replicarea si repararea adn 2015

Biologie moleculară Replicarea ADN Reparația ADN L.Rotaru S.Capcelea

1

REPLICAREA ȘI REPARAREA ADN

Replicarea este procesul fundamental pentru toate organismele vii și reprezintă esența

eredității. Conform modelului complementarității a lui Watson și Crick, fiecare catenă ADN

conține o secvență de dezoxiribonucleotide, care activate se aranjează complementar(A-T, G-C),

în direcţia 5’→3’, fiind polimerizate de ADN polimeraze. Fiecare catenă ADN servește drept

tipar pentru formarea unei noi catene. Acordarea Premiului Nobel (1959) lui A. Korn'sOchoa şi

berg pentru descrierea mecanismului replicării ADN, explică astăzi obținerea celor mai puternice

antibiotice și antivirale care blochează replicarea genomului bacterian/viral.

1. Principiile replicării:

- Secvenţa ADN nou sintetizată este complementară cu

catena matriţă – sinteză matricială;

- Matrița este citită în direcția 3 '5' iar sinteza se

realizează în direcția 5 '3': monomerii sunt adăugaţi la

capătul 3’al catenei nou sintetizate de enzima ADN-

polimeraza - astfel replicarea se realizează antiparalel;

- Procesul se realizează bidirecţional – ambele catene

matrițe se citesc concomitent și pe baza lor se

sintetizează în direcții opuse catene noi;

- Sinteza este semiconservativă– molecula bicatenară nou

sintetizată conţine o catenă veche (matriţa) şi o catenă

nou-sintetizată (catena fiică);

- Sinteza catenelor noi se sintetizează semidiscontinuu

(catena lider – continuu, iar catena întîrziată –

discontinuu, sub forma unor fragmente mai scurte –

Okazaki);

- Replicarea se realizează rapid ( circa 100 nucleotide/sec) și cu mare fidelitate– reparativ.


2

2. Elemente implicate în replicarea ADN

A. Repliconul – fragment de ADN ce conțineori- originea replicării;

B. Monomeri și surse de energie :

a. Dezoxiribonucleotide activate : dATP, dGTP, dCTP și dTTP – unități de

polimerizare pentru noile catene de ADN;

b. Ribonucleotide activate: ATP, GTP, CTP și UTP – unități de polimerizare ARN

pentru primer (amorsa);

C. Proteine – sintetaze a. ADN-polimeraze α,δ,ε și γ;

b. Primaza

c. ADN-ligaza

D. Proteine ce pregatesc matrițele

a. Helicaze

b. Topoizomeraze

c. SSB-proteine

E. Proteine ce asigură reparația replicativă;

a. ADN-polimeraze β, δ,ε și γ;

F. Proteine – reglatori ai replicării.

2.1. Unitatea de replicare a ADNului - REPLICONUL

Replicarea ADN începe în situsuri specifice ale genomului numite origini ale replicării

(ori), la care se fixează proteinele de inițiere ale replicării – numit complexul pre-replicativ

(pre-RC); Secvenţa ori are următoarea structură :

ORE – secvenţa ADN-ului la care se unesc proteinele situs-specifice şi proteinele replicării;

DUE - situsul care uşor se despiralizează, este sensibil la nucleaze şi nesensibil la mutaţii;

A/T – situsul ce reglează activitatea helicazei;

AUX-2 şi AUX-1 – situsuri ce se unesc cu factorii de iniţiere ai replicării cu specificitate înaltă.

La nivelul întregului genom au fost identificate aproximativ 30-50000 de ori, iar repliconii au o

lungime de 2000kb.

Figura1. Particularitățile secvenței de replicare

autonomă la eucariote.

Originea replicării ADNului nuclear conține secvențe

consens recunoscute de factori reglatori ai ciclului

celular:

ACS (autonomously consensus sequence)

flancate de regiuni libere de histone, secvențe

bogate în A/T - DUE( unwinding elements),

recunoscute de ORC (origin recognition

complex).

In perioada G1

ORC interacționează cu un complex MCM2-7

formînd pre-RC (complex prereplicativ cu

helicase inactive) ce reține replicarea pînă în

perioada S;

În perioada S

complexul pre-RC interacționează cu CDK

(Cyclin-Dependent Kinases) ce activează

enzimele aparatului de replicare formînd

pre-IC (complex de inițiere a replicării).


