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FRET
BRET
FLIM
BiFC
1
Stéphane GUILLOU - Timothée BITSCH - Thibaud LAGACHE
Limite : 200 nm
Microscopes à fluorescence conventionnels
2
F R E T
Transfer
Förster /Fluorescence
Resonance
Energy
3
FRET
1946 par Theodore Förster
« Energie d’excitation transférée d’une molécule à
une autre à travers une interaction entre dipôles
oscillant de molécules proches dans l’espace »
Théorie du FRET
4
FRET
Théorie du FRET
1 à 10 nm
Définition : Processus non radiatif par lequel de l’énergie
d’un fluorophore donneur à l’état excité est transmis à un
fluorophore accepteur à proximité immédiate (1-10nm)
5
FRET
Les conditions
I. Excitation du donneur
6
FRET
Les conditions
FRET
II. Chevauchement du spectre d’émission du donneur et du
spectre d’absorption de l’accepteur
Spectre
d’excitation
Spectre
d’émission Spectre
d’excitation
Spectre
d’émission
Inte
nsi
té
Longueur d’onde en nm
Donneur Accepteur
Chevauchement
Intégrale de recouvrement J(λ) :• fD : intensité de la fluorescence émise par le
donneur à une longueur d’onde donnée
• εA : coefficient d’extinction molaire de l’accepteur7
FRET
Les conditions
III. Distance donneur/accepteur 1-10 nm
= distance donneur - accepteur pour laquelle l’efficacité
du transfert d’énergie est de 50%.
• R : distance effective qui sépare les deux molécules
• R0 : rayon de Förster
Efficacité de transfert E = nb de molécules qui se désactivent par transfert
nb total de molécules excitées
8
Les conditions
Calcul de la distance :
• J : intégrale de recouvrement
• n : indice de réfraction du milieu
• QD : rendement quantique du donneur en absence d’accepteur
• κ2 : facteur d’orientation qui est fonction de l’orientation relative
des dipôles du donneur et de l’accepteur
III. Distance donneur/accepteur 1-10 nm
= distance donneur - accepteur pour laquelle l’efficacité
du transfert d’énergie est de 50%.
• R : distance effective qui sépare les deux molécules
• R0 : rayon de Förster
Efficacité de transfert E = nb de molécules qui se désactivent par transfert
nb total de molécules excitées
9
FRET
IV. Orientation donneur – accepteur favorable
Les conditions
Angle différent de 90°
FRET
Angle égal à 90°
Pas de FRET
Remarque : En Biologie ceci n’est généralement pas un
problème car les donneurs et les accepteurs peuvent
avoir une certaine liberté de rotation
10
FRET
Les conséquences
Inte
nsi
té d’é
mis
sion
Temps
Donneur seul
Donneur en présence d’accepteur
et lorsqu’il y a FRET
• Diminution de l’intensité de fluorescence du donneur et
augmentation de l’ intensité de fluorescence de l’accepteur
• Diminution de la durée de vie de florescence du donneur
11
FRET
Visualisation et Mesure du FRET
Fluorimètre Microscope
Fluorimètre pour microplaques
Appareil qui va permettre de
mesurer le spectre de fluorescence
d’une molécule en fonction de la
longueur d’onde d’excitation et
inversement on pourra mesurer la
variation de la fluorescence pour
diverses longueurs d’ondes
d’excitation.
Après excitation du donneur
celui-ci va à sont tour (s’il y a
interaction) exciter le
receveur, permettant ainsi la
mesure de la fluorescence. En
plus de l’information sur
l’existence de l’interaction,
nous aurons une information
de localisation subcellulaire. 12
FRET
Visualisation et Mesure du FRET
Mesure du FRET par intensité
Mesure du ratios donneur/accepteur
Mesure de l’augmentation de l’intensité de l’accepteur
Mesure de l’intensité du donneur
!
!
!
