emlősök korai embrionális génjei kifejeződésének
Post on 06-Jan-2022
5 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Emlősök korai embrionális génjei kifejeződésének vizsgálata
molekuláris biológiai módszerekkel
Doktori értekezés
Baji Gál Árpád
Biológia Doktori Iskola, iskolavezető: Prof. Erdei Anna
Szerkezeti biokémia program, programvezető: Prof. Gráf László
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar
Témavezető: Dr. Dinnyés András
MTA doktora, kutatócsoport vezető
Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Gödöllő
Genetikai Újraprogramozás Csoport
Gödöllő, 2008. május
1
„Felfedezni valamit annyit tesz, mint látni, amit mindenki lát,
és közben arra gondolni, amire még senki.”
Szent-Györgyi Albert
2
TartalomjegyzékRövidítések......................................................................................................................................11. Bevezetés.....................................................................................................................................2
1.1 Genetika, epigenetika..................................................................................................31.2 Génexpresszió..............................................................................................................31.3 Epigenetikai újraprogramozódás.................................................................................4
1.3.1 DNS metiláció.................................................................................................51.3.2 Genomi imprinting..........................................................................................51.3.3 X kromoszóma inaktiválás..............................................................................51.3.4 Telomer fenntartás...........................................................................................61.3.5 Kromatin átrendeződés....................................................................................61.3.6 Hiszton módosítások.......................................................................................8
1.4 Hiszton-kód.................................................................................................................91.5 Emlősök korai egyedfejlődése...................................................................................11
1.5.1 Morfológiai leírás..........................................................................................121.5.2 Molekuláris megközelítés.............................................................................141.5.3 Megtermékenyítést követő változások..........................................................161.5.4 Embrionális genom aktiváció........................................................................171.5.5 Az első differenciálódást kísérő változások..................................................18
1.6 Embrió technológiák..................................................................................................191.6.1 In vitro tenyésztés..........................................................................................201.6.2 Parthenogenetikus aktiválás..........................................................................201.6.3 Krioprezerváció, vitrifikáció.........................................................................201.6.4 Klónozás........................................................................................................21
1.7 Molekuláris biológiai megközelítési lehetőségek......................................................221.7.1 Módszertár.....................................................................................................221.7.2 A génexpresszió vizsgálata............................................................................231.7.3 Reverz transzkripcióval kombinált real-time polimeráz láncreakció............251.7.4 Egyedi embriók és sejtek génexpressziós vizsgálata....................................26
1.8 Vizsgált gének............................................................................................................272. Célkitűzések...............................................................................................................................293. Anyagok, módszerek..................................................................................................................31
3.1 Anyagok, vegyszerek.................................................................................................313.1.1 Tápoldatok petesejt és embrió kinyeréséhez, tartásához és kezeléséhez......313.1.2 Molekuláris biológiai módszerekhez használt anyagok, oldatok..................31
3.2 Állatok, élő sejtek, embriók kezelése........................................................................323.2.1 Állatvédelmi szabályok.................................................................................323.2.2 Petesejt kinyerése..........................................................................................323.2.3 Embriók kinyerése.........................................................................................333.2.4 Embriók tenyésztése......................................................................................333.2.5 Embriók mélyhűtése, felmelegítése..............................................................333.2.6 Embriók szétválasztása blasztomer sejtekre.................................................343.2.7 Parthenogenetikus aktiválás..........................................................................34
3.3 Alkalmazott molekuláris vizsgálómódszerek............................................................353.3.1 Totál RNS izolálás emlős szövetből..............................................................353.3.2 mRNS izolálás...............................................................................................353.3.3 Reverz transzkripció......................................................................................353.3.4 Polimeráz láncreakció...................................................................................363.3.5 Agaróz gél-elektroforézis..............................................................................36
3
3.3.6 Real-time polimeráz láncreakció...................................................................363.3.7 Primer tervezés..............................................................................................393.3.8 Kvantitatív PCR adatelemzés........................................................................403.3.9 Génexpresszió stabilitás vizsgálat.................................................................423.3.10 Egyéb molekuláris biológiai módszerek.....................................................42
4. Eredmények...............................................................................................................................434.1 Egyedi embriókon alapuló génexpressziós protokoll kifejlesztése és validálása......43
4.1.1 Primerek tervezési eljárásának validálása.....................................................434.1.2 Kvantitatív RT-PCR módszerek összehasonlítása.........................................474.1.3 Protokoll kidolgozása, jellemzése.................................................................484.1.4 Protokoll ellenőrzése.....................................................................................49
4.2 Embrió mélyhűtési módszerek összehasonlítása.......................................................504.3 Egér egyedfejlődésének összehasonlítása különböző körülmények között...............534.4 Nyúl egyedfejlődésének vizsgálata............................................................................574.5 Egér és szarvasmarha egyedfejlődésének összehasonlítása......................................624.6 HDAC és HAT gének expressziójának meghatározása egér embriókban.................64
5. Tárgyalás....................................................................................................................................665.1 Módszer fejlesztés.....................................................................................................665.2 Mélyhűtés..................................................................................................................685.3 Egér embriók tenyésztése és a parthenogenetikus aktiválás......................................695.4 Nyúl embriók egyedfejlődése és tenyésztése............................................................705.5 Egér és szarvasmarha összehasonlítása.....................................................................715.6 Hiszton kód szabályozása..........................................................................................725.7 Gyakorlati felhasználás, távlatok...............................................................................73
