extraction d’adn gÉnomique À partir de cellules vivantes

EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE ÀPARTIR DECELLULES VIVANTES

EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE

Buts

• préparer l’ADN génomique à partir de deux sortes de cellules, celles de levure et celles de kiwi

• apprendre à rédiger un article scientifique -sections d'Introduction, des Matériels et méthodes et des Références

EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE

Objectifs pratiques

exposition aux techniques de lyse cellulaire

exposition aux techniques d'extraction d'ADN

utilisation d'une microcentrifugeuse

EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE

Objectifs pratiques

déprotéinisation d'une préparation d'ADN par extraction phénol/CHCl3

précipitation d'ADN avec de l'éthanol

dosage de l'ADN (DO260 et DO260/DO280)

LES ACIDES NUCLÉIQUES

Deux classes

désoxyribonucléique (ADN)

ribonucléique (ARN)

Traduction

Transcription

Réplication

ARN

ADN

Protéine

LES ACIDES NUCLÉIQUES

ADN

hélice double monotone (= double brins)

associé à plusieurs protéines (histones)

sous la microscope électronique

nucleosome

LES ACIDES NUCLÉIQUES

nucleosome

l’unité de base de la chromatine

1e niveau de compaction de l’ADN

composé des histones +ADN

LES ACIDES NUCLÉIQUES

ADN

dépositaire de l'information génétique

génome = ensemble des chromosomes localisés dans le noyau d'une cellule

seulement deux rôles: 1. diriger sa réplication lors de la division cellulaire 2. diriger la transcription d'ARNm complémentaire

LES ACIDES NUCLÉIQUES

ADN - rôles

ARN

ADN

Protéine

Traduction

Transcription

Réplication

EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE

• plusieurs méthodes

• choix dépend du matériel à extraire

3 étapes principales

1. lyse cellulaire

2. séparation de l’ADN des autres composantes cellulaires

3. précipitation (concentration) de l’ADN

EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE

1. lyse cellulaire: libère l’ADN du noyau

mécanique

à l’aide de détergents

N.B. Les détergents (ex. SDS) dénaturent les protéines et solubilisent les membranes.

peuvent êtrecombinés

EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE

Alors, dans les cas pertinents:

• les cellules de kiwi et de levure possèdent une paroi cellulaire (= barrière physique)

• il faut la détruire pour être capable d’isoler l’ADN génomique des noyaux des cellules

CELLULES de KIWI et de LEVURE

levure

paroi cellulaire

CELLULES de KIWI et de LEVURE

kiwi

paroi cellulaire

EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE

Alors, dans les cas pertinents:

levure billes de verre (lyse physique) mélange au vortex (lyse physique) tampon de lyse avec détergent (chimique) phénol/CHCl3 (lyse chimique)

EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE

Alors, dans les cas pertinents:

kiwi écrasement par fourchette (lyse physique) tampon de lyse avec détergent (chimique)

CELLULES ANIMALES

Pas de paroi :

Alors,ne nécessite pas de bris mécaniquedes fois un tampon hypotonique suffit pour faire éclater la cellule

EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE

1. lyse cellulaire: libère l’ADN du noyau

2. séparation de l’ADN des autres composantes cellulaires

filtration ou centrifugation du lysat cellulaire extraction des protéines (phénol/CHCl3)

EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE

1. lyse cellulaire: libère l’ADN du noyau

2. séparation de l’ADN des autres composantes cellulaires

3. précipitation (concentration) de l’ADN précipitation à l’éthanol colonne d’affinité (au lieu de précipitation,

trousses commerciales)

À noter: dans le cas des trousses utilisant une colonne effectivement les étapes 2+3 sont combinées.

