esquema general

ESQUEMA GENERAL

SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico

SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de

etidio

SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A

KANAMICINA

Medio LB + KANAMICINA

Escherichia coli

Se “introducirá el vector pET-TEM

Sitio múltiple de restricción

Origen de replicación

Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina

fosfotransferasa

PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS

Niveles de impurezas aceptados por la FDA

Ccc: supercoiled circular covalently closed

Oc: open circular

Plásmidos

La diferencia en TAMAÑO entre el DNA cromosomal y el DNA plasmídico permite

desarrrollar estrategias de purificación

TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento

TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento

TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento

PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS

Niveles de impurezas aceptados por la FDA

Ccc: supercoiled circular covalently closed

Oc: open circular

Purificación de plásmidos

1. LisisQuímica Mecánica Cambios en la Tempratura

2. Remover partículas grandes Centrifugación Filtración (uso de membranas)

3. Purificación intermedia Precipitación fraccionada Adsorción a membranas

4. Purificación alta resoluciónMétodos cromatográficos: Intercambio iónico Filtración en gel Afinidad

Disolver Liofilizar Formular

5. Conservar

ESQUEMA GENERAL DEL AISLAMIENTO DE

PLÁSMIDOS POR LA TÉCNICA DE LISIS ALCALINA

Aislamiento de plásmidos por el método de lisis

alcalina

Las bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria

Solución GTE: Glucosa/Tris-HCl/EDTA pH=7.9

La glucosa no tiene carga pero es un osmolito

El EDTA une cationes divalentes como Mg2+ y Ca2+ en la membrana celular, debilitando la

membrana.

También el Mg2+ es cofactor de Dnasas

Componentes de la solución GTE

Tris-HCl

Glucosa

Solución de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1%

Esta solución disuelve los fosfolípidos y los componentes proteícos de las membranas

celulares.

SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CÉLULAS

Solución de lisis

El NaOH desnaturaliza el

DNA plasmídico y cromosomal

Acetato de Potasio: Precipita el SDS junto con proteínas y lípidos.

El DNA cromosomal que se renaturaliza se “atrapa” en el precipitado SDS/proteínas/lípidos.

Sólo el DNA plasmídico y moléculas de RNA “escapan” del precipitado y SE ENCUENTRAN EN

EL SOBRENADANTE

El isopropanol precipita los ácidos nucleícos

Incubar por 20 min a -20°C

Lavar el “botón” con etanol al 70%: remueve sales y remanentes de SDS. También remueve el isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se

evapora más rápido

Purificación de plásmidos

Por ejemplo unión al pétido 16mer

NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-

Gln-COOH

¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos?

1. Absorbancia 260 nm

2. Electroforesis en geles de agarosa

Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la purificación de plásmidos

DNA cromosomal

Plásmido abierto

Plásmido superenrrollado

1 Precipitación con isopropanol

2 Cromatografía intercambío aniónico

3 Filtración con membrana de nitrocelulosa

4 Lo que se retuvo en la membrana de

nitrocelulosa

Microscopia de polímero de agarosa

Uso de “colorantes”

Tinción con Syber Safe