3

3. Etapele replicării

Sinteza ADNului începe prin despiralizarea/denaturarea catenelor de ADN şi formare a

ochiului de replicare. Fiecare catenă reprezintă o matriţă pentru catena nou formată.

Despiralizarea este necesară pentru expunerea bazelor celor două catene în aşa mod ca noile baze

să le poată recunoaşte şi să formeze perechea complementară. Sinteza decurge bidirecţional: de

la fiecare punct de origine se formează două furci replicative în direcţii opuse faţă de origine.

Figura 2. Etapele replicării ADN cromozomial

Replicarea necesită un complex proteic numit ORC care recunoaşte punctul de origine a

acesteia şi o iniţiază. Proteina/proteinele de recunoaştere se leagă de ori şi iniţiază despiralizarea

locală a ADN în situsul DUE.

Complexul multifermentativ, numit replizoma, se mişcă de-a lungul ADN-ului şi

efectuează sinteza pe ambele catene ale ochiului replicativ. Replicarea ar putea fi văzută ca

creşterea continuă a noi catene de ADN în dublul helix. Este necesar de accentuat că:

Citirea matriţei se efectuează doar în direcţia 3′ 5′;

Sinteza catenei noi se efectuează doar în direcţia 5′3′.


4

3.1. Inițierea replicării ADN include urmatoarele evenimente:

(1.) Recunoașterea regiuni iori de către ORC;

(2.) Formarea complexului pre-replicativ (MCM cu două helicase inactive);

(3.) Activarea helicazelor și atașarea a cite o helicază pe o monocatenă de ADN;

(4.) Formarea replizomei= complex proteic compus din urmatoarele proteine:

o Primaza (ADN pol )

o ADN pol

o Helicaza

o Topoizomeraze

o Proteine SSB

Sub acțiunea helicazelor și topoizomerazelor dublul helix este despiralizat și denaturat,

iar catenele sunt separate temporar formand furca de replicare. După legarea helicazei,

proteinele SSB (single-stranded DNA binding) stabilizează ADN-ul monocatenar din furca de

replicare, ceea ce impiedică reîmperecherea bazelor complementare și refacerea spontană a

dublului helix. Din fiecare origine de replicare pleacă două furci de replicare care se îndepărtează

de locul de origine, desfăcând dublul helix de ADN pe măsură ce înaintează. Deci, replicarea

ADN-ului este bidirecțională.

Figura 3. Etapele replicării și responsabilii majori de fiecare etapă

Figură 4 Inițierea replicării - formarea ochiului replicativ.


5

Figura 5. Sinteza ARN-primer.

(5) Inițierea replicării - sinteza ARN-primer;

o un complex de proteine Primozomul format din helicază şi primază se deplasează

simultan cu furca de replicare şi este responsabil pentru sinteza unei secvențe de

ARN primer (amorsă)necesar inițierii replicării noilor catene ADN.

(6) Inceperea sintezei catenelor noi de ADN, elongînd primerii

o Adăugarea dNTP complementar matriței ADN de către ADN polimeraza cu

următoarele proprietăți:

Citirea matrițelor are loc doar în direcţia 3' → 5';

sinteza se produce doar în direcţia 5' → 3' prin adăugarea nucleotidului la

gruparea 3'-OH a pentozei nucleotidului precedent;

Figura 6. Elongația replicării.

3.2. Elongația include:

mărirea ochiului replicativ și sinteza concomitentă și bidirecționată a catenelor noi de ADN:

o de la ORI spre helicază se sintetizează catena nouă de ADN continuu de la un singur

primer;

o de la helicază spre ORI, pe măsura măririi ochiului replicativ se sintetizează catena

nouă discontinuu, din fragmente Okazaki care pornește fiecare de la un primer; se

sintetizeazămai lent și este numită catena întîrziată.


6

Figura 7. Sinteza bidirecționată a catenelor noi de ADN.

o Catena lider este sintetizată de ADN-polimeraza δ, iar fragmetele Okazaki ale

catenei întîrziate sunt sintetizate de ADN-polimeraza .

Figura 8. Furca replicativă și replisoma.