1. Estimation de la [ADN] par A260

à l’aide du spectrophotomètre bases azotées de l’ADN absorbent à 260 nm ADN doit être si pur

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ

1 DO260 = 50 µg/ml d’ADN double brin

1. Estimation de la [ADN] par A260

Problème: les protéines absorbent à 280 nm le phénol absorbe à 270 nm peut causer surestimation de [ADN] en

raison de l'absorbance résiduelle à 260nm

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ

1. Estimation de la [ADN] par A260

Solution: mesurer DO280

calculer le rapport DO260/DO280

donne une indication de la pureté de l’ADN (±)

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ

DO260 / DO280 Indique 1,8 ADN pur

< 1,8 contamination protéique > 2,0 contamination possible avec ARN

1. Estimation de la [ADN] par A260

Point technique: il faut que les lectures de DO se situent

entre 0,1 et 1,0 pour être fiables (au 2 λ)

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ

2. Intégrité de l’ADN spectrophotométrie donne aucune information

sur l’intégrité de l’ADN (i.e. dégradé ou non)

Pourquoi?Parce que, même si l'ADN est dégradé, les bases azotées de l'ADN sont encore présenteset absorbent à 260 nm

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ

2. Intégrité de l’ADN souvent on utilise un gel d’agarose pour

visualiser la qualité de l’ADN (permets aussi d’évaluer [ADN])

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ

λH3

bactériophage λ

ADN plasmidique

tomate

soya

orge

marqueur de taille

migration

Un exemple de BCM111:

GELS d'AGAROSE

Gel d'agarose d'ADN de levure et de kiwi

5 μg

1 μg 5 μg

1 μg marqueur

ADN génomiquePas de traînée = ADN non-dégradé !

direction de la migration

Un exemple de BCM111:

GELS d'AGAROSE

Gel d'agarose d'ADN de levure et de kiwi

5 μg

1 μg 5 μg

1 μg marqueur

ADN génomiquePas de traînée = ADN non-dégradé !

ARN

1. Phénoltrès corrosifpeut causer des brûlures

Alors, les précautions:porte de gantsporte de sarrauporte de lunettes de protectiontravailler le plus possible sous la hotte

SÉCURITÉ

1. Phénoltrès corrosifpeut causer des brûlures

S’il y a contact de phénol/CHCl3 avec la peau:

rincer avec beaucoup d’eauensuite laver avec de l’eau et du savonne jamais utiliser d’éthanol

SÉCURITÉ

1. Phénolrécupération sous la hotte

ne jamais mettre des Eppendorfs contenant du dans les poubelles ordinaires

SÉCURITÉ

2. Microcentrifugeuse lire/comprendre les règles d’utilisation sur p.7. équilibrer vos tubes !

SÉCURITÉ

2. Microcentrifugeuse lire/comprendre les règles d’utilisation sur p.6. équilibrer vos tubes = mettre un tube équilibre

en face de votre tube pour les microtubes un volume égal est

souvent acceptable

SÉCURITÉ

2. Microcentrifugeuse si le rotor n’est pas balancé…

SÉCURITÉ

La soucoupe volante vue hier était en fait un rotor débalancé.

2. Microcentrifugeuse si le rotor n’est pas balancé…

SÉCURITÉ

2. Microcentrifugeuse s'il y a un bruit bizarre, immédiatement

arrêter la centrifugeuse et vérifier

SÉCURITÉ

3. acides nucléiques en général dégradés par les nucléases, des enzymes qui

se retrouvent partout (sur nos mains, etc.)

Alors, les précautions:solutions, embouts et tubes stérilesporte de gants (très important pour l’ARN)

SÉCURITÉ

3. acides nucléiques en général

À noter: uniquement cette semaine on travaille

avec des embouts stériles, alors SVP ne pas remplir les boîtes avant qu'elles soient vides

SÉCURITÉ

1. EXERCICE 1 Extraction de l’ADN génomique de levure

2. EXERCICE 2 Extraction de l’ADN génomique de kiwi.

PLAN EXPÉRIMENTAL

BCM111:Un coéquipier prépare l’ADN de levure pendant que l’autre prépare l’ADN de kiwi.

