genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/genetikai... ·...

Genetikai vizsgálatok módszerei

Dr. Gál Anikó

galaniko77@gmail.com

Genetikai vizsgálat fogalma

• A vizsgált egyén DNS állományában (genomjában)

történő elkésések kimutatása

• A genetikai vizsgálatot „A humángenetikai adatok

védelméről, a humángenetikai vizsgálatok és

kutatások, valamint a biobankok működésének

szabályairól” szóló 2008. évi XXI. törvény alapján

minden esetben genetikai tanácsadásnak kell

megelőznie

Genetikai vizsgálat céljai

1. Betegség hátterében álló patogén mutációk kimutatása

2. Genetikai rizikófaktorok vizsgálata – hajlamosító és

védő polimorfizmusok elemzése

3. Farmakogenomikai vizsgálatok

4. Személyazonosítás – igazságügyi DNS vizsgálatok

5. Apasági vizsgálatok

6. Prenatális vizsgálat – szűrés, ismert mutációk

kimutatása

7. Szervezetben lévő vírusok, baktériumok kimutatása

8. Transzplantációs genetika – HLA tipizálás

• A talált eltérés patogenitásának eldöntése

– Irodalmi adatok

– Fenotípus – genotípus korreláció vizsgálata

– Kontroll személyekben történő vizsgálat

– Funkcionális vizsgálatok – RNS, fehérje

szinten

Genetikai vizsgálatok főbb

csoportosítása

Citogenetika

Molekuláris genetika

„Biokémiai genetika”

Biokémiai genetika

(protein- és metabolit-

rendellenességek) • Metabolitok:

– hosszú szénláncú zsírsavak

gázkromatográfiája

• Fehérje szerkezet:

– dystrophin Western blot

dystrophinopathiak esetében

• Enzimaktivitás:

– foszforiláz aktivitás – McArdle betegség

– alfa glükozidáz - Pompe kór

Citogenetika

A citogenetika feladata

• Különböző genom- és

kromoszómamutációk

azonosítása a

preimplantációs, pre-

és posztnatális

genetikában.

Citogenetikai módszerek

Kariotipizálás

FISH

CGH

Vizsgálati minták

• Lymphocyta – vér

• Csontvelő

• Fibroblast

• Amnionfolyadék

(NOR)

heterokromatin

Kromoszóma azonosítás

szempontjai

- méret

- centromer helyzete

- másodlagos befűződés helye

- festési mintázat

- heterokromatin eloszlása

eukromatin

Kromoszómák morfológiája

• A számbeli elváltozások – leggyakrabban a nemi kromoszómákat érintik (Turner-,

Klinefelter-szindróma).

– A testi sejteket érintő számbeli (Patau-, Edwards-, Down-szindróma) kromoszóma elváltozások több szerv rendellenességeihez vezetnek.

• Szerkezeti kromoszóma rendellenességek: – kromoszómaszakasz elvesztése (deléció).

– kromoszómadarab áthelyeződése egy másik kromoszómára (transzlokáció)

• Kiegyensúlyozott – a letörött nem vész el (más helyen megvan – másik kromoszómára rátapad) – az adott egyedre nincsen súlyos következményük – ivarsejteknél keletkezhetnek olyan ivarsejtek amelyek hiányos genetikai információval járó sejtek

• Kiegyensúlyozatlan: a letört darab kikerül a rdsz-ből – azon lévő gének hiányoznak (több 100 gén hatása is kieshet

– Kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulása (inverzió).

• Kariotípus: – Az egyed kromoszómáinak összessége, iIl. az egyed

kromoszómáinak száma, alak és nagyság szerinti meghatározottsága.

– A kariotípust az idiogramm segítségével rögzítik.

– Az eljárás segítségével felismerhetők egyes kromoszóma rendellenességek illetve öröklődő betegségek.

Kromoszóma sávok:

• G-sávozás: savas-sós Giemsa festés

• R-sávozás: (reverse) emelt hőmérsékleten történő Giemsa festés

• C-sávozás: centroméra specifikus festés

• T-sávozás: teloméra specifikus festés

• Q-sávozás: quinacrin festés (fluoreszcens mikroszkópban vizsgálható)

Kariotipizálás

• Phitohaemoglutinin növényi lektin) Go-G1 fázis átvitelét

segíti

• 1-3 napig tenyésztik

• Colhicin kezelés – gátolja az osztódási orsó működését,

de a mitózisba lépést nem

• Hipotonizálás KCL hatására a sejtek megdúzzadnak,

kromoszómák elkülönülnek egymástól

• Fixálás – metanol-ecetsav keverék

• Gimsa festés

Standard karyotípus

Bármilyen metafázisos sejteket tartalmazó, osztódni képes sejtpopuláció

Általában: lymphocyta (ezek proliferációját könnyű indukálni)

egyéb szövetek – bőr (fibroblastok)

– Csontvelő

– amnion folyadék

– Chorionboholy

– szájnyálkahártya

Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) • A DNS fragmentumokat fluoreszkáló festékkel jelölünk meg és ezáltal

fénymikroszkóppal nem látható kromoszóma részleteket is azonosíthatunk.

