extraction d’adn gÉnomique À partir de cellules vivantes
TRANSCRIPT
EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE ÀPARTIR DECELLULES VIVANTES
EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE
Buts
• préparer l’ADN génomique à partir de deux sortes de cellules, celles de levure et celles de kiwi
• apprendre à rédiger un article scientifique -sections d'Introduction, des Matériels et méthodes et des Références
EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE
Objectifs pratiques
exposition aux techniques de lyse cellulaire
exposition aux techniques d'extraction d'ADN
utilisation d'une microcentrifugeuse
EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE
Objectifs pratiques
déprotéinisation d'une préparation d'ADN par extraction phénol/CHCl3
précipitation d'ADN avec de l'éthanol
dosage de l'ADN (DO260 et DO260/DO280)
LES ACIDES NUCLÉIQUES
Deux classes
désoxyribonucléique (ADN)
ribonucléique (ARN)
Traduction
Transcription
Réplication
ARN
ADN
Protéine
LES ACIDES NUCLÉIQUES
ADN
hélice double monotone (= double brins)
associé à plusieurs protéines (histones)
sous la microscope électronique
nucleosome
LES ACIDES NUCLÉIQUES
nucleosome
l’unité de base de la chromatine
1e niveau de compaction de l’ADN
composé des histones +ADN
LES ACIDES NUCLÉIQUES
ADN
dépositaire de l'information génétique
génome = ensemble des chromosomes localisés dans le noyau d'une cellule
seulement deux rôles: 1. diriger sa réplication lors de la division cellulaire 2. diriger la transcription d'ARNm complémentaire
LES ACIDES NUCLÉIQUES
ADN - rôles
ARN
ADN
Protéine
Traduction
Transcription
Réplication
EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE
• plusieurs méthodes
• choix dépend du matériel à extraire
3 étapes principales
1. lyse cellulaire
2. séparation de l’ADN des autres composantes cellulaires
3. précipitation (concentration) de l’ADN
EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE
1. lyse cellulaire: libère l’ADN du noyau
mécanique
à l’aide de détergents
N.B. Les détergents (ex. SDS) dénaturent les protéines et solubilisent les membranes.
peuvent êtrecombinés
EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE
Alors, dans les cas pertinents:
• les cellules de kiwi et de levure possèdent une paroi cellulaire (= barrière physique)
• il faut la détruire pour être capable d’isoler l’ADN génomique des noyaux des cellules
CELLULES de KIWI et de LEVURE
levure
paroi cellulaire
CELLULES de KIWI et de LEVURE
kiwi
paroi cellulaire
EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE
Alors, dans les cas pertinents:
levure billes de verre (lyse physique) mélange au vortex (lyse physique) tampon de lyse avec détergent (chimique) phénol/CHCl3 (lyse chimique)
EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE
Alors, dans les cas pertinents:
kiwi écrasement par fourchette (lyse physique) tampon de lyse avec détergent (chimique)
CELLULES ANIMALES
Pas de paroi :
Alors,ne nécessite pas de bris mécaniquedes fois un tampon hypotonique suffit pour faire éclater la cellule
EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE
1. lyse cellulaire: libère l’ADN du noyau
2. séparation de l’ADN des autres composantes cellulaires
filtration ou centrifugation du lysat cellulaire extraction des protéines (phénol/CHCl3)
EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE
1. lyse cellulaire: libère l’ADN du noyau
2. séparation de l’ADN des autres composantes cellulaires
3. précipitation (concentration) de l’ADN précipitation à l’éthanol colonne d’affinité (au lieu de précipitation,
trousses commerciales)
À noter: dans le cas des trousses utilisant une colonne effectivement les étapes 2+3 sont combinées.
