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Prof. F. BourgaudDir. Laboratoire Agronomie et Environnement (UMR INRA – Univ. de Lorraine)VP Recherche Plant Advanced Technologies PATfrederic.bourgaud@plantadvanced.com
Plantes médicamentsPlantes à traire
Métabolisme secondaire des végétaux
Métabolisme primaire = métabolisme de base
Métabolisme secondaire = métabolisme de l’adaptation
Réponse/tolérance aux stress biotiques ou abiotiques
Polyphénols
- Flavonoïdes
- Stilbènes
Terpènes
- Composés à HE
- Caroténoïdes
Alcaloïdes
- Indoliques
- Tropaniques
Les plantes comme sources de médicaments
3
Vinblastine
Taxol
Camptothécine
Catharanthus roseus
Taxus baccata
Camptotheca acuminata
Quelle ressource végétale pour répondre aux besoins en ingrédients actifs végétaux ?
� Des plantes facilement disponibles
� Biodiversité végétale concentrée dans les zones équatoriales
� Comment rationaliser l’approvisionnement ?
� Technologie des bioréacteurs de cellules végétales
Des succès (Taxol® BMS-Phyton)mais d’une portée limitée
Réacteurs (Protalix)
4
� Une matière végétale fortement titrée en principes actifs
� La teneur en M2 résulte d’une interaction complexe G x E
� Cultures/récoltes conventionnelles
Ruta graveolens0%
25%
50%
75%
100%
root stem leaf fruit
fura
no
co
um
ari
ns %
Compartment
psoralen xanthotoxin isopimpinellin bergapten
O O O
OCH3
OCH3
O O O
OCH3
O O OO O O
OCH3
Milesi et al., Plant Sci. 161 (2001) 189-199
Spécifique aux racines
Plantes de 6 mois :
3.8 mg (+/- 1.7 mg) de furanocoumarines
Exsudé par les racines en 24h
Gontier et al., Plant Sci. 163 (2002) 723-732
Plants de 3 ans :
0.20 mg (+/- 0.16 mg) de paclitaxel
Exsudé par les racines en 24h
Cultures hydroponiques
Plantes de 2 mois:
0.7 mg (+/- 0.17 mg) d’alcaloïdes tropaniques
Exsudé par les racines en 24h
Ruta graveolens Taxus baccata Datura innoxia
Après permeabilisation
4.5 mg (+/- 1.2 mg) de furanocoumarines
Exsudé par les racines en 24h
2.1 mg (+/- 1.0 mg) de paclitaxel
Exsudé par les racines en 24h
5.0 mg (+/- 1.5 mg) d’alcaloïdes tropaniques
Exsudé par les racines en 24h
Observations de laboratoire
Alcaloïdes tropaniques de Datura
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Alc
alo
ïde
s p
ar
pla
nte
(m
g/p
lan
t)
Alcaloïdes dans le milieu (mg)
Alcaloïdes dans la plante (mg)
6
Amélioration du rendementen métabolites secondaires
� Composante Génétique
7
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
A B C D E
Teneur en dérivé d’acide caféique (mg/g MS de racine)
Variétés, plante X
a a
b b
c
Variabilité intra-spécifique
Amélioration du rendementen métabolites secondaires
8
� Composante Environnement� Nutrition
Le Bot et al., J Exp Bot 2009
� Facteurs abiotiques
Suivi de l’expression de l’orf c2’h
Vialart et al., Plant J 2012
� Facteurs biotiques
Larbat et al., JBC 2007
Ajout d’éliciteurs (Pmg)
PAT plantes à traire®
Un nouveau procédé de production d’actifs naturelsà partir de végétaux
Brevet WO0133942 9
Société & objectifs
10
Objectifs:
� Développer des plateformes végétales innovantes
� Produire des molécules naturelles rares à destination des marchés
cosmétiques et pharmaceutique
� Préserver et valoriser les ressources végétales
• Récompensée : Concours du Ministère de la Recherche, tremplin Entreprise (Sénat-ESSEC), Lauréat 2006 Prix Pierre Potier « L'innovation en chimie au bénéfice de l'environnement »
• Société créée en 2005 à Nancy - France
(essaimage de l’INPL-ENSAIA/INRA)
• Cotée sur NYSE Euronext depuis juillet 2009
• Aujourd’hui composée de 25 personnes
11
SolventCuve
d’exsudation
CultureCulture ExudationExudationChoix desespècesChoix desespèces
IngrédientactifIngrédientactifStimulationStimulation
Développementdes plantesCulture
aéroponique
Tablettesmobiles
Systèmed’irrigation
Eliciteur, precurseur, optimisation des
conditions de culture
Recyclage des plantes pour un
nouveau cycle de production (3 à 8 /an)
Procédé PAT Plantes A Traire ®
12
0,125
0,25
0,75
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
récolte
traditionnelle*
récolte après
optimisation*
PAT
Rendement en polyphénols (g/m²/an)
PAT plantes à traire®: Exemples de rendements
� Dans ces conditions de rendement1000m² de production = 6000 m² en champ !