• FISH-el kromoszómák, kromoszómaszegmentek, mint különálló egységek, vagy akár gének tehetők láthatóvá.

• Lehet – Direkt FISH - A fluoreszcensen jelölt

– Indirekt FISH - reporter molekula kell

• A módszer használható – Interfázisos sejtmagokban (pl. vérkenet, vagy akár 10-100 mikrométer vastagságú szöveti

metszet)

– Kromoszómapreparátumokon (metafázis)

• Jellemzői:

– Nagy érzékenység

– 100 bázisnyi méret alatti szekvencia is kimutatható

– Lehetséges több DNS-szekvencia egyidejű kimutatása

• A kicsiny kromoszóma részletek kiesésével járó ún. mikrodeléciós kórképek (Prader-Willi-, Angelman-, Williams-, DiGeorge-,Miller-Dieker-, Smith-Magenis-szindróma) célzott FISH vizsgálattal diagnosztizálhatók.

• Az ismeretlen eredetű értelmi fogyatékossággal társuló mikrodeléciókat a kromoszóma végdarabjait elemző szubtelomérikus próbákkal lehet kimutatni

• Tumor specifikus transzlokációk kimutatása

Multikolor FISH

(Spektrális kariotipizálás)

Komparatív genomikus hibridizáció

(CGH)

• Egészséges egyénből származó, tárgylemezen fixált, metafázisban lévő kromoszómákat denaturáljuk és etanolban dehidratáljuk

• A beteg és a referencia DNS 1:1 arányú keverékét szintén denaturáljuk (a DNS – ket előzőleg eltérő fluoreszcens festékkel jelölik)

• Ezt hibridizáltatjuk a normális kromoszómákat tartalmazó preparátumra

• A nem hibridizált DNS-t eltávolítjuk

• A kromoszómákat „antifase”-ban oldott DAPI-val (kék festék, amely a DNS-t specifikusan jelzi és a G-sávozáshoz hasonló mintázatban kötödö molekula: 1,6 diamino-fenil-indol) jelöljük

• E három eredőjeként kapjuk meg a CGH képet

CGH értéklése

• Ha citogenetikai eltérés nem található: a két szín egyenlő arányú kombinációját narancssárga fluoreszcenciaként látjuk

• A fluoreszcencia intenzitás arányából valamennyi kromoszóma anomális feltérképezhető – deléció, duplikáció

• Digitális image analízis: a három fluoreszcencia intenzitást zöld, piros, kék optikai szűrőkkel CCD kamerával rögzítjük.

• A kromoszómák azonosítása a DAPI sávozott image segítségével automatizált színes kariotípus analizáló programmal történik.

• Módszer előnye – A teljes genom vizsgálható egyetlen hibridizáció során

– Sejtkultúra, vagy a vizsgálni kívánt sejtekből származó metafázis indukció nem szükséges

– A korábban nem ismert duplikált vagy deletált DNS szakasz kimutatására is alkalmas

Deléció

Duplikáció

Molekuláris biológiai

módszerek

• PCR alapú technikák

– VNTR meghatározás

– PCR-RFLP

– Multiplex PCR

– Trinukleotid repeat meghatározások

• Real-time PCR

• MLPA

• Fragment elemzés

• Szekvenálási metodikák

– Sanger

– Piroszekvenálás

– Újgenerációs szekvenálás

• GWAS vizsgálatok

PCR (polimeráz

láncreakció)

DNS megsokszorozása

Elektroforézis

A töltéssel rendelkező

makromolekuláknak

(pl. DNS) az a

tulajdonsága, hogy

elektromos erőtér

hatására

elmozdulnak.

A negatív töltésű DNS

a pozitív töltés felé

vándorol

_

+

Nested PCR

• PCR

specificitását

növeli

Multiplex PCR • Egyszerre több primerrel történő PCR vizsgálat

• Pl. homozigóta exoni deléciók kimutatása

(dystrophin)

VNTR vizsgálatok

Trinukleotid repeat kimutatás

Huntington kór

Spinocerebelláris ataxiák (SCA)

Friedreich ataxia

Dystonia myotonica

Huntington kór

CAG repeats

4-es kromoszóma

IT 15 gén - huntingtin protein

RFLP

(restrikciós fragmenthossz polimorfizmus) Enzimatikus hasítás

Bioanalyser

Real-time PCR

• PCR reakció eredménye valós időben követhető

• PCR-t követően olvadáspont analízis is elvégezhető (olvadáspont arányos a DNS összetétellel – GC arány/ és hossz) a fragmensek azonosíthatók

• SyberGreen – interkaláris festék, ha van termék zöld fluoreszcenciát mutat

• TaqMan próba – két hagyományos próba és egy hibridizáló próba a kettő között

• A PCR reakcióban a hibridizáló primer hozzátapad az egyszálúított DNS-hez

• Taq poliemeráz 3’>5’ exonukleáz aktivitással a hibridizáló primert nukleotidokra bontja

