tensiunea de la care începe curgerea sau
tensiunea limită de curgere.
Hidrogelurile având valori o, parametrii s-au calculat cu relaţia (5.2) (tabelul 5.2).
Valorile o cresc cu concentraţia colagenului la ambele pH-uri şi sunt mai mari la o concentraţie
dată pentru cele acide. Şi indicii de consistenţă, de 6,5-7,3 ori mai mari pentru cele acide, cresc cu
concentraţia colagenului, iar cei de curgere scad. Valorile subunitare ale indicilor de curgere confirmă
Tabelul 5.2. Parametrii reologici pentru hidrogelurile
cu concentraţiile şi pH-urile indicate
Concentraţie gel, %/
parametru reologic
o, Pa
K, Pa.sn
n comportarea pseudoplastică a hidrogelurilor şi creşterea
caracterului pseudoplastic cu mărirea concentraţiei sale.
Comportarea reologică staţionară arată că 1,1% este cea
mai convenabilă concentraţie, atât în ceea ce priveşte
stabilitatea sub acţiunea forţelor de forfecare, cât şi consistenţa.
Deşi hidrogelul slab bazic are doar jumătate din viscozitatea
celui acid, creşterea concentraţiei la 1,3% nu este justificată de
aportul la viscozitate.
pH 3,8
0,9
1,1
1,3
1,553
1,857
2,504
16,321
23,641
29,835
0,394
0,314
0,259
pH 7,4
0,9
1,1
1,3
0,414
0,839
1,567
2,496
3,513
4,106
0,591
0,541
0,521
5.3. Hidrogeluri cu acid tanic
AT leagându-se rapid şi relativ ferm de colagen în mediu acid, s-au preparat hidrogeluri cu pH 3,8.
Pentru a stabili cantitatea optimă de AT pentru reticulare, în hidrogelul acid cu concentraţia 1,1% s-
a intodus 5, 10 şi 15% AT raportat la cantitatea de colagen din hidrogel. Hidrogelul cu 5% AT este mai opalescent şi mai viscos decât martorul; cel cu 10% AT este
asemănător, cu opalescenţă şi viscozitate mai mari. Fragilitatea creşte, agitarea producând fragmentarea, dar
în stare de repaus redevine omogen. Pentru 15% AT opalescenţa şi viscozitatea cresc, apare o slabă
neomogenitate, fragmentarea este mai accentuată şi timpul pentru a recăpăta aspectului iniţial este mai lung.
Hidrogelurile s-au caracterizat structural – prin spectroscopie FT-IR şi UV-DC – şi reologic.
5.3.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR
Colagenul nedenaturat tip I este compus din 20 resturi de aminoacizi conectate prin legături C-N.
Este constituit din secvenţe oligomerice tripeptidice Gly-X-Y, [33] (Gly – rest de glicină, X şi Y – resturile
oricăruia dintre ceilalţi aminoacizi). Acesta constituie structura primară a lanţului colagenului.
Glicina se află în lanţul -polipeptidic în fiecare a 3-a poziţie, iar prolina – Pro şi hidroxiprolina –
Hyp constituie 1/3 din resturile de aminoacizi; secvenţele Gly-Pro-Hyp, caracteristice colagenului, sunt
frecvente. Inflexibilitatea Pro şi Hyp rigidizează lanţul şi face imposibilă formarea helixului alfa, dar
favorizează apariţia spontană a helixului răsucit spre stânga, tip poliprolină II (PP II). [34] Conformaţia nu
se poate stabiliza prin legături de hidrogen, grupele ce formează legăturile fiind în poziţii nefavorabile.
Stabilitatea este dată de repulsiile sterice ale ciclurilor pirolidinice din Pro şi Hyp. [34] Helixul conţine trei
resturi de aminoacizi într-un pas, este mai extins decât alfa şi exclude interacţiunile pe distanţă mare.
Aranjamentele structurilor primare constituie structurile secundare ale segmentelor, iar pentru colagen al
lanţului polipeptidic în întregime. [35]
Trei helixuri răsucite spre stânga se răsucesc spre dreapta, în jurul unei axe centrale comune,
formând helixul triplu, caracteristic moleculei de colagen nativ (tropocolagen), conformaţie numită
structură terţiară, [36-40] stabilizată de legăturile de hidrogen dintre lanţuri. Structurile terţiare reprezintă
deci modul de autoasamblare a celor secundare în conformaţia tridimensională a moleculei de proteină.
În spectrul FT-IR s-au identificat următoarele benzi caracteristice colagenului: [42] 1640 şi 1660
cm-1 – foarte intensă, datorate în special vibraţiilor de întindere ale legăturii C=O amidă, la care contribuie
şi legăturile de hidrogen cuplate cu vibraţiile de întindere C-N, bandă numită amidă I; 1500-1600 cm-1 –
intensă, atribuită vibraţiilor de oscilaţie N-H (contribuţie 60% [43, 44]) cuplată puternic cu întindere C-N
din amină, denumită amidă II; semnalele din regiunea spectrală 1400-1200 cm-1 datorate întinderii
legăturilor C-N cuplate cu oscilaţiile N-H în plan din legăturile amidă, numite amidă III. Alte benzi
atribuite grupelor amidă sunt: 3289 cm-1 – întindere N-H cuplată cu legături de hidrogen – amidă A şi 2920
cm-1 – umăr, dat de întinderea asimetrică a CH2 – amidă B. Mai slabe apar la: 1450 cm-1 – oscilaţie CH2,
1260 cm-1 – oscilaţie N-H cuplată cu întindere C-N, 1078 şi 1021 cm-1 – întindere C-O şi 804 cm-1 –
întinderea scheletului moleculei.
Benzile amidă I şi II datorându-se absorbţiei produse de helixurile triple ale colagenilor, [47] se pot
utiliza pentru a stabili păstratrea structurii native.
Pentru a determina conservarea conformaţiei native/cantitatea de helixuri triple rămase se
utilizează: (a) rapoartele absorbanţelor benzilor amidă III şi de oscilaţie a grupei CH2 de la 1450 cm-1,
AIII/A1450 – valoarea 1 sau mai mare arată că helixurile triple sunt intacte, iar cele mai mici – că au fost
denaturate; (b) diferenţele dintre numerele de undă ale benzilor amidă I şi II, (AI - AII) – valoari mai mari
ca 100 cm-1 arată prezenţa colagenului denaturat. Utile sunt şi rapoartele absorbanţelor benzilor amidă I şi
A, AI/AA, care reflectă extinderea reticulării: raport mare indică reticulare mai avansată. [48]
Spectrul FT-IR al colagenului din hidrogelul martor în intervalul 1700-1000 cm-1 este prezentat în
figura 5.8, culoarea portocalie. În figură sunt date şi spectrele hidrogelurilor cu cele trei procente de AT.
Figura 5.8.
Spectrele FT-
IR ale
hidrogelurilor
de colagen
martor şi cu
AT: 5%; 10%
şi 15%
Tabelul 5.4. Numerele de undă ale benzilor amidă I-III, de oscilaţie
a CH2 şi valorile (AI - AII) pentru hidrogelurile martor şi cu AT
AT, % Amidă I,
cm-1
Amidă II,
cm-1
Amidă III,
cm-1
CH2 oscilaţie,
cm-1 (AI - AII),
cm-1
0 1655 1556 1240 1454 99
5 1655 1556 1242 1458 99
10 1655 1558 1240 1456 97
15 1657 1556 1240 1456 101
Figura arată benzi slabe şi
largi pentru hidrogelul martor,
concentraţia colagenului fiind mică.
Banda amidă I apare la 1655 cm-1, cu
umăr la 1630 cm-1 şi altele mai slabe
de o parte şi alta, amidă II la 1556
cm-1 – mai intensă şi 1528 cm-1 – mai
slabă, cu umeri la numere de undă
mai mici, amidă III la 1240şi 1205 cm-1; a grupei CH2 la 1454 cm-1, cu umeri de ambele părţi, în
concordanţă cu valorile din literatură [49] (tabelul 5.4).
Liniile de bază ale benzilor fiind greu de delimitat, s-a renunţat la raportul AIII/A1450 şi s-au folosit
doar diferenţele (AI - AII). Valoarea 99 cm-1 arată că martorul nu conţine colagen denaturat.
AT nu conţine benzi comune cu ale colagenului, cu excepţia celei de la 1447 cm-1, apropiată de cea
a grupei CH2, dar aceasta este slabă pentru AT.
Benzile amidă I-III şi 1454 cm-1 apar la aceleaşi numere de undă ca în colagenul nativ, dar amidă II
se modifică: mărirea concentraţiei AT scade intensitatea celei de la 1528 cm-1 şi apare umăr la 1545 cm-1.
Diferenţele dintre frecvenţele benzilor amidă I şi II sunt mai mici de 100 cm-1, cu excepţia
concentraţiei de 15% AT, care este cu 1 cm-1 mai mare. Deci interacţiunile dintre colagen şi AT nu
afectează benzile caracteristice colagenului tip I nativ.
5.3.2. Caracterizarea prin pectroscopie UV-DC
Spectrul UV-DC al hidrogelului de colagen cu pH 3,8 este prezentat în figura 5.10 (negru).
190 200 210 220 230 240 250
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
Elip
tic
ita
te, m
grd
Lungime de unda, nm
Figura 5.10. Spectrele UV-DC pentru hidrogelurile
martor şi cu AT: 5%; 10% şi 15%
Comparându-l cu al colagenului iniţial se constată diferenţele:
(a) minimul este mult aplatisat; (b) maximul pare mult mai
ascuţit, dar aceasta se datorează scalei mult mai mari din
figura 5.10 (de 6 ori); (c) minimul este deplasat spre lungimi
de undă mai mici (199 nm comparativ cu 204 nm); (d)
maximul se află la lungimi de undă mai mari – 225 faţă de 221
nm; (e) punctul de elipticitate zero se află la lungime de undă
ceva mai mare, de 214,8 nm comparativ cu 213,5; (f) raportul
Rpn este mare, de 3,54 ori mai mare decât cel obţinut din
spectrul din figura 5.1 pentru colagenul iniţial.
O valoare Rpn aşa de mare nu a fost găsită în
literatura de specialitate, dar sunt raportate numai spectre
pentru soluţii diluate, sub 0,15%, pentru care valorile sunt
cuprinse între 0,12 şi 0,15. [26, 53, 54]
Hidrogelul utilizat la prepararea biomaterialelor fiind mult mai concentrat, pentru a stabili cauzele
obţinerii unui spectru cu forma şi caracteristicile din figura 5.10 s-a întreprins un studiu privind efectul
concentraţiei colagenului şi deschiderii fantei spectropolarimetrului asupra caracteristicilor spectrului.
5.3.2.1. Efectul concentraţiei colagenului asupra spectrului UV-DC
S-a lucrat cu soluţii de colagen molecular cu concentraţii 0,1-1,0% în acid acetic 0,1 M, la
deschiderea fantei de 400 μm şi drum optic al celulei de 0,2 mm. Rezultatele sunt prezentate în figura 5.11.
190 200 210 220 230 240 250
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
100
Concentratia colagenului:
1.00%
0.67%
0.48%
0.31%
0.16%
0.11%
0.10%
Elip
tic
ita
te, m
grd
Lungime de unda, nm
Figura 5.11. Efectul măririi concentraţiei
colagenului asupra spectrului UV- DC
Creşterea concentraţiei colagenului măreşte mult intensitatea
maximului dar poziţia sa se păstrează, iar minimul se
deplasează mult spre valori mai mari ale , modificând
valorile Rpn. Punctul de elipticitate zero este comun, la 214
nm, deci nu depinde de concentraţie. Maximele au foarte
apropiate pentru 0,10-0,67% (221,2-221,6 nm) şi creşte la
226 nm pentru 1%. Intensitatea maximului creşte liniar cu
concentraţia între 0,10 şi 0,67%, iar între 0,67 şi 1,00% scade
uşor, cu consecinţe asupra valorilor Rpn. Intensităţile
minimelor variază astfel: cresc la mărirea concentraţiei
colagenului de la 0,10 la 0,16%, scad puţin între 0,16 şi
0,31%, mai mult între 0,31 şi 0,67% şi foarte puţin între 0,67
şi 1,00%. Poziţiile se deplasează sensibil spre lungimi de
undă mai mici la creşterea diluţiei între 0,67 şi 0,10%, iar la
1% peak-ul este mai larg şi mai puţin net, iar poziţia sa mai
greu de stabilit. Din combinarea variaţiilor intensităţilor celor două peak-uri cu creşterea concentraţiei
colagenului rezultă pentru Rpn următoarea dependenţă de concentraţie: între 0,10 şi 0,31% creşte puţin,
de la 0,15 la 0,25; între 0,31şi 0,48% creşte mai mult – de la 0,25 la 0,70; între 0,48 şi 0,67% se măreşte şi
mai mult, de la 0,70 la 1,9; peste 0,67% mărirea este din nou mai redusă, ajungând în final la 2,4.
5.3.2.2. Efectul deschiderii fantei
Opalescenţa sistemului alterează spectrul UV-DC, difuzia luminii putând depăşi absorbţia. Soluţiile
de colagen sunt slab turbide, efect accentuat de concentraţie. Utilizarea de cuve cu drum optic foarte mic şi
deschideri mari ale fantei reduce efectele, dar uneori factorul dispersiv nu poate fi diminuat suficient.
Sub 0,67% maximele şi punctele de elipticitate zero nu sunt afectate de deschiderea fantei, dar la
1% scad uşor la creşterea deschiderii, fără modificarea poziţiei. Formele, intensităţile şi lărgimile minimelor
sunt însă puternic afectate pentru primele cinci concentraţii: elipticităţile scad şi lărgimile cresc la
concentraţie dată, efecte accentuate de concentraţie. La 1% forma spectrului se modifică mult şi este slab
definit, fotomultiplicatorul nefuncţionând optim din cauza opalescenţei mari. Acelaşi lucru este de aşteptat
şi peste 1%. Spectrul UV-DC are deci forma specifică colagenului doar la concentraţii mici. [24-27]
Intensitatea peak-ului negativ scăzând, iar a celui pozitiv crescând cu mărirea concentraţiei colagenului,
Rpn creşte şi poate depăşi unitatea. Deci valoarea 1,24 obţinută pentru hidrogelul cu 1,1% colagen poate fi
considerată corectă.
Pentru geluri sau soluţii concentrate de colagen se poate propune deci drept criteriu pentru existenţa
conformaţiei de helix triplu a moleculelor în fibrile doar existenţa peak-urilor pozitiv şi negativ la lungimi
de undă specifice colagenului, indiferent de valorile intensităţilor. Existenţa helixurilor triple s-ar putea
confirma prin diluare, când spectrele recapătă aspectul specific, dar numai când aceasta se poate face.
Revenind la efectul AT asupra colagenului, în tabelul 5.5 sunt date caracteristicile spectrelor cu AT.