1. EXERCICE 1 Extraction de l’ADN génomique de levure

2. EXERCICE 2 Extraction de l’ADN génomique de kiwi.

3. EXERCICE 3 Dosage de l’ADN (DO260 + DO260/DO280)

i) levure (BCM)ii) kiwi (BCM+TSB)

PLAN EXPÉRIMENTAL

aide visuel en laboratoire

montre les grandes lignes

ne pas inclure tous les détails

une par extraction d'ADN

à mettre dans le cahier avant le labo

ORGANIGRAMMES

organigramme• extraction d'ADN génomique de levure

NON OUI

NON

NON NON

OUI

OUI

OUI

OUI

NON

RÉGLAGE DE PROBLÈMES: ORGANIGRAMME

Est-ce que la *&?%! de chose marche?

Ne la toucher pas L'as-tu touché? Est-ce que IDIOT quelqu'un est au courant? Cache-la ! PAUVRE BÂTARD Vas-tu être chicané ? Oublie-le

Peux-tu blâmer quelqu'un d'autre

AUCUN PROBLÈME!

ORGANIGRAMME: EXTRACTION DE L'ADN GÉNOMIQUE DE KIWI (Ex. 2)

¼ de Kiwi (sans peau)

Écraser

Ajouter solution de lyse

15 min @ 60ºC

5 min sur glace

Filtrer Résidus Filtrat Centrifugation

Culot Surnageant Extraction φOH/CHCl3 Phase aqueuse Phase organique + interphase Précipitation à l'éthanol Lavage Séchage Dissolution

Mesurer le volume. Utiliser seulement 1 ml pour procéder.

Extraction d'ADN génomique

POINTS TECHNIQUES

Lunettes et gants obligatoire

Extraction d'ADN génomique

1. Levure bien resuspendre le culot des levures dans le

tampon de lyse (étape 7)

l'eppendorf + les billes contient DÉJÀ le ФOH / CHCl3

n'oublier pas de sceller votre microtube, APRÈS l'avoir fermé, avec du parafilm avant de vortexer

POINTS TECHNIQUES

Extraction d'ADN génomique

1. Levure prélèvement de la phase aqueuse:

i. gardez le tube à un angle en la sortant de la microcentrifugeuse

POINTS TECHNIQUES

Extraction d'ADN génomique

1. Levure prélèvement de la phase aqueuse:

ii. enlevez la phase aqueuse le plus vite possible

POINTS TECHNIQUES

Phase aqueuse (acides nucléiques) Phase organique (quelques protéines)

Interphase (majorité des protéines)

Extraction d'ADN génomique

1. Levure prélèvement de la phase aqueuse:

iii. prenez soin de ne pas prendre de l'interphase (laissez un peu de la phase aqueuse, étapes 12+15).

POINTS TECHNIQUES

Extraction d'ADN génomique

1. Levure ne pas mélanger EtOH 70% et 95%

POINTS TECHNIQUES

Extraction d'ADN génomique

2. Kiwi

POINTS TECHNIQUES

Lunettes et gants obligatoire

Extraction d'ADN génomique

2. Kiwi n'oublier pas de peser votre ¼ de kiwi! n'oublier pas de mélanger pendant les

incubations à 60oC et sur glace noter le volume de votre filtrat

(étape 6, pipette de 10ml stérile) utiliser seulement 1 ml de votre filtrat pour

continuer (étape 7)

POINTS TECHNIQUES

Extraction d'ADN génomique

2. Kiwi prélèvement de la phase aqueuse: comme pour

la levure

POINTS TECHNIQUES

Extraction d'ADN génomique

2. Kiwi prélèvement de la phase aqueuse: comme pour

la levure

l'ADN est le matériel clair et gélatineux collé sur le bord de l'Eppendorf

assurez-vous d'avoir rincé/dissous tout le culot

ne pas mélanger EtOH 70% et 95%

POINTS TECHNIQUES

Estimation des petits volumes

à l'aide de la micropipette

essai et erreur

POINTS TECHNIQUES

Culots d'ADN

portez attention de ne pas les perdre

portez attention de bien les dissoudre• vérifier en regardant au travers du tube s'il n'y

a plus de culot transparent et gélatineux

• sinon, mélanger la solution, car une solution non-homogène est nuisant à la quantification

