カリジノゲナーゼは強力な血管拡張物質であるキニンを遊離することにより、高血圧や末梢循環障害の治療に広く用いられてきた。最近では、糖尿病モデルラットにおいて増加する眼内液中 VEGF 濃度を低下させることにより、血管透過性を抑制することが示されたが、血管新生に対するカリジノゲナーゼの影響を評価した報告はない。そこで今回、網膜血管新生に対するカリジノゲナーゼの役割を同定するため、in vitro 及びin vivoモデルを用いて抗血管新生作用を検討した。

＜試験方法＞

カリジノゲナーゼの血管新生抑制作用

1）管腔形成試験 (in vitro)　　　ヒト臍帯静脈内皮細胞 (以下 HUVEC) と皮膚線維芽細胞の共培養系モデル（血管新生キット、クラボウ）を用いた。

あらかじめ培地中に血管新生促進物質であるVEGF165 10ng/mL を添加し、その培地にカリジノゲナーゼをそれぞれ0.01、0.1、1.0 および 10μg/mL となるよう添加した。培養11日目に、解析ソフト（血管新生キット定量ソフトウェア Ver.2、クラボウ）を用いて、新生血管の管腔面積、総延長、分岐点数および枝数を測定した。

2）細胞増殖試験 (in vitro)　　　1well あたり2×103cell の HUVEC またはヒト網膜毛細血管内皮細胞 ( 以下 HRMEC) を96穴マイクロプレートに

播種した。VEGF165および各濃度のカリジノゲナーゼを添加後、CCK-8 を用いた WST assayを行い、吸光度（492nm）を測定することにより定量した。

3）細胞遊走試験 (in vitro)　　　1well あたり4×104cell の HUVEC または HRMECを12穴マイクロプレートに播種した。細胞の一部をはがし取り、

VEGF165 および各濃度のカリジノゲナーゼを添加し、24時間後にその領域に移動してきた細胞数の測定を行った。4）細胞増殖および細胞遊走シグナルについての western blot 解析 (in vitro)　　　HUVEC 1×105 細胞 / ウェルの密度で12 ウェルプレートへ播種し、サブコンフルエンスの状態になるまで培養を行

った。VEGF165 およびカリジノゲナーゼを添加し、VEGF2 型受容体（以下 VEGFR2) は添加 2分後、ERK1/2 および p38 は添加 5 分後にそれぞれ VEGF165 誘発リン酸化抑制作用についてwestern blot 解析を行った。さらに、検出試薬を用いてバンドを発色させ、その輝度を測定することにより定量化した。

5）VEGF165 切断試験 (in vitro)　　　Cell-free の状態で、培地中に VEGF165 およびカリジノゲナーゼを混合して 6 時間反応させ、 western blot により

バンドを検出した。6）マウス未熟児網膜症モデル（以下 OIR モデル）に対する作用（in vivo）　　　本モデルは C57BL/6マウスを生後 7～12 日目まで 75％高酸素条件下で飼育し、その後13～17日目まで通常

大気条件下で飼育することにより網膜中に異常血管を誘発させる。本試験では、生後13～17日目までの5日間、カリジノゲナーゼを皮下投与した。

7）ヒト硝子体液中カリジノゲナーゼ、VEGF 濃度 (in vitro)　　　硝子体手術を施行した増殖糖尿病網膜症（PDR）、黄斑円孔（MH）、黄斑上膜（ERM）患者の硝子体液中カリジノゲナ