6. Következtetések.........................................................................................................................75Köszönetnyilvánítás.......................................................................................................................77Irodalomjegyzék............................................................................................................................78Függelékek.....................................................................................................................................91
I. Hiszton módosítások és funkcióik................................................................................91II. Egy sejt RNS tartalma.................................................................................................92III. A vizsgált gének szekvencia adatai............................................................................93IV. A nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának összehasonlítása...............................................96
Összefoglalás...............................................................................................................................103Summary......................................................................................................................................104
4
RövidítésekARTs asszisztált reprodukciós technikák (assisted reproductive technologies)bp bázispárBSA szarvasmarha szérum albumin (bovine serum albumin)cDNS (mRNS-ről átírt) komplementer DNS (complementary DNA)CG (CpG) citozin-guanin nukleotid pár (citozin-foszfát-guanin)COC kumulusz-petesejt komplexek (cumulus oocyte complexes)Ct küszöbérték ciklusszám (threshold cycle)CV relatív szórás, variációs együttható (coefficient of variation)CZB Chatot Ziomek Bavister tápoldatDNS dezoxiribonukleinsav (deoxyribonucleic acid)dNTP dezoxi-nukleotid-trifoszfátok (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)dT dezoxi-timinEBSS Earl-féle kiegyensúlyozott sóoldat (Earle's Balanced Salt Solution)eCG vemhes kanca placentájában termelődő hormon (equine chorionic gonadotropin)ECS ösztruszban lévő szarvasmarha szérum (estrous cow serum)EDTA etiléndiamin-tetraecetsav (ethylenediamine tetraacetic acid)EGA embrionális genom aktiváció (embryonic genome activation)EST expresszált szekvencia címke (rövid génszakasz) (expressed sequence tag)GOI vizsgált gén (gene of interest)H1 hiszton 1 fehérjeH2A hiszton 2A fehérjeH2B hiszton 2B fehérjeH3 hiszton 3 fehérjeH4 hiszton 4 fehérjeH4-K12Ac acetilált lizin oldallánc a H4 hiszton fehérje 12-es pozíciójábanHAT hiszton acetil-transzferáz enzimhCG emberi korion gonadotróp hormon (human chorionic gonadotropin)HDAC hiszton-deacetiláz enzimHEPES N-2-hidroxietil-piperazin-N'-2-etán-szulfonsavHKG háztartási gén (housekeeping gene)ICM epiblaszt, belső sejtcsomó (inner cell mass)ISV gyors fagyasztás műszalmában (in-straw vitrification)MMLV Moloney egér leukémia vírus (Moloney Murine Leukemia Virus)mRNS hírvivő RNS (messenger RNS)PCR polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction)PMSG vemhes kanca szérum gonadotróp hormon (pregnant mare serum gonadotropin)qRT-PCR kvantitatív, real-time RT-PCR (quantitative real-time RT-PCR)R2 determinációs együttható, a korreláció négyzete (coefficient of determination)RNáz ribonukleáz (ribonuclease - RNase)RNS ribonukleinsav (ribonucleic acid)RT reverz transzkripció (reverse transcription)SCNT testi sejtes sejtmagátültetés (somatic cell nuclear transfer)SDS nátrium-dodecil-szulfát (sodium dodecyl sulphate)SSV gyors fagyasztás szilárd felületen (solid surface vitrification)TAE Tris-acetát-EDTA puffer (Tris-Acetate-EDTA)TCM 199 szövetkultúra médium 199 (tissue culture medium 199)TE trofoblaszt, trofektoderma (trophectoderm)
1
1. Bevezetés
Ma már elfogadható mennyiségű bizonyíték áll rendelkezésre mind az orvostudományi,
mind az állati és növényi genetikai tanulmányokból arról, hogy az elsődleges DNS szekvencián
kívül is öröklődik információ generációkon át és befolyásolhatja az utódok fenotípusát. Ezt
epigenetikai információnak hívják és molekuláris alapjainak felfedezése a kutatók
érdeklődésének középpontjában áll.
A fejlődésbiológiai kutatások elsődleges célja sok év óta az emlősök egyedfejlődése során
zajló sejtes folyamatok molekuláris mechanizmusainak megértése. Napjainkban jutott oda a
tudomány, hogy a hagyományos genetikai és embriológiai kísérleti módszerek repertoárját
kiegészítsék a molekuláris és sejtbiológiai megközelítésekkel. Ennek eredményeképpen a mai
modern fejlődésbiológia több más tudományág, mint a biokémia, genomika és rendszerbiológia
határterületén valósul meg. A reverz transzkripcióval kombinált real-time polimeráz láncreakció
jelenleg az általánosan alkalmazott módszer, mely az mRNS mennyiségi meghatározásával, a
megfelelő adatelemzésével és a nyilvánvaló követelményekkel együtt alkalmas az egyedfejlődést
irányító génexpresszió vizsgálatára az orvostudományban, diagnosztikában, a mikrobiológiában
és a biotechnológiában.
Röviden a kutatás céljai, melyek a kutatócsoport emlős embrió technológiai (például
klónozási) munkáját szolgálják:
– alkalmas módszer kifejlesztése a génexpresszió mennyiségi meghatározására egyedi
sejtekben, embriókban, valamint a molekuláris, és epigenetikai újraprogramozódási
folyamatoknak a vizsgálata az emlősök korai egyedfejlődése alatt;
– a génexpresszió vizsgálata természetes és többféle módon előállított „mesterséges”
embriókban (in vivo, in vitro tenyésztett, parthenogenetikusan aktivált, mélyhűtött);
– különböző emlősállatok (egér, nyúl és szarvasmarha) összehasonlítása;
– a hiszton-kódot szabályozó különböző (hiszton acetil-transzferáz és hiszton-deacetiláz)
gének szerepének meghatározása.
Az értekezés több tudományterületet érint, mint a genetikát és molekuláris biológiát, az
epigenetikát, valamint az emlős embriológiát, és a biotechnológiát. Irodalmi áttekintésük és az
általánosan használt fogalmak, az alkalmazott módszerek elméleti háttere külön alfejezetekben
kerültek leírásra, rámutatva a kapcsolódási pontokra, mely alapján az elvégzett kísérleti munka
összefüggéseit egyszerűbben lehet majd megmagyarázni.
2
1.1 Genetika, epigenetika
Az egyedfejlődés sikeres, zavartalan lejátszódásáért jól szervezett, szabályozott
molekuláris folyamatok felelnek. Középpontjukban a genom, a két ivarsejt DNS állománya áll,
mely magában hordozza a teljes egyedfejlődés információját, programját. Amíg a DNS nukleotid
szekvenciája - a genetikai információ - a géneket, RNS és fehérje struktúrákat kódolja, ezek
programozott működését, kifejeződésük aktivációját-csöndesítését (ki- bekapcsolását), időbeli és
térbeli mintázatát, szövet és sejtspecifikus kifejeződését a primer szekvencián felüli, epigenetikai
információ határozza meg. Az epigenetikai mintázat tükrözi az adott sejt genotípusát, fejlődési
útját, az őt érő környezeti hatásokat, és végső soron a sejt fenotípusában fejeződik ki. Minden
egyedi sejtnek megvan a saját epigenetikai profilja, epigenomja (Morgan és mtsai. 2005.). Az
epigenetikai tényezők összessége a DNS funkciójának, a génexpressziónak a stabil, öröklődő és
visszafordítható módosulásai a sejtosztódás és fejlődés alatt anélkül, hogy a DNS szekvenciája
megváltozna. A kromatin szerkezetét, összetételét, helyspecifikus átalakítását érintik például a
DNS metilációjával vagy a DNS-t körülvevő hiszton fehérjék kémiai módosításaival, melyek
meghatározzák a DNS hozzáférését, transzkripciós aktivitását (Jones és Takai 2001., Jaenish és
Bird 2003.).
1.2 Génexpresszió
A génkifejeződés - génexpresszió - folyamatait a centrális dogmában foglalták össze
először (Crick 1970.). Első lépése a transzkripció, mely során általában egy génről a szabályozó
régiók (promóter) és a stop jel közötti információt hordozó, kódoló szakaszok (exonok) és a
köztes nem kódoló régiók (intronok) íródnak át a kétszálú DNS-ről egyszálú RNS-re. Az RNS
érése során (splicing) kivágódnak az intronok és létrejön az érett mRNS. Ezt követi a transzláció,
amikor az mRNS-ről fehérje szintetizálódik, végül a fehérje felveszi aktív formáját, egyéb
utólagos módosításokon eshet át, melyek után betölthetik specifikus szerepüket és kialakítják az
adott fenotípust (1. ábra). A genetikai információ - a DNS szekvencia - egy emlős szinte minden,
a zigótából kifejlődő sejtmaggal rendelkező testi sejtjében azonos (kivétel néhány specifikus
sejttípus, mint a limfociták). Alakjuk, felépítésük és működésük mégis egészen eltérő lehet,
mivel változó génkészlet fejeződik ki a különböző fejlődési stádiumokban és az egyes
sejtvonalakban, megadva a differenciálódott szöveti sejtek jellegét.