Tabelul 5.5. Lungimile de undă, elipticităţile, punctele de elipticitate zero şi valorile Rpn pentru hidrogelurile H1-H4
Hidrogel
Minim Maxim Punct de elipticitate
zero, nm
Rpn λ, nm θ, mgrd λ, nm θ, mgrd
H1 199,0 -57,7 225,0 71,7 214,8 1,24
H2 200,8 -24,0 228,6 24,8 218,8 1,03
H3 198,2 -15,0 230,6 8,0 215,2 0,53
H4 199,8 -15,9 232,2 4,1 224,6 0,26
Figura 5.10 arată că toate minimele şi maximele pentru hidrogelurile cu AT sunt mult mai
aplatisate, rapoartele Rpn sunt mai mici, în special pentru cantităţi mai mari de AT, şi punctele de
elipticitate zero deplasare spre valori mai mari comparativ cu cele din colagen. Asemenea modificări fiind
considerate dovezi de denaturare parţială a colagenului, [53, 54] s-ar putea crede că hidrogelurile conţin
colagen denaturat, cu atât mai mult cu cât cantitatea de AT este mai mare. Dar diferenţele (AI - AII) au
valoare peste 100 cm-1 (101 cm-1) numai pentru 15% AT. Deci datele FT-IR confirmă criteriul propus
pentru aprecierea prezenţei conformaţiei native.
Considerând efectul turbidităţii asupra spectrului, modificările pentru hidrogelurile cu AT se pot
atribui măririi opalescenţei, ipoteză susţinută de spectrele apropiate ale hidrogelurilor cu 10 şi 15 % AT.
Sigur este faptul că mărirea concentraţiei AT deplasează uşor lungimea de undă a minimului spre
valori mai mari, scade considerabil intensitatea maximului, creşte lungimea de undă şi scade valoarea Rpn.
5.3.3. Caracterizarea prin comportare reologică staţionară
Comportarea reologică staţionară permite determinarea consistenţei şi plasticităţii sistemelor
disperse, [55] proprietăţi ce permit prevederea comportării hidrogelurilor la aplicarea pe piele, a tehnicii de
aplicare şi a comportării la locul aplicării. Viscozitatea determină întinderea sau etalarea pe piele, cinetica
eliberării substanţelor active conţinute şi timpul de stază la locul aplicării.
În figurile 5.16-5.19 sunt prezentate reogramele înregistrate pentru hidrogelul martor şi cele cu AT
la mărirea şi micşorarea vitezelor de forfecare pe un interval larg de viteze, pentru a stabili sensibilitatea la
forfecare, vitezele de forfecare la care începe destructurarea şi refacerile hidrogelurilor destructurate.
0 200 400 600 800 1000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Te
ns
iun
e d
e f
orf
ec
are
, P
a
Viteza de forfecare, s-1
a
0 200 400 600 800 10000
20
40
60
80
100
Te
ns
iun
e d
e f
orf
ec
are
, P
a
Viteza de forfecare, s-1
b
0 200 400 600 800 1000
0
20
40
60
80
100
Te
ns
iun
e d
e f
orf
ec
are
, P
a
Viteza de forfecare, s-1
c
0 200 400 600 800 1000
0
20
40
60
80
100
Te
ns
iun
e d
e f
orf
ec
are
, P
a
Viteza de forfecare, s-1
d
Figurile 5.16-5.19. Reogramele hidrogelurilor: a – martor şi cu b –5% , c – 10% şi 15% AT
Reograma martorului arată curgere la tensiuni mici, comportare ideală elastică la viteze foarte mici,
apoi pseudoplastică, destructurare la cca 10 s-1 şi continuare la viteze mai mari; scădere bruscă de pantă la
cca 300 s-1, apoi comportare plastică ideală. Rezistenţa redusă la forfecare se datorează concentraţiei mici
de colagen. La reducerea vitezelor de forfecare reograma este sub cea anterioară, deci structura nu se reface
complet. Apare o buclă de histerezis, deci hidrogelul este tixotrop.
Efectului reticulării asupra comportării reologice este evidenţiat de reogramele din fig. 5.17-5.19.
Consistenţa hidrogelurilor, rezistenţa la forfecare şi tixotropia se măresc cu creşterea cantităţii de
AT. Pentru 15% AT restructurarea se reduce, sugerând depăşirea cantităţii necesare reticulării colagenului.
Determinarea valorilor 0 prin liniarizarea dependenţelor viscozitate aparentă-viteză de forfecare
arată că pentru fiecare hidrogel se obţin două drepte care se intersectează la 10 s-1, deci destructurarea
începe pentru toate la această viteză. Panta mai mare la viteze mai ridicate demonstrează creşterea
Tabelul 5.6. Viscozităţile dinamice şi indicii de curgere pentru probele
H1-H4 obţinute la mărirea şi micşorarea vitezelor de forfecare
Hidrogel Mărire viteze forfecare Micşorare viteze
forfecare pseudoplasticităţii.Valorile 0 s-au determinat
doar din dreptele de la viteze de forfecare mici
şi sunt date în tabelul 5.6.
Hidrogelul cu 10% AT este cel mai
viscos, susţinând ipoteza că 15% depăşeşte
cantitatea necesară pentru reticulare, excesul
deteriorând colagenul.
0 , Pa.s n
0 , Pa.s n
H1 9,80 0,43 3,80 0,46
H2 13,86 0,35 3,73 0,50
H3 21,55 0,42 5,37 0,44
H4 19,17 0,41 0,98 0,79
Influenţa asupra capacităţii de curgere s-a evidenţit prin indicii de curgere, calculaţi cu ecuaţia
Ostwald-de Waele, dar rezultatele (tabelul 5.6) nu corespund complet cu viscozităţile, hidrogelurile
prezentând totuşi tensiuni limită de curgere.
Restructurarea hidrogelurilor s-a urmărit din reogramele obţinute la micşorarea vitezelor de
forfecare. Valorile 0 (tabelul 5.6) sunt mult mai mici decât cele obţinute la mărire. Hydrogelul cu 15% se
restructurează cel mai slab. Indicii de curgere sunt în concordanţă mai bună cu valorile viscozităţilor.
5.3.4. Caracterizarea prin comportare reologică dinamică
Măsurătorile reologice dinamice nu afectează structura sistemelor supuse determinărilor. Valorile
modulilor de stocare sau de elasticitate, G’, şi de pierderi sau de viscozitate, G”, la amplitudini de
deformaţie mici pentru ca răspunsul meterialului să fie viscoelastic liniar, permit determinarea contribuţiilor
elastică şi viscoasă la comportarea viscoelastică: valori G’ mari indică preponderenţa proprietăţilor elastice,
iar G” mari – predominanţa celor viscoase. Aceştia permit şi diferenţierea sistemelor nereticulate de
reticulate: ambii moduli sunt foarte mari şi curbele ce dau dependenţele de frecvenţă sunt aproape paralele
pentru cele puternic reticulate, [55] pe când cele nereticulate nu prezintă relaţie între valorile modulilor sau
în variaţia acestora cu frecvenţa.
Dependenţele G’ şi G” de din figura 5.22 arată că: (a) valorile G’ > G” pentru toate hidrogelurile,
deci comportarea este preponderent elastică; (b) diferenţele modulilor la o frecvenţă dată cresc cu cantitatea
de AT, deci AT măreşte elasticitatea; (c) ambii cresc practic liniar cu ; (d) dreptele modulilor sunt paralele
pentru fiecare hidrogel, cu excepţia celui făra AT, arătând că este foarte slab reticulat; (e) hidrogelul cu
10% AT are cele mai mari valori G’ şi G”, deci este cel mai elastic şi cel mai viscos, adică este cel mai
reticulat; (f) hidrogelul cu 15% AT este mai puţin elastic şi mai puţin viscos, deci este mai slab reticulat
decât cel cu 10% AT, din cauza denaturării parţiale a colagenului produsă de excesul de AT. Deci cea mai
adecvată cantitate de AT pentru reticularea colagenului din hidrogel este 10%.
1 10 100 1000
10
100
G' H1
G" H1
G' H2
G" H2
G' H3
G" H3
G' H4
G" H4
G',
G"
, P
a
, rad/s
Figura 5.22. Variaţiile G’ şi G” cu pentru
hidrogelurile H1-H4
Viscozităţile aparente, *, la o frecvenţă dată, ,
sunt date de rapoartele G”/ corespunzătoare înmulţite cu
2. Valorile * astfel obţinute depind liniar de frecvenţele
unghiulare iar pantele dreptelor depind de cantitatea de AT:
hidrogelul martor are cea mai mică pantă, creşte pentru 5 şi
10% AT, iar pentru 15% AT se situează între pantele
ultimelor două. Extrapolând la frecvenţa de 1 rad/s (0,16
Hz) s-au obţinut valorile: 19,08 Pa.s pentru martor, 39,80
Pa.s pentru hidrogelul cu 5% AT, 56,09 Pa.s pentru cel cu
10% şi 52,83 Pa.s pentru 15%. Valoarea pentru ultimul
hidrogel este mai mică decât pentru cel cu 10% AT din
cauza excesului de AT, care afectează slab colagenul nativ.
Valorile 0 sunt mult mai mari decât cele obţinute
din măsurători staţionare. Ca şi în cazul viscozităţilor
dinamice,cea mai mare valoare s-a obţinut pentru hidrogelul cu 10% AT, care se destructurează cel mai
slab, deci are structură tridimensională mai bine consolidată. Rezultatele susţin ipoteza denaturării slabe
produse de excesul de AT.
5.4. Hidrogeluri cu digluconat de clorhexidină
Asemenea hidrogeluri s-au prepararea cu pH acid – 3,8 şi slab bazic – 7,4, [56, 57] DGCH
prezentând activitate la pH 5-8, [58] cu activitatea maximă la pH-ul fiziologic al pielii. [59] Cantităţile de
DGCH introduse au fost 1,82, 4,55 şi 9,09% raportat la cantitatea de colagen din hidrogel. Cele cu pH slab
bazic fiind prea fluide, pentru mărirea consistenţei s-a introdus ca agent de reticulare aldehidă glutarică
(AG), 0,15% raportată la colagenul din hidrogel. S-au preparat astfel trei serii de hidrogeluri: (a) cu pH 3,8,
(b) cu pH 7,4 şi (c) cu pH slab bazic şi AG. Acestea s-au caracterizat prin aceleaşi metode ca cele cu AT.
5.4.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR
Spectrele FT-IR ale hidrogelurilor martor cu pH 3,8 şi 7,4, al celui cu ultimul pH reticulat cu 0,15%
AG şi ale hidrogelurilor care conţin DGCH sunt prezentate în figura 5.25.
Figura 5.25.
Spectrele FT-IR
suprapuse
obţinute pentru
hidrogeluril cu pH
3,8 şi: 0, 1,82,
4,55, 9,09%
DGCH; pH 7,4 şi:
0, 1,82, 4,55,
9,09% DGCH; pH
7,4, 0,15% AG şi:
0, 1,82, 4,55,
9,09% DGCH
[56,57]
Numerele de undă la care apar benzile pentru hidrogelurile acide sunt prezentate în tabelul 5.7.
Tabelul 5.7. Frecvenţele benzilor amidă I-III şi A, de oscilaţie a grupei CH2, rapoartele AIII/A1450 şi AI/AA şi
diferenţele frecvenţele amidă I şi II pentru hidrogelurile acide
DGCH,
%
Amidă I,
cm-1
Amidă II,
cm-1
Amidă III,
cm-1
CH2 ,
cm-1
Amidă A,
cm-1
AIII/A1450
AI/AA
(AI - AII), cm-1
0 1639 1543 1238 1450 3298 0,96 1,38 96
1,82 1641 1541 1234 1448 3298 1,88 1,29 100
4,55 1639 1543 1234 1446 3298 2,15 1,28 96
9,09 1639 1542 1234 1446 3298 1,21 1,29 97
Mărirea pH-ului reduce mult intensităţile tuturor benzilor, dar reticularea cu AG nu le modifică.
Aceasta se datorează separării slabe de faze din hidrogelurile bazice, care reduce concentraţia colagenului.
Comparând spectrul DGCH cu cel al colagenului se constată benzi comune doar în intervalul 3750-
2750 cm-1 şi banda amidă I. Deci se pot suprapune doar aceste benzi, care trebuie utilizate cu grijă.
Pentru stabilirea efectului DGCH asupra conformaţiei moleculelor de colagen din fibrile se pot
utiliza şi rapoartele AIII/A1450, precum şi rapoartele AI/AA, care măsoară extinderea reticulării.
Hidrogeluri cu ambele substanţe preparându-se doar cu pH acid, se discută caracterizarea acestora.
Benzile îşi păstrează frecvenţele în prezenţa DGCH. Pentru hidrogelurile cu 4,55 şi 9,09% DGCH
benzile se suprapun. Deci DGCH interacţionează slab cu colagenul.
Rapoartele AIII/A1450 variază între 0,96 (martor) şi 2,15 (cu 4,55% DGCH); diferenţele benzilor
amidă I şi II nu depăşesc 100 cm-1, valori ce dovedesc că niciun hidrogel nu conţine colagen denaturat.
Rapoartele AI/AA arată că martorul este cel mai puţin reticulat. DGCH micşorează puţin rapoartul,
datorită legării dicationilor CH de grupele carboxil ale colagenului. Acestea fiind în număr foarte mic la pH
3,8, reticularea astfel produsă este extrem de slabă. În concluzie, DGCH nu afectează conformaţia
moleculelor de colagen din fibrile în condiţiile experimentale utilizate, dar reduce uşor reticularea. [56, 57]
5.4.2. Caracterizarea prin UV-DC
S-au înregistrat spectrele UV-DC ale hidrogelurile martor şi cu 4,55% DGCH(figura 5.27). [56, 57]
Spectrul hidrogelului martor este foarte asemănător cu al soluţiei 1% din figura 5.10, dar peak-ul
negativ este mai bine conturat şi mai intens, deci raportul Rpn este mai mare. Aceasta se poate explica prin
reducerea flexibilităţii moleculelor de colagen datorită asocierii supramoleculare în fibrile.
190 200 210 220 230 240 250
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
Elip
tic
ita
te, m
grd
Llungime de unda, nm
Figura 5.27. Spectrele UV-DC pentru hidrogelurile cu
pH 3,8 şi: ▪ – 0; ▪ – 4,55% DGCH
Corelând cu datele FT-IR se constată că
mediul acid favorizează asocierea.
DGCH reduce intensităţile ambelor peak-uri:
mai mult a celui pozitiv şi mai puţin a celui
negativ, şi deci micşorează valoarea Rpn (de la 2,61 la
2,44). Deci DGCH denaturează uşoar colagenul sau
măreşte flexibilitatea moleculelor. Considerând şi
rezultatele FT-IR, se constată că DGCH are ca efect
micşorarea uşoară a asocierii supramoleculare, prin
interpunere între fibrile, mărind flexibilitatea
colagenului la nivel molecular. Microzonele de fibrile
care sunt reticulate cu DGCH, mai fluide, alterează
puţin structura hidrogelului şi acesta devenine uşor
discontinuu.
