replicarea adn vs pcr
Post on 06-Jul-2018
223 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
1/59
REPLICAREA ADN (in
vivo ) vs. PCR (in vitro )
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
2/59
REPLICAREA ADN – proces prin care se asiguratransmiterea fidela a informatiei genetice la celulele fiice, in urma
diviziunii celulare.
Etape- initiere
- elongare
- terminare
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
3/59
ÎNTREBĂRI
Care sunt modelele propuse pentru replicareaADN?
Ce este originea replicării?
Care este direcţia replicării?
Cum se realizează sinteza catenelor fiice deADN?
Care sunt enzimele implicate în replicarea ADN?
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
4/59
1. Matriţa = ADN m.c.;
2. Substratul care urmează să fie încorporat înnoua catenă sintetizat ă;
3. Enzime + alte tipuri de proteine.
“Componentele” replicării (I)
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
5/59
Noile catene de ADN sunt sintetizate pe baza deoxiribonucleotidtrifosfaţilor (dNTP). Direcţia de sinteză 5’3’.
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
6/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
7/59
Aceste modele diferă prin modul de iniţiere areplicării şi progresia replicării.
Comun: replicarea semi-conservativă
Modelele replicării ADN
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
8/59
MODELUL THETA: E. colihttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNA
http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNA
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
9/59
Modelul cercului rotativ:
Virusuri şi plasmide (factorul F -E. Coli )
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
10/59
R
E
P
L
I
C
A
R
E
A
L
I
N
I
A
R
Ă
E
U
C
A
R
I
O
TE
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
11/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
12/59
1. Replicarea este semi-conservativă
Meselson & Stahl au demonstrat la E. coli că fiecare
catenă a ADN d.c. joacă rolul de matriţă pentrusinteza unei noi molecul de ADN d.c.
http://highered.mcgraw-
hill.com/olc/dl/120076/bio22.swf
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swf
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
13/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
14/59
2. Replicarea începe la un
situs specific – origineareplicării
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swf
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swf
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
15/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
16/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
17/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
18/59
3. Replicarea ADN se desf ăşoară îndirecţia 5’-3’
Sinteza ADN se desf ăşoară simultan, dar îndirecţii opuse pe cele două catene.
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
19/59
Leading strand
lagging strand
Replication fork
Replication fork
4. Replicarea ADN este semi-discontinuă
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
20/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
21/59
Polaritatea
sintezeiADNdetermină
apariţia unei
asimetrii între catena“leading” şi
catena
“lagging” lanivelul furciide replicare
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
22/59
AD
N
Po
lime
raza
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
23/59
DNA Polymerase III
ADN Polimeraze la PK (E. coli )
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
24/59
Topoisomerase
Complexe proteice
asociate furcii de
replicare
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
25/59
Helicaza
despiralizează
dublul helix ADN
înaintea ADN
polimerazei
determinând
formarea de
monocatene care
servesc ca tipar.
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
26/59
PROTEINE ssB single strand DNA binding proteins) se leagă lascheletul pentozofosfat şi lasă bazele expuse acţiunii ADNPolimerazei. Legarea ssB previne reasocierea catenelor.
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
27/59
ADN Polimeraza necesit ă o catenă tipar şi o
grupare 3’ OH liberă pentru adăugarea de noinucleotideprimeri ARNpentru inţierea sinezei de
ADN.Primaza, enzim
ă
component ă aprimosomului,
sinteizează fragmentemici de ARN (primeri)
care reprezint ă un situsde pornire a sintezei ADNmediat ă de ADN
Polimerază.
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
28/59
ADN Polimeraza sepoate detaşa uşor de
catena ADN.“Sliding
l mp”necesară pentru menţinereaADN Polimerazei
ataşate la catena ADN
şi replicarea unorregiuni extinse din
ADN.
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
29/59
“Clamploader:”
aducerea“clemei” la
nivelul AND.
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
30/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
31/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
32/59
Înaintea furciide replicare
ADNsuperîncolăcit
(supercoiled)
Eliminareasuperîncolăcirilor pentru
a evita creştereatensiunii şi blocarea înaint ării furcii de
replicare.
Superîncolăcirile sunt eliminate sub
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
33/59
Superîncolăcirile sunt eliminate subacţiunea topoizomerazelor.
Topoisomeraze de tip I
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
34/59
Topoizomeraze de tip II
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
35/59
A
DN
LIGAZA
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
36/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
37/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
38/59
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
39/59
1. Helicaza desface helixul ADN. Reacţia catalizat ă de aceast ă enzimă necesit ă ATP. La nivelul furcii de replicare, monocateneleADN sunt protejate de legarea ssB (single-strand bindingproteins).
2. Primaza sintetizează primerii ARN. La nivelul grupării 3' OHlibere a primerului se vor ataşa noi dNtP.
3. ADN Polimeraza III ataşează noi dNTP la capătul 3' OH al catenei în extensie (leading strand) care va fi sintetizat ă continuu în
direcţia furcii de replicare 5’ – 3’. După încorporarea unui noudNTP este eliberat ă a grupare PPi care funcţionează ca donor deenergie.
4. Pe catena lagging sunt sintetizaţi mai mulţi primeri. ADNPolimeraza III sinetizează fragmente de ADN în direcţia 5' - 3‘.
5. ADN Polimeraza I (Pol I) îndepărtează primerii ARN şi îi înlocuieşte cu secvenţe ADN.6. Ligaza uneşte fragmentele ADN de pe catena lagging.
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
40/59
-în faza S a ciclului celular (6-8 ore la mamifere).