1. Estimation de la [ADN] par A260
à l’aide du spectrophotomètre bases azotées de l’ADN absorbent à 260 nm ADN doit être si pur
QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ
1 DO260 = 50 µg/ml d’ADN double brin
1. Estimation de la [ADN] par A260
Problème: les protéines absorbent à 280 nm le phénol absorbe à 270 nm peut causer surestimation de [ADN] en
raison de l'absorbance résiduelle à 260nm
QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ
1. Estimation de la [ADN] par A260
Solution: mesurer DO280
calculer le rapport DO260/DO280
donne une indication de la pureté de l’ADN (±)
QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ
DO260 / DO280 Indique 1,8 ADN pur
< 1,8 contamination protéique > 2,0 contamination possible avec ARN
1. Estimation de la [ADN] par A260
Point technique: il faut que les lectures de DO se situent
entre 0,1 et 1,0 pour être fiables (au 2 λ)
QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ
2. Intégrité de l’ADN spectrophotométrie donne aucune information
sur l’intégrité de l’ADN (i.e. dégradé ou non)
Pourquoi?Parce que, même si l'ADN est dégradé, les bases azotées de l'ADN sont encore présenteset absorbent à 260 nm
QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ
2. Intégrité de l’ADN souvent on utilise un gel d’agarose pour
visualiser la qualité de l’ADN (permets aussi d’évaluer [ADN])
QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ
λH3
bactériophage λ
ADN plasmidique
tomate
soya
orge
marqueur de taille
migration
Un exemple de BCM111:
GELS d'AGAROSE
Gel d'agarose d'ADN de levure et de kiwi
5 μg
1 μg 5 μg
1 μg marqueur
ADN génomiquePas de traînée = ADN non-dégradé !
direction de la migration
Un exemple de BCM111:
GELS d'AGAROSE
Gel d'agarose d'ADN de levure et de kiwi
5 μg
1 μg 5 μg
1 μg marqueur
ADN génomiquePas de traînée = ADN non-dégradé !
ARN
1. Phénoltrès corrosifpeut causer des brûlures
Alors, les précautions:porte de gantsporte de sarrauporte de lunettes de protectiontravailler le plus possible sous la hotte
SÉCURITÉ
1. Phénoltrès corrosifpeut causer des brûlures
S’il y a contact de phénol/CHCl3 avec la peau:
rincer avec beaucoup d’eauensuite laver avec de l’eau et du savonne jamais utiliser d’éthanol
SÉCURITÉ
1. Phénolrécupération sous la hotte
ne jamais mettre des Eppendorfs contenant du dans les poubelles ordinaires
SÉCURITÉ
2. Microcentrifugeuse lire/comprendre les règles d’utilisation sur p.7. équilibrer vos tubes !
SÉCURITÉ
2. Microcentrifugeuse lire/comprendre les règles d’utilisation sur p.6. équilibrer vos tubes = mettre un tube équilibre
en face de votre tube pour les microtubes un volume égal est
souvent acceptable
SÉCURITÉ
2. Microcentrifugeuse si le rotor n’est pas balancé…
SÉCURITÉ
La soucoupe volante vue hier était en fait un rotor débalancé.
2. Microcentrifugeuse si le rotor n’est pas balancé…
SÉCURITÉ
2. Microcentrifugeuse s'il y a un bruit bizarre, immédiatement
arrêter la centrifugeuse et vérifier
SÉCURITÉ
3. acides nucléiques en général dégradés par les nucléases, des enzymes qui
se retrouvent partout (sur nos mains, etc.)
Alors, les précautions:solutions, embouts et tubes stérilesporte de gants (très important pour l’ARN)
SÉCURITÉ
3. acides nucléiques en général
À noter: uniquement cette semaine on travaille
avec des embouts stériles, alors SVP ne pas remplir les boîtes avant qu'elles soient vides
SÉCURITÉ
1. EXERCICE 1 Extraction de l’ADN génomique de levure
2. EXERCICE 2 Extraction de l’ADN génomique de kiwi.
PLAN EXPÉRIMENTAL
BCM111:Un coéquipier prépare l’ADN de levure pendant que l’autre prépare l’ADN de kiwi.
