molekularbiologische methoden für die lebensmittelanalytik
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Dr. Felix Fockefelix.focke@uni-hamburg.de
Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP)
Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
Dr. Felix Fockefelix.focke@uni-hamburg.de 13.01.2012
Seite 2Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
Warum überhaupt Gewürze?
• Die Vielseitigkeit der Gewürz-Matrices lässt eine Anpassung der
entwickelten Methoden an andere Fragestellungen in der
Lebensmittelanalytik erwarten.
• Aktuelle Methode „der Wahl“ für
die Differenzierung von Gewürzen:
Mikroskopie �
• Molekularbiologische Methoden
können von nicht speziell geschultem
Personal angewendet werden.
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Seite 3Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
Was sind das für Methoden?
• Nachweis von Organismen über ihre DNA.→ Ähnliche Methoden werden z.B. in der Forensik genutzt.
→ Jeder Organismus enthält seine (spezifische) DNA.
→ Lebensmittel stammen (fast immer) aus Organismen.
• Etablierte Methode: PCR
(Polymerasekettenreaktion)→ Spezifische DNA-Abschnitte
werden kopiert und somit
nachgewiesen
-100
300
700
1100
1500
0 5 10 15 20 25
Zyklus
DN
A M
enge
.
Endpunkt
ExponentiellePhase
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Seite 4Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
500 g Backmischung
2 mg Senf0,1 mg
Kreuzkraut
125 gRucola
Mittels PCR können wenige ppm nachgewiesen werden:
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Seite 5Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP)
• Im Jahre 2000 von Notomi et al. zuerst beschrieben.
Kaum Methoden zu Lebensmittelzutaten (-kontaminanten).
• Isothermale Methode zur Amplifikation von DNA.
Reaktion ohne Thermocycler / außerhalb eines Labors.
• Größerer Substratumsatz im Vergleich zur PCR.
Detektion mit bloßem Auge / außerhalb eines Labors.
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Seite 6Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
DNA-Isolierung- Einheitliche Methode zur Isolierung der DNA aus allen betrachteten Gewürzen
Endpunkt PCR- als Gewürz-Nachweis
Real-time PCR- zur quantitativen Bestimmung
Endpunkt LAMP- als Gewürz-Nachweis?
Real-time LAMP- zur quantitativen Bestimmung?- Charakterisierung der LAMP- Ermittlung des Leistungspotentials
Entwicklung, Optimierung und Validierung:
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Seite 7Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
Ergebnis: LAMP als Gewürz-Nachweis (Beispiel: Schwarzer Senf)
M[bp]
1000
500
100
3000
negativ S. alba B. nigra C. carvi
(Agarosegel, 2 %, Ethidiumbromidfärbung)
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Seite 8Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
Quantitative Bestimmung mittels real-time-LAMP?(Beispiel: Kümmel)
• Endpunkt LAMP:
→ Reaktionsansatz ergänzt
um SYBR Green I.
→ Reaktionsbedingungen
optimiert.
→ Fluoreszenz-Messung
im real-time-Cycler.-500
100
700
1300
1900
0 20 40 60 80 100
Zeit [min]
rel.
Flu
ores
zenz
.
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-100
300
700
1100
1500
0 5 10 15 20 25
Zyklus
rel.
Flu
ores
zenz
.
-500
100
700
1300
1900
0 20 40 60 80 100
Zeit [min]
rel.
Flu
ores
zenz
.
real-time LAMP
real-time PCR
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Seite 10Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
-500
100
700
1300
1900
0 20 40 60 80 100
Zeit [min]
rel.
Flu
ores
zenz
.
X
Messgröße:→ PCR: Ct-Wert (Schwellenwert-Zyklus).
→ LAMP: Tt-Wert (Schwellenwert-Zeit).
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Seite 11Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
-500
1000
2500
4000
5500
35 55 75 95 115
Zeit [min]
rel.
Flu
ores
zenz
.
.