3.3. Terminarea-replicarea se oprește atunci când se întâlnesc furcile replicative a doi

repliconi vecini. Într-o fază mai avansată a replicării primerii sunt îndepărtați de ribonucleaza

H1, atât din structura catenei lider, cât şi din cea întârziată, după care golurile sunt umplute de

ADN polimeraza δ, iar aceste fragmente sunt apoi unite între ele de către o ADN-ligază prin

legături fosfo-diesterice.

Figura 9. Terminarea replicării.


7

Caracteristica principalelor proteine ce asigură replicarea ADNului

ADN-polimeraza catenei lider –

sintetizează o catenă nouă de ADN

complementară matriței: citește

nucleotidele catenei inițiale în direcția

3'5' și polimerizează dNTPuri în

direcția 5'3'; începe de la primer,

alunecă de-a lungul matriței după

helicază.

ADN-polimeraza catenei întîrziate –

sintetizează mai multe fragmente

Okazaki pentru o catenă nouă de ADN

complementară matriței: citește

nucleotidele catenei inițiale în direcția

3'5' și polimerizează dNTPuri în

direcția 5'3'; începe de la primer,

alunecă de-a lungul matriței de la

helicază şintetizînd un Okazaki, apoi alt

Okazaki…..

Topoizomeraza – despiralizează

molecula de ADN, relaxînd dublul

helix ce permite înaintarea

helicazei și alungirea furcii

replicative, ochiului replicativ

Helicaza- denaturează dublul

helix, scindînd punți de H, ce

permite înaintareaADN-

polimerazei catenei lider și sinteza

unui nou fragment Okazaki pe

catena întîrziată.

Primaza/ ADN polimeraza ɑ

sintetizează primerii (secvențe de

nucleotide ARN) pentru a ajuta

ADN polimeraza să înceapă sinteza

catenelor noi de ADN (! ADN

polimeraza nu poate începe sinteza

pe loc gol)

Proteinele SSB (single-

strandbindingproteins) stabilizează

matrițele, mențin separate cele două

catene inițiale și previn formarea

palindroamelor, facilitînd alunecarea

ADN polimerazelor pe matrițe.


8

ADN- helicazele, sunt enzime care hidrolizează ATP, producând ruperea legăturilor de hidrogen dintre cele două

catene parentale ADN;

ADN-topoizomerazele –relaxează dublul helix, scade numătul de spire/ kpb:

ADN- topoizomeraza I- induc rupturi monocatenare ADN;

ADN – topoizomeraza II – induc rupturi bicatenare ADN;

Proteinele SSB – facilitează activitatea ADN-polimerazelor:

Figura 10. Rolul proteinelor SSB

ADN – polimerazele - asigură polimerizarea nucleotidelor, sintetizând o catenă nouă de ADN numai, în direcția

5’→3’. ADN – polimeraza nu începe sinteza unei catene noi de ADN, ci numai o extinde, adăugând fiecare nou

nucleotid la gruparea 3’OH a nucleotidului deja încorporat. Unele ADN

polimeraze au capacitatea de relectură, verifică erorile, înlătură ultimul

nucleotid încorporat greșit – asigură reparația replicativă.

Există 5 tipuri de ADN- polimeraze:

ADN polimerazaα– sinteza catenei întârziate și sinteza ARN primer;

ADN polimerazaβ – repararea ADN;

ADN polimerazaγ – sinteza și repararea ADNmitocondrial;

ADN polimerazaδ - sinteza catenei lider și repararea ADN;

ADN polimerazaε - sinteza catenei întârziate și repararea ADN;

PCNA (Proliferatingcell nuclear activity) – complex proteic cu rol de

stimulare a activitații nucleare, alunecând pe matrița ADN permite

încorporarea neîntreruptă a nucleotidelor în catena nou sintetizată.

Primaza - enzima responsabilă de sinteza unei mici molecule de ARN cu

rol de primer a replicării. Primerul este un fragment oligonucleotidic

ARN de 5‐10 nucleotide, ce oferă ADN polimerazei un capăt 3’‐OH liber.

Ribonucleaza H1 (RNaza H1) - enzima ce intervine în degradarea

primerului ARN la finalizarea replicării.

ADN – ligaza - este enzima implicată în refacerea legaturilor fosfo–

diesterice și sudarea capetelor ADN din catena nou sintetizată în timpul

terminării replicării.