5.4.3. Caracterizarea prin comportare reologică staţionară
Reogramele înregistrate pentru hidrogelul acid martor şi cu cele trei cantităţi de DGCH la viteze de
forfecare mici, cuprinse între 0,1 şi 20,4 s-1, sunt prezentate în figura 5.30. [56, 57]
0 4 8 12 16 20
10
20
30
40
50
60
70 B
D
E
F
Te
nsiu
ne
de
fo
rfe
ca
re, P
a
Viteza de forfecare, s-1
Figura 5.30. Reogramele pentru hidrogelurile acide cu: B –
0; D – 1,82; E – 4,55; F – 9,09% DGCH
Introducând 1,82% DGCH viscozităţile
cresc uşor la viteze mici, deci colagenul este slab
reticulat cu dicationi CH. Vitezele mai mari de
10,2 s-1 destructurează hidrogelul. Mărind
cantitatea de DGCH reogramele se situează mai
jos. Deci mărirea cantităţii de DGCH scade
Tabelul 5.10. Parametrii reologici pentru hidrogelurile
de colagen acide martor şi cu DGCH
Concentraţie DGCH,
%/parametru reologic
τo, Pa
K, Pa.sn
n
0
1,82
4,55
9,09
0,986
0,982
0,921
0,959
27,582
28,411
26,644
25,704
0,272
0,263
0,273
0,276
viscozităţile, ponderea reticulării fibrilelor cu dicationi crescând cu concentraţia sa şi reticularea prin
legături de hidrogen scăzând; legăturile de hidrogen asigură consistenţa hidrogelurilor de colagen. [56,57]
DGCH afectează similar şi viscozităţile dinamice – la început cresc, apoi scad. Hidrogelul cu
1,82% este cel mai viscos, urmat de martor şi de cel cu 4,55%. Parametrii reologici s-au calculat cu ecuaţia
Herschel-Bulkley (tabelul 5.10).
Din valorile obţinute se constată că DGCH nu afectează tensiunea limită de curgere, dar reduce
puţin indicii de curgere cu creşterea concentraţiei. [56, 57] Deci hidrogelul devine uşor discontinuu pe
măsură ce creşte concentraţia DGCH.
5.4.4. Caracterizarea prin comportare reologică dinamică
În figura 5.33 sunt reprezentate dependenţele G’ şi G” de frecvenţa aplicată pentru hidrogelurile
acide care conţin DGCH şi pentru hidrogelul martor. [56, 57]
Pentru toate hidrogelurile valorile modulilor cresc cu frecvenţa şi scad la mărirea concentraţiei
DGCH. Valorile G’ sunt de 2,5-2,9 ori mai mari decât G’’, deci atât martorul cât şi hidrogelurile cu DGCH
sunt predominant elastice.
Diferenţierea curbelor G’ pentru cantităţi utilizate de DGCH este o dovadă a reticulării slabea
colagenului cu dicationii clorhexidinei, interacţiuni evidenţiate şi prin celelalte metode.
Viscozităţile la frecvenţă minimă (0,5 s-1) şi maximă (140 s-1) sunt date în tabelul 5.11.
La frecvenţa cea mai mică DGCH produce mai întâi scăderea uşoară a viscozităţii hidrogelului,
apoi o mărire slabă. La frecvenţa maximă valorile sunt apropiate şi mai mici decât valoarea pentru martor.
0 20 40 60 80 100 120 140
50
100
150
200
250
300
G''
G'
G',
G''
, P
a
, s-1
Figura 5.33. Dependenţele G’ şi G”de frecvenţă pentru
hidrogeluri acide: – 0, ▲ – 1,82, – 4,55 şi – 9,09% DGCH
Tabelul 5.11. Viscozităţile hidrogelurilor
martor şi cu DGCH
DGCH, % Viscozitate, Pa.s = 0,5 s-1 = 140 s-1
0 12,188 0,116
1,82 10,047 0,107
4,55 11,487 0,108
9.09 11,468 0,110
5.5. Hidrogeluri cu acid tanic şi digluconat de clorhexidină
AT nu a fost utilizat ca agent de reticulare pentru hidrogelurile de colagen ce conţin DGCH.
Metabolit secundar polifenolic sintetizat de plante pentru a le apăra de microorganisme, AT are
proprietăţi antimicrobiene in vivo şi in vitro. [60]. Introdus în hidrogeluri de colagen, funcţionează ca agent
de reticulare şi antimicrobian, putând totodată să mărească activitatea compuşilor antiseptici.
Reticulând fibrilele de colagen prin forţe de natură fizică, AT poate difuza la suprafaţa rănii. Cei
doi compuşi pot interacţiona la pH 3,8 prin legături de hidrogen şi mai puţin prin forţe ionice, din cauza
numărului foarte mic de grupe carboxil existente în colagen la acest pH. Acţiunea celor două substanţe
antimicrobiene poate fi individuală sau sinergetică, iar AT poate potenţa acţiunea antimicrobiană a DGCH.
S-au preparat hidrogelurile cu AT şi DGCH cu pH 3,8 şi compoziţiile din tabelul 5. 12. [61]
Tabelul 5.12. Compoziţiile şi notarea hidrogelurilor care conţin AT şi DGCH
AT, % 5 10 15 5 10 15 5 10 15
DGCH, % 1,82 1,82 1,82 4,55 4,55 4,55 9,09 9,09 9,09
Denumire H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13
Hidrogelurile sunt mai opalescente ca cele ce conţin numai AT. Opalescenta creşte, ca şi
viscozităţile, nu numai cu concentraţia AT, ci şi cu a DGCH. La concentraţii mari ale celor două
componente omogenitatea scade, dar – păstrate la 4oC – nu suferă sinereză nici după 3 luni. Începând cu
4,55% DGCH hidrogelurile conţin bule de aer. Din cauza viscozităţii mari nu pot fi îndepărtate şi
îngreunează caracterizarea hidrogelurilor: opalescenţa – măsurătorile UV-CD, iar discontinuitatea –
afectează toate celelalte metode pentru caracterizare.
5.5.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR
Spectrele FT-IR ale hidrogelurilor cu 1,82% DGCH şi AT sunt prezentate în figura 5.36.
Figura 5.36. Spectrele FT-IR ale hidrogelurilor care conţin 1,82%
DGCH martor şi cu AT: 5%; 10% şi 15%
Foarte asemănătoare cu ale
hidrogelurilor acide care conţin numai
AT şi cu benzi practic la aceleaşi
numerele de undă, spectrele arată că
interacţiunea colagen-AT este mai
puternică decât colagen-DGCH.
Numerele de undă ale benzilor
şi diferenţelor necesare pentru
caracterizare sunt date în tabelul 5.13.
Diferenţele sunt mai mici ca
100 cm-1 pentru hidrogelurile P5 şi P6
şi 101 cm-1 pentru P7. Deci
hidrogelurile cu 1,82% DGCH şi AT
nu conţin colagen denaturat.
Aspectul spectrele hidrogelurilor H8-H10 este acelaşi cu al celor anterioare, deci interacţiunile nu
depind sensibil de cantitatea de DGCH. Benzile au aceleaşi valori , cu excepţia benzii amidă I pentru
hidrogelul cu 5% AT (P8), deplasată spre mai mari, dar nici acesta nu conţine colagen denaturat.
Tabelul 5.13-5.15. Numerele de undă ale benzilor amidă I-III, de oscilaţie a grupei CH2 şi valorile
diferenţelor dintre frecvenţele benzilor amidă I şi II obţinute pentru hidrogelurile H1 şi H5-H13
Hidrogel
Amidă I,
cm-1
Amidă II,
cm-1
Amidă III,
cm-1
CH2 oscilaţie,
cm-1 (AI - AII), cm-1
H1 1651 1556 1238 1454 95
H5 1655 1556 1240 1456 99
H6 1651 1556 1240 1454 95
H7 1657 1556 1240 1454 101
H8 1659 1556 1240 1454 103
H9 1651 1556 1240 1454 95
H10 1651 1556 1240 1454 95
H11 1657 1556 1242 1456 101
H12 1653 1556 1240 1454 97
H13 1651 1556 1240 1456 95
Pentru ultima serie benzile amidă I şi III îşi păstrează formele şi poziţiile, dar amidă II se scindează:
la 10% AT apare o bandă la 1541 cm-1, a cărei intensitate creşte cu concentraţia AT, atribuită interacţiunilor
grupelor –OH ale AT cu amină din DGCH, [63,64] ce devin sesizabile la cantităţi mai mari din ambii
compuşi. Şi banda grupei CH2 se modifică: pentru 10% AT apare un umăr slab la 1470 cm-1, mai intens
pentru 15%, care se datorează interacţiunii punţilor hexametilenice ale DGCH cu grupele hidrofobe ale AT.
Numerele de undă ale benzilor pentru hidrogelurile H1 şi H11-H13, din tabelul 5.13-5.15, arată că
diferenţa este 101 cm-1 doar pentru hidrogelul P11, dar intră în erorile experimentale. Deci nici aceste
hidrogeluri nu conţin colagen denaturat.
Spectrele FT-IR arată că la concentraţii mai mari de AT şi DGCH banda amidă II se scindează,
aparînd o nouă bandă la 1541 cm-1, şi un umăr pe banda grupei CH2 la 1470 cm-1, ceea ce indică apariţia
interacţiunilor AT-DGCH; niciun hidrogel nu conţine colagen denaturat, deci se pot utiliza ca biomateriale.
5.5.2. Caracterizarea prin spectroscopie UV-DC
Spectrele UV-DC obţinute pentru hidrogelurile cu DGCH şi AT sunt prezentate în figura 5.39-5.41.
190 200 210 220 230 240 250
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
Elip
tic
ita
te, m
grd
Lungime de unda, nm
Figura 5.39. Spectrele UV-DC pentru
hidrogelurile H1 şi H5-H7
190 200 210 220 230 240 250
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
Elip
tic
ita
te, m
grd
Lungime de unda, nm
Figura 5.40. Spectrele UV-DC pentru
hidrogelurile H1 şi H8-H10
190 200 210 220 230 240 250
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
Elip
ticita
te, m
grd
Lungime de unda, nm
Figura 5.41. Spectrele UV-DC pentru
hidrogelurile H1 şi H11-H13
Ca şi în cazul spectrelor FT-IR, aspectele sunt asemănătoare cu ale hidrogelurilor cu AT (fig. 5.9),
dar sunt şi deosebiri. În tabelul 5.16-5.18 sunt date valorile pentru spectrele din figurile 5.39-5.41.
Tabelul 5.16-5.18. Lungimile de undă, elipticităţile picurilor, punctele de elipticitate zero
şi valorile Rpn obţinute pentru hidrogelurile H1 şi H5-H13 din tabelul 5.12.
Hidrogel
Minim Maxim Punct de
elipticitate zero
Rpn λ, nm θ, mgrd λ, nm θ, mgrd
H1 199,0 -57,7 225,0 71,7 214,8 1,03
H5 200,2 -23,4 229,4 24,3 218,2 1,04
H6 199,4 -56,1 231,2 14,7 215,8 0,26
H7 198,8 -34,8 233,0 8,1 217,2 0,23
H8 200,0 -32,6 229,6 22,8 215,2 0,70
H9 200,0 -22,2 232,6 9,6 216,8 0,43
H10 201,0 -33,0 225,0 7,9 217,6 0,24
H11 201,0 -21,0 230,6 9,9 221,6 0,47
H12 200,6 -21,6 234,0 5,8 220,0 0,27
H13 199,8 -34,5 228,6 3,7 217,2 0,11
Pentru 1,82% DGCH diferenţe faţă de hidrogelurile cu AT apar începând cu 10% AT: pentru
minim, lărgimea şi elipticitatea sa se apropie mult de ale martorului; maximul este mai slab conturat, mai
apropiat de al hidrogelului cu 10% AT şi elipticitatea aproape dublă; punctele de elipticitate zero sunt
apropiate, iar Rpn este 1/2 din cel pentru hidrogelul cu AT, datorită măririi intensităţii minimului. Acestea
se datorează măriri turbidităţii şi uşoarei separări de faze. La 15% AT intensităţile minimului şi maximului
scad, dar valorile Rpn rămân foarte apropiate. Când concentraţia DGCH s-a mărit la 4,55% s-au obţinut
spectrele din figura 5.40: lungimile de undă ale minimelor sunt foarte apropiate de ale martorului, dar
înălţimile sunt diferite, iar minimul are cea mai mare intensitate pentru hidrogelul cu 15% AT. Maximele se
deplasează spre mai mari cu creşterea concentraţiei AT, cu excepţia celui cu 15% AT, care revine la
valoarea pentru martor; înălţimile scad continuu. Punctele de elipticitate zero cresc cu concentraţia AT şi
valorile Rpn scad. Scăderea intensităţii ambelor benzi, a valorii Rpn şi deplasarea spre roşu a punctului de
elipticitate zero sunt considerate dovezi de denaturare parţială a helixului triplu. [53, 54] Responsabile de
modificări sunt însă opalescenţa, uşoara separare de faze şi bulele de aer şi nu denaturarea parţială.
Considerând criteriul propus anterior, se poate afirma că acestea nu conţin colagen denaturat.
Spectrele din figura 5.41 sunt foarte apropiate pentru 5 şi 10% AT; pentru 15% maximul este foarte
aplatisat. Valorile din tabel arată că diferenţele dintre minime sunt nesemnificative pentru 5 şi 10% AT, dar
pentru maxime este mai mare pentru hidrogelul cu 10% AT şi intensitatea sa de 1,7 ori mai mică decât a
celui cu 5%. Punctele de elipticitate zero sunt apropiate şi Rpn scade cu mărirea cantităţii de AT.
Dacă se acceptă criteriul propus în subparagr. 5.3.2 pentru dovedirea existenţei conformaţiei native,
se poate afirma că niciun hidrogel nu conţin colagen denaturat, aşa cum arată şi spectrele FT-IR.
5.5.3. Caracterizarea prin comportare reologică staţionară
Hidrogelurile cu 1,82% DGCH şi cele trei cantităţi de AT sunt mai opace şi mai neomogene decât
cele ce conţin numai AT. Cel mai transparent şi omogen este cel cu 5% AT, foarte asemănător ca aspect cu
martorul. Viscozitatea în stare de repaus a hidrogelului pare a se mări mult cu creşterea cantităţii de AT.
Reogramele obţinute la prima mărire a vitezelor de forfecare pentru hidrogelurile martor şi H5-H7
în intervalul 0-100 s-1, în care destructurarea nu este semnificativă, sunt prezentate în figura 5.42.