3
1.3 Epigenetikai újraprogramozódás
A preimplantációs egyedfejlődés során az epigenetikai módosítások szabályozzák például
az X kromoszóma inaktivációját, a genomi imprintinget, a telomerek hosszának szabályozását.
Központi szerepet töltenek be a génexpressziós mintázatának kialakításában a gének
aktiválásával, csöndesítésével. A sejtek elsődlegesen azáltal szabályozzák a génjeik aktivitását,
hogy növelik vagy csökkentik az adott gén transzkripcióját, amit fehérjéken, transzkripciós
faktorokon keresztül valósítanak meg a gének szabályozó régióihoz kapcsolódva. A
megtermékenyítést követő korai egyedfejlődés során - ahol a sejtek fejlődési potenciálja
nagymértékben megváltozik - az emlősök epigenomja a teljes genom szintjén
újraprogramozódik: az elősejtmagokban meglévő epigenetikai mintázat törlődik, és egy új
mintázat alakul ki. (Erről részletesebben olvasható az Egyesült Államok Élelmiszer és
Gyógyszerhatósága tanulmányában (FDA; Rudenko és mtsai. 2007.a,b).) Habár a kutatások
középpontjában főként a korai egyedfejlődésben zajló epigenetikai változások állnak, ezek
később, a felnőtt egyedben is lejátszódnak, például az ivarsejtek képzésekor. Szintén
valószínűsíthető, hogy a különböző orvosi beavatkozások, táplálékok és a környezeti kitettség
(vegyszerek) ezeknek a véletlenszerű megzavarásához vezethet, vagyis általában a környezethez
való adaptálódásnak is szükséges és normális része, melynek a folyamatait azonban még alig
ismerik (Bartolomei és Bickmore 2005.).
Az epigenetikai újraprogramozódással foglalkozó tudományág viszonylag fiatal. Még
4
1. ábra: Génkifejeződés.
A DNS molekulán az exonok rózsaszínnel, az intronok zölddel, a promóter és a stop jel pirossal vannak jelölve. (Forrás: http://hu.wikipedia.org/)
nem minden epigenetikai változást ismernek részleteiben, mivel a mögöttük rejlő molekuláris
folyamatok igen összetettek. Mindezzel együtt nagyon sok mindent tudnak már arról, hogy a
genom kifejeződését hogyan szabályozzák az egyedek, sejtek élete során. Ezek a különböző
típusú epigenetikai folyamatok: DNS metiláció, genomi (molekuláris) imprinting, X
kromoszóma inaktiválás, telomer fenntartás, kromatin átrendeződés (a kromatin szerkezet
szabályozott változásai), hiszton módosítások.
1.3.1 DNS metiláció
A DNS metilációs állapotát központi szerepűnek tartják a génexpresszió epigenetikai
szabályozásában, s mivel mind jobban kezdik megérteni ebben betöltött szerepét, ez az egyik
legaktívabban kutatott terület (Holliday 2005.; Scarano és mtsai. 2005.). A genomi DNS
metilációs mintázata a DNS nagy részén megtalálható metilált citozinokat, főként a CG
dinukleotidok 5' citozinjait jelenti, és a bizonyos régiókba - CpG szigetekbe - csoportosuló nem
metilált citozinokat. Az emlősök genomjában 30-40 ezer ilyen sziget található, főként háztartási
gének promóter régiói közelében, de szövet specifikus gének környezetében is (Antequera
2003.). A CG dinukletidokban lévő citozinokon megjelenő metiláció helyes mintázata szükséges
a normális egyedfejlődéshez, és szerepet játszik az X kromoszóma inaktiválásában és az
imprintingben is (Li és mtsai. 1993., Beard és mtsai. 1995.). A DNS metilációja az egyik
legstabilabb módosításnak tűnik, ezért ez az első számú jelölt, mely felelős a generációk közötti
epigenetikai öröklődésért. Azonban egy nemrégiben megjelent tanulmány alapján kijelenthető,
hogy az egérben (Mus musculus) nem ez a keresett epigenetikai jel (Blewitt és mtsai. 2006.).
1.3.2 Genomi imprinting
Emlősökben az anyai és apai genomok mindegyike szükséges a normális embrionális
egyedfejlődéshez. Működésbeli egyenlőtlenségüket epigenetikai folyamat, a genomi imprinting
határozza meg azáltal, hogy bizonyos gének aktivitása a szülői eredetétől függően szabályozódik
- vagyis vagy csak az apai, vagy csak az anyai kromoszómán elérhető és szabályozható, míg a
másikon nem. Így funkcionális különbség alakul ki a két szülői genom között, mely az
ivarsejtekben továbbítódik és a korai embrionális újraprogramozódás alatt is érintetlen marad
(Surani és mtsai. 1984.).
1.3.3 X kromoszóma inaktiválás
Az emlősök egyedfejlődésének már korai szakaszában az egyik X kromoszóma
transzkripcionálisan inaktiválódik, hogy az X kromoszóma géntermékeinek dózis kompenzációja
5
biztosítva legyen. Az inaktív X jellemzői a késői DNS replikáció és az epigenetikai módosítások,
mint a DNS metiláció, valamint hogy a hiszton 3 (H3) és hiszton 4 (H4) fehérjék kevéssé
acetiláltak, ellentétben az aktív X kromoszómával (Shi és mtsai. 2003.).
1.3.4 Telomer fenntartás
A telomerek az eukarióta kromoszómák végein található speciális, nem kódoló, ismétlődő
DNS szakaszok. A legtöbb testi sejtben védik a kromoszómák végeit a lebomlástól, elősegítik a
DNS replikáció befejezését és a sejtmagban való elhelyezkedésben is szerepük van. A
sejtosztódások során fokozatosan megrövidülnek, végül emiatt az osztódási képességüket is
elveszítik a sejtek. Ezt a jelenséget hívják a sejtek elöregedésének (Greider 1990.).
1.3.5 Kromatin átrendeződés
A kromoszóma anyaga a kromatin, mely
eukarióta sejtekben kettős szálú DNS és fehérjék
komplexéből áll. A kromatin szerveződésének több
szintje van, melyben a DNS molekula tömören össze
van csomagolva. A DNS két szála bázispárosodás
révén kettős hélix szerkezetet vesz fel, mely a
hiszton fehérjékkel nukleoszómákat formálnak és
mint a gyöngyök füzérszerűen ismétlődnek
szakaszonként - ezért hívják gyöngyfüzér
struktúrának. Ezek szabályosan összetömörödve
alkotják a kromatin szálat. A kromoszóma
működésétől függően a kromatin szál
feltekeredésével, hurkolódásával további
kondenzálódás érhető el (2. ábra). Szerkezete
dinamikusan változik az egyedfejlődés és
differenciálódás alatt. Fontos szerepet tölt be a gének
kifejeződésében, és a DNS megkettőződésében, a
replikációban is. A kromatin nem egységes a gének
eloszlása és a transzkripció aktivitása tekintetében.