Figura 11. Polimerizarea nucleotidelor și

proprietatea ADN polimerazei de

autocorecție a greșelilor de împerechere

a nucleotidelor în timpul replicării.


9

4. Modele de replicare

4.1 Replicarea ADN-nuclear

este un proces foarte complex deoarece genomul nuclear este enorm, asociat cu

proteine, cu diferite nivele de compactizare;

se desfășoară în condiții stricte – numai în faza S a ciclului celular,

este multirepliconică– începe în mai multe puncte de origine (ori), ce corespund unui

replicon- numită unitatea de replicare independentă ADN;

Figura 12. Replicarea ADNului cromozomial asincronă și multirepliconă.

este asincronă – regiunile de eucromatină se replică precoce la începutul fazei S, în timp

ce heterocromatină se replică tardiv la sfârșitul fazei S;

este multiproteică– implică un număr mare de proteine și enzime numit replizom sau

aparat de replicare;

O particularitate a replicării ADN

eucariotic este că capătul 5′ al catenei noi

este mai scurt, deoarece nu există

posibilitatea completării golului după

înlăturarea primerului ultimului fragment

Okazaki. Astfel apare riscul ca în

succesiunea generaţiilor de molecule să se

scurteze cromozomii, ceea ce ar putea

cauza pierderea informaţiei genetice de la

capătul lor. Pentru prevenirea pierderilor

de secvenţe terminale de ADN capătul

cromozomului este prevăzut cu o structură

specială (telomerul) cu un mechanism

propriu de sinteză.

Regiunile telomerice ale cromozomilor se replică după un mecanism special, cu

participarea enzimei telomeraza, format dintr-o proteină cu funcţie de reverstranscripţie

ce conţine ARN în calitate de matriță.

Figură 13 Particulatitățile terminării replicării ADNului crs


10

4.2. Replicarea telomerelor

Particularitățile telomerelor:

Telomerii sunt secvențe repetitive de ADN (TTAGGG)n localizate la terminațiile

cromozomilor la majoritatea organismelor eucariote, care asigură protecţia şi

stabilitatea cromozomilor.

Replicarea ADN la nivelul capetelor cromozomilor este incompletă: la capătul 5’

al catenei noi sintetizate există o mică regiune nereplicată;

Telomeraza- enzima ce asigură replicarea ADN telomeric şi “repară” telomerele.

Telomeraza este formată din:

Revers-transcriptaza telomerazică

TERT(complex proteic);

O moleculă de ARN – telomerazic TERC cu

lungimea de 451 n., ce include o scurtă regiune

complementară cu repetiţia telomerică: la om -

5’– CAAUCCCAAUC – 3’;

disckerina(DKS1) – proteina ce asigură

foldingul și stabilitatea Revers-transcriptazei.

- este activă în celulele germinale şi la embrion, se

inactivează postnatal (excepţie celulele stem) ;

- extinde capul 3’ al catenei ADN parentale ;

- nu necesită primer separat,foloseşte capul 3’-OH al catenei parentale;

- pe post de catenă matriţăf oloseşte ARN-ul propriu ;

- se desprinde de pe catena ADN, se deplasează spre capul 3’ şi se reașează repetînd

elongarea 3'.

Replicarea telomerelor:

(1.) Telomeraza se aşează cu ARN-ul propriu

în regiunea de complementaritate a monocatenei

ADN de la capul 3’-OH;

(2.) Telomeraza extinde această monocatenă

ADN, folosind drept primer capătul 3’-OH al

acesteia, iar drept matriţă – propriul ARN;

(3.) Telomeraza repetă de multe ori acest

ciclu, alungind la capătul

3’multerepetiţii[TTAGGG ];

(4.) Telomeraza se desprinde complet;

(5.) Capătul 5’ este extins, pe modelul unei

catene întârziate, de către o ADN polimezază

“obişnuită”.

În final, la eucariote cromozomii au capul 3’

extins, prelungit monocatenar.

