日本標準商品分類番号872491 カリジノゲナーゼの …21kda コントロール 0.1 11...
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カリジノゲナーゼは強力な血管拡張物質であるキニンを遊離することにより、高血圧や末梢循環障害の治療に広く用いられてきた。最近では、糖尿病モデルラットにおいて増加する眼内液中 VEGF 濃度を低下させることにより、血管透過性を抑制することが示されたが、血管新生に対するカリジノゲナーゼの影響を評価した報告はない。そこで今回、網膜血管新生に対するカリジノゲナーゼの役割を同定するため、in vitro 及びin vivoモデルを用いて抗血管新生作用を検討した。
<試験方法>
カリジノゲナーゼの血管新生抑制作用
1)管腔形成試験 (in vitro) ヒト臍帯静脈内皮細胞 (以下 HUVEC) と皮膚線維芽細胞の共培養系モデル(血管新生キット、クラボウ)を用いた。
あらかじめ培地中に血管新生促進物質であるVEGF165 10ng/mL を添加し、その培地にカリジノゲナーゼをそれぞれ0.01、0.1、1.0 および 10μg/mL となるよう添加した。培養11日目に、解析ソフト(血管新生キット定量ソフトウェア Ver.2、クラボウ)を用いて、新生血管の管腔面積、総延長、分岐点数および枝数を測定した。
2)細胞増殖試験 (in vitro) 1well あたり2×103cell の HUVEC またはヒト網膜毛細血管内皮細胞 ( 以下 HRMEC) を96穴マイクロプレートに
播種した。VEGF165および各濃度のカリジノゲナーゼを添加後、CCK-8 を用いた WST assayを行い、吸光度(492nm)を測定することにより定量した。
3)細胞遊走試験 (in vitro) 1well あたり4×104cell の HUVEC または HRMECを12穴マイクロプレートに播種した。細胞の一部をはがし取り、
VEGF165 および各濃度のカリジノゲナーゼを添加し、24時間後にその領域に移動してきた細胞数の測定を行った。4)細胞増殖および細胞遊走シグナルについての western blot 解析 (in vitro) HUVEC 1×105 細胞 / ウェルの密度で12 ウェルプレートへ播種し、サブコンフルエンスの状態になるまで培養を行
った。VEGF165 およびカリジノゲナーゼを添加し、VEGF2 型受容体(以下 VEGFR2) は添加 2分後、ERK1/2 および p38 は添加 5 分後にそれぞれ VEGF165 誘発リン酸化抑制作用についてwestern blot 解析を行った。さらに、検出試薬を用いてバンドを発色させ、その輝度を測定することにより定量化した。
5)VEGF165 切断試験 (in vitro) Cell-free の状態で、培地中に VEGF165 およびカリジノゲナーゼを混合して 6 時間反応させ、 western blot により
バンドを検出した。6)マウス未熟児網膜症モデル(以下 OIR モデル)に対する作用(in vivo) 本モデルは C57BL/6マウスを生後 7~12 日目まで 75%高酸素条件下で飼育し、その後13~17日目まで通常
大気条件下で飼育することにより網膜中に異常血管を誘発させる。本試験では、生後13~17日目までの5日間、カリジノゲナーゼを皮下投与した。
7)ヒト硝子体液中カリジノゲナーゼ、VEGF 濃度 (in vitro) 硝子体手術を施行した増殖糖尿病網膜症(PDR)、黄斑円孔(MH)、黄斑上膜(ERM)患者の硝子体液中カリジノゲナ
ーゼ濃度及び VEGF濃度を測定するとともに、カリジノゲナーゼによる硝子体液中 VEGF165 の切断作用を検討した。
日本標準商品分類番号 872491
21kDa
コントロール 0.1 1 10 μg/mlカリジノゲナーゼ
VEGF165
VEGF165断片16kDa
p38のリン酸化率
0
0.5
1
1.5
2
コントロール 生食
##
10
†
10 μg/mlカリジノゲナーゼ
VEGF165
*
##
細胞遊走率
0
0.5
1
1.5
2
2.5
コントロール 生食 0.1 1 10 10 μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165
**
コントロール 生食カリジノゲナーゼ
VEGF165
10μg/ml 10μg/ml
500μm 血管新生
血管内皮細胞
##:p<0.01(student t-test)**:p<0.01、*:p<0.05