1. EXERCICE 1 Extraction de l’ADN génomique de levure
2. EXERCICE 2 Extraction de l’ADN génomique de kiwi.
3. EXERCICE 3 Dosage de l’ADN (DO260 + DO260/DO280)
i) levure (BCM)ii) kiwi (BCM+TSB)
PLAN EXPÉRIMENTAL
aide visuel en laboratoire
montre les grandes lignes
ne pas inclure tous les détails
une par extraction d'ADN
à mettre dans le cahier avant le labo
ORGANIGRAMMES
organigramme• extraction d'ADN génomique de levure
NON OUI
NON
NON NON
OUI
OUI
OUI
OUI
NON
RÉGLAGE DE PROBLÈMES: ORGANIGRAMME
Est-ce que la *&?%! de chose marche?
Ne la toucher pas L'as-tu touché? Est-ce que IDIOT quelqu'un est au courant? Cache-la ! PAUVRE BÂTARD Vas-tu être chicané ? Oublie-le
Peux-tu blâmer quelqu'un d'autre
AUCUN PROBLÈME!
ORGANIGRAMME: EXTRACTION DE L'ADN GÉNOMIQUE DE KIWI (Ex. 2)
¼ de Kiwi (sans peau)
Écraser
Ajouter solution de lyse
15 min @ 60ºC
5 min sur glace
Filtrer Résidus Filtrat Centrifugation
Culot Surnageant Extraction φOH/CHCl3 Phase aqueuse Phase organique + interphase Précipitation à l'éthanol Lavage Séchage Dissolution
Mesurer le volume. Utiliser seulement 1 ml pour procéder.
Extraction d'ADN génomique
POINTS TECHNIQUES
Lunettes et gants obligatoire
Extraction d'ADN génomique
1. Levure bien resuspendre le culot des levures dans le
tampon de lyse (étape 7)
l'eppendorf + les billes contient DÉJÀ le ФOH / CHCl3
n'oublier pas de sceller votre microtube, APRÈS l'avoir fermé, avec du parafilm avant de vortexer
POINTS TECHNIQUES
Extraction d'ADN génomique
1. Levure prélèvement de la phase aqueuse:
i. gardez le tube à un angle en la sortant de la microcentrifugeuse
POINTS TECHNIQUES
Extraction d'ADN génomique
1. Levure prélèvement de la phase aqueuse:
ii. enlevez la phase aqueuse le plus vite possible
POINTS TECHNIQUES
Phase aqueuse (acides nucléiques) Phase organique (quelques protéines)
Interphase (majorité des protéines)
Extraction d'ADN génomique
1. Levure prélèvement de la phase aqueuse:
iii. prenez soin de ne pas prendre de l'interphase (laissez un peu de la phase aqueuse, étapes 12+15).
POINTS TECHNIQUES
Extraction d'ADN génomique
1. Levure ne pas mélanger EtOH 70% et 95%
POINTS TECHNIQUES
Extraction d'ADN génomique
2. Kiwi
POINTS TECHNIQUES
Lunettes et gants obligatoire
Extraction d'ADN génomique
2. Kiwi n'oublier pas de peser votre ¼ de kiwi! n'oublier pas de mélanger pendant les
incubations à 60oC et sur glace noter le volume de votre filtrat
(étape 6, pipette de 10ml stérile) utiliser seulement 1 ml de votre filtrat pour
continuer (étape 7)
POINTS TECHNIQUES
Extraction d'ADN génomique
2. Kiwi prélèvement de la phase aqueuse: comme pour
la levure
POINTS TECHNIQUES
Extraction d'ADN génomique
2. Kiwi prélèvement de la phase aqueuse: comme pour
la levure
l'ADN est le matériel clair et gélatineux collé sur le bord de l'Eppendorf
assurez-vous d'avoir rincé/dissous tout le culot
ne pas mélanger EtOH 70% et 95%
POINTS TECHNIQUES
Estimation des petits volumes
à l'aide de la micropipette
essai et erreur
POINTS TECHNIQUES
Culots d'ADN
portez attention de ne pas les perdre
portez attention de bien les dissoudre• vérifier en regardant au travers du tube s'il n'y
a plus de culot transparent et gélatineux
• sinon, mélanger la solution, car une solution non-homogène est nuisant à la quantification
POINTS TECHNIQUES
SPECTROPHOTOMÉTRIE
utiliser les côtés rayés des cuvettes pour les manipuler (cuvettes UV)
essuyer les cuvettes avec un kleenex
faire un blanc à toutes les longueurs d’onde
SPECTROPHOTOMÉTRIE
Côté rayé Côté rayé
3 ml 1 ml Volume minimal
Loi de Beer-Lambert:
DO = densité optique (pas d'unités)
E = coefficient d'extinction molaire(M-1cm-1)
c = concentration (M)
l = longueur (cm)
SPECTROPHOTOMÉTRIE
DO = Ecl
Loi de Beer-Lambert:
le DO varie en fonction [ADN]
c.-à-d pour 2 échantillons d'ADN « E » et « l » ne changent pas
SPECTROPHOTOMÉTRIE
DO = Ecl
Spectrophotométrie
• 2 échantillons (levure + kiwi)
• bien identifier vos cuvettes!