Figură 14 Replicarea telomerilor


11

4.3. Replicarea ADNmit

Se realizează pe parcursul interfazei, nu este limitată în faza S;

Deoarece ADN mitocondrial are structură inelară, fiecare catenă conține un câte

un situs de inițiere (ori);

Enzima polimerazică – ADN polimerazaγ, care sintetizează în direcţia 5' → 3'

prin adăugarea nucleotidului la gruparea 3'-OH a pentozei și citirea are loc doar

în direcţia 3' → 5'; ADN polimerazaγ este ajutată de helicaze, topoizomeraze,

primază, SSB proteine, ARNaza H1, ADN-ligaza.

Replicarea este asincronă după modelul D:

Începe de pe catena grea (H);

Când furca de replicare ajunge la punctual ori al catenei uşoare (L) începe

replicarea acesteia în sens opus.

Figura 15. Modelul D de replicare a ADNului mitocondrial


12

Particularitățile replicării ADNului bacterian :

Deși mecanismul de replicare procariotic nu se diferențiază mult de cel eucariot, acesta totuși are niște

particularități:

o Cromozomul bacterian este un replicon unic, adică are o singură secvenţă de origine a replicării.

Moleculele circulare ale procariotelor (nucleoidul, plasmidele) se replica prin mecanismul replicării de

tip . Din situsul ori pornesc concomitant două furci replicative, ceeace duce la formarea unor structuri

asemănătoare cu literagrecească (teta); cele 2 furci de replicare se întâlnesc la nivelul secvenţei ter

spre deosebire cromozomul de tip eucariot care are o structură lineară, iar capetele lui (denumite

telomere) se replica diferit de restul cromozomului.

Cele mai importante proteine ale aparatului de replicare bacterian sunt:

- Primaza: la bacterii estedenumită proteina DnaG;

- Proteinele de iniţiere: DnaA, DnaB, DnaC şi DnaT

o Iniţierea replicării presupune detaşarea secvenţei ori C de membrane plasmatică, după

ce, în prealabil, a fost atinsă o anumită masa celulară (denumitămasă de iniţiere) şi

înurma acumulării unei cantităţi substanţiale de fosfolipide acide pe faţa internă a

membranei plasmatice;

- Proteina DnaB - funcţie de helicază;

- Topoizomeraza la procariote este denumită – giraza;

- ADN polimerazele I, II și III;

- Proteine SSB.


13

5. Rolul biologic al replicării

Replicarea ADN-ului reprezintă procesul molecular de sinteză a doua molecule de ADN

identice prin copierea unei molecule de ADN inițiale. Astfel, fiecare moleculă ADN nou formată

reprezintă o copie a moleculei de ADN parentale, care va conduce la dublarea cantității de ADN

și transmiterea informației ereditare în succesiunea generațiilor de celule și organisme. ADN

nuclear se replică numai în faza S a ciclului celular, iar ADN mitocondrial pe tot parcursul

interfazei. Acest proces se desfășoară, de regulă, cu mare exactitate și reprezintă una din funcțiile

esențiale ele materialului genetic.

Perioada G1 – Celula rezultată din mitoză moștenește de la celula mamă -

Cromosomi monocromatidieni, decondensați (cromatină);

Perioada S – Celula primește semnale mitogene, se activează complexele de inițiere a replicării

și se desfăsoară REPLICAREA:

Multireplicon – din mai mulți ORI concomitent;

Asincron – segmentele de eucromatină se replică mai precoce, cele de heterocromatină

– spre sfîrșitul perioadei S;

Cromozomii devin bicromatidieni – cele două cromatide surori conțin cîte o moleculă

de ADN identice, ce rămîn unite prin centromer pînă în Anafază.

Perioada G2 – Celula cu cromozmi bicromatidieni, decondensați se pregătește pentru mitoză:

Figură 16 Perioadele ciclului celular și evoluția cromozomilor


14

Verificarea dublării exacte a ADNului cromozomial;

Verificarea și repararea erorilor din moleculele nou sintetizate de ADN;

Acumularea factorilor necesari desfășurării mitozei.

Mitoza – diviziunea ecvațională a celulei somatice:

Profaza – condensarea cromatinei și transformarea ei în cromozomi, maximal

condensați și bicromatidieni; disocierea anvelopei nucleare; interacțiunea cromozomilor

cu fusul mitotic;

Metafaza – alinierea cromozomilor bicromatidieni la ecuatorul celulei;

Anafaza – clivarea centromerului, separarea cromatidelor surori spre poli opuși ai

celulei;

Telofaza – cromozomii monocromatidieni ajung la polii celulei, decondensează (se

transformă în cromatină); se reface anvelopa nucleară pentru doi nuclei genetic identici.