(Dunnett の多重比較)コントロールを 1とした相対比
##:p<0.01、†:p<0.05(student t-test)コントロールを 1とした相対比
VEGF165 の切断作用
血管新生抑制作用(HUVEC)
p38のリン酸化抑制作用(HUVEC)
細胞遊走抑制作用(HRMEC)
VEGF165の血管新生作用とカリジノゲナーゼの抑制作用VEGF165
リン酸化
リン酸化
VEGFR1
細胞遊走
p38
コントロール 生食
VEGF165
VEGF165
カリジノゲナーゼ(0.01μg/ml)
カリジノゲナーゼ(0.1μg/ml)
カリジノゲナーゼ(1.0μg/ml)
カリジノゲナーゼ(10μg/ml)
500μm
10APMAEGGGQN
20HHEVVKFMDV
30YQRSYCHPIE
40TLVDIFQEYP
50DEIEYIFKPS
60CVPLMRCGGC
70CNDEGLECVP
160LELNERTCRC
165DKPRR
80TEESNITMQI
90MRIKPHQGQH
100IGEMSFLQHN
110KCECRPKKDRC102-K107(m/Z849)
120ARQENPCGPC
130SERRKHLFVQ
140DPQTCKCSCK
150NTDSRCKARQ
VEGF165のアミノ酸配列
管腔面積
00.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
コントロール 生食
##
0.01 0.1 1 10μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165
**
**
分岐点数
0123456789
コントロール 生食 0.01 0.1 1 10μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165
**
** **
枝数
00.511.522.533.544.5
コントロール 生食 0.01 0.1 1 10μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165
**
****
総延長
00.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
コントロール 生食 0.01 0.1 1 10μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165
**
**
*
##
細胞増殖率
0
0.5
1
1.5
2
コントロール 生食 0.1 1 10 10 μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165
*
VEGF受容体のリン酸化率
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
生食 1
*
**
10 μg/mlカリジノゲナーゼ
VEGF165
ERK1/2のリン酸化率
0
0.5
1
1.5
2
コントロール 生食
##
10
†
10 μg/mlカリジノゲナーゼ
VEGF165
血管新生
血管内皮細胞
##:p<0.01(student t-test)**:p<0.01、*:p<0.05(Dunnettの多重比較)コントロールを 1とした相対比
VEGF165 の切断部位の検討
血管新生抑制作用(HUVEC)
細胞増殖抑制作用(HRMEC)
VEGFR2のリン酸化抑制作用(HUVEC)
ERK1/2のリン酸化抑制作用(HUVEC)
VEGF165の血管新生作用とカリジノゲナーゼの抑制作用VEGF165
##:p<0.01(student t-test)*:p<0.05(Dunnett の多重比較)コントロールを 1とした相対比
##:p<0.01、†:p<0.05(student t-test)コントロールを 1とした相対比
**:p<0.01、*:p<0.05(Dunnett の多重比較)生食を 1とした相対比
リン酸化
リン酸化
VEGFR2
PKC
細胞増殖
ERK1/2
カリジノゲナーゼ
(μg/ml)
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
黄斑円孔 黄斑上膜 増殖糖尿病網膜症
**##
黄斑円孔
黄斑上膜
増殖糖尿病網膜症カリジノゲナーゼ
(μg/ml)
VEGF(pg/ml)
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.4