Figura arată că: [61] reticularea cu AT măreşte viscozităţile; valorile o sunt mici; la viteze mici se
comportă ideal plastic, apoi pseudoplastic; structura începe să se distrugă la 10 s-1 şi încetează la 20 s-1.
0 20 40 60 80 100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
H1
H5
H6
H7
, P
a
, s-1
.
Figura 5.42. Reogramele hidrogelurilor H1 şi H5-H7
obţinute la mărirea vitezelor de forfecare
Liniarizarea viscozităţilor dinamice conduce la
două drepte pentru fiecare hidrogel, ce se intersectează
la 10 s-1. Valorile 0 obţinute sunt date în tabelul 5.19.
Viscozităţile hidrogelurilor cu DGCH şi AT
sunt mai mari decât pentru martor, dar mai mici decât
pentru cele cu AT, datorită interacţiunii AT-DGCH, şi
cresc cu procentul de AT; 15% AT nu mai este exces.
Reogramele de la reducrea vitezelor de forfecare
arată că hidrogelul cu 1,82% DGCH şi 5% AT – cel mai
omogen – se restructurează cel mai rapid, urmat de cel
cu 10%. Viscozităţile sunt mai mici decât cele obţinute
la mărire şi scad cu concentraţia AT: hidrogelurile mai
reticulate necesită mai mult timp pentru restructurare.
Indicii de curgere variază invers cu viscozităţile.
Tabelul 5.19-5.21. Viscozităţile dinamice şi indicii de curgere pentru hidrogelurile
H1 şi H5-H13obţinute la mărirea şi micşorarea vitezelor de forfecare
Hidrogel
Mărire viteze forfecare Micşorare viteze forfecare Hidrogelurile cu 4,55% DGCH
se aseamănă cu cele din seria cu 1,82%,
dar în stare de repaus par mai viscoase şi
conţin bule de aer. Reogramele arată că
cel cu 10% AT este cel mai viscos, urmat
de H8 (5% AT), dar la viteze de forfecare
peste 20 s-1 viscozităţile devin apropiate.
Liniarizarea arată existenţa tot a
câte două drepte pentru fiecare hidrogel,
ce se intersectează la aceeaşi viteză de
forfecare – 10 s-1. Viscozităţile dinamice
0 , Pa.s n 0 , Pa.s n
H1 9,80 0,43 3,80 0,46
H5 10,14 0,63 7,55 0,40
H6 15,21 0,48 4,45 0,46
H7 20,72 0,30 3,89 0,47
H8 15,51 0,47 8,02 0,39
H9 16,66 0,55 7,91 0,39
H10 11,93 0,49 1,64 0,62
H11 21,17 0,28 6,62 0,41
H12 14,85 0,42 5,07 0,41
H13 9,11 0,70 3,82 0,51
(tabelul 5.19-5.21) sunt mai mici decât ale celor cu 1,82% la toate procentele de AT, din cauza consumării
unei părţi mai mari de AT şi deci reducerii reticulării. Acestea cresc pentru 5 şi 10% AT, dar scad pentru
15%, din cauza cantităţii mai mari de asociate AT-DGCH cu viscozitate mai mică, ce se interpun între
fibrile. Ipoteza este susţinută de valorile apropiate ale viscozităţilor celorlalte hidrogeluri.
În tabel sunt daţi indicii de curgere; aceştia scad cu mărirea concentraţiei AT.
La micşorarea vitezelor de forfecare hidrogelurile cu 5 şi 10% AT se restructurează cel mai
puternic; cel cu 15% AT îşi reface structura mai slab decât martorul, datorită numărului mai mare de
associate AT-DGCH.
Viscozităţile dinamice (tabelul 5.19-5.21) sunt de 2 până la 7,5 ori mai mici decât cele obţinute la
mărirea vitezelor de forfecare. Valoarea mică pentru hidrogelul P10 este susţinută şi de valoarea mai mare a
indicelui de curgere din acelaşi tabel, care arată că hidrogelul care conţine 15% AT curge cel mai uşor.
Hidrogelurile cu 9,09% are DGCH au cea mai mare opalescenţă, sunt cele mai puţin omogene, par
cele mai viscoase în stare de repaus şi conţin cele mai multe şi mai mari bule de aer.
La tensiunea de forfecare minimă valorile * cresc în ordinea: H13 < H12 < H11; relaţia continuă
până la cca 10 s-1. Peste această valoare H13 devine mai viscos, iar valorile celorlalte devin apropiate.
Explicaţia constă în orientarea asociatelor AT-DGCH în direcţia tensiunii, care favorizează interacţiunea
dintre fibrile. La aceasta se adaugă contribuţia bulelor de aer: la viteze mici, când viscozităţile sunt mari,
bulele nu pot părăsi spaţiul dintre cilindrii senzorului, dar la viteze mari o parte ies pe măsură ce scade
viscozitatea. Tabelul 5.19-5.21 arată că H13 are cea mai mică viscozitate iar H11 cea mai mare.
La 9,09% DGCH cel mai mult se refac hidrogelurile cu 5 şi 15% DGCH şi cel mai slab cel cu 10%.
Comportarea reologică staţionară sugerează deci formarea de asociate AT-DGCH la concentraţii
mari de antiseptice, mai puţin viscoase decât restul hidrogelului, care creează aspectrul de neomogenitate.
5.5.4. Caracterizarea prin comportare reologică dinamică
Dependenţele G’ şi G” de frecvenţele unghiulare sunt date în figurile 5.51-5.53.
1 10 100 1000
10
100
G' H1
G" H1
G' H5
G" H5
G' H6
G" H6
G' H7
G" H7
G',
G",
Pa
, rad/s
Figura 5.51. Dependenţele G’ şi G” de
pentru hidrogelurile H1 şi H5-H7
1 10 100 1000
10
100
G' H1
G" H1
G' H8
G" H8
G' H9
G" H9
G' H10
G" H10
G',
G",
Pa
, rad/s
Figura 5.52. Dependenţele G’ şi G” de
pentru hidrogelurile H1 şi H8-H10
1 10 100 1000
10
100
G' H1
G" H1
G' H11
G" H11
G' H12
G" H12
G' H13
G" H13
G',
G",
Pa
rad/s
Figura 5.53. Dependenţele G’ şi G” de
pentru hidrogelurile H1 şi H11-H13
Comparând cu datele pentru hidrogelurile cu AT, se constată asemănări şi deosebiri.
Asemănări: G’ pentru hidrogelurile cu AT sunt mai mari decât pentru martor; toate valorile G’
sunt puţin mai mari decât G” pe întregul domeniu ; ambii moduli cresc practic liniar cu ; diferenţele
dintre valorile modulilor la o fvaloare dată sunt cu atât mai mari cu cât cantitatea de AT este mai ridicată;
dreptele ce dau dependenţele G’ sunt practic paralele cu cele pentru G” pentru fiecare hidrogel, cum este de
aşteptat pentru sisteme reticulate, cu excepţia martorului, pentru care valorile devin apropiate la mai mici.
Deosebiri: hidrogelul cu 15% AT are cele mai mari valori G’ şi G”, şi nu cel cu 10% ca în cazul
absenţei DGCH (o parte din AT este consumat de DGCH şi acesta nu mai este în exces faţă de cantitatea
necesară reticulării); hidrogelul cu 10% AT curge mai uşor chiar decât cel iniţial, în special la ce
depăşesc 100 rad/s. Deci cantitatea optimă de agent de reticulare este în acest caz 15%.
Mărind cantitatea de DGCH la 4,55% se obţin pentru G’ şi G’’ dependenţele de concentraţia AT şi
de din figura 5.52. Valorile sunt puţin mai mari decât pentru seria anterioară, dreptele ce dau variaţia G’
şi G’’ cu rămân paralele pentru fiecare hidrogel, iar cele cu 10 şi 15% AT sunt apropiate, deci şi DGCH
contribuie la reticulare. La 4,55% DGCH reticularea este optimă atât pentru cantitatea de 10 cât şi 15% AT.
Cantitatea maximă de DGCH conduce la variaţiile modulilor cu frecvenţa din figura 5.53. Cel mai
elastic este hidrogelul cu 9,09% DGCH şi 15% AT (H13); cele cu 5 şi 10% AT au valori mai mici şi
apropiate ale elasticităţii. Pentru hidrogelurile cu 5 şi 10% AT dreptele ce dau dependenţele modulilor de
rămân practic paralele, iar pentru cel cu 15% paralelismul dispare, probabil din cauza cantităţii mai mari de
aglomerate AT-DGCH din acest hidrogel, evidenţiată şi prin comportare reologică staţionară.
Dependenţele viscozităţilor de pentru fiecare serie de hidrogeluri sunt strict liniare, iar acestea
scad cu mărirea practic la fel în fiecare serie. Valorile obţinute prin extrapolare la 1 rad/s din tabelul 5.22
variază în serii ca în cazul celor obţinute din măsurători staţionare: cresc cu mărirea cantităţii de AT, dar
sunt mult mai mari decât decât cele obţinute din măsurători staţionare, hidrogelurile ne fiind destructurate.
Tabelul 5.22. Viscozităţile dinamice ale hidrogelurilor H5-H13 la frecvenţa unghiulară de 1 rad/s
Proba H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13
η, Pa.s 41,6 43,4 58,2 41,0 81,2 66,7 66,0 76,9 58,6
Creşterea cantităţii de DGCH măreşte valorile viscozităţilor hidrogelurilor cu acelaşi conţinut de
AT, cu excepţia celui cu 15%, pentru care întâi creşte, apoi scade pentru 9,09%, din cauza numărului mare
de asociate AT-DGCH, care împiedică reticularea cu AT şi, fiind mai puţin viscoase, reduc viscozitatea.
B i b l i o g r a f i e
1. „The American Heritage Dictionary of the English Language”, ed. A 4-a, updatată în 2009, Houghton Mifflin Company.
2. “Collins English Dictionary” ed. 6-a completată şi neprescurtată, Harper Collins Publishers, 2003.
3. N.A. Peppas şi A.G. Mikos, Preparation methods and structure of hydrogels, în “Hydrogels in Medicine and Pharmacy”, ed. N.
A. Peppas, vol. 1, CRC Press, Boca Raton, 1986.
4. L. Brannon-Peppas, Preparation and characterization of crosslinked hydrophilic networks, în “Absorbent Polymer
Technology”, ed. L. Brannon-Peppas şi R.S. Harland, Elsevier, Amsterdam, 1990.
5. N.A. Peppas, P. Bures, W. Leobandung şi H. Ichikawa, Hydrogels in pharmaceutical formulations, Eur. J. Pharm. Biopharm.
50, 27-46, 2000.
8. B.D. Ratner şi A.S. Hoffman, Synthetic hydrogels for biomedical applications, în “Hydrogels for Medical and Related
Applications”, ed. J.D. Andrade, ACS Symposium Series, No. 31, American Chemical Society, Washington, DC, 1976, 1-36.
9. N.A. Peppas şi R. Langer, New challenges in biomaterials, Science 263, 1715-1720, 1994.
10. K. Park, “Controlled Release: Challenges and Strategies”, American Chemical Society, Washington, 1997.
11. N.A. Peppas, Hydrogels and drug delivery, Curr. Opin. Coll. Int. Sci. 2, 531-537, 1997.
13. E.A. Abou Neel, U. Cheema, J.C. Knowles, R.A. Brown şi S.N. Nazhat, Use of multiple unconfined compression for control
of collagen gel scaffold density and mechanical properties, Soft Matter 2, 986–992, 2006.
14. V. Charulatha şi A. Rajaram, Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes,
Biomaterials 24, 759-769, 2003.
16. A. Jayakrishnan şi S.R. Jameela, Glutaraldehyde as a fixative in bioprosthetic and drug delivery matrices, Biomater., 17, 471-
84, 1996.
17. H.M. Powell şi S.T. Boyce, EDC cross-linking improves skin substitute strength and stability, Biomater., 27, 5821–5827,
2006.
18. H.M. Powell şi S.T. Boyce, Wound closure with EDC cross-linked cultured skin substitutes grafted to athymic mice,
Biomater. 28, 1084–1092, 2007.
19. W.M. Elbjeirami, E.O. Yonter, B.C. Starcher şi J.L. West, Enhancing mechanical properties of tissue-engineered constructs
via lysyl oxidase crosslinking activity, J. Biomed. Mater. Res. 66A, 513-521, 2003.
20. W. Friess, Collagen – biomaterial for drug delivery, Eur. J. Pharm. Biopharm. 45, 113-361, 1998.
23. M.L. Tiffany şi S. Krimm, The effect of temperature on the circular dichroism spectra of polypeptides in the extended state,
Biopolymers 11, 2309-2316, 1972.
24. M.G. Venugopal, J.A.M. Ramshaw, E. Braswell, D. Zhu şi B. Brodsky, Electrostatic interactions in collagen-like triple-helical
peptides, Biochem. 33, 7948-7956, 1994.
25. Y. Feng, G. Melacini, J.P. Taulane şi M. Goodman, Acetyl-terminated and template-assembled collagen-based polypeptides
composed of Gly-Pro-Hyp sequences. 2. Synthesis and conformational analysis by circular dichroism, ultraviolet absorbance,
and optical rotation, J. Am. Chem. Soc. 118, 10351-10358, 1996.
26. U. Freudenberg, S.H. Behrens, P.B. Welzel, M. Muller, M. Grimmer, K. Salchert, T. Taeger, K. Schmidt, W. Pompe şi C.
Werner, Electrostatic interactions modulate the conformation of collagen I, Biophys. J. 92, 2108-2119, 2007.
27. M. Leca, V. Trandafir şi M.G. Albu, Preparation and characterization of some collagen gels and matricers, „Ovidius” Annals
of Medicine Sci. – Pharmacy 1, 84-92, 2003.
28. M.G. Albu şi M. Leca, Rheological behaviour of some cross-linked collagen hydrogels for drug delivery use, European Cells
& Materials, 10, 8, 2005.
29. H. A. “A handbook of elementary rheology”, Institute of Non−Newtonian Fluid Mechanics, University of Wales, 2000.
30. J. A. M. Ramshaw, N. K. Shas şi B. Brodsky, Gly-X-Y tripeptide frequencies in collagen: a contest of host-guest triple-helical
peptides, J. Struct. Biol. 122, 86-91, 1998.
34. K. Kar, P. Amin, M. A. Bryan, A. V. Persikov, A. Mosh, Y.-H. Wang şi B. Brodsky, Self-association of collagen triple helix
peptides into higher order structures, J. Biol. Chem. 281, 33283-33290, 2006.