Az eukariótákban a genom transzkripcionálisan aktív
(eukromatin) és inaktív (heterokromatin) részekre
tagolt. Az eukromatin a kromatin egy típusa, mely
6
2. ábra: A kromatin szerveződése.
A) DNS kettős hélix; B) gyöngyfüzér; C) kromatin szál; D) fellazult és E) kondenzált kromoszóma részlet; F) mitózisos kromoszóma. (Forrás: Alberts és mtsai. 2002.a)
gazdag génekben. A hiszton fehérjék nem kötődnek szorosan a DNS-hez, biztosítva ezáltal
egyfajta laza, nyitott szerkezetet, melyen sokféle molekula, fehérje hozzáférést nyerhet a DNS
megfelelő (szabályozó, kódoló) régióihoz. A génexpresszió aktív, szinte folyamatos az mRNS
átírás. Ezzel szemben a magasabb fokon rendeződött, zárt szerkezetű heterokromatin inaktív. A
DNS-t körülvevő hiszton fehérjék szoros kapcsolata miatt az RNS polimeráz (DNS-ről RNS
átírást végző) enzim nem fér hozzá a DNS-hez. A gének elhelyezkedése ezekben a részekben
ezért fontos szabályozója az expressziójuknak. Áthelyeződésük a nyitott és zárt kromatin
szerkezet között szükséges az expressziójuk hosszú távú változásához.
A kromatin alapegysége a
nukleoszóma, 146 bázispárnyi (bp) DNS-t
tartalmaz, mely két körben tekeredik fel egy
magot alkotó fehérje-komplexre (3. ábra). A
fehérje magot nyolc hiszton határozza meg:
két-két hiszton 2A (H2A), hiszton 2B
(H2B), H3 és H4 (Luger és mtsai. 1997.).
Az egyes nukleoszómákat egy rövid
„összekapcsoló” DNS szakasz és egy
hiszton 1 fehérje (H1) köti össze. A
hisztonok kis méretű, bázikus fehérjék. Öt
fő típusuk van (H1, H2A, H2B, H3 és H4),
egyenként körülbelül 130 aminosav
hosszúak. Mindegyik gazdag pozitív
töltésű, bázikus aminosavakban (arginin,
lizin, hisztidin), melyek szoros
kölcsönhatásba lépnek a negatívan töltött
DNS foszfát csoportjaival. A nukleoszómák
szerkezetükön keresztül szabályozzák a
transzkripciós komplexek kötődését a DNS
megfelelő régióihoz. A kromatin fellazulása
és a nukleoszómák átrendeződése
előfeltétele a transzkripció aktiválásának. A
fentiekre nézve csak a hímivarsejtek
jelentenek kivételt. A képzésük során
(spermiogenezis) a kromatin jelentősen
7
3. ábra: A nukleoszóma térbeli szerkezete.
A két körben feltekeredő DNS kettős szála barna-zöld színekkel, a magot képező hiszton fehérjék sárga (H2A), piros (H2B), kék (H3) és zöld (H4) színekkel, a Mn2+ és Cl-
ionok világoskék és sötétkék golyókkal vannak jelölve. PDB kód: 2CV5. Ábrázolás: UCSF chimera programmal (Pettersen és mtsai. 2004.). (Forrás: Tsunaka és mtsai. 2005.)
szorosabb formába tömörül, a génexpresszió teljesen felfüggesztődik és a hisztonok nagyrészt a
protaminnak nevezett, arginin-gazdag fehérjékkel helyettesítődnek (Braun 2001.).
1.3.6 Hiszton módosítások
A magasabb fokon rendeződött kromatin szerkezet szoros összefüggésben áll a
nukleoszómák magját alkotó hiszton fehérjék kinyúló N-terminálisának, ritkábban C-
terminálisának kovalens, transzláció utáni módosításaival. A hiszton H3 és H4 N-terminálisa az
eukarióták egyik legkonzervatívabb szekvenciája (Eberharter és Becker 2002.). A mostani
kutatásokból kiderül, hogy mennyire komplex rendszerről van szó, amit példáz a DNS
metilációjának, és a hisztonok acetilációjának, metilációjának, foszforilációjának és
ubiquitinációjának az óriási számbeli és minőségbeli változatossága is (Kanka 2003.; Quivy és
mtsai. 2004.; Cheung és Lau 2005.; Fuks 2005.; Verschure és mtsai. 2005.). Az eltérő hiszton
módosítások együttműködő vagy ellentétes kölcsönhatást gyakorolnak a kromatinhoz kötődő
fehérjékkel, amivel a transzkripcionálisan aktív vagy csöndes állapotok közti dinamikus
átmeneteket szabályozzák és szerepet játszanak a DNS megkettőződésében, a DNS hibák
javításában és a mitózisban is (részletesebben: Függelékek: I. Hiszton módosítások és funkcióik)
(Peterson és Laniel 2004.; Zhang és mtsai. 2007.). A hisztonok pozitív töltésű lizin oldalláncai a
DNS negatív töltésű foszfát csoportjaihoz szorosan kapcsolódnak. Az aktív géneknél a hisztonok
- főként a H3 és H4 - nagyon acetiláltak. Az acetilációjuk során semlegesítődnek, és a
nukleoszómális „gyöngyfüzér” becsomagoltsága csökken, így a DNS hozzáférhető lesz a
transzkripciós faktorok számára (4. ábra). Ezáltal a hiszton acetiláció, mint a kromoszómákon
található epigenetikai jel, a transzkripcióra való alkalmasságot jelöli, de az aktív transzkripcióval
nincs közvetlenül összefüggésben. Deacetilációjukkal ellentétes folyamat játszódik le, a
transzkripció gátlódik, és a kinyúló végek represszor fehérjéket kötnek meg (Grunstein 1997.).
Mint a preimplantációs embriófejlődés génexpressziójának legfontosabb epigenetikai
szabályozója, a DNS metiláció mellett ez a másik igen sokat tanulmányozott folyamat. Egyes
esetekben a DNS metiláció és a hiszton deacetiláció egyidejűleg eredményezi a géncsöndesítést
(Santoro és mtsai. 2002.).