1000 2000 4000 8000
VEGF
(pg/ml)
0
200
400
600
800
1000
1200
黄斑円孔 黄斑上膜 増殖糖尿病網膜症
**##
カリジノゲナーゼ
黄斑円孔 増殖糖尿病網膜症
カリジノゲナーゼ
免疫沈降法(VEGF)
VEGF
VEGF断片16kDa
21kDa
(10μg/ml)
***N
ode数
0
50
100
150
200
生食 20 50 μg/kgカリジノゲナーゼ
**
0
0.5
1
1.5
2
2.5
生食 20 50 μg/kgカリジノゲナーゼ
Node面積
(mm2)
21kDa
カリジノゲナーゼ
免疫沈降法(VEGF)
(50μg/kg)生食
VEGF164
VEGF164断片16kDa
OIR モデルマウスにカリジノゲナーゼを皮下投与したところ、異常血管である Node 数及び Node 面積を用量依存的に有意に抑制した。またカリジノゲナーゼ投与群における網膜及び硝子体液を分析したところ、21kDa 付近におけるVEGF164 の減少と、16kDa 付近に切断された VEGF164 の断片が確認された。
ヒト硝子体液中のカリジノゲナーゼとVEGF濃度を測定したところ、いずれも黄斑円孔(MH)や黄斑上膜(ERM) に比べて、増殖糖尿病網膜症(PDR)では有意に高値を示し、両者には統計学的に有意な相関(p<0.001)が認められた。PDR患者の硝子体液では、カリジノゲナーゼを添加することで16kDa付近に切断されたVEGF165の断片が確認された。
OIRモデルマウスに対する作用
ヒト硝子体液カリジノゲナーゼ・VEGF濃度の関係
**:p<0.01、*:p<0.05(Dunnett の多重比較)
カリジノゲナーゼ生食
**、##:p<0.001(Steel-Dwassの多重比較)
p<0.001(Spearman の順位相関検定)
N.S.
細胞増殖率
0
0.5
1
1.5
2
2.5
コントロール 生食
##
0.1 1 10 10 μg/mlカリジノゲナーゼ
VEGF121
N.S.
細胞遊走率
00.511.522.533.54
コントロール 生食 0.1 1 10 10 μg/mlカリジノゲナーゼ
VEGF121
##
コントロール 生食カリジノゲナーゼ(10μg/ml)
VEGF121
リン酸化VEGF受容体
総VEGF受容体
βアクチン
コントロール 生食カリジノゲナーゼ
VEGF121
10μg/ml 10μg/ml
500μm
VEGF受容体のリン酸化率
0
0.5
1
1.5
生食 カリジノゲナーゼ(10μg/ml)
N.S.
VEGF121
管腔面積
0
0.5
1
1.5
コントロール カリジノゲナーゼ
N.S.
総延長
0
0.5
1
1.5
コントロール カリジノゲナーゼ
N.S.
分岐点数
0
0.5
1
1.5
コントロール カリジノゲナーゼ
N.S.
枝数
0
0.5
1
1.5
コントロール カリジノゲナーゼ
N.S.
(50μg/kg)
(50μg/kg)
(50μg/kg)
(50μg/kg)
VEGF121に対する影響
OIR モデルマウスで、生後 8 日目(相対的虚血負荷前)の生理的血管新生に対するカリジノゲナーゼの影響を検討したところ、血管の管腔面積、総延長、分岐点数および枝数には有意な差が認められなかった。
VEGF121 による血管内皮細胞の増殖・遊走及び VEGFR2 のリン酸化に対するカリジノゲナーゼの影響を検討したところ、いずれの項目に対しても、有意な変化は見られなかった。
N.S.(student t-test)コントロールを 1とした相対比
a:生後 0 日(コントロ-ル)b:生後 4 日(コントロ-ル)c:生後 8 日(コントロ-ル)d:生後 8 日(カリジノゲナ-ゼ)
##:p<0.01(student t-test) N.S.(Dunnett の多重比較)コントロールを 1とした相対比
N.S.(student t-test)生食を 1とした相対比
生理的血管新生に対する作用
本文中の図表はすべて 中村信介、原英彰他:ATVB 31:1041-1048 及び SFⅣ SFⅤ,2011
##:p<0.01(student t-test)N.S.(Dunnett の多重比較)コントロールを 1とした相対比
2015
カルナ
クリン
25
カルナ
クリン
50
カ
ルナクリン
50
カルナ
クリン
25
2016年2月改訂CAR-127R 84805 PM0216
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