Citochineza – separarea citoplasmei cu formarea a două celule fiice.

Astfel replicarea :

A. Asigură sinteza matricială a moleculelor de ADN cu dublarea exactă a IG;

B. Dublarea exactă a IG determină transmiterea IG:

i. Altor celule prin mitoză sau

ii. Altor generații prin mitoză și fecundație;

C. Transmiterea IG din generație în generație asigură autoreproducerea celulelor /

organismelor și stă la baza eredității caracterelor de familie, de populație, de specie.


15

6. Reparația ADN

Leziunile ADN-ului celular sunt frecvente și se produc în orice perioadă a interfazei, în

timpul replicării normale sau independent de ea. Defectele din ADN sunt supuse procesului de

reparare care scade probabilitatea de apariţie a mutaţiilor, iar acuratețea replicarii este critică

pentru transmiterea informației genetice. În corpul uman secvenţa şi structura ADN-ului sunt

deteriorate cu o rată de 10 000 – 1 000 000 leziuni moleculare / zi / celulă – 0,000165% din

genomul unei celule umane este afectat zilnic.

Repararea este proprietatea unică a moleculelor de ADN de a-și restabili structura

primară, inițială.

Repararea ADN este reprezentată de un complex enzimatic capabil:

Să identifice greşelile din ADN – proteine de recunoaștere;

Să înlăture fragmentul de ADN cu eroare - endonucleaze;

Să sintetizeze un nou fragment – ADN-polimeraza;

Să integreze fragmentul în macromolecula de ADN bicatenară - ADN-ligaza.

Principiile de realizare a repararii ADN:

Matricial - una din catenele ADN este matriță în timpul reparării celeilalte catene de

ADN;

Complementar catenei matriță.

Mecanismele posibile de producere a erorilor în moleculele de ADN

erori de replicare a ADN, prin împerecheri greşite (“mismatch”) a nucleotidelor în

catena nou sintetizată.

leziuni provocate în ADN de factori mutageni exogeni sau endogeni (fizici sau chimici

sau biologici)

- dezaminare,

- depurinare,

- demetilare.

Leziunile la nivelul ADN–ului pot apare:

la nivelul structurii primare a moleculei de ADN prin

modificarea chimică a bazelor azotate (dezaminarea, oxidarea, etc.);

înmerecherea incorectă a bazelor azotate;

depurinizarea nucleotidelor.

la nivelul structurii secundare a moleculei de ADN

afectează împachetarea ADN-ului cu histone;

ruperea catenelor de ADN (cu rearanjarea incorectă a fragmentelor, deleții,

inserții).

6.1 FACTORI CE INDUC LEZIUNI LA NIVELUL ADN–ului:

Factori endogeni:

replicarea eronată a ADN-ului;

transpozonii (inserții în regiunile codificatoare sau reglatoare ale genelor);

speciile reactive de oxigen generate prin procesele oxidative normale –

respiraţie, generare ATP.

Factori exogeni:

Agenți chimici reactivi (modificarea bazelor azotate, împerechere greșită);

Analogi de baze (împerechere greșită);

Agenți de intercalare (împerechere greșită);

radiaţia UV (200 – 400 nm) emise de soare sau din surse antropice (apariția

dimerilor pirimidinici);


16

radiaţiile X sau Gamma ( ruperea catenelor de ADN)

temperatura ridicată (depurinizarea– pierderea bazelor purinice);

toxine – de origine vegetală, animală sau fungice – aflatoxinele (depurinizare,

afectează eficiența reparației, produc specii reactive de oxigen ce duc la

împerecheri eronate de baze azotate);

Viruși (inserții în regiunile codificatoare sau reglatoare ale genelor);

Metalele – As (arsenium), Cd (cadmiu), Cr (crom), Ni (nikel) – pot induce

apariția radicalilor liberi ce modifică bazele azotate, pot afecta desfășurarea

reparației).

In structura normală a ADNului bazele azotate se află sub forma tautomerică: keto sau

amino. In unele condiţii, care se întalnesc mai rar acestea pot trece in formele enol și imino, prin

deplasarea unui proton (H+) ce pot forma împerecheri greșite: C-A (forma rară), T-G (forma

rară).