35. IUPAC, Compendium of Chemical Terminology, Internet ed., http://goldbook.iupac.org/ T06282 html
36. G. N. Ramachandran, Structure of collagen, Nature 174, 269-270, 1954.
37. A. Rich şi F. H. Crick, Nature 176, 915–916, 1955.
38. P. M. Cowan, S. McGavin şi A. C. North, Nature 176, 1062-1064, 1955.
39. A. Rich şi F. H. Crick, The molecular structure of collagen, J. Mol. Biol. 3, 483-506, 1955.
40. G. N. Ramachandran, Structure of collagen at the molecular level, în “Treatise on collagen” vol. 1, “Chemistry of collagen”, ed.
G. N. Ramachandran, Academis Press, London, 1967.
42. C. Petibois, G. Gouspillou, K, Wehbe, J-P. Delage şi G. Deleris, Analysis of type I and IV collagens by FT-IR spectroscopy and
imaging for a molecular investigation of skeletal muscle connective tissue, Anal. Bioanal. Chem. 386, 1961-1966, 2006.
43. C. Palpandi, P. Ramasamy, T. Rajinikanth, S. Vairamani and A. Shanmugam, Extraction of Collagen from Mangrove
Archeaogastropod Nerita (Dostia) crepidularia Lamarck, 1822, Am-Euras. J. Sci. Res. 5, 23-30, 2010.
44. N.F. Mohd Nasir, M.G. Raha, N.A. Kadri, S.I. Sahidan, M.Rampado and C.A Azlan, The Study of Morphological Structure,
Phase Structure and Molecular Structure of Collagen- PEO 600K Blends for Tissue Engineering Application, Amer. J.
Biochem. Biotechnol. 2, 175-179, 2006.
47. A. Barth, Infrared spectroscopy of proteins, Biochim. Biophys. Acta 1767, 1073-1101, 2007.
48. Z. Garcia, H. Naik, R., Collighan, M. Griffin, J. C. R. Cabello şi A. Pandit, In-vitro characterization of an enzymatically cross-
linked collagen-elastin like polymer scaffold, 8th World Biomaterials Congress, Amsterdam, May 28 – June 1, 2008.
49. K. Belbachir, R. Noreen, G. Gouspillou, C. Petibois, Collagen types analysis and differentiation by FTIR spectroscopy. Anal.
Bioanal. Chem. 395, 829-837, 2009.
53. E. M. Brown, R. L. Dudley, A. R. Elsetinow, A conformational study of collagen as affected by tanning procedures, J. Amer.
Leather Chem. 92, 225-233, 1992.
54. D. Jenness, C. Sprecher şi W. C. Johnson Jr., Circular dichroism of collagen, gelatin and poly(proline) II in the vacuum
ultraviolet, Biopolymers 15, 513-521, 1976.
56. D. Şulea, M. V. Ghica, M. Micutz, M. G. Albu, L. Brăzdaru, T. Staicu, M. Leca şi L. Popa, Characterization an in vitro release
of chlorhexidine digluconate comprised in type I collagen hydrogel, Rev. Roum. Chim. 55, 543-551, 2010.
57. M. Leca, D. Şulea, M. V. Ghica, M. Micutz, M. G. Albu, L. Brazdaru, T. Staicu şi L. Popa, Collagen hydrogels containing
chlorhexidine digluconate: Characterization and in vitro drug release, Proc. 3rd Int. Conf. ICAMS 2010, September 16-18,
Bucharest, 205-210.
58. DGCH pH “Basic and Clinical Pharmacology”, Miscellaneous Antimicrobial Agents; Disinfectants, Antiseptics, & Sterilants,
cap. 50, McGraw-Hill Comp., http://basic-clinical-pharmacology.net/chapter50.htm
59. http://www.burmester-pharma.de/deutsch/analyse_datenblatt/a1929.pdf
60. M. Murphy Cowan, Plant Products as Antimicrobial Agents, Clin. Microbiol. Rev. 12, 564-582, 1999.
61. S. K. Filoche, K. Soma şi C. H. Sissons, Antimicrobial effects of essential oils in combination with chlorhexidine digluconate,
Oral Microbiol. Immunol. 20, 221-225, 2005.
62. A. Albert şi E.P. Sargeant, ”Ionization Constants of Acids and Bases”, Methuen, London, 1962.
63. L. Brazdaru, M. Leca, M. Micutz, M. G. Albu şi T. Staicu, Stationary and dynamic Rheological behaviour of some collagen
hydrogels for wound management containing mixtures of chlorhexidine digluconate and tannic acid, Proc. 4th Int. Conf.
ICAMS 2012, September 27-29, Bucharest, 237-242.
64. L. Brăzdaru, M. Micutz, T. Staicu, M. Albu, D. Şulea, M. Leca, Structural and rheological properties of collagen hydrogels
containing tannic acid and chlorhexidine digluconate intended for wound dressings, C. R. Chim., doi:
10.1016/j.crci.2014.07.007
6. CARACTERIZAREA MATRICILOR POROASE CE CONŢIN ACID TANIC,
DIGLCONAT DE CLORHEXIDINĂ SAU AMESTECURI ALE ACESTORA
Matricile de colagen au aplicaţii multiple în medicină: suport/schelet/eşafodaj (scaffold) în ingineria
ţesuturilor, [6] hemostatic şi material de protecţie pentru răni şi noul ţesut ce se formează, [6, 7] sisteme de
înglobare şi de eliberare a celulelor, proteinelor, acizilor nucleici şi medicamentelor. [8-11]
6.1. Matrici cu acid tanic
6.1.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR
Spectrele pentru matricile martor şi cu 5, 10 respectiv 15% AT sunt date în figura 6.1.
1000200030004000
Wavenumbers
0.0
0.2
0.4
0.6
Ab
sorb
ance
L-4.jws: SubFile 1
Figura 6.1. Spectrele FT-IR ale matricilor care conţin: M1 – 0;
M2 – 5; M3 – 10 şi M4 – 15% AT
Spectrul FT-IR al martorului
conţine benzile colagenului, [18] cu
excepţia umărului de la 2920 cm-1
(amidă B), [20] care este suprapus cu
un alt umăr la 2957 cm-1.
Valorile şi diferenţele (AI -
AII) sunt date în tabelul 6.1.
În matricea martor vlorile
pentru amidă I şi II sunt puţin mai
mici decât în hidrogel, dar celelalte
rămân aceleaşi. Din banda complexă
amidă III, în spectrul martorului se
observă: 1338 cm-1 – foarte slabă,
1277 cm-1 – umăr, 1237 şi 1203 cm-1
– umăr, în
concordanţă cu literatura. [22-24] Valoarea (AI - AII) este 84 cm-1, deci nu conţine colagen denaturat.
Figura 6.1 relevă că AT produce următoarele modificări: (a) Intensităţile benzilor amidă A scad,
datorită legării AT de colagen şi reducerii numărului de legături de hidrogen dintre fibrile. (b) Subbenzile Tabelul 6.1. Numerele de undă ale benzilor amidă A, amidă I-III, de oscilaţie a grupei CH2 şi diferenţele
(AI - AII) obţinute pentru matricile cu concentraţiile specificate de AT
AT, % Amidă A,
cm-1
Amidă I, cm-
1
Amidă II,
cm-1
Amidă III,
cm-1
CH2 oscilaţie,
cm-1 (AI - AII), cm-1
0 3301 1629 1545 1237 1451 84
5 3292 1630 1542 1235 1448 88
10 3291 1630 1539 1232 1447 91
15 3291 1631 1539 1231 1447 92
din banda amidă III apar la 1336-1332, 1278-1276, 1235-1231 şi 1202-1200 cm-1, iar intensităţile se
modifică cu creşterea concentraţiei AT: 1335 cm-1 îşi măreşte uşor intensitatea, dar sunt identice pentru 10
şi 15%; intensitatea umărului martorului de la 1277 cm-1 scade şi nu se mai observă pentru matricea cu 15%
AT. Banda martorului de la 1237 cm-1 se deplasează spre mai mici, dar îşi păstrează înălţimea.
Intensitatea umărului de la 1203 cm-1 se măreşte: pentru 5% AT devine bandă, la 10% intensitate este
comparabilă cu a celei de la 1237 cm-1, iar la 15% este mai intensă. Transformarea umărului de la 1200 cm-1
în bandă şi creşterea intensităţii sale se datorează reticulării, accentuată de cantitatea de AT. (c) Intensităţile
benzilor martorului de la 1080 şi 1031 cm-1 se modifică cu creşterea concentraţiei AT: a doua, mai puţin
intensă, devine mai intensă în prezenţa AT, pentru 10 şi 15% AT fiind mai intensă ca prima. Diferenţele
(AI - AII) cresc cu concentraţia AT, dar rămân sub 100 cm-1.
Deplasările uşoare ale benzilor amidă A, II şi III spre numere de undă mai mici, cresterea intensităţii
benzii de la 1200 cm-1 din banda complexă amidă III şi scăderea intensităţii benzii amidă I la introducerea
AT se pot asocia cu reticularea colagenului cu AT prin asemenea forţe.
6.1.2. Caracterizarea prin SEM
SEM, evidenţiind aglomerarea fibrilelor şi modificarea dimensiunilor porilor matricilor, permite
urmărirea extinderii reticulării. Imaginile SEM pentru matricile martor şi cu AT sunt date în figurile 6.3a-d.
a – 100X
b – 200x
c – 100x
d – 100x
Figura 6.3. Imaginile SEM 100x ale matricilor: a – martor şi cu b – 5%; c – 10%; d – 15% AT
Figura 6.3a arată matrice lamelară pentru martor şi pori alungiţi interconectaţi prin fibre şi fibrile de
colagen cu grosimi de cca 0,3-8,0 µm. Lungimile sunt de 100-500 µm, iar lăţimile la 50-150 µm.
Matricea obţinută din hidrogelul cu 5% AT nu mai are structură lamelară (figura 6.3b), porii sunt
inelari şi turtiţi, cu dimensiuni de 40-220 µm, predominând cei mari. Diferenţa de morfologie se datorează
viscozităţii mai mari a hidrogelului cu AT, care conduce la formarea de cristale de gheaţă mai mari.
Dublarea concentraţiei AT face ca porii inelari să fie mai bine conturaţi, cu dimensiunile alungite
de 350-500 µm şi cele mici de 100-250 µm şi porţiuni compacte mari de colagen, datorate reticulării cu AT.
Aspectul matricilor cu 15% AT este foarte neomogen, cu pori mici (figura 6.3d) şi regiuni
compacte, determinate de reticularea mai avansată.
6.1.3. Caracterizarea prin absorbţia apei
Capacitatea remarcabilă a matricilor de colagen de a reţine mediu apos este dată de numărul mare
de grupe hidrofile: amidă, carboxil şi hidroxil. [30] Îmbibarea în medii apoase este foarte importantă pentru
utilizarea ca pansamente, asigurând hidratarea suprafeţei ţesutului şi cedarea medicamentului. Îmbibarea cu
fluide biologice este prima etapă, obligatorie, în degradarea matricii.
Rezultatele pentru absorbţia apei, exprimate ca raport între masa apei absorbite şi masa iniţială a
matricii (g/g), sunt prezentate în figura 6.5 pentru matricile M1-M4, cu un detaliu în interiorul figurii pentru
absorbţia la timpi mici. [18]
Cele mai mari cantităţi de apă sunt absorbite de matricea martor (curba B). Aceasta absoarbe foarte
mult în primele cca 70 min, devenind din ce în ce mai gelatinoasă, cantitatea scade între 70 şi 100 min, iar
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0
20
40
60
80
100
120
B
C
D
E
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340
0
20
40
60
80
100
120
Ab
so
rbtie
ap
a,
g/g
Timp, min
Ab
so
rbtie
ap
a, g
/g
Timp, min
Figura 6.5. Cantităţile de apă absorbite în timp de 24 h de
matricile care conţin AT: B – 0; C – 5; D – 10; E – 15%
la 120 min matricea îşi pierde integritatea.
Pentru matricea din hidrogelul cu 5%
AT absorbţia apei este mult mai redusă.
Aceasta – fiind reticulată, nu-şi mai pierde
integritatea, ci se transformă într-o masă
gelatinoasă voluminoasă continuă. Mai
accentuată în primele cca 200 min, absorbţia
scade treptat.
Mărind cantitatea de AT la 10%
absorbţia scade mai mult şi peste 100 min
diferenţa faţă de matricea de referinţă devine
semnificativă.
Curba pentru matricea cu 15% AT
este foarte apropiată de cea anterioară,
sugerând grade de reticulare apropiate şi
demonstrând că 10% AT este suficient pentru
reticularea colagenului.
6.1.4. Caracterizarea prin digestie cu colagenază
Colagenaza, enzima cea mai utilizată pentru digestia colagenului in vitro, [34] scindează lanţurile,
lăsând intacte legăturile intermoleculare. De aceea se utilizează pentru evaluarea gradului de reticulare.
Matricile cu AT servesc drept probe martor pentru pentru cele care conţin AT şi DGCH. Digestia s-
a efectuat în condiţii fiziologice – în soluţie tampon fosfat salină cu pH 7,4 şi la temperaura de 37oC. [18]
Matricile în care AT este absent dispar în cca 30 min, iar soluţia în care se face digestia rămâne
clară. Dacă conţin 5% AT matricile îşi păstrează integritatea şi forma timp de cca 240 min, apoi se
dezintegrează în fragmente puternic îmbibate. Soluţia în care se face digestia nu mai este foarte clară, ci
slab colorată în galben-verzui. Dublând cantitatea de AT matricile rămân întregi timp de 24 h, fragmentele
formate prin dezintegrare ulterioară sunt mai mari decât cele rezultate în urma dezintegrării celor reticulate
cu 5% AT, iar turbiditatea şi culoarea solţiei în care se face digestia se intensifică puţin. Pentru 15%AT
rezistenţa este de 9 zile, ultima zi de observaţie. Probele îşi păstrează forma, dar au volum mult mărit. [18]
6.2. Matrici cu digluconat de clorhexidină
6.2.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR
Spectrele FT-IR ale matricilor martor şi ale celor cu DGCH obţinute din hidrogelurile cu ambele
pH-uri, ultimele în absenţa şi prezenţa AG, sunt prezentate în figura 6.6. [16]
Figura 6.6.
Spectrele FT-IR
ale matricilor din
hidrogelurile:
acide cu 0, 1,82,
4,55 şi 9,09%
DGCH; slab
bazice cu 0,
1,82, 4,55 şi
9,09% DGCH;
slab bazice şi
0,15% GA cu 0,
1,82, 4,55 şi
9,09% DGCH
Spectrele sunt grupate în două categorii: cu benzi intense pentru matricile rezultate din hidrogeluri
acide şi foarte slabe şi apropiate pentru cele obţinute din hidrogeluri slab bazice.
Matricile obţinute din hidrogeluri acide, discutate în continuare, au intensităţile benzilor amidă I şi
II foarte apropiate, dar diferite pentru amidă III. Valorile caracteristicilor spectrelor sunt date în tabelul 6.2.