Az hiszton végeken található acetilált lizin aminosavakat a bromodomének, bizonyos
kromatin átrendező és transzkripciót aktiváló fehérje szakaszok kötik, melyek körülbelül 100
aminosav hosszúak és négy α-hélixből állnak (Winston és Allis 1999.; Owen és mtsai. 2000.). A
kromatin szerkezet dinamikus átmeneteit a kapcsolódó nem-hiszton típusú kromoszómális
fehérjék biztosítják. Közülük kiemelkedő fontosságúak a „hiszton kódot” előállító és azt leolvasó
fehérjék, mint például a hiszton acetil-transzferáz (HAT) és a hiszton-deacetiláz (HDAC)
8
enzimek, melyek közösen együttműködve határozzák meg az általános genom szintű hiszton
acetiláltsági állapotot, és ennélfogva a transzkripciós állapotok közötti központi kapcsolóként
működnek (Shi és mtsai. 2003.). Érdekes módon olyan területeket is találtak a genomban,
amelyeken a génkifejeződés nincsen összhangban a helyi hiszton fehérjék módosításaival. Ez
egybecseng azzal az elképzeléssel, miszerint a genomnak jóval nagyobb része íródik át DNS-ről
RNS-re, mint korábban gondolták, és nem csak a klasszikus mRNS-eket kódolja, amelyek a
fehérjék szerkezetéhez szükséges információt hordozzák. A genom számos régiójáról fehérjéket
nem kódoló RNS-ek is átíródnak, amelyek elsősorban a génszabályozásban játszanak fontos
szerepet. Úgy tűnik, hogy ezeken a fehérjét nem kódoló genomi szakaszokon nem jelennek meg
az ismert hiszton módosítási mintázatok.
1.4 Hiszton-kód
A lehetséges sokféle kombináció alapján felállították az úgynevezett „hiszton-kód”
elméletét. Ez egy bonyolult szabályozó rendszer, amely jelentős mértékben kiterjeszti a genetikai
kód információtartalmát és a génexpresszió specifikus szabályozására egy epigenetikai
jelrendszert határoz meg (5. ábra). A de/acetiláció következetes mintázatára génről génre,
9
4. ábra: A hiszton acetiláció szerepe a génexpresszió szabályozásában.
A hisztonok lizin oldalláncainak acetilációjával a nukleoszómák fellazulnak, létrehozva egy nyitottabb kromatin szerkezetet, így a transzkripciós faktorok hozzáférhetnek a DNS-hez, a génexpresszió aktív (bal oldal). Ezzel ellentétes folyamat játszódik le a lizin oldalláncok deacetilációjával, géncsöndesítést okozva (jobb oldal). HDAC: hiszton-deacetiláz; HAT: hiszton acetil-transzferáz; N: hiszton N-terminális; Ac: acetiláció; TF: transzkripciós faktorok; RF: represszor fehérjék.
valamint a kód kombinatorikus felhasználásár azonban napjainkig nagyon kevés bizonyítékot
találtak (Turner 2000.; Strahl és Allis 2000.; Jenuwein és Allis 2001.; Kurdistani és mtsai. 2004.;
Nightingale és mtsai. 2006.).
A hiszton-kód acetil jelét létrehozó és szabályozó enzimek (HAT és HDAC) nagy
számban fordulnak elő az emlősökben. A hiszton acetil-transzferáz aktivitással rendelkező,
transzkripciót szabályozó koaktivátor fehérjék több különböző fehérjecsaládba tartoznak, melyek
különböző szubsztrátokat részesítenek előnyben, és más-más feladatokat látnak el a sejtekben.
Többségük a transzkripciót szabályozó, nagy komplexekben fordul elő, ezzel tovább tágítva a
viszonylag gyenge szubsztrát specificitásukat. A családok közötti szekvencia hasonlóság kicsi,
általában csak a hiszton acetil-transzferáz doménre korlátozódik (Marmorstein és Roth 2001.). A
10
5. ábra: Hiszton módosítások.
Az emberi hiszton fehérjék eddig ismert transzláció utáni módosításai: acetiláció (Ac), metiláció (Me), foszforiláció (P), ubiquitináció (U). A vastag sötétebb régiók az alfa-hélix struktúrát jelölik. (Forrás: www.histone.com/modification_map.htm)
HAT enzimek katalizálják az acetil csoport áthelyezését az acetil-koenzim A-ról a hiszton
fehérjék nukleoszómából kinyúló N-terminálisán található lizinek ε-amino csoportjára (4. ábra)
(Carrozza és mtsai. 2003.). Fontos szerepüket írták le egérben az egyedfejlődés során, valamint
emberben (Homo sapiens) rákos elváltozások okaként.
A hiszton-deacetiláz aktivitással rendelkező fehérjéket két családba sorolják, az egyik a
klasszikus HDAC család. Közös jellemzőjük a kromatin szerkezethez való kötődési képességük
a katalitikus doménen keresztül, valamint az acetil csoport eltávolítása a hiszton fehérjékről.
Mint a génexpressziós aktivitás szabályozói, aktívan kutatják a kóros génműködés
szabályozásában betöltött szerepüket a rákos elváltozásokban (Khochbin és mtsai. 2001.; de
Ruijter és mtsai. 2003.).
Több vizsgálatot végeztek preimplantációs stádiumú emlős embriókban a különböző
ismert HDAC és HAT gének expressziós mintázatának feltárására egérben, szarvasmarhában
(Bos taurus) és bundermajomban (Macaca mulatta), azonban egyik tanulmányba sem a teljes
készletet, hanem csak néhány (1-10) kiválasztott gént vontak be, és az újabban leírt HDAC
gének expresszióját még senki nem jellemezte (Schuettengruber és mtsai. 2003.; Hayashi és
mtsai. 2003.; McGraw és mtsai. 2003.; Zheng és mtsai. 2004.).
1.5 Emlősök korai egyedfejlődése
Az embrionális egyedfejlődés első, preimplantációs szakasza a petesejt
megtermékenyítésével kezdődik és az embrió méhbe való beágyazódásáig tart. Viszonylag lassú
folyamat, egérben átlagosan 4,5 napot vesz igénybe - míg embernél 6-7 napot, szarvasmarhában
17-34, birkában (Ovis aries) és sertésben (Sus scrofa) 14-16 napot (Ko 2004.). Lassú, de
funkcionálisan eseménydús sejtosztódások jellemzik, melyek során az embrió méretbeli,
tömegbeli növekedést nem mutat. Ez alatt történik meg az egyesülő ivarsejtek genomjának
epigenetikai újraprogramozódása, az embrionális genom aktivációja (EGA) és az első
differenciálódás.
A laboratóriumi (házi) egér széles körben, általánosan elfogadott és választott modell
szervezet az egyedfejlődés és az emberi betegségek tanulmányozásában. Az egér és az ember
számos fiziológiai és patológiai tulajdonsága azonos. Az idegi, szív- és érrendszeri, endokrin,
immun-, és egyéb belső szervrendszeri, valamint izom- és vázszerkezeti hasonlóságokról óriási
irodalom áll rendelkezésre (Rosenthal és Brown 2007.).
A szarvasmarha, mint nagy testű kísérleti modell állatfaj preimplantációs
egyedfejlődéséről szintén sok információ gyűlt már össze és ma is intenzíven tanulmányozzák.
11
Több vonatkozásban is eltér az egérétől, mint például a kisebb genom aktivációnak (minor
genome activation) és az EGA-nak az időzítése.