Comparativ cu PK, FR se deplasează doar o zecime, în timp ce materialul genetic de replicat este de 108
bp mai numeros.FR multiple = repliconi.
Complexul ORC Origin Recognition Complex )conţine 6 proteine cu funcţie ATP-azică şi reprezint ă echivalentul funcţional al proteinei DnaA de la PK.
REPLICAREA ADN LA EUCARIOTE
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
41/59
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swf
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swf
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
42/59
ADN POLIMERAZE LA EK
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
43/59
Polymerase chain reaction(PCR)
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
44/59
T ehnică de biologie moleculară prin care se realizează amplificarea (obţinerea a milioane de copii) unei regiunispecifice din ADN genomic.
Pusă la punct de către K. Mullis şi colab. care şi-auimaginat un proces prin care ADN sa poată fi multiplicat
artificial prin cicluri repetate de replicare direcţionate de ADN Polimerză. Iniţial – nu se foloseau ADNpolimeraze termostabile şi nici aparate automate pentrureproducerea ciclurilor de temperatură.
În 1993, Mullis primeşte Premiul Nobel pentru Chimie.
Principiu
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
45/59
Practic se realizează amplificarea unui fragmentdintr-o matriţă ADN utilizând oligonucleotide sintetice
(primeri ADN) complementare la matriţa ADN. Numărul de copii ale secvenţei alese pentruamplificare este dublat la fiecare replicare.
Principiu
REPLICAREA ADN
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
46/59
46
In vivo In vitro (PCR)
REPLICAREA ADN
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
47/59
47
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
48/59
Componentele reacţiei PCR
Matriţa ADN (10 -100 ng) - poate proveni dintr-omare varietate de probe biologice.
Primerii = secvente oligonucleotidicecomplementare la secventa ADN tinta;
ADN polimeraza;
Mg Cl2;
dNTP (dATP; dTTP; dCTP; dGTP).
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
49/59
ADN polimeraza ADN Polimeraze termostabile (Taq/ Amplitaq) izolate
din Thermus.Dezavantaj comite erori în copierea catenei de ADN,conducând la erori în secvenţa ADN, din moment ce îilipseşte activitatea de proofreading 3'->5'exonucleazică.Pwo (Pyrococcus woesei ), Pfu (Pyrococcus furiosus) posedă mecanisme de proofreading prin care suntcorectate erorile apărute în cursul ciclurilor dereplicare şi pot reduce semnificativ numărul erorilor
care apar în copierea catenei de ADN.La ora actuală sunt disponibile combinaţii de Taq şi Pfu , fapt ce conferă atât o fidelitate înaltă, cât şi oamplificare corespunzătoare a ADN.
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
50/59
Amestec de nucleotide
Soluţie amestec a celor patru nucleotide (dATP, dCTP, dGTP şi dTTP).
Concentraţiile optime depind de lungimea fragmentului cetrebuie amplificat şi de numărul de cicluri de amplificare.
Soluţia tampon a polimerazei
Conţine TRIS, HCl, KCl şi are pH 8,3.
Există şi variante de tampon care includ clorura de magneziu.
MgCl2Ionii de magneziu sunt cofactori ai ADN Polimerazelor.
Apă ultrapură – Nuclease Free
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
51/59
Reactiv Concentratie Volum(µL)
Tampon PCR 10 X 2.5
Mg Cl2 25 mM 1.5
Amestec denucleotide
10 mM 2
Primer sens(F)
80 pmoli/ µL 0.25
Primerantisens (R)
80 pmoli/ µL 0.25
PolimerazaAmpliTaq
5 U/ µL 0.2
Apa ultrapura 13.3
Amestec PCR
Proba
50-60 ng ADN
51
PCR î di t d t t ă
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
52/59
PCR în gradient de temperatură
60 - 51º C
Selectarea
temperaturii optimede hibridizare a
primerilor
APARAT
PCR
Timpii şi temperaturile de incubare
Etapa
iniţială
35 de cicluri Extensie
finală Denaturare Anelare Extindere
iCycler
BioRad
3 min.
95oC
1 ciclu
30 sec.
95oC
30 sec.
51-60 oC
1 min.
72oC
10 min.
72oC
1 ciclu
∞
4oC
52
Vizaualizarea produsilor rezultati in urma PCR in
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
53/59
• Electroforeza in gel de agaroza (2%)
Principiul: ADN (-) se deplaseaza spre (+) atunci cand este plasat intr-un
camp electric; un gel de agaraoza este utilizat pentru a incetini deplasareamoleculelor de ADN si separarea acestora in functie de marime.
V zaua zar a pr us r r zu tat n urma ngradient de temperatura
micmare
+-
SursaAgaroza polimerizata este poroasa sipermite deplasarea ADN.
53
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
54/59
Echipament pentru electroforeza
SURSA TANC DE
ELECTROFOREZA
TAVITAPENTRU GEL
PIEPTEN
54
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
55/59
Tavita pentru gel & piepteni
Izolarea tavitei
55
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
56/59
(1)Agaroza
(2)Tampon demigrare TAE 1X
(3) Agaroza estesolubila la temperatura
camerei
(4) Solutia de
agaroza esteincalzita
PREPARAREAGELULUI DEAGAROZA
Et Br
56
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
57/59
Turnarea gelului de
agaroza
Polimerizare la
temperatura camerei/ 30
minute57
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
58/59
ADN
ANOD
(+)CATOD(-)
godeuri
58
-
8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR
59/59
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swf
http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Fork
http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replication
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swf
top related