Tabelul 6.2. Frecvenţele benzilor amidă I-III, A şi de oscilaţie a grupei metilen, rapoartele AIII/A1450
şi AI/AA şi diferenţele (AI - AII) pentru matricile martor şi cu DGCH
DGCH,
%
Amidă
A, cm-1
Amidă I,
cm-1
Amidă II,
cm-1
Amidă
III, cm-1
Oscilaţie
CH2, cm-1
AIII/A1450
AI/AA (AI - AII), cm-1
pH 3,8
0 3293 1639 1542 1234 1446 1.98 1,27 97
1,82 3300 1637 1543 1238 1450 2.00 1,37 94
4,55 3298 1639 1542 1234 1446 2.08 1,36 97
9,09 3298 1637 1543 1238 1450 2.15 1,37 94
Tabelul demonstrează că DGCH nu modifică poziţiile benzilor colagenului, dar măreşete rapoartele
AIII/A1450, deci stabilizează helixurile. Rapoartele AI/AA, măsură a reticulării, cresc cu concentraţia DGCH,
datorită reticulării colagenului cu dicationi CH şi formării de microzone reticulate prin forţe mai slabe.
Scăderea intensităţii benzii amidă I se poate datora creşterii uşoare a interacţiunilor prin legături de
hidrogen în colagen, deci reticulării sale slabe, dovedită şi de mărirea uşoară a rapoartelor AI/AA.
7.2.2. Caracterizarea prin SEM
Imaginile SEM obţinute pentru matricea rezultată din hidrogelul acid martor, precum şi pentru cele
care conţin 1,83 şi 4,55% DGCH sunt prezentate în figura 6.7a-c. [16]
a
b
c
Figura 6.7. Imaginile SEM 200x ale matricilor obţinute din hidrogeluri acide: a – martor;
b – cu 1,82 % DGCH; c – cu 4,55% DGCH
Introducerea cantităţii minime de DGCH dă imaginea SEM din figura 6.7b: matricile rămân
lamelare, cu lamele mai groase decât pentru martor, şi distanţe mai mici, rezultând pori mai mici.
Îngroşarea lamelelor se datorează reticulării colagenului cu dicationi CH. 4,55% DGCH modifică şi mai
mult morfologia (figura 6.7c): lamelele se apropie mai mult, predominând cele subţiri şi porii mici.
6.3. Matrici cu acid tanic şi digluconat de clorhexidină
6.3.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR Spectrele matricilor cu AT şi DGCH sunt prezentate şi discutate la concentraţii constante de
DGCH. Figura 6.11 prezintă spectrele matricilor M5-M7, cu 1,82% DGCH şi cele trei cantităţi de AT. [18]
Numerele de undă ale benzilor amidă A, I-III, de oscilaţie a grupei CH2 şi diferenţele dintre
numerele de undă ale benzilor amidă I şi II sunt date în tabelul 6.3-6.5.
Spectrele matricilor cu 1,82% DGCH şi 5, 10 şi 15% AT sunt foarte asemănătoare cu ale matricii
M1 în intervalul de frecvenţe 4000-1400 cm-1, în care se află benzile amidă A, B, I şi II şi de oscilaţie a
grupei CH2. Uşoară scădere a intensităţilor şi deplasare slabă spre frecvenţe mai mici a benzii amidă A apar
doar pentru 10 şi 15% AT. În intervalul 1400-1200 cm-1 intensităţile se modifică, dar poziţiile rămân
aceleaşi: umărul de la 1203 cm-1 devine bandă şi intensitatea sa creşte cu cantitatea de AT, ca pentru
matricile cu AT. Comparându-le cu acestea se constată că sunt puţin mai intense, probabil din cauza
blocării unei părţi din AT cu DGCH, care reduce reticularea. Modificări ale intensităţilor benzilor cu
cantitatea de AT se observă şi în intervalul 1120-1000 cm-1, asemănătoare cu cele pentru matricile cu AT.
1000200030004000
Wavenumbers
0.0
0.2
0.4
0.6
Abs
orba
nce
L-10.jws: SubFile 1
Figura 6.11.
Spectrele FT-IR
ale matricilor cu
1,82% DGCH şi:
P1 – 0; P5 – 5;
P6 – 10 şi P7 –
15% AT
Rezultatele de mai sus demonstrează că AT interacţionează cu colagenul mai puternic decât
DGCH, iar o parte interacţionează şi cu DGCH, făcându-l astfel indisponibil pentru reticularea colagenului.
Tabelul 6.3.-6.5. Frecvenţele benzilor amidă A şi I-III, de oscilaţie a grupei CH2 şi diferenţele (AI - AII) pentru
matricile ce conţin toate combinaţiile înte cele trei cantităţi de DGCH şi AT
Matrice AT, % Amidă A,
cm-1
Amidă I,
cm-1
Amidă II,
cm-1
Amidă III,
cm-1
CH2
oscilaţie,
cm-1
(AI - AII), cm-1
M1 0 3301 1629 1545 1237 1451 84
M5 5 3294 1629 1541 1236 1448 88
M6 10 3296 1631 1539 1234 1447 92
M7 15 3292 1630 1539 1233 1447 91
M8 5 3299 1631 1538 1233 1447 93
M9 10 3299 1631 1538 1235 1448 93
M10 15 3299 1631 1537 1231 1447 94
M11 5 3306 1631 1539 1237 1449 88
M12 10 3303 1632 1539 1235 1448 92
M13 15 3297 1631 1536 1234 1447 91
Diferenţele numerelor de undă ale benzilor amidă I şi II sunt aceleaşi ca pentru matricile cu AT
(toate sub 100 cm-1), deci nici acestea nu conţin colagen denaturat.
La concentraţia de 4,55% DGCH apar, în principiu, aceleaşi modificări cu mărirea concentraţiei
AT, dar scăderile intensităţilor sunt mai pronunţate, în special când matricea conţine 10% AT – tabelul 6.3.
Diferenţele dintre numerele de undă ale benzilor amidă I şi II sunt puţin mai mari decât pentru
matricile anterioare, dar sunt inferioare valorii 100 cm-1, deci matricile nu conţin colagen denaturat.
Modificările aduse de dublarea cantităţii de DGCH sunt, în principiu, aceleaşi ca în spectrele
anterioare. Caracteristică este apropierea intensităţilor tuturor benzilor când matricile conţin 10 şi 15% AT.
Frecvenţele benzilor sunt date tot în tabelul 6.3. Diferenţele numerelor de undă ale benzilor amidă
I şi II arată că nici matricile M11-M13 nu conţin colagen denaturat.
În concluzie, în matricile de colagen care conţin toate combinaţiile dintre 5, 10 şi 15% AT şi 1,82,
4,55 şi 9,09% DGCH nu există colagen nedenaturat, deci acestea pot servi ca pansamente pentru răni.
6.3.2. Caracterizarea prin SEM
Imaginile SEM pentru matricile ce conţin 1,82% DGCH şi 5, 10 şi 15% AT sunt prezentate în
figura 6.14.a-c. Comparate cu cele care conţin doar AT, porii sunt mai mici, mai slab definiţi, mai alungiţi
şi mai neregulaţi, caracteristici care se accentuează când creşte cantitatea de AT.
Suprafeţele matricilor cu 5,05% DGCH şi AT se aseamănă cu ale celor anterioare şi există aceeaşi
tendinţă de micşorare a dimensiunilor porilor cu creşterea concentraţiei AT. Porii sunt însă mai bine
definiţi, iar compactitatea creşte mai accentuat cu conţinutul de AT. Matricile cu 10% AT şi 5,05% DGCH
au cei mai bine definiţi pori.
Cantitatea de 9,09% DGCH conduce la matricile cu imaginile din figura 5.16.
Deşi aspectul nu se modifică mult comparativ cu al matricilor anterioare, dimensiunile porilor sunt
mai neuniforme şi, la ultimele două concentraţii de AT, mai mici, din cauza reticulării mai puternice. În
toate imaginile apar regiuni cu dimensiuni mult mai mici ale porilor, datorate probabil reticulării cu DGCH,
care conduce la reţele tridimensionale mai dense, lucru evidenţiat şi prin alte măsurători.
Figura 6.14. Imaginile SEM 100 x ale matricilor care conţin 1,82% DGCH şi: a – 5, b – 10 şi c – 15% AT
a b c
Figura 6.16. Imaginile SEM 100x ale matricilor care conţin 9,09% DGCH şi: a – 5, b – 10 şi c – 15% AT
În concluzie, cel mai adecvat raport între cele două substanţe antimicrobiene din punctul de vedere
al dimensiunilor şi uniformităţii porilor matricilor este 10% AT/5,05% DGCH, concluzie desprinsă şi din
alte proprietăţi.
6.3.3. Caracterizarea prin absorbţia apei
Curbele care dau cantităţile de apă absorbită de matricile obţinute prin liofilizarea hidrogelurilor ce
conţin 1,82% DGCH şi cele trei cantităţi de AT în interval de 24 h sunt prezentate în figura 6.14. [18]
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0
10
20
30
40
50
60
70
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
10
20
30
40
50
60
B
C
D
Abso
rbtie
apa, g
/g
Timp, min
Ab
so
rbtie
ap
a, g
/g
Timp, min
Matricea care conţine 10% AT absoarbe
cea mai mare cantitate de apă pe întreg
intervalul (24 h), cu excepţia primelor 40 min în
care cea cu 15% AT absoarbe ceva mai mult, şi
nu de cea cu 5%, cum era de aşteptat, fiind cea
mai puţin reticulată.
Comparând cu absorbţiile matricilor cu
AT, serie în care absorbţia scade cu creşterea
concentraţiei AT, când este prezent DGCH în
concentraţie de 1,82% ordinea anterioară nu se
mai păstrează: matricea ce conţine 10% AT
absoarbe cantitatea maximă în 24 h, dar aceasta
este mai mică decât atunci când nu conţine
DGCH. Aceasta demonstrează că DGCH reduce
hidrofilia matricilor reticulate cu AT.
Dacă hidrogelurile din care s-au
a b c
Figura 6.14. Cantităţile de apă absorbite de matricile
cu 1,82 % DGCH şi: – 5; – 10 şi – 15% AT preparat matricile conţin 4,55% DGCH, curbele
de absorbţie au aceeaşi alură, dar cantităţile
absorbite sunt mai mari, comparabile cu ale celor cu AT. Cea mai mare cantitate este absorbită de matricea
cu 10% AT, urmată de cea cu 5%. Singura explicaţie pentru mărirea hidrofiliei ar fi că aceasta este
cantitatea optimă de digluconat pentru combinaţiile cu AT.
Mărind cantitatea de DGCH la 9,09% alura curbelor se păstrează, dar valorile absorbţiilor variază
invers cu cantitatea de AT pentru timpi de absorbţie sub 120 min: cel mai mult absoarbe matricea cu 15%
AT, urmată de cea cu 10%, şi cel mai puţin cea cu 5%. Între 4 şi 24 h ordinea cantităţilor absorbite este:
matricea cu 15% AT absoarbe mai mult decât cea cu 5%, iar cel mai puţin absoarbe matricea cu 10%. Toate
matricile sunt puţin mai hidrofobe ca cele cu 4,55% DGCH, dar puţin mai hidrofile ca cele cu 1,82%.
Trebuie remarcat diferenţele mici dintre cantităţile de apă absorbite în 24 h.
În concluzie se poate spune că cea mai convenabilă cantitate de DGCH pentru a fi combinată cu
cele trei cantităţi de AT pare a fi 4,55%, iar dintre acestea – combinaţia 10% AT-5,05% DGCH.
6.3.4. Caracterizarea prin digestie cu colagenază
Prezenţa simultană a celor două substanţe antimicrobiene în matricile de colagen măreşte
spectaculos rezistenţa la digestie cu colagenază. Astfel, toate matricile rezistă 9 zile (ultima zi de
observare), cu excepţia celor care conţin 5% AT şi 1,82% DGCH, care – în ultima zi – sunt fragmentate în
2 sau 3 bucăţi. Aceasta demonstrează, încă odată, că şi DGCH reticulează colagenul, sau cel puţin se leagă
de fibrilele, crescându-le astfel rezistenţa la digestie. Matricile cu 9,09% DGCH şi 5 şi 10% AT îşi
păstrează forma, pe când marginile celor care conţin 15% AT sunt puţin erodate. Acest lucru este în
concordanţă cu observaţiile anterioare, că 15% AT depăşeşte cantitatea necesară reticulării şi că excesul
afectează într-o oarecare măsură colagenul nativ. [18]
B i b l i o g r a f i e
6. M. Geiger şi W. Friess, Collagen sponge implants: applications, characteristics and evaluation: Part II, Pharm. Tech. Europe,
14, 58-66, 2002.
7. M. Geiger şi W. Friess, Collagen sponge implants: applications, characteristics and evaluation: Part I, Pharm. Tech. Eur., 14,
48-56, 2002.
8. V. Glattauer, J.F. White, W.B. Tsai, C.C. Tsai, T.A. Tebb, S.J. Danon, J.A. Werkmeister şi J.A. Ramshaw, Preparation of
resorbable collagen-based beads for direct use in tissue engineering and cell therapy applications, J. Biomed. Mater. Res., A
92, 1301-1309, 2010.
9. F. Takeshita, N. Hokaiwado, K. Honma, A. Banas şi T. Ochiya, Local and systemic delivery of siRNAs for oligonucleotide
therapy, Methods Mol. Biol., 487, 83-92, 2009.
10. F. Takeshita şi T. Ochiya, Therapeutic potential of RNA interference against cancer, Cancer Sci., 97, 689-696, 2006.
11. A. Sano, M. Maeda, S. Nagahara, T. Ochiya, K. Honma, H. Itoh, T. Miyata şi K. Fujioka, Atelocollagen for protein and gene
delivery, Adv. Drug Deliv. Rev., 55, 1651-1677, 2003.
15. M.V. Ghica, M.G. Albu, L. Popa, M. Leca, L. Brăzdaru, C. Cotruţ, şi V. Trandafir, Drug delivery systems based on collagen-
tannic acid matrices, Rev. Roum. Chim., 54, 1103-1110, 2009.
16. D. Şulea, M.G. Albu, M.V. Ghica, L. Brăzdaru, M. Leca şi L. Popa, Characterization and in vitro release of chlorhexidine
digluconate contained in type I collagen porous matrices, Rev. Roum. Chim., 56, 65-71, 2011.
17. L. Mincan, M.G. Albu, M. Leca şi R. Sîrbu, Izolation of type I fibrilar collagen and characterization of collagen matrices,
Timişoara Medical J. 55 Suppl., 212-214, 2005.
18. L. Mincan, M. Micutz, M.V. Ghica, M.G. Albu, M. Leca, baiatul cu FT-IR si SEM?, Characterization of collagen matrices
containing tannic acid and chlorhexidine digluconate and tannic acid delivery, revista, sent for publication.