ーゼ濃度及び VEGF濃度を測定するとともに、カリジノゲナーゼによる硝子体液中 VEGF165 の切断作用を検討した。

日本標準商品分類番号 872491

21kDa

コントロール 0.1 1 10 μg/mlカリジノゲナーゼ

VEGF165

VEGF165断片16kDa

p38のリン酸化率

0

0.5

1

1.5

2

コントロール 生食

##

10

†

10 μg/mlカリジノゲナーゼ

VEGF165

＊

##

細胞遊走率

0

0.5

1

1.5

2

2.5

コントロール 生食 0.1 1 10 10 μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165

＊＊

コントロール 生食カリジノゲナーゼ

VEGF165

10μg/ml 10μg/ml

500μm 血管新生

血管内皮細胞

##：p<0.01（student t-test）＊＊：p<0.01、＊：p<0.05

（Dunnett の多重比較）コントロールを 1とした相対比

##：p<0.01、†：p<0.05（student t-test）コントロールを 1とした相対比

VEGF165 の切断作用

血管新生抑制作用（HUVEC）

p38のリン酸化抑制作用（HUVEC）

細胞遊走抑制作用（HRMEC）

VEGF165の血管新生作用とカリジノゲナーゼの抑制作用VEGF165

リン酸化

リン酸化

VEGFR1

細胞遊走

p38

コントロール 生食

VEGF165

VEGF165

カリジノゲナーゼ（0.01μg/ml）

カリジノゲナーゼ（0.1μg/ml）

カリジノゲナーゼ（1.0μg/ml）

カリジノゲナーゼ（10μg/ml）

500μm

10APMAEGGGQN

20HHEVVKFMDV

30YQRSYCHPIE

40TLVDIFQEYP

50DEIEYIFKPS

60CVPLMRCGGC

70CNDEGLECVP

160LELNERTCRC

165DKPRR

80TEESNITMQI

90MRIKPHQGQH

100IGEMSFLQHN

110KCECRPKKDRC102-K107(m/Z849)

120ARQENPCGPC

130SERRKHLFVQ

140DPQTCKCSCK

150NTDSRCKARQ

VEGF165のアミノ酸配列

管腔面積

00.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

コントロール 生食

##

0.01 0.1 1 10μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165

＊＊

＊＊

分岐点数

0123456789

コントロール 生食 0.01 0.1 1 10μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165

＊＊

＊＊ ＊＊

枝数

00.511.522.533.544.5

コントロール 生食 0.01 0.1 1 10μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165

＊＊

＊＊＊＊

総延長

00.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

コントロール 生食 0.01 0.1 1 10μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165

＊＊

＊＊

＊

##

細胞増殖率

0

0.5

1

1.5

2

コントロール 生食 0.1 1 10 10 μg/mlカリジノゲナーゼVEGF165

＊

VEGF受容体のリン酸化率

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

生食 1

＊

＊＊

10 μg/mlカリジノゲナーゼ

VEGF165

ERK1/2のリン酸化率

0

0.5

1

1.5

2

コントロール 生食

##

10

†

10 μg/mlカリジノゲナーゼ

VEGF165

血管新生

血管内皮細胞

##：p<0.01（student t-test）＊＊：p<0.01、＊：p<0.05（Dunnettの多重比較）コントロールを 1とした相対比

VEGF165 の切断部位の検討

血管新生抑制作用（HUVEC）

細胞増殖抑制作用（HRMEC）

VEGFR2のリン酸化抑制作用（HUVEC）

ERK1/2のリン酸化抑制作用（HUVEC）

VEGF165の血管新生作用とカリジノゲナーゼの抑制作用VEGF165

##：p<0.01（student t-test）＊：p<0.05（Dunnett の多重比較）コントロールを 1とした相対比

##：p<0.01、†：p<0.05（student t-test）コントロールを 1とした相対比

＊＊：p<0.01、＊：p<0.05（Dunnett の多重比較）生食を 1とした相対比

リン酸化

リン酸化

VEGFR2

PKC

細胞増殖

ERK1/2

カリジノゲナーゼ

（μg/ml）

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

黄斑円孔 黄斑上膜 増殖糖尿病網膜症

＊＊##

黄斑円孔

黄斑上膜

増殖糖尿病網膜症カリジノゲナーゼ

（μg/ml）

VEGF(pg/ml)