POINTS TECHNIQUES

SPECTROPHOTOMÉTRIE

utiliser les côtés rayés des cuvettes pour les manipuler (cuvettes UV)

essuyer les cuvettes avec un kleenex

faire un blanc à toutes les longueurs d’onde

SPECTROPHOTOMÉTRIE

Côté rayé Côté rayé

3 ml 1 ml Volume minimal

Loi de Beer-Lambert:

DO = densité optique (pas d'unités)

E = coefficient d'extinction molaire(M-1cm-1)

c = concentration (M)

l = longueur (cm)

SPECTROPHOTOMÉTRIE

DO = Ecl

Loi de Beer-Lambert:

le DO varie en fonction [ADN]

c.-à-d pour 2 échantillons d'ADN « E » et « l » ne changent pas

SPECTROPHOTOMÉTRIE

DO = Ecl

Spectrophotométrie

• 2 échantillons (levure + kiwi)

• bien identifier vos cuvettes!

• DO entre 0,1 et 1,0 pour être fiable (2 λ)

• duplicata de chaque échantillon (i.e. refaire la bonne dilution pour chaque échantillon et refaire les lectures à 260 et à 280 nm)

POINTS TECHNIQUES

Ex. spectrophotométrie

• DO entre 0,1 et 1,0 pour être fiable

• 10ul échantillon+990ul H2O donne DO =1,5

• Qu’est-ce qu’il faut faire ?

• diluer 1:2 ou utiliser seulement 5 ul

POINTS TECHNIQUES

But

• apprendre à rédiger un article scientifique

• partie 1 Sc.4(Introduction, Matériels et Méthodes et Références)

• partie 2 Sc.9(Résumé, Résultats et Discussion)

MINI RAPPORT

article scientifique - sections

• résumé

• introduction

• matériels et méthodes

• résultats

• discussion

• références

Consultez le «Guide de rédaction de rapport»

MINI RAPPORT

peuvent être combinées

cette semaine

• pour l'extraction d'ADN génomique de levure et le dosage par spectrophotométrie

• introduction

• matériels et méthodes

• références

• à remettre la semaine prochaine

MINI RAPPORT

détails

• 5 pages max (-10% page supplémentaire) exclut la page titre, mais inclut les références

• police Times New Roman de taille 12 pt

• interligne double

• pages numérotées

MINI RAPPORT

pondération

présentation 5 pts

introduction 20 pts

Matériels et méthodes 10 pts

Références 5 pts

Analyse des résultats 10 pts

MINI RAPPORT

40 pts

Introduction

• entonnoir - commence large et se spécifie de plus en plus autour du sujet principal de l'article

• éléments introduction à l'ADN génomique méthodes d'extraction d'ADN méthodes de dosage de l'ADN les objectifs (et le méthodes utilisées pour les

réaliser inclure des références

MINI RAPPORT

Matériels et méthodes

• le lecteur doit être en mesure de refaire l'expérience à l'aide de cette section

• écrite au passé (passé composé) à la 3e personne (impersonnel)

• texte continu

• divisé en sous-sections

• pas écrite comme un protocole dans un manuel de laboratoire

MINI RAPPORT

Références

• format (dans le texte et dans la section des références) - voir Guide

• références supplémentaires aux notes de cours

• chaque référence doit être utilisée dans le texte

• pas de sites internet, ni Wikipedia

MINI RAPPORT

BCM111

• analyse des résultats

• compléter les feuilles du compte rendu dans vos notes de cours

• pourrait être fait en laboratoire

• remettre à l’heure normale

COMPTE RENDU

QUESTIONS?

• l'utilisation de Wikipedia comme référence sera pénalisée

• l'affirmation de choses (parfois farfelues) sans référence - sera pénalisée

• respectez l'espace alloué - essayer d'être concis et précis, trop d'info dilue le message

• inclure les originales et non des photocopies

CORRECTION des TRAVAUX

• évitez de faire des comparaisons sans utiliser des statistiques pour appuyer(ex: % erreur)

e.g. Ne pas écrire:

"Les valeurs se ressemblent, alors on a bien manipulé" ou "Les valeurs ne se ressemblent pas, alors on a dû faire une erreur de manipulation".

CORRECTION des TRAVAUX