20. C. Petibois, G. Gouspillou, K, Wehbe, J-P. Delage şi G. Deleris, Analysis of type I and IV collagens by FT-IR spectroscopy and
imaging for a molecular investigation of skeletal muscle connective tissue, Anal. Bioanal. Chem., 386, 1961–1966, 2006.
22. R.J. Jakobsen, L.L. Brown, T.B. Hutson, D.J. Fink şi A. Veis, Intermolecular interactions in collagen self-assembly as
revealed by Fourier transform infrared spectroscopy, Sci., 220, 1288-1290, 1983.
23. K.J. Payne şi A. Veis, Fourier transform IR spectroscopy of collagen and gelatin solutions: deconvolution of the amide I band
for conformational studies, Biopolymers, 27, 1749-1760, 1988.
24. A. George şi A. Veis, FTIRS in H2O demonstrates that collagen monomers undergo a conformational transition prior to
thermal self-assembly in vitro, Biochem., 30 2372-2377, 1991.
30. K. Pal, A.K. Banthia, D.K. Majumdar, Polymeric Hydrogels: Characterization and Biomedical Applications – A mini review,
Design. Monomers Polymers, 12, 197-220, 2009.
34. R. Mayne şi R. Burgeson, „Structure and Function of Collagen Types”, Academic Press, N.Y., 1987.
7. ELIBERAREA ACIDULUI TANIC DIN MATRICI
Colagenul, datorită proprietăţilor fizice, chimice şi imunologice, biocompatibilităţii, absenţei
toxicităţii, antigenităţii slabe, capacităţii de reconstituire şi acţiunii hemostatice este suport pentru multe
medicamente. [10-13]
AT se leagă cu colagenul prin legături de hidrogen, [24] forţe electrostatice, [25] interacţiuni
hidrofobe [26] şi legături covalente. [27] Reticularea poate fi modulată prin cantitatea de AT introdusă. [28]
Presupunând matricea de colagen suport polimeric omogen, medicamentul poate fi liber sau legat.
Matricea fiind poroasă, medicamentul liber difuzează şi se eliberează practic imediat, iar cel parţial
imobilizat este eliberat treptat, pe măsură ce fluidul biologic difuzează iar îmbibarea şi eroziunea matricii
progresează. Eliberarea prelungită este favorizată de porozitatea şi structura tridimensională a matricii. [32,
33] Cinetica eliberării mai este influenţată de tratamentele chimice aplicate matricii şi de modificarea
porozităţii sau densităţii sale. [34]
Ecuaţia cinetică ce descrie eliberarea medicamentelor din suporturi are următoarea formă generală:
mt/m∞ = ktn (7.1)
în care mt este cantitatea de medicament eliberată la timpul t, m∞ – cantitatea totală de medicament conţinut
în suport, mt/m∞ – fracţia de medicament eliberat, k – constanta cinetică şi n – exponentul de eliberare, care
indică mecanismul prin care aceasta are loc: (a) dacă n are valoarea 0,5 viteza de difuziune a
medicamentului este mult mai mică decât cea de relaxare a suportului, cantitatea eliberată este
proporţională cu radical din timpul de eliberare, iar eliberarea este guvernată de prima lege a lui Fick;
modelul ce descrie comportarea a fost elaborat de Higuchi; (b) când n este 1 viteza de difuziune a
medicamentului este mult mai mare decât cea de relaxare a suportului, cantitatea eliberată este
proporţională cu timpul de eliberare şi este descrisă de modelul de ordinul zero; (c) dacă 0,5 < n < 1 viteza
de difuziune este de acelaşi ordin de mărime cu cea de relaxare a suportului, eliberarea nu se bazează doar
pe difuziune ci este asociată şi cu alte mecanisme, iar modelul care o descrie a fost elaborat de Ritger-
Peppas. [30, 35, 36]
Pentru suporturi poroase care nu se îmbibă n este mai mic decât 0,5 şi se utilizează o extindere a
modelului Peppas, numită modelul legii puterii, în care n are valoarea cuprinsă între 0 şi 1.
Eliberarea AT s-a determinat in vitro în condiţii fiziologice: mediu de cedare soluţie tampon fosfat
salină cu pH 7,4 şi temperatură de 370C.
AT interacţionând cu DGCH prin legături de hidrogen şi forţe hidrofobe, [37] prezenţa DGCH
influenţează reţinerea sa şi eliberarea din cele două categorii de matrici trebuie discutată separat.
7.1. Eliberarea din matrici care conţin numai acid tanic
Concentraţia AT eliberat s-a măsurat prin spectrofotometrie UV, din valorile absorbanţelor
maximului de la lungimea de undă de 276 nm, folosind curba de etalonare trasată în prealabil. [38]
Cantităţile cedate din matricile de colagen obţinute din hidrogelurile ce conţin cele trei procente de
AT, exprimate ca procente din cantitatea totală introdusă, sunt prezentate în figura 7.2.
0 100 200 300 400 500 600 7000
20
40
60
80
100
B
C
D
Ac
id t
an
ic,
%
Timp, min
Figura 7.2. Curbele cumulative de eliberare a AT din
matricile de colagen cu: B – 5; C – 10 şi D – 15% AT
Curbele au alură asemănătoare: până la cca
240 min cantitatea cedată creşte practic liniar în timp,
apoi se reduce şi peste 500 min tinde spre un platou.
Cea mai mare cantitate este cedată de matricea cu
10% AT. Aceasta susţine ipoteza că 10% AT este
suficient pentru a reticula colagenul. Excesul
denaturează colagenul, mărind numărul de grupe
funcţionale, deci legarea de colagen este mai puternică
şi este eliberat mai puţin.
Datele obţinute pentru cedarea AT au fost
introduse în cele trei modele ce descriu cinetica
eliberării, iar valorile obţinute pentru coeficienţii de
corelare sunt date în tabelul 7.1.
Valorile arată că datele de cedare sunt descrise
cel mai satisfăcător, pentru toate matricile, de modelul
Ritger-Peppas. Acest lucru era de aşteptat, la
eliberarea din matrici poroase contribuind, în afara
difuziunii şi relaxării suportului, şi alte fenomene, cum este îmbibarea matricii cu fluidul de cedare.
Modelul de ordinul unu poate fi valabil doar în primele minute.
Cu modelul Ritger-Peppas s-au calculat parametrii cinetici k şi n, iar valorile obţinute sunt
prezentate în tabelul 7.2, împreună cu cantităţile maxime eliberate măsurate (la 660 min) – cm.
Valorile coeficienţilor de eliberare sunt foarte apropiate pentru matricile cu 10 şi 15% AT, probabil
din cauza gradului de reticulare apropiat. Deci la eliberare contribuie şi alte fenomene ce au loc la
Tabelul 7.1. Valorile coeficienţilor de corelare obţinuţi
cu modelele menţionate
% AT Modelul
Higuchi
Modelul de
ordin zero
Modelul
Ritger-Peppas
5 0,9700 0,9702 0,9924
10 0,9794 0,9568 0,9916
15 0,9775 0,9562 0,9902
Tabelul 7.2. Parametrii cinetici calculaţi cu modelul
Ritger-Peppas pentru matricile cu AT
% AT k, min-n n cm, %
5 0,711 0,734 79,54
10 1,113 0,685 90,00
15 0,961 0,698 84,28
introducerea matricilor în soluţia de fosfat, cel mai important fiind îmbibarea, care controlează probabil
cedarea. Rezultatele sunt în concordanţă cu absorbţiile de apă, foarte apropiate pentru aceste matrici.
7.2. Eliberarea din matrici care conţin acid tanic şi digluconat de clorhexidină
Eliberarea AT din matricile ce conţin toate combinaţiile dintre AT şi DGCH s-a determinat în
acelaşi mod, iar cantităţile cedate s-au măsurat şi exprimat similar. S-au calculat coeficienţii de corelare cu
cele trei ecuaţii cinetice şi parametrii de cedare cu ecuaţia Ritger-Peppas ce descrie cel mai fidel cedarea şi
în aceste cazuri. Curbele prezentând regularităţi la concentraţii constante de AT, se discută separat.
7.2.1. Eliberarea din matrici cu 5% acid tanic
Curbele de eliberare cumulativă a AT din matricile cu 5% AT şi 1,82, 4,55, respectiv 9,09% DGCH
sunt reprezentate în figura 7.3.
0 100 200 300 400 500 600 7000
20
40
60
80
100 B
C
D
Acid
tan
ic,
%
Timp, min
Figura 7.3. Curbele cumulative de eliberare a AT din
matricile cu 5% AT şi B – 1,82, C – 4,55 şi
D – 9,09% DGCH
Pentru aceste matrici regiunile de creştere
liniară a cantităţilor de AT în primele cca 3 h cu
timpul sunt înlocuite cu regiuni exponenţiale. Cu
cât procentul de DGCH este mai mare, cu atât
cantitatea de AT eliberată este mai redusă, fiind
simţitor mai mică pentru matricea cu cantitatea
maximă de DGCH. Rezultatele pentru cantităţile
Tabelul 7.3. Coeficienţii de corelare pentru matricile cu
5% AT şi DGCH calculaţi cu modelele specificate
%
DGCH
Modelul
Higuchi
Modelul
de ordin zero
Modelul
Ritger-Peppas
1,82 0,9960 0,9329 0,9974
4,55 0,9919 0,9424 0,9959
9,09 0,9911 0,9506 0,9973
Tabelul 7.4. Parametrii cinetici daţi de modelul Ritger-
Peppas pentru matricile cu 5% AT şi DGCH
% DGCH k, min-n n cm, %
1,82 2,548 0,562 94,28
4,55 1,789 0,601 84,89
9,09 1,289 0,618 69,40
cedate sunt în concordanţă cu viscozităţile dinamice ale hidrogelurilor din care s-au obţinut matricile,
sugerând că difuzia AT prin hidrogelul format prin îmbibarea matricilor cu soluţia de fosfat joacă rol
important în eliberare.
Valorile coeficienţilor de corelare obţinuţi cu ecuaţiile cinetice ce descriu eliberarea din suporturi
sunt mai apropiate de unitate tot pentru ecuaţia Ritger-Peppas, cum se poate vedea din tabelul 7.3.
Exponenţii de eliberare (tabelul 7.4), calculaţi cu ecuaţia Ritger-Peppas, sunt mai mici decât pentru
matricea cu aceeaşi cantitate de AT, cu valorifoarte apropiate pentru cele cu 4,55 şi 9,09% DGCH.
Cantităţile de AT maxime eliberate, cm, date în acelaşi tabel, scad cu creşterea cantităţii de DGCH
apoi cresc, la fel ca viscozităţile hidrogelurilor la mărirea cantităţii de digluconat (tabelele 5.19-5.21).
7.2.2. Eliberarea din matrici cu 10% acid tanic
Curbele de eliberare a AT din matricile cu 10% AT şi DGCH sunt prezentate în figura 7.4.
Acestea sunt plasate asemănător cu cele anterioare numai pentru 1,82 şi 4,55% DGCH, pe când cea
pentru matricea cu 9,09% digluconat este situată deasupra primelor două. Deci matricea cu cea mai mare
cantitate de DGCH cedează cele mai mari cantităţi de AT, urmată de cea cu 1,82%. Poziţiile curbelor sunt
0 100 200 300 400 500 600 7000
20
40
60
80
100
B
C
D
Ac
id t
an
ic,
%
Timp, min
Figura 7.4. Curbele cumulative de eliberare a AT din
matricile cu 10% AT şi 1,82, 4,55 şi 9,09% DGCH
Tabelul 7.5. Valorile coeficienţilor de corelare obţinuţi pentru
matricile cu 10% acid tanic şi 1,88, 4,55 şi 9,09% DGCH
% DGCH Modelul
Higuchi
Modelul
de ordin zero
Modelul
Ritger-Peppas
1,82 0,9876 0,9547 0,9957
4,55 0,9810 0,9685 0,9968
9,09 0,9939 0,9444 0,9977
Tabelul 7.6. Parametrii cinetici obţinuţi cu modelul Ritger-
Peppas pentru matricile cu 10% AT şi DGCH
% DGCH k, min-n n cm, %
1,82 1,405 0,630 80,85
4,55 0,862 0,689 73,15
9,09 1,878 0,600 89,74
în concordanţă cu viscozităţile hidrogelurilor din care s-au obţinut matricile, cea mai mare viscozitate având
hidrogelul cu 4,55% digluconat. Deci şi în acest caz difuzia AT prin hidrogelul format în urma îmbibării
matricii este importantă în procesul de cedare.
Valorile coeficienţilor de corelare obţinuţi cu modelele cinetice utilizate au valorile cele mai
apropiate de unitate tot pentru modelul Ritger-Peppas, aşa cum se poate vedea din tabelul 7.5.
Cele mai mici valori ale coeficienţilor de corelare au rezultat pentru modelul de ordinul zero,
eliberarea la timpi mici depinzând neliniar de timp, şi cele mai mari pentru Ritger-Peppas.
Coeficientul de eliberare are cea mai mare valoare pentru matricea care conţine 4,55% digluconat,
pentru care s-a măsurat şi cea mai mică cantitatea maximă eliberată, cum se poate constata din tabelul 7.6.
7.2.3. Eliberarea acidului tanic din matrici cu 15% acid tanic
Reprezentate în figura 7.5, curbele cumulative pentru eliberare a AT din matricile cu 15% AT sunt
plasate cu atât mai sus cu cât conţin mai mult DGCH, deci cantităţiile eliberate cresc cu cantitatea de
DGCH.
0 100 200 300 400 500 600 7000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
B
C
D
Ac
id t
an
ic,
%
Timp, min
Figura 7.5. Curbele cumulative de eliberare a AT din
matricile cu 15% AT şi 1,88, 4,55 şi 9,09% DGCH
Tabelul 7.7. Valorile coeficienţilor de corelare obţinuţi cu
modelele specificate pentru matricile cu 15% AT DGCH
Tabelul 7.8. Parametrii cinetici obţinuţi cu modelul Ritger-
Peppas pentru matricile cu 15% AT şi DGCH
% DGCH k, min-n n cm, %
1,82 1,041 0,628 60,06
4,55 1,434 0,601 68,33
9,09 2,002 0,577 82,21
% DGCH Modelul
Higuchi
Modelul de
ordin zero
Modelul
Ritger-Peppas
1,82 0,9852 0,9633 0,9963
4,55 0,9920 0,9419 0,9959
9,09 0,9952 0,9387 0,9976
Cantităţile eliberate sunt în concordanţă cu viscozităţile hidrogelurilor din care s-au obţinut
matricile, care scad la creşterea cantităţii de digluconat.
Coeficienţii de corelare au, şi în acest caz, cele mai mari valori dacă sunt calculaţi cu modelul
Ritger-Peppas, aşa cum se poate vedea din tabelul 7.7.
Valorile coeficienţilor de eliberare, calculaţi cu modelul Ritger-Peppas, sunt date în tabelul 7.8.