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.4

1000 2000 4000 8000

VEGF

（pg/ml）

0

200

400

600

800

1000

1200

黄斑円孔 黄斑上膜 増殖糖尿病網膜症

＊＊##

カリジノゲナーゼ

黄斑円孔 増殖糖尿病網膜症

カリジノゲナーゼ

免疫沈降法（VEGF）

VEGF

VEGF断片16kDa

21kDa

（10μg/ml）

＊＊＊N

ode数

0

50

100

150

200

生食 20 50 μg/kgカリジノゲナーゼ

＊＊

0

0.5

1

1.5

2

2.5

生食 20 50 μg/kgカリジノゲナーゼ

Node面積

（mm2）

21kDa

カリジノゲナーゼ

免疫沈降法（VEGF）

（50μg/kg）生食

VEGF164

VEGF164断片16kDa

　OIR モデルマウスにカリジノゲナーゼを皮下投与したところ、異常血管である Node 数及び Node 面積を用量依存的に有意に抑制した。またカリジノゲナーゼ投与群における網膜及び硝子体液を分析したところ、21kDa 付近におけるVEGF164 の減少と、16kDa 付近に切断された VEGF164 の断片が確認された。

　ヒト硝子体液中のカリジノゲナーゼとVEGF濃度を測定したところ、いずれも黄斑円孔（MH）や黄斑上膜（ERM) に比べて、増殖糖尿病網膜症（PDR）では有意に高値を示し、両者には統計学的に有意な相関（p<0.001)が認められた。PDR患者の硝子体液では、カリジノゲナーゼを添加することで16kDa付近に切断されたVEGF165の断片が確認された。

OIRモデルマウスに対する作用

ヒト硝子体液カリジノゲナーゼ・VEGF濃度の関係

＊＊：p<0.01、＊：p<0.05（Dunnett の多重比較）

カリジノゲナーゼ生食

＊＊、##：p<0.001（Steel-Dwassの多重比較）

p<0.001（Spearman の順位相関検定）

N.S.

細胞増殖率

0

0.5

1

1.5

2

2.5

コントロール 生食

##

0.1 1 10 10 μg/mlカリジノゲナーゼ

VEGF121

N.S.

細胞遊走率

00.511.522.533.54

コントロール 生食 0.1 1 10 10 μg/mlカリジノゲナーゼ

VEGF121

##

コントロール 生食カリジノゲナーゼ（10μg/ml）

VEGF121

リン酸化VEGF受容体

総VEGF受容体

βアクチン

コントロール 生食カリジノゲナーゼ

VEGF121

10μg/ml 10μg/ml

500μm

VEGF受容体のリン酸化率

0

0.5

1

1.5

生食 カリジノゲナーゼ（10μg/ml）

N.S.

VEGF121

管腔面積

0

0.5

1

1.5

コントロール カリジノゲナーゼ

N.S.

総延長

0

0.5

1

1.5

コントロール カリジノゲナーゼ

N.S.

分岐点数

0

0.5

1

1.5

コントロール カリジノゲナーゼ

N.S.

枝数

0

0.5

1

1.5

コントロール カリジノゲナーゼ

N.S.

（50μg/kg）

（50μg/kg）

（50μg/kg）

（50μg/kg）

VEGF121に対する影響

OIR モデルマウスで、生後 8 日目（相対的虚血負荷前）の生理的血管新生に対するカリジノゲナーゼの影響を検討したところ、血管の管腔面積、総延長、分岐点数および枝数には有意な差が認められなかった。

VEGF121 による血管内皮細胞の増殖・遊走及び VEGFR2 のリン酸化に対するカリジノゲナーゼの影響を検討したところ、いずれの項目に対しても、有意な変化は見られなかった。

N.S.（student t-test）コントロールを 1とした相対比

a：生後 0 日（コントロ－ル）b：生後 4 日（コントロ－ル）c：生後 8 日（コントロ－ル）d：生後 8 日（カリジノゲナ－ゼ）

##：p<0.01（student t-test） N.S.（Dunnett の多重比較）コントロールを 1とした相対比

N.S.（student t-test）生食を 1とした相対比

生理的血管新生に対する作用

本文中の図表はすべて 中村信介、原英彰他：ATVB 31:1041-1048 及び SFⅣ SFⅤ,2011

##：p<0.01（student t-test）N.S.（Dunnett の多重比較）コントロールを 1とした相対比

2015

カルナ

クリン

25

カルナ

クリン

50

カ

ルナクリン

50

カルナ

クリン

25

2016年2月改訂CAR-127R 84805 PM0216