Korrelation zwischen Tt-Wert und DNA-Gehalt:
Gehalt an Kümmel in einer Backmischung
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Seite 12Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
• Ein Nachweis der Gewürze ist mittels LAMP genauso wie mit der konventionellen PCR möglich.
• Mit Hilfe der real-time LAMP können Gewürzgehalte quantitativ erfasst werden.
• Die Leistungsgrenzen der LAMP liegen in ähnlichen Bereichen wie die der PCR.
• Wo sind die Vorteile der LAMP?
Die Vorteile der LAMP gegenüber der PCR?
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Seite 13Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
Vor-Ort-Analysen mittels LAMP?
UV UV
Calcein
Mg2+
Calcein
Mn2+LAMP
Mg2+
Mg2+
Mg2+
Mg2+
Mg2+
Mg2+
dNTPs
dNTPs Mg2P2O7Mn2P2O7
• Die Amplifikation kann mit Hilfe einer „konstanten“Wärmequelle (ohne Thermocycler) durchgeführt werden.
• Welche Möglichkeiten der Detektion bieten sich neben Agarosegelelektrophorese und real-time Analysen?
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Seite 14Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
Calcein + weißes Licht Calcein + weißes Licht + UV-Licht
Calcein + UV-Licht weißes Licht ohne Calcein
+ +- - + +- -
+ +- - + +- -
Calcein + weißes Licht Calcein + weißes Licht + UV-Licht
Calcein + UV-Licht weißes Licht ohne Calcein
+ +- - + +- -
+ +- - + +- -
Detektion mit Calcein (Beispiel: weißer und schwarzer Senf)
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Seite 15Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
Zusammenfassung - LAMP
• Die LAMP ermöglicht einen qualitativen Nachweis und eine quantitative Bestimmung von Gewürzen in Lebensmittelmatrices.
• Durch isothermale Reaktionsprotokolle und Detektionsverfahren mit dem bloßen Auge ermöglicht die LAMP eine Analytik „vor Ort“.
• Fazit: Die LAMP stellt für die Lebensmittelanalytik eine leistungsfähige Methode mit großem Potential in der Vor-Ort-Analytik als Alternative zur PCR dar.
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Seite 16Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
Zusammenfassung - Überblick
• Methoden zur DNA-Isolierung aus Gewürzen. Anwendbarkeit der
Methoden auf andere Lebensmittelmatrices (z.B. Kaffee) [1].
• MDA-basierte Präamplifikation zur Verbesserung des DNA/Inhibitor-
Verhältnisses für „schwierige“ Matrices (z.B. Nelke, Piment) [1].
• PCR-Nachweise für 18 Gewürze. Erweiterung der Methode z.B. für die
Artendifferenzierung von Kaffee [1].
• Real-time PCR für die quantitative Bestimmung von allergenen Gewürzen
(z.B. Senf und Sellerie). Erweiterung der Methode auf eine aktuelle
Fragestellung (Kreuzkraut in Rucolasalat) [2].
• LAMP-Methoden als Alternative zur PCR [3].
[1] Focke et al. (2011) ”DNA-based identification of spices: DNA isolation, whole genome amplification and polymerase chain reaction“[2] Focke et al. (2011) “Determination of plant contaminants in food using real-time-PCR”[3] Focke et al. (in prep.) “Development of Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Methods as a Tool for Food Analysis”
Dr. Felix Fockefelix.focke@uni-hamburg.de 13.01.2012
Seite 17Molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik am Beispiel der Gewürze
...für die Aufmerksamkeit!... meinen Diplomanden
→ Christian Schoefinius→ Johanna Schiller→ Dominique Tressat→ Sonja Schüssler→ Qi Chen→ Malte Oetting→ Annika Sötje→ Sandra Lorenz
für die tollen Arbeiten!
...für die Unterstützung
→ Prof. Dr. Markus Fischer→ Dr. Ilka Haase→ Philipp Brüning
Danke...
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