Acide gallique et dérivés
x2
x3x6
par élicitation
13
0,06
0,15
0,45
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
récolte
traditionnelle*
récolte après
optimisation*
PAT
Rendement en alcaloïdes (g/m²/an)
PAT plantes à traire®: Exemples de rendements
� Dans ces conditions de rendement1000m² de production = 7500m² en champ !Scopolamine et apparentés
x2,5
x3x7,5
Datura innoxia
par ajout de précurseurs phenylalanine et ornithine
14
0,02 0,6
3
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
récolte
traditionnelle*
récolte après
optimisation*
PAT
Rendement en dérivés d'acide caféique
(g/m²/an)
PAT plantes à traire®: Exemples de rendements
�Dans ces conditions de rendement : 1000m² de production = 15 ha en champ !
x30
x5
x150
Acide chlorogénique et dérivés
par optimisation du milieu nutritif
PATplantes à traire®Avantages
15
Procédé écologique : préservation des plantes et production durable
Accès à des composés à haute valeur ajoutée issus de plantes rares ou difficiles à cultiver (>200 espèces)
Haut rendement par la stimulation
La racine est la partie la plus riche de la plante et la moins étudiée
Accès au profil phyto-chimique unique et meilleure pureté
Echelle de production facile et rapide à adapter
Sécurité d’approvisionnement
Processus de production (4000m² de serre instrumentée en 2012) incluant le management de la qualité selon ISO9001
���� Une opportunité pour produire ou revisiter des « hits » issus de végétaux
Nouvelles approches : ingénierie métabolique
D’après Aharoni et al., 2006, Trends in Plant Sci.
Consortium européen Smartcell (FP7)
16
� Synthèse de monoterpènes chez le tabac (Projet EU SMARTCELL)
O P
O
O-
O P
O
O-
O-Geranyl diphosphate
OH
Geraniol
OH
OH
10 hydroxy-geraniol
Geraniol synthase (Veronica officinalis)
Geraniol 10 hydroxylase (Arabidopsis / Catharanthus)
P450 reductase (Arabidopsis)
Néosynthèse de monoterpènes
chez le tabac
N
N
H
H3C
H3CO
CH3
O
O
CH3
OHH
O
OCH3
N
NH
O
OCH3
CH3
OH
17
Nouvelles approches : ingénierie métabolique
Production de protéines recombinantes par des végétaux
� Procaryotes
• Bactéries
� Eucaryotes
• Levures
• Cellules animales
� Cellules de hamster (CHO)
� Cellules d’insectes (baculovirus)
• Plantes
18
PAT Vendredi®Un nouveau système d’expression
pour la production de protéines recombinantes végétales
Patent WO/2008/040599 20
Interferon Y humain
Drosera Protéines humaines recombinantes
Facteur intrinsèque de Castle humain
Témoin FI Plante
transforméePlante témoin
WT
Plante témoin
WT
Plantes
transformées
Témoin IFN Y
Modèle Nepenthes
Production des premières protéines recombinantes PAT Friday®
23
� Récolte aisée
� Purification & downstream process simplifiés
� Stérilité possible
� Montée en echelle facile
� Activité Protease controlée
PAT Friday®
Avantages
24
Merci de votre attentionRemerciements à tous nos collaborateurs :
Dr. Flore Biteau
Sissi Miguel
Benoit Mignard
Jean-Marc Lainé
Dr. Paul Hannewald
Estelle Muller
Cindy Michel
Jean-Paul Fèvre
Dr. Alain Hehn
Prof. E. Gontier
Alain Clément
Prof. Guckert
Audray Dugrand 25
Comparaison des systèmes d’expression hétérologue
Sécurité sanitaire Maturation des protéines
Immunogenicité Sécurité technologique (confinement)
Coût économique
E. Coli Pyrogénicité (endotoxines)
NON NON OUI €€€
Levure Pyrogenicité (endotoxines)
OUI OUI OUI €€€
CHO Risques théoriques liés aux maladies (prions, virus) , ADN oncogénique
OUI NON OUI €€€€€€
Cellules végétales en réacteur
Pas de risques théoriques
OUI OUI parfois OUI €€€
Plantes entières Pas de risques théoriques
OUI Oui parfois OUI si serresNON si plein champ
€
27
Expression de GFP
Drosera Gènes marqueurs(GFP et GUS)
Trichome
Papier filtre avec des taches fluorescentes
Preuve de concept PAT Friday®
28
Ma
rqu
eu
r d
e
po
ids
(KD
a)
Flu
id e
issu
de
N.
ra
ffle
sia
na
Flu
id f
rom
N.
ve
ntr
ico
sa
Flu
ide
issu
de
N
. a
lata
20
26
34
4786
120
20
26
34
4786
120
20
26
34
4786
120
34
SDS-Page sur des fluides de feuilles de Nepenthes pitcher
���� PURIFICATION facilitée (sterilité possible)
Ma
rqu
eu
r d
e
po
ids
(KD
a)
Etude des protéines foliaires de Népenthes
29
Zymogramme
pH5
Fluide
d’urne
fermée
Fluide
d’urne
ouverte
Zymogramme
pH7
Fluide
d’urne
fermée
Fluide
d’urne
ouverte
Zymogramme,
pH3
Fuilde
d’urne
fermée
Fluid
d’urne
ouverte
Nepenthacine
� Zymogramme� Gel + Gelatine + pH 3 / 5 / 7 à 37°C pendant 12H
Evaluation de l’activité protéase chez Nepenthes
31
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