A nyúl (Oryctolagus cuniculus), mint klasszikus modellállat preimplantációs
egyedfejlődése, az embrionális genom aktivációja hasonló a nagy emlősökhöz és az emberhez,
és e mellett metabolizmus tanulmányokban, antitest termelésben és gyógyszer hatóanyagok
tesztelésében is előszeretettel használják (Graves és Moreadith 1993.). Az irodalomban ennek
ellenére nincs elegendő információ az embriók molekuláris biológiai és génexpressziós
vizsgálatáról. A különböző fajok génexpressziós mintázatainak összehasonlításából közelebb
lehet jutni a jelenségek faji különbségektől független, általános megértése felé.
Példaként az egér, mint a legkönnyebben vizsgálható és az egyik legjobban
tanulmányozott emlős modellállat korai egyedfejlődése kerül bemutatásra röviden.
1.5.1 Morfológiai leírás
A petefészekből kiszabaduló érett petesejt az ampullába, a petevezeték végső kitágult
szakaszába jut és itt a megtermékenyítés hatására esik át a meiózis második szakaszán. A
zigótában még két külön elősejtmagban lévő haploid szülői génállományok replikálódnak, majd
lezajlik az első sejtosztódás. Mivel a petesejtek érése, ovulációja és megtermékenyítése, valamint
a sejtosztódások nem
összehangoltak, aszinkron
zajlanak, az egyes embrionális
stádiumokat és a sejtosztódások
időpontjait bizonyos
időtartamokkal lehet csak
megadni (6. ábra). Az
állatvilágban ezek az első
embrionális sejtosztódások a
leghosszabbak, 12-24 órát
vesznek igénybe. A létrejövő
utódsejtek még teljesen azonosak,
totipotens blasztomerek, vagyis
képesek bármilyen sejttípust
létrehozni, differenciálódni, vagy
akár egyetlen blasztomer sejt is
élő állattá fejlődni.
12
6. ábra: Az egér preimplantációs egyedfejlődése.
Az 1. napon, az éjszakai fázisban történik meg a megtermékenyítés és a fejlődő embrió az 5. napon jut el a méhbe való beágyazódásig a különböző stádiumokon keresztül. (Forrás: Nagy és mtsai. 2003.a)
Az első néhány sejtosztódás során az embrió végighalad a petevezetéken és eljut a méhig.
Habár a blasztomerek is aszinkron osztódnak, megkülönböztetjük a kétsejtes, négysejtes,
nyolcsejtes, szedercsíra (vagy kompakt morula) (8-16 sejt), hólyagcsíra (vagy blasztociszta) (32-
64 sejt) stádiumokat, mint jellemző állapotokat (7.A ábra).
A nyolcsejtes stádium végén megkezdődik egy szintén emlősökre jellemző speciális
folyamat, a kompaktálódás, így a következő stádiumot kompakt morulának is nevezik (7.B ábra).
Az eddig gömbölyű, hézagosan elhelyezkedő blasztomer sejtek ellaposodnak, szorosabban
összerendeződnek. Ezt a struktúrát a külső sejtek által kialakított számos sejt-sejt kapcsolat
stabilizálja, elzárva a belső összekapcsolódó sejteket.
13
7. ábra: Egér embrió stádiumok.
A) Fázis kontraszt mikroszkóppal készített fényképek: petesejt (a), zigóta (b), kétsejtes (c), négysejtes (d), korai nyolcsejtes (e), szedercsíra (f), hólyagcsíra állapot (g); ICM: belső sejtcsomó; TE: trofektoderma;
B) nyolcsejtes embrió kompaktálódás előtti (h) és utáni (i) scanning elektronmikroszkópos felvétele (Forrás: Gilbert 2006.);
C) beágyazódás előtt a peteburokból kibújó hólyagcsíra (j).
A 16 sejtes szedercsírában történik meg az első differenciálódás, kialakul az első két
különböző sejttípus. A kevesebb belső sejt hozza létre az embrionális sejteket, a belső sejtcsomót
(ICM), míg a többségében külső sejtek az extraembrionális sejteket, a trofektodermát (TE). Ezzel
együtt elindul egy másik jelentős folyamat is: fokozatosan csökken a sejtek fejlődési potenciálja,
már csak pluripotensek - vagyis sokféle, de nem minden sejttípust képesek létrehozni, valamint
egymást nem képesek helyettesíteni. Az ICM sejtekből alakul ki többek között az embrió,
valamint a petehártya, allantoisz, amnion, míg a TE sejtek az embrió fejlődéséhez szükséges
járulékos struktúrákat, mint például a méhlepény embrionális részét, külső magzatburkot hozzák
létre.
A következő osztódások során a 64 sejtes állapotra lejátszódik még egy folyamat, az
üregesedés. Az embrió gömbölyű felszínét adó TE sejtek folyadékot termelnek belülre,
létrehozva egy üreget, a blasztocölt, melyben a TE belső felszínére kapcsolódik egyik oldalon az
ICM. Ezt a jellegzetes stádiumot hívják hólyagcsírának. Itt az embrió fejlődése lelassul, a
folytatáshoz szükséges a méhbe való beágyazódás. Eddig az embriót a petesejt burka, egy
extracelluláris mátrix (zóna pellucida) veszi körül, mely védi az embriót az idő előtti
megtapadástól a petevezetékben. A méhbe érve éri el körülbelül azt a késői hólyagcsíra állapotot,
amikor a TE sejtek termelte enzimek segítségével „ki tud bújni” ebből a burokból (7.C ábra), és
megtörténhet a méh falán a megtapadás, és beágyazódás (Nagy és mtsai. 2003.a; Gilbert 2006.).
1.5.2 Molekuláris megközelítés
A fent leírt embriológiai és morfológiai változások hátterében számos összetett
molekuláris folyamat húzódik. A petesejt és a korai stádiumú embriók kis mérete ellenére
molekuláris biológiai és genetikai kutatásokból sok információ összegyűlt a genom, az RNS és
fehérje szintézis változásairól, szabályozásáról (Schultz 1986.; Edwards 2003.). Az egymást
követő sejtosztódások alatt az egész genomra kiterjedő, jól szervezett és gyorsan változó
génexpressziós mintázat valósul meg a normális egyedfejlődés biztosítására, szemben a felnőtt
szervezet differenciálódott sejtjeivel, melyek génexpressziójára egy állandó alapmintázat a
jellemző, és csak a genom kisebb része mutat változást a különféle környezeti hatásokra.
Az emlősök egyedfejlődése során két jelentős epigenetikai újraprogramozódás megy
végbe, mely során a génexpressziós mintázatok is megváltoznak minden sejtben. Először
közvetlenül a megtermékenyítés után (preimplantációs), majd később az ivarsejtek
képződésekor. Az elsőben a két ivarsejt nagyon eltérő epigenetikai mintázatú, kromatin
szerveződésű és sejtciklus fázisú haploid genomjából alakul ki a zigóta diploid génállománya.