• DO entre 0,1 et 1,0 pour être fiable (2 λ)
• duplicata de chaque échantillon (i.e. refaire la bonne dilution pour chaque échantillon et refaire les lectures à 260 et à 280 nm)
POINTS TECHNIQUES
Ex. spectrophotométrie
• DO entre 0,1 et 1,0 pour être fiable
• 10ul échantillon+990ul H2O donne DO =1,5
• Qu’est-ce qu’il faut faire ?
• diluer 1:2 ou utiliser seulement 5 ul
POINTS TECHNIQUES
But
• apprendre à rédiger un article scientifique
• partie 1 Sc.4(Introduction, Matériels et Méthodes et Références)
• partie 2 Sc.9(Résumé, Résultats et Discussion)
MINI RAPPORT
article scientifique - sections
• résumé
• introduction
• matériels et méthodes
• résultats
• discussion
• références
Consultez le «Guide de rédaction de rapport»
MINI RAPPORT
peuvent être combinées
cette semaine
• pour l'extraction d'ADN génomique de levure et le dosage par spectrophotométrie
• introduction
• matériels et méthodes
• références
• à remettre la semaine prochaine
MINI RAPPORT
détails
• 5 pages max (-10% page supplémentaire) exclut la page titre, mais inclut les références
• police Times New Roman de taille 12 pt
• interligne double
• pages numérotées
MINI RAPPORT
pondération
présentation 5 pts
introduction 20 pts
Matériels et méthodes 10 pts
Références 5 pts
Analyse des résultats 10 pts
MINI RAPPORT
40 pts
Introduction
• entonnoir - commence large et se spécifie de plus en plus autour du sujet principal de l'article
• éléments introduction à l'ADN génomique méthodes d'extraction d'ADN méthodes de dosage de l'ADN les objectifs (et le méthodes utilisées pour les
réaliser inclure des références
MINI RAPPORT
Matériels et méthodes
• le lecteur doit être en mesure de refaire l'expérience à l'aide de cette section
• écrite au passé (passé composé) à la 3e personne (impersonnel)
• texte continu
• divisé en sous-sections
• pas écrite comme un protocole dans un manuel de laboratoire
MINI RAPPORT
Références
• format (dans le texte et dans la section des références) - voir Guide
• références supplémentaires aux notes de cours
• chaque référence doit être utilisée dans le texte
• pas de sites internet, ni Wikipedia
MINI RAPPORT
BCM111
• analyse des résultats
• compléter les feuilles du compte rendu dans vos notes de cours
• pourrait être fait en laboratoire
• remettre à l’heure normale
COMPTE RENDU
QUESTIONS?
• l'utilisation de Wikipedia comme référence sera pénalisée
• l'affirmation de choses (parfois farfelues) sans référence - sera pénalisée
• respectez l'espace alloué - essayer d'être concis et précis, trop d'info dilue le message
• inclure les originales et non des photocopies
CORRECTION des TRAVAUX
• évitez de faire des comparaisons sans utiliser des statistiques pour appuyer(ex: % erreur)
e.g. Ne pas écrire:
"Les valeurs se ressemblent, alors on a bien manipulé" ou "Les valeurs ne se ressemblent pas, alors on a dû faire une erreur de manipulation".
CORRECTION des TRAVAUX