Corrections à apporter concernant la fluorescence détecter
dans le canal de l’accepteur due au donneur
La stœchiométrie donneur /accepteur doit être constante au
cours de l’expérience
Débris
Mesure du FRET par photoblanchiment (pbFRET)
Mesure du FRET par pbFRET de l’accepteur (DFRAP)
Mesure du FRET à l’aide de la durée de vie de
fluorescence (FLIM)13
FRET
Applications du FRET
Etude d’interactions intermoléculaires
Protéine - Protéine
Exemple :
- Montrer la dimérisation de récepteurs couplés aux protéines G,
- Analyser la fixation d'un ligand sur un récepteur
- Mettre en évidence l'interaction de canaux ioniques de type L
avec la calmoduline . 14
FRET
Applications du FRET
Etude d’interactions intramoléculaires
Changements conformationnels de protéines
Caractérisation de complexes macromoléculaires
Dimérisation de protéines
15
FRET
Applications du FRET
FRET
Etude d’interactions intramoléculaires
Changements conformationnels de protéines
Caractérisation de complexes macromoléculaires
Dimérisation de protéines
Biosenseurs : applications à l’étude d’activités enzymatiques, à la
détermination déconcentration d’ions (Ca 2+ ) ou de métabolites
(AMPc).
535 nm
480 nm
+ 4 Ca 2+
- Ca 2+
RATIO : 535/480 (YFP/CFP) 16
17
Les principaux avantages et
inconvénients
FRET
Avantages :
- Simplicité de mise en œuvre
- Possibilité d’étude dynamique
- Rapidité
Inconvénients :
- Risque d’artefacts : auto-fluorescence
18
FRET
Perspectives du FRET
Développements
- de nouveaux fluorophores
- de détecteurs plus performants
- de logiciels d’acquisition et d’analyse
19
F L I M
Fluorescence
Lifetime
Imaging
FLIM
20
Problème : SBT = spectral bleed-through
Solution : mesure de la durée de vie d’excitation
FLIM
21
FLIM
BRET
B R E T
Bioluminescence
Resonance
Energy
Transfer
22
Découverte du BRET
Phénomène de
bioluminescence chez
Aequorea victoria
Dr Shimomura en 1960
observe un phénomène de
Bioluminescence
23
BRET
Théorie de BRET
Site d’affinité pour
le Ca2+ (Cofacteur)
Site d’affinité pour
l’oxygène moléculaire
Coelenterazine
Ca2+
O2/
O3
L’Aequorine:
24
BRET
Théorie de BRET
Site d’affinité pour
l’oxygène moléculaire
Coelenterazine
O2/
O3
La Renilla Luciférase :
25
BRET
La Technique du BRET
Prot A Prot BProt A Prot B
26
BRET
La Technique du BRET
BRET
27
La Technique du BRET
28
BRET
Avantages du BRET
- L’utilisation d’une enzyme pour exciter le
donneur luminescent permet de s’affranchir
d’une source excitatrice extérieure
-Plus sensible que le FRET et meilleur
quantification
-Adaptable au format microplaque
-outil de choix pour l’étude des
protéines en cellules vivantes
29
-Travail avec cellules auto-fluorescente
BRET
Désavantages du BRET
-Variations de signal dues à des fluctuations
de la lumière émise (interférences optiques
des milieux, variations du nombre de
cellules, volume de l’essai…).
-Le signal sur bruit d’un essai en BRET est
affecté par le recouvrement des spectres
d’émission du substrat de la Luciférase et
de la YFP.
30
BRET
Désavantages du BRET
-Orientation du donneur et de l’accepteur
-Sensibilité de la GFP au pH
-Amplification du BRET difficile
31
BRET
Utilisations du BRET
-Utilisée pour analyser l’oligomérisation
(association de protéines)
-utilisée pour l’activation des récepteurs
couplés aux protéines G
-Outils de choix pour l’études de protéine en
cellules vivantes
- De nouveaux outils
32
BRET
BiFC
Bimolecular
Fluorescence
Complementation
33
Bi F C
On veut :
- Observer une interaction entre macromolécules
- In vivo
- Avec une bonne sensibilité
34
BiFC
T. K
. Kerp
pola
, Nat.