Míg a kis méretű hímivarsejtben a DNS protamin fehérjékkel szorosan összetekerve, kompaktan
14
szállítódik, addig az óriási méretű emlős petesejtben a genom a testi sejtekre is jellemző hiszton
fehérjékkel lazábban szervezett kromatin struktúrában van jelen. Ahhoz, hogy kialakuljon az
egységesen működő genom, a két különböző struktúrának át kell alakulnia. A második genom
szintű újraprogramozódás az ivarsejtek képződésekor megy végbe az előbbihez képest sokkal
lassabban. Már a 11-12 napos embrióban megkezdődik egy általános DNS demetiláció a
primordiális csírasejtekben (primordial germ cells: PGC), melyet de novo metiláció követ,
kialakítva az ivarspecifikus imprinting mintázatot is. A hímivarsejtek esetén a folyamat a 18.
napon befejeződik, míg a petesejtnél az ovulációig tart (8. ábra).
A gének aktiválásának és inaktiválásának pontos időzítése kulcsfontosságú a normális
preimplantációs egyedfejlődésben. Az adott gének kifejeződésének hiánya, vagy bármilyen
késése rendellenességekhez vezet, ezért az újraprogramozódásban hibátlan aktiválási időzítésnek
és jól szervezett génkifejeződési mintázatnak kell megvalósulnia ahhoz, hogy megkezdődjön és
folytatódjon is az embrionális egyedfejlődés. Összehasonlító tanulmányokból kiderül, hogy bár
minden vizsgált emlősfajban lejátszódik az újraprogramozódás, annak mértéke és időzítése
jelentősen eltérhet a fajok között a preimplantációs egyedfejlődés során (Morgan és mtsai.
2005.).
15
8. ábra: Az epigenetikai újraprogramozódási ciklus egérben.
A preimplantációs egyedfejlődés alatt (jobb oldal), és az ivarsejtek képződésekor (bal oldal) lezajló folyamatok. ICM: belső sejtcsomó; TE: trofektoderma; PGC: primordiális csírasejtek. (Forrás: Morgan és mtsai. 2005.)
1.5.3 Megtermékenyítést követő változások
A megtermékenyítés után az első órától kezdve az apai kromatin szerkezet nagy
átalakuláson megy keresztül, amikor a protaminok lecserélődnek a petesejtben tárolt hiszton
fehérjékre, melyek közül főként a H3 és H4 hisztonok nagyon acetiláltak. Ezt követően a DNS
genom szintű demetilációja kezdődik el - bizonyos régiók kivételével, mint például a
centromerek heterokromatinja, és az apai metilált imprinting gének. A kromatin fellazul, és
létrejön az apai elősejtmag (Santos és Dean 2004.).
Ezalatt fejeződik be a petesejt második meiotikus osztódása kialakítva az anyai
elősejtmagot. Általános hiszton deacetiláció zajlik le az egér petesejtben a meiózis alatt, mely
szerepet játszhat a genom újraprogramozódásában. Ez elengedhetetlen előfeltétele annak, hogy a
differenciálódott petesejt átalakulhasson totipotens zigótává. A meiózis két szakasza között
kimutatható a kromatin szerkezet ideiglenes változása. A H4 hiszton 12-es acetilált lizinje (H4-
K12Ac) kulcsfontosságú epigenetikai jel, mely az aktív géneken található meg (Smith és mtsai.
2002.).
Az apai és anyai elősejtmag eltérő epigenetikai - DNS metilációs, hiszton acetilációs -
mintázata feltehetőleg az eltérő transzkripciós aktivitást határozza meg. Amíg a petesejt
megtermékenyítésekor mindkét genomban azonos mennyiségű, kevéssé acetilált hiszton H4
mutatható ki, addig ez a kiegyenlített állapot hamar megváltozik, és az apai elősejtmagban már
nagyobb mennyiségben van jelen a többszörösen acetilált H4 (9. ábra) (Adenot és mtsai. 1997.).
Az anyai genomban több heterokromatin szerkezet található és ezzel összhangban alacsonyabb a
transzkripciós aktivitás, szemben az apaival, ahol több eukromatikus régió, és lényegesen
aktívabb transzkripció mutatható ki (Reik és mtsai. 2003.). Ezt az apai genomról kimutatható
16
9. ábra: Újraprogramozódás az anyai és apai elősejtmagban.
Az aktív transzkripciót okozó módosítások zöld színnel, a gátlók pirossal, a protaminok lilával vannak jelölve, a színátmenetek a módosítások intenzitását, a pöttyözés a centromerek környékén található heterokromatint, valamint az imprinting mintázatot jelölik a megtermékenyítéstől a két elősejtmag egyesüléséig. Ac: acetiláció; Me: metiláció. (Forrás: Morgan és mtsai. 2005.)
kisebb mértékű mRNS átírást hívják kisebb genom aktiválásnak (Memili és First 2000.). A két
elősejtmag egyesül, majd replikálódik, és végbemegy az első sejtosztódás létrehozva a két
utódsejtet (blasztomert), melyekben már egy sejtmagban együtt található meg a két szülői
genom. A kromatin szerkezeten alapuló, általános transzkripcionálisan gátolt állapot alakul ki,
melyért főként a HDAC enzimek a felelősek, és amelyet később a hiszton fehérjék fokozott
acetilációja vált fel (10. ábra) (Taylor és mtsai. 2003.).
1.5.4 Embrionális genom aktiváció
Az egérben az első sejtosztódás után megy végbe az első nagy fejlődésbeli átmenet: az
„anyaiból embrionálisba történő átmenet”, más néven az embrionális genom aktiváció, de ezzel
egyidejűleg több más jelentős molekuláris folyamat is lezajlik (Aoki és mtsai. 1997.). Az
egyedfejlődési programot eredendően az anyai - petesejt - eredetű RNS-ek és fehérjék indítják el.
Már a petesejtek fejlődése alatt mindenféle RNS - köztük az mRNS-ek - és fehérjék
szintetizálódnak és halmozódnak fel, melyek jellemzően nagyon stabilak. A petesejt növekedése
és érése során nagymértékben megváltozik az újan szintetizált fehérjék mintázata, valamint az
mRNS-ek közel fele lebomlik (Bachvarova 1985.). A fejlődés zavartalan továbbviteléhez
azonban új gének kifejeződése szükséges, az EGA során megtörténik a fő genom aktiváció:
– A petesejtben felhalmozott és tárolt specifikus RNS és fehérje tartalékok lebontása, melyek a
megtermékenyítéshez, az azt követő első sejtosztódáshoz és a genetikai
újraprogramozódáshoz nélkülözhetetlenek, és amiket azután már nem expresszál tovább az
17
10. ábra: A génexpresszió változása a korai egyedfejlődés során az egér embrióban.
embrió. Jellemző az anyai fehérjék nagyobb lecserélődési sebessége.
– Az anyai RNS-ek leváltása embrionálisokra, amikre mind a petesejtnek, mind a korai
embriónak folyamatosan szüksége van.