Cantităţile de acid tanic eliberate cresc cu mărirea concentraţiei digluconatului, legarea sa de
compusul antibacterian fiind mai slabă decât de colagen, aşa cum s-a mai specificat.
B i b l i o g r a f i e
10. C. H. Lee, A. Singla şi Y. Lee, Biomedical application of Collagen, Int. J. Pharmaceutics, 221, 1-22, 2001.
11. H. C. Goo, Yu-S. Hwang, Y. R. Choi, H. N. Cho şi H. Suh, Development of collagenase-resistant collagen and its interaction
with adult human dermal fibroblasts, Biomat. 24, 5099-5113, 2003.
12. J. M. Pachence, Collagen-based devices for soft tissue repair, J. Biomed. Mater. Res. A 33, 35-40, 1996.
13. R. K. Panduranga, Recent developments of collagen-based materials for medical applications and drug delivery systems, J.
Biomater. Sci. Polym. Ed. 7, 623-645, 1995.
25. K. M. Meek şi J. B. Weiss, Differential fixation of poly(L-arginine) and poly(L-lysine) by tannic acid and its application to the
fixation of collagen in electron microscopy, Biochim. Biophys. Acta., 587, 112-120, 1979.
26. W. D. Loomis, Removal of phenolic compounds during isolation of plant enzymes, Methods Enzymol., 13, 535-563, 1969.
27. B. Madhan, V. Subramanian, J. Raghava Rao, B. Unni Nair şi T. Ramasami, Stabilization of collagen using plant polyphenoles:
Role of catechine, Int. J. Biol. Macromol., 37, 47-53, 2005.
28. B. Madhan, C. Muralidharan şi R. Jayakumar, Study on the stabilisation of collagen with vegetable tannins in the presence of
acrylic polymer, Biomater., 23, 2841-2847, 2002.
30. N. A. Peppas, P. Bures, W. Leobandung şi H. Ichikawa, Hydrogels in pharmaceutical formulations. Eur. J. Pharmaceutics and
Biopharmaceutics, 50, 27-46, 2000.
32. Z. Ruszczak şi W. Friess, Collagen as a carrier for on-site delivery of antibacterial drugs. Adv. Drug Delivery Rev., 55, 1679-
1698, 2003.
33. D. G. Wallace şi J. Rosenblatt, Collagen in drug delivery and tissue engineering, Adv. Drug Delivery Rev., 55, 1631-1649,
2003.
34. M. Grassi şi G. Grassi,. Mathematical modelling and controlled drug delivery: matrix systems, Current Drug Delivery, 2, 97-
116, 2005.
35. S. Li, Y. Shen, W. Li, X. Hao, A common profile for polymer-based controlled releases and its logical interpretation to general
release process, J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 9, 238-244, 2006.
36. H. Teles, T. Vermonden, G. Eggink, W. E. Hennink, şi F. A. de Wolf, Hydrogels of collagen-inspired telechelic triblock
copolymers for the sustained release of proteins, J. Controlled Release, 147, 298-303, 2010.
37. L. Mincan, M. Micutz, M.V. Ghica, M.G. Albu, M. Leca, baiatul cu FT-IR si SEM?, Characterization of collagen matrices
containing tannic acid and chlorhexidine digluconate and tannic acid delivery, revista, sent for publication.
38. M. V. Ghica, M. G. Albu, L. Popa, M. Leca, L. Brăzdaru, C. Cotruţ şi V. Trandafir, Drug delivery systems based on collagen-
tannic acid matrices, Rev. Roumaine Chim., 54, 1103-1110, 2009.
8. CONCLUZII GENERALE
Metodele rapide de caracterizare arată că puritatea colagenului din hidrogelul iniţial este suficientă,
iar spectrul UV-DC că este păstrată conformaţia nativă, deci poate fi utilizat la obţinerea biomaterialelor.
Concentraţia optimă de colagen în hidrogelul pentru prepararea biomaterialelor – hidrogeluri şi
matrici poroase – determinată din proprietăţi reologice staţionare, este 1,1%, atât consistenţa cât şi
stabilitatea sub acţiunea forţelor de forfecare fiind convenabile.
Caracterizarea hidrogelurilor
Obţinerea de hidrogeluri de colagen care conţin compuşii antimicrobieni acid tanic sau/şi
digluconat de clorhexidină, în vederea tratării rănilor uscate, cu caracteristicile:
- conformaţie nativă a moleculelor de colagen;
- consistenţă suficientă pentru a putea fi aplicate şi a rămâne pe rană;
- elasticitate suficientă pentru a putea fi întinse.
1. Hidrogeluri cu AT. În spectrele FT-IR interacţiunile colagen-AT se manifestă prin modificarea
benzii amidă II: mărirea concentraţiei AT produce reducerea intensităţii benzii de la 1528 cm-1 şi apariţia
unui umăr la 1545 cm-1, atribuit reticulării. AT nu denaturează colagenul în concentraţiile utilizate.
Intensităţile minimelor, maximelor şi valoarile Rpn din spectrele UV-DC scad considerabil la
mărirea concentraţiei AT, dar lungimile de undă sunt nemodificate, deci hidrogelurile cu AT nu conţin
colagen denaturat. S-a demonstrat că valorile Rpn mari obţinute pentru hidrogeluri sunt determinate de
concentraţia mare a colagenului şi de opalescenţă şi nu de denaturare. S-a stabilit criteriul de recunoaştere a
structurii native a colagenului în soluţii concentrate/hidrogeluri de colagen: existenţa maximului şi
minimului la lungimile de undă specifice, indiferent de valorile intensităţilor, adică ale valorilor Rpn.
Hidrogelurile devin mai viscoase şi rămân pseudoplastice şi tixotrope, proprietăţi accentuate de
concentraţia AT. Cea mai consoloidată structură are hidrogelul cu 10% AT.
Hidrogelurile sunt predominant elastice, caracteristică amplificată de AT. Modulii cresc liniar cu
frecvenţa unghiulară şi dreptele ce dau variaţiile sunt paralele, confirmând reticularea cu AT. Cel cu 10%
AT este cel mai elastic şi cel mai viscos, deci cel mai reticulat. 15% AT depăşeşte cantitatea necesară
reticulării şi afectează puţin colagenul.
2. Hidrogeluri cu DGCH. DGCH nu modifică numerele de undă ale benzilor FT-IR ale
colagenului, concluzie susţinută şi de diferenţele numerelor de undă ale benzilor amidă I şi II, care sunt mai
mici ca 100 cm-1. Valorile AIII/A1450 > 1, deci nu există colagen denaturat. Rapoartele AI/AA sunt micşorate
puţin, deci reticularea prin legături de hidrogen este redusă slab datorită interacţiunilor ionice a grupelor
carboxil cu dicationii clorhexidinei.
UV-DC. DGCH reduce maximele şi mai puţin minimele, nu denaturează colagenul dar produce o
uşoară separare de faze, mai redusă în mediu acid, din cauza numărului mult mai mic de grupe carboxil
disociate la pH 3,8. Colagenul nu este denaturat.
Hidrogelurile au comportare pseudoplastică cu viteze limtă de curgere. Viscozităţile dinamice
scad cu creşterea cantităţii de DGCH, indicii de consistenţă sunt reduşi uşor în fiecare serie, iar cei de
curgere sunt măriţi puţin.
Contribuţiile elastică şi viscoasă depind de concentraţia DGCH şi pH: în mediu acid ambii moduli
scad uşor la introducerea DGCH şi predomină componenta elastică; în mediu slab bazic valorile sunt mai
mari pentru ambii moduli.
3. Hidrogeluri cu AT şi DGCH. Interacţiunea AT-DGCH se evidenţiază în spectrele FT-IR în
mediu acid la concentraţia maximă de DGCH: banda amidă II se scindează, apărând o bandă nouă la 1541
cm-1. Mai apare şi un umăr pe banda de oscilaţie a grupei metilen. Intensităţile ambelor se măresc la
creştera concentraţiei AT. Valorile AIII/A1450 > 1 şi diferenţele dintre numerele de undă ale benzilor amidă I
şi II < 100 cm-1, deci nu conţin colagen denaturat.
Spectre UV-DC se aseamănă foarte mult cu ale hidrogelurilor cu AT. Maximele şi minimele sunt
cu atât mai aplatizate cu cât concentraţia DGCH este mai mare, dar poziţiile şi punctele de elipticitate zero
se deplasează foarte puţin. Valoare Rpn minimă – 0,11 – s-a obţinut pentru hidrogelul cu cantităţi maxime
din cele două componente. Colagenul nu este denaturat.
Reologia staţionară sugerează formarea de asociate AT-DGCH, mai ales la concentraţii mari ale
ambelor antiseptice. Viscozitatea hidrogelului cu 15% AT este mai mică decât a celui cu 10%, probabil din
cauza asociatelor AT-DGCH care au viscozitate mică şi se interpun între fibrile. Colagenul reticulat cu
dicationi CH conduce la hidrogel cu viscozitate mai mică decât cel reticulat cu AT, ceea ce creează
aspectrul de neomogenitate a hidrogelurilor.
Reologia dinamică arată că hidrogelurile sunt predominant elastice. Componetele elastice cresc mai
mult decât cele viscoase cu mărirea cantităţii de AT. Hidrogelul cu cantităţile maxime de AT şi DGCH este
cel mai elastic, iar cel cu 9,09% DGCH şi 5% AT cel mai viscos.
Caracterizarea matricilor
Obţinerea de matrici poroase de colagen ce conţin acid tanic sau/şi digluconat de
clorhexidină, în vederea tratării rănilor umede, cu caracteristicile:
- conformaţie nativă a moleculelor de colagen;
- dimensiuni ale porilor care să permită creşterea şi migrarea celulelor epiteliale;
- capacitate bună de absorbţie a fluidelor biologice;
- rezistenţă suficientă la degradare.
1. Matrici cu AT. Spectrele FT-IR prezintă, la introducerea AT, deplasări uşoare ale benzilor
amidă A şi II spre valori mai mici ale numerelor de undă, cresterea intensităţii benzii de la cca 1200 cm-1
din banda complexă amidă III şi scăderea intensităţii benzii amidă I, modificări asociate reticulării
colagenului cu AT prin legături de hidrogen. Diferenţele numerelor de undă ale benzilor amidă I şi II cresc
la mărirea concentraţiei AT, dar rămân mai mici ca 100 cm-1, deci AT nu denaturează colagenul în
concentraţiile utilizate.
SEM. Morfologia lamelară caracteristică matricilor de colagen dispare, porii sunt inelari şi relativ
alungiţi, cu dimensiuni variind în limite largi, adecvate pentru creşterea şi migrarea celulelor. Dimensiunile
se măresc la creşterea concentraţiei AT şi conţin zone compacte de colagen, ca rezultat al reticulării cu AT.
Cantităţile de apă absorbite scad cu creşterea procentului de AT, de la 90 g/g pentru matricea ce
conţine 5% AT la 65 g/g pentru cea cu 15% în 24 h, cu valori foarte apropiate pentru 10 şi 15% AT,
sugerând grade de reticulare apropiate pentru ultimele două matrici. Deci 10% AT este suficient pentru
reticularea colagenului.
Digestia cu colagenază din Clostridium histolyticum în condiţii fiziologice arată că matricile devin
mai rezistente pe măsură ce se măreşte concentraţia AT; cele cu 10 şi 15% AT rămân întregi şi la 9 zile.
2. Matrici cu DGCH. DGCH nu modifică lungimile de undă ale benzilor FT-IR ale colagenului.
Rapoartele AIII/A1450 > 1 şi diferenţele numerelor de undă ale benzilor amidă I şi II < 100 cm-1 arată că
matricile nu conţin colagen denaturat. Rapoartele AI/AA sugerează că DGCH reduce puţin reticularea prin
legături de hidrogen, datorită reticulării cu dicationi clorhexidină.
SEM. La 1,82% DGCH se păstrează morfologia lamelară pentru matricile obţinute din hidrogel
acid, în timp ce pentru celelalte concentraţii nu se mai păstrează. Cele preparate din hidrogel slab bazic au
porii şi aglomeratele de fibrile mai mari, interacţiunile colagen-DGCH fiind mai puternice. Dimensiunile
porilor permit dezvoltarea şi migrarea celulelor.
3. Matrici cu AT şi DGCH. Spectrele FT-IR arată că interacţiunile colagen-AT sunt mai
puternice decât colagen-DGCH. Diferenţele numerelor de undă ale benzilor amidă I şi II sunt mai mici ca
100 cm-1, deci nu conţin colagen nedenaturat şi pot servi ca pansamente pentru răni.
SEM. În prezenţa ambelor componente porii sunt mai mici decât în matricile ce conţin substanţele
individuale, mai alungiţi şi mai neregulaţi; matricile conţin aglomerate, a căror dimensiuni cresc cu
concentraţia componentelor. Deci atât AT, cât şi DGCH reticulează colagenul, iar reţelele tridimensionale
rezultate prin reticulare cu DGCH sunt ceva mai dense. Porii permit dezvoltarea şi migrarea celulelor.
Cantitatea de apă absorbită se reduce la mărirea concentraţiei AT, dar şi DGCH are un slab efect
de micşorare, deci reticulează colagenul. Capacitatea de absorbţie rămâne suficientă.
Digestia matricilor arată că prezenţa celor două substanţe antimicrobiene măreşte spectaculos
rezistenţa la digestie cu colagenază, ceea ce înseamnă că ambele componente reticulază colagenul.
Singurele matrici care nu rezistă 9 zile sunt cele ce conţin cantităţile cele mai mici de AT – 5% şi de DGCH
– 1,82%, care în ultima zi prezintă 2-3 fragmentate. Deci şi DGCH produce reticularea colagenului, mărind
astfel rezistenţa la digestie.
Eliberarea acidului tanic din matrici
S-a determinat cu un dispozitiv USP modificat (sandwich).
Matrici cu AT. Cantităţile cumulative de AT eliberat cresc liniar cu timpul în primele 4 h, apoi
panta se micşorează treptat, tinzând spre platou. Eliberarea este descrisă de modelul Ritger-Peppas, ceea ce
arată că, pe lângă difuzie, la eliberare contribuie şi alte fenomene, cel mai important şi probabil fiind
îmbibarea. Cea mai mare cantitate de AT este cedată de matricea cu 10% AT şi cea mai mică de cea cu 5%.
Matrici cu AT şi DGCH. Porţiunile liniare dispar din curbele de eliberare a AT, acestea fiind
exponenţiale pe întregul interval de timp în care s-au facut măsurători (11 h). Cinetica eliberării este
descrisă tot de modelul Ritger-Peppas, deci la eliberare contribuie aceleaşi fenomene ca în cazul în care
conţin AT. Cea mai mare cantitate de AT este eliberată de matricea care conţine 10% AT şi 9,09% DGCH.
top related