Alchilarea bazelor poate induce împerecherea greșită a bazelor

Agenţii de intercalare (proflavina, acridin-oranj) se intercalează între perechile de baze

și mimează dispunerea acestora. In stare intercalată agenţii de intercalare favorizează deleţiile

sau inserţiile.

Razele ultraviolete pot induce formarea dimerilor de T (2 baze de pe aceeași catenă

formează legături covalente). Aceste legături pot fi de tip C5-C6 cu formare de structură de tip

ciclobutil sau pot fi de tip C4-C6.

Figura 17. Formarea dimerilor de Timină sub acțiunea UV.


17

Aflatoxina B1 este un carcinogen puternic descoperit prima data la alune infectate cu

ciuperci. Aflatoxina B1 se leagă de N7 a guaninei, care cauzează ruperea legăturii glicozidice

dintre bază și pentoză, astfel rămane un situs apurinic.

Figura 18. Depurinizarea Guaninei și consecințele asupra replicării ADNului

Modificarea bazelor poate avea loc prin reacţii de dezaminarea a altor baze. Dezaminarea C are

ca rezultat formarea U. Uracilul poate forma legături de H cu A, iar la replicarea ulterioară a

ADN pe catena nou sintetizată in locul G va fi A. In unele cazuri (forma ionizată a U) poate

forma legături de H si cu G. Dezaminarea 5-metil citozinei (se presupune că 5-metil-C participă

la inactivarea genelor) va avea ca rezultat o T.

Figura 19. Dezaminarea Citozinei.

Erorile datorate replicării (introduse de ADN polimerază) sunt rare, 1 la 100 mln

pb.Toate organismele posedă mecanisme de reparare a ADN. Mitocondria nu posedă mecanisme

de reparare a ADN, acest fapt explică rata mare a erorilor în ADNmt.


18

6.2 TIPURI ȘI MECANISME DE REPARAȚIE A ADNului:

Reparația erorilor de împerechere a nucleotidelor din cursul replicării

(“mismatch repair” = MMR)

Reparația bazelor /nucleotidelor modificate după replicare:

» excizie a bazelor (BER)

» excizia nucleotidelor (NER)

Reparația rupturilor ADN (sistemul HR)

• Mecanismele de reparare (MMR, BER, NER) diferă prin ţinta lor dar modul de acţiune

este asemănător (implicând multiple gene şi enzime “mutator”); Enzimele de reparare

sunt codificate de anumite gene (MSH, MLH, PMS) numite şi gene “mutator”

• Mutaţiile acestor gene → predispoziţie la cancer.

Figura 20. Mecanisme de reparație a leziunilor din ADN și factorii proteici specifici fiecărui tip de reparație

concordant cu tipul defecturlui. Abrevieri: AGT, O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase; ATM, ataxia

telangiectasia mutated; BER, base excision repair; DR, direct repair; GG-NER, global genome NER; HR,

homologous recombination; 06MeG, O6-methylguanine; MMR, mismatch repair; NER, nucleotide excision

repair; NHEJ, non-homologous end joining.

• Etapele reparației:

– recunoaşterea defectului din molecula de ADN (biomarcatori specifici erorii);

– excizia fragmentului de ADN modificat (←endonucleaza)

– îndepărtarea şi degradarea fragmentului (←helicaza, exonucleaza)

– refacerea, sinteza secvenţei normale (←ADN polimeraze) = reparare

– legarea secvenței sintetizate în catena reparată (← ADN ligaza)


19

Reparația erorilor de împerechere a nucleotidelor “mismatch repair” = MMR

În cursul replicării se produc frecvent erori de împerechere (“mismatch”) cu frecvența

de 1:10.000 nucleotide = 10-4

ce determină mutaţii. Organismul uman are posibilitatea

corecţiei lor. Rata mutaţiilor este menţinută la un nivel scăzut (10-10

) prin intervenţia unor

mecanisme de recunoaştere şi reparare a leziunilor (“controlul calităţii ADN”). Acţiunea lor

este cuplată cu mecanismele de control a progresiei prin ciclul celular şi cu apoptoza G1 → Go

→ ± reparare → G1 sau apoptoză. Dacă NU au o eficienţă absolută în final, se produce o

mutaţie nouă la fiecare replicare / diviziune celulară.