– A génexpresszió elindítása, új RNS-ek átírása, amik a petesejtben még nem voltak jelen, de
az embrió továbbfejlődéséhez szükségesek (Schultz 2002.). Az egérben már a kétsejtes
stádium közepétől számos embrionális gén aktiválódik, és megjelennek az embrió saját maga
termelte RNS-ek, fehérjék (11. ábra) (Piko és Clegg 1982.).
A különböző fajok között eltérés lehet, így például más rágcsálókban, mint a patkány
(Rattus norvegicus) (Zernicka-Goetz 1994.), vagy aranyhörcsög (Mesocricetus auratus)
(Seshagiri és mtsai. 1992.), szintén két sejtes állapotban, míg a szarvasmarhában (Mann és
Bartolomei 2002.), kecskében (Capra hircus) (Sakkas és mtsai. 1989.), birkában, nyúlban
később, a nyolcsejtes állapotban, a macskában (Felis catus) (Hoffert és mtsai. 1997.) és az
emberben pedig a négy-nyolcsejtes állapotban zajlik le (Telford és mtsai. 1990.).
1.5.5 Az első differenciálódást kísérő változások
A génexpresszió változása sokszor a környező sejtek differenciálódására indukálódik,
különböző faktorok kiválasztásával, vagy a sejt-sejt kapcsolatok változásával. Ez történik
például a szedercsíra állapotban (Kidder 2002.).
Az egysejtes stádiumtól kezdődően a DNS metiláció és hiszton módosítások genom
szintű mintázata is folyamatosan változik az osztódásokkal. A hólyagcsíra állapot létrejöttéig
18
11. ábra: Az egér embrionális genom aktivációját kísérő molekuláris folyamatok.
Pirossal az anyai, kékkel az apai, sárgával az embrionális genomhoz kapcsolódó események vannak jelölve, a színátmenetek az intenzitás változását jelzik az egyedfejlődés során. (Forrás: Schultz 2002.)
folyamatos a DNS demetilációja, majd amikor az embrionális (ICM) és extraembrionális (TE)
sejtek külön válnak, jelentkezik először az epigenetikai mintázatban is eltérés. A TE sejtekben
alacsony DNS metilációs szint mutatható ki, például az inaktív X kromoszómán. Az ICM-ben
széleskörű de novo metiláció zajlik már a szedercsíra állapottól kezdve, valamint a hiszton
acetiláció is fokozottabb (12. ábra). Ez az átprogramozódás szükséges az ICM sejtek
pluripotenciájának fenntartásához, a későbbi
sejtvonalak kialakításához, valamint a
génexpresszió helyes beindításához is az
embrióban.
A két sejttípus génexpressziójának eltérő
indukálása a kutatások középpontjában áll. Egér
embrionális őssejtek (embrionic stem cells:
ESC) vizsgálatából sikerült olyan
kulcsfontosságú géneket azonosítani, név szerint a Pou5f1 (Oct-4) és a Nanog homeobox
transzkripciós faktorokat, melyek specifikusak az ICM sejtekre és azok pluripotenciájának
fenntartásáért felelősek (Boiani és mtsai. 2002.; Mitsui és mtsai. 2003.).
1.6 Embrió technológiák
A legtöbb embrió technológia részét képezi az embriók hosszabb-rövidebb ideig tartó in
vitro körülmények közötti tenyésztése, ami - mint egy nem természetes fiziológiai környezet -
hatással van a génexpresszióra, ezen keresztül a fejlődés menetére is (Niemann és mtsai. 2002.).
Az anyai környezetből kivett és in vitro körülmények közt tenyésztett embriók a mesterséges
beavatkozások hatására minőségükben, fejlődésükben eltérnek a természetes módon létrejövő, in
vivo megfelelőjüktől. Feltehetőleg a tápanyagok (metionin, homocisztein, poliaminok, B12
vitamin, fólsav, urea) és környezeti hatások olyan finom változásokat indukálnak az epigenetikai
újraprogramozódásban, melyek csak később nyilvánulnak meg a fenotípusban, mint a korai
magzati elhalás, a születési súlyban való óriási különbségek, vagy számos felnőttkori betegség
(Taylor és mtsai. 2003.). Ezért a normális egyedfejlődés folyamatainak molekuláris szintű
meghatározása előfeltétele a terhesség alatti táplálkozás optimális kialakításának és a különböző
embrió technológiák javításának is.
Az in vitro tenyésztett embriók óriási előnye, hogy lényegesen egyszerűbb és könnyebb
kísérleteket végezni velük, azonban vizsgálatukból mégsem kapható az in vivo megfelelőjükkel
teljesen azonos eredmény, és ezekből nem minden esetben lehet egyértelműen következtetni a
természetes fejlődési folyamatokra. A különböző biotechnológiai úton előállított emlős embriók
19
12. ábra: Epigenetikai különbségek az egér embrió első két sejttípusában.
ICM: belső sejtcsomó; TE: trofektoderma; Xi: inaktív X kromoszóma; többit lásd: 9. ábra. (Forrás: Morgan és mtsai. 2005.)
összehasonlítása fontos különbségeket tárhat fel, ezért szükség van olyan további állatmodell
kísérletekre, amelyekből megérthető a korai embriók egyedfejlődési rugalmassága és amelyek
eredménye által javíthatók az embrió technológiák hatékonysága és mérsékelhetők a kedvezőtlen
következmények.
A fontosabb mesterséges beavatkozások, melyek a későbbiekben a vizsgálatok tárgyát
képezik: in vitro tenyésztés, parthenogenetikus aktiválás, krioprezerváció (fagyasztás) és
vitrifikáció (mélyhűtés), valamint a sejtmagátültetés (klónozás).
1.6.1 In vitro tenyésztés
A preimplantációs egyedfejlődés mesterséges körülmények között, in vitro is
hasonlóképpen végigmegy, de a folyamat nem teljesen zavartalan. Valamivel hosszabb időre van
szükség a hólyagcsíra stádium eléréséig, mint in vivo, az egyes stádiumokba lassabban jutnak el
az embriók, vagyis a fejlődés általános lelassulása jellemző (Harlow és Quinn 1982.). Számos
kísérlet irányul az in vitro tenyésztés optimális körülményeinek feltárására, az in vivo állapot
modellezésére. A fejlődéshez speciális tápoldatra, inkubációs hőmérsékletre és oxigén, illetve
szén-dioxid tartalomra van szükség (lásd a „3. Anyagok, módszerek” fejezetben: „3.2.4 Embriók
tenyésztése”). Az in vitro tenyésztéssel a külső környezeti feltételek hatásait lehet vizsgálni.
1.6.2 Parthenogenetikus aktiválás
A parthenogenetikus aktiváláskor a petesejtet kémiai anyagokkal indukálják. Ennek
hatására megtermékenyítés nélkül megkezdi az egyedfejlődést. A petesejt mesterséges aktiválása
a klónozásnak is fontos lépése. Az embrionális fejlődés beindításáért felelős, de gyakorlati
alkalmazásán túl lehetőséget nyújt a belső környezeti feltételek, a petesejt és genomjának hatásai,
valamint a megtermékenyülés alatt bekövetkező sejt- és