• A kioltótó enzim (qencer) nem gátolja a fluorokróm működését

• Nagyon specifikus, könnyen multiplexezhető

TaqMan SNP assay

CC

TT

CT

C allél

T allél

T allél

C allél

Génexpresziós változások mérése

Bcl-2

Bcl-XL Syn1

kontroll

Bcl-2 kezelt

kontroll

Bcl-XL kezelt Bcl-XL kezelt

Bcl-2 kezelt

kontroll

Bax

normoxia

hypoxia

Fluoreszcens fragment analízis

MLPA

• Multiplex ligation-dependent

probe amplification

• Génen belüli nagyobb

kópiaszám változások

kimutatására használható

• Egyszerre több gén is

vizsgálható

Kontroll

PMP22 duplikáció

PMP22 deléció

DNS szekvenáló módszerek

Sanger szekvenálás

Piroszekvenálás

Újgenerációs szekvenálás

Sanger szekvenálás

Felhasználás

• Ismert gének szekvencia

analízise

• Patogén mutációk keresése

Piroszekvenálás • DNS másolásakor beépülő nukleotidról leszakad egy pirofoszfát

• Ezt a luciferáz felvillanása jelzi

Felhasználás

• Mutációk pontos

mozaicizmus rátájának a

megadása (pl. tumorokban

szomatikus mutációk

vizsgálata – KRAS 2.exon

12. és 13. kodon)

• Pontos heteroplazmia

arány

Újgenerációs szekvenálás

• A genomot 50-1000bp közti

darabokban lehet

szekvenálni

• Ezt de novo módszerekkel

lehet összerakni - min 30

millio fragment

• Covarage (lefedettség)

– 1 bp hányszor van előhívva –

humánnál min 10x-es

lefedettség kell

• Sanger szekvenálás

– Max 1000bp

– Nagy pontosság

– Kicsi akapcitás

– Drága

– Munka és időigényes

– Nem multiplexezhető

– Elektroforetikus elvű

• Újgenerációs

– Több millió bp

egyidejű szekvenálása

– gyors

– olcsóbb

– Jól automatizálható

– Nincs elektroforetikus

elválasztás

– multiplexezhető

NGS vizsgálatok felhasználhatósága

• Teljes genom

• Teljes exom

• Teljes transzkriptom

• NGS panelek (enrichment)

– Célzottan, betegségre specifikus gének

egyidejű szekvenálása

NGS szakaszai

• Könyvtárkészítés

– A genomot szekvenálható darabokra bontjuk

– Ismert szekvenciájú oligonukleotidokat mindkét végére

hozzáadjuk - egységessen szekvenálható a minta

– Barcode adható hozzá (megjelöli melyik minta)

• Klonális amplifikáció

– 1 fragmentből kb 1 millió

• Szekvenálás

• Bioinformatikai kiértékelés

Könyvtárkészítés

Klonális amplifikáció

• Emúlziós PCR

– Olajban vízcseppek vannak

(mikroreaktorok) amiben minden

benne van

– Fragmentet juttatjuk bele

– SOLID és Roche

• Bridge amplifikáció

– A komplamenter oligok

üveglemezen vannak és a pH

változás miatt lesz grid képzés

– Illumina

Szekvenálás

• Sanger alapú - Illumina

• Piroszekvenálás alapú – SOLID és Roche

• Proton detektálás - Iontorrent

Blot technikák

Western blot – fehérje

Southern blot - DNS

Northern blot - RNS

Fehérje meghatározás

Western blot

• biomolekulák

komplexében lévő fehérje

kimutatására

• Ez egy analitikus

technológia, a fehérje

expressziójának,

mérésére

• Detektálás:

autoradiográfiával, rtg

filmre

• Kiértékelés:

denzitometrálás

Pl. Qantity One Software

Denzitás meghatározás meghatározás

Kvantifikálás

Northern blot

Southern blot

GWAS

• A fenotípusos jellel (pl. beteg) rendelkező, illetve

kontroll populációt genotipizálnak

• Megkeresik, hogy melyik marker (SNP)

gyakorisága különbözött a két populáció között

• Multifaktoriális jellegek genomikai hátterének

tisztázására

Microarray („génchip”) technológia

• Nagyságrendekkel emelik az egyidejűleg vizsgálható gének számát

• Szerkezeti (nukleotidsorrend) és funkcionális (génkifejeződés-mRNS) információk tömegét képes nyújtani

• A génchipek (génlapok) rendezetten (microarray), sorokban és oszlopokban több tízezer ismert nukleotidszálat tartalmaznak, ezekhez kapcsolódik a jelzett minta nukleinsav

• A fluoreszcens festékekkel láthatóvá tett kötődési mintázatot a komputer értékeli, és ismerve a génlapon levő elrendezést, a pozitív/negatív reakció alapján jellemzi a minta genetikai tartalmát

• Egyszerre több tízezer (akár a teljes genom) gén kifejeződése értékelhető ezzel az eljárással