Met
hod
s, 2
006, 3
, 969
Association de fragments de protéines
I. Origines
35
BiFC
I. Origines
Ghosh, I., Hamilton, A. D. & Regan, L.
Antiparallel Leucine Zipper-Directed Protein Reassembly: Application to the
Green Fluorescent Protein
Journal of the American Chemical Society 122, 5658 (2000) 36
BiFC
Hu, C. D., Chinenov, Y. & Kerppola, T. K
.
Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living
cells using bimolecular fluorescence complementation
Mol. Cell 9, 789-798 (2002).
Kerppola, T. K.Hu, C. D.
I. Origines
37
BiFC
C-YFP
P1P2
N-YFP
II. Principe
38
BiFC
II. Principe
Préparation...
Schun a
nd C
ourt
lai,
2010 (
Wik
imedia
Com
mo
ns)
39
BiFC
II. Principe
… et observation
Microscope à fluorescence inversé
Nuno N
ogu
eir
a, 2
007 (
Wik
imedia
com
mo
ns)
Schun a
nd C
ourt
lai,
2010 (
Wik
imedia
Com
mo
ns)
40
BiFC
III. Variantes
→ Multicolor BiFC
C. D
. H
u a
nd T
. K
. K
erp
pola
, N
at. B
iote
chnol.,
2003, 21, 539
→ UbFC
41
BiFC
V. Avantages
- Observation in vivo
- Visualisation directe
- Sensibilité
- Pouvoir de résolution très élevé
- Équipement classique
IV. Applications
- Observation simultanée de plusieurs complexes
- Observation des modifications de voies de signalisation
- Observation d'interactions entre protéines et ARN
- Étudier la formation de complexes dans divers compartiments
cellulaires
42
BiFC
VI. Limites
43
- Attente de plusieurs heures
- Reformation irréversible du fluorochrome
- Reformation indépendante d'une interaction
- Altération de la structure ou fonction de la protéine
- Seulement chez des organismes aérobies
Peuvent être évitées !
BiFC
44
Bibliographie
Author(s): Trugnan, G; Fontanges, P; Delautier, D; Ait-Slimane, T
Title: FRAP, FLIP, FRET, BRET, FLIM, PRIM... new techniques for a colourful life
Source: M S-MEDECINE SCIENCES, 20 (11): 1027-1034 NOV 2004
Author(s): Wallrabe, H; Periasamy, A
Title: Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy
Source: CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, 16 (1): 19-27 FEB 2005
Author(s): Ghosh, I; Hamilton, AD; Regan, L
Title: Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein
Source: JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, 122 (23): 5658-5659 JUN 14 2000
Author(s): Hu, CD; Chinenov, Y; Kerppola, TK
Title: Visualization of interactions among bZip and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation
Source: MOLECULAR CELL, 9 (4): 789-798 APR 2002
Author(s): Yao Xu, Akihito Kanauchi,et al
Title: Bioluminescence resonance energy transfer (BRET): a new technique for monitoring protein-protein interactions in living cells; 18p, 2001
Author(s): K.D.G.Pfleger and K.A.Eidne;
Title: Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer (BRET); vol3, n°3, Mars 2006
Cours de Didier Pascal (Université de Strasbourg) ; Title : La fluorescence
Autor(s): Rocheville M, La,ge DC, Kumar U, Patel SC, Patel RC, and Patel YC (2000)
Title : Recpetors for dopamine and somatostatin: formation of hétéro-oligomers with enhanced functional activity.
Source: Science 288: 154-157
Author(s): Riyaz A Bhat, Thomas Lahaye and Ralph Panstruga
Title: The visible touch: in planta visualization of protein-protein interactions by fluorophore-based methods
Source: Plant Methods 2006, 2:12
Author(s): Wu P, Brand L.
Title: Resonance energy transfer: methods and applications.
Source: ANALYTICAL BIOCHEMISTRY Volume: 218 Issue: 1 Pages: 1-13 Published: APR 1994
Author(s): Jares-Erijman EA, Jovin TM
Title: FRET imaging
Source: NATURE BIOTECHNOLOGY Volume: 21 Issue: 11 Pages: 1387-1395 Published: NOV 2003
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