Repararea bazelor nepotrivite – nucleotidele

încorporate greșit în timpul replicării formează o buclă,

enzimele reparatorii excizează nucleotidul incorect, iar

ADN polimerza il adaugă pe cel corect, legătura

fosfodiesterică este refăcută de către ADN ligază. Aceste

împerecheri greșite se întalnesc mai des în regiunile cu

secvenţe repetitive, ADN polimeraza introduce erori mai

des în cazul acestor secvenţe. Secvenţele repetitive sunt

frecvente în genomul uman (mini și microsateliţii). ADN

polimerazele recunosc erorile de împerechere (prin variaţia

diametrului moleculei de ADN) şi le corectează iar

numărul erorilor scade de la 10-4

la 10-6

.

Mecanismul de proof-reading - eliminarea bazelor

azotate introduse greşit de domeniul catalitic al ADN-

polimerazei prin intermediul unei activităţi 3'-5' exo-

nucleazice a ADN-polimetazei.

Leziunile la nivelul unei singure catenei de ADN – sunt reparate pe baza informatiei de pe catena

complementară prin acţiunea unor mecanisme de excizie-reparaţie, ce taie secvența cu defect şi

resintetizează porţiunea de ADN după principiul complementaritații.

Figura 21 Autocorecția erorilor de către ADN polimerază pe parcursul replicării


20

Au fost descrise două tipuri distincte de mecanisme de excizie-reparaţie:

A. prin excizia şi inserţia unei singure baze - base excision repair (BER) – se repară

defectele ce afectează o singură nucleotidă prin următoarele etape:

Recunoașterea defectului din molecula de ADN (o bază

modificată, o ruptură monocatenară) de către un factor de recunoaștere

specific defectului.

Înlăturarea bazei greșite prin acţiunea unor glicozilaze şi

obţinerea unui situs AP;

Înlăturarea nucleotidei fără bază cu ajutorul unei AP-

endonucleaze;

Completarea golului cu un dNTP complementar catenei intacte

realizată de o ADN polimerază specifică;

Integrarea nucleotidului inserat în catena reparată realizată de o

ADN ligază.

Figura 22. Reparația BER

B. prin excizia şi inserţia uneia sau a mai multor nucleotide - nucleotide excision

repair (NER) – repară defectele ce afectează una sau mai multe nucleotide prin:

Recunoașterea defectului din molecula de

ADN (dimerului) de către un factor de recunoaștere

specific defectului.

Clivarea catenei de ADN cu defect de către

endonucleaze;

Înlăturarea fragmentului de 24-32 de

nucleotide ce conține defectul cu ajutorul helicazei;

Completarea golului cu un dNTPuri

complementare catenei intacte de o ADN

polimerază specifică;

Integrarea fragmentului sintetizat în catena

reparată de o ADN ligază.

Figura 23. Reparația NER.


21

6.3 ROLUL BIOLOGIC ȘI ROLUL MEDICAL AL REPARAȚIEI ADNului UMAN

Diferiți factori mutageni exogeni sau endogeni, fizici, chimici sau biologici determină

diferite defecte în molecula de ADN. Erorile se pot produce în diferite perioade ale ciclului

celular. Gardienii ciclului celular semnalizează defectele, blochează evoluția ciclului celular și

activează sistemele de reparație corespunzătoare tipului de modificare în molecula de ADN,

pentru evitarea acumulării și transmiterii acestora altor generații de celule. În caz că reparația nu

s-a produs celula este încurajată să-și activeze mecanismul de apoptoză. Dacă celula nu poate

realiza reparația și evită apoptoza – mutațiile se acumulează, se transmit altor generații de celule

perturbînd dezvoltarea sau producînd clone tumorale (cancere).

Figura 24. Abbrevieri: cis-Pt and MMC, cisplatin and mitomycin C, respectively (both DNA-cross-linking agents); (6–4)PP and CPD, 6–4 photoproduct and cyclobutane pyrimidine dimer, respectively (both induced by UV light); BER and NER, base- and nucleotide-excision repair, respectively; HR, homologous recombination; EJ, end joining.

replicarea si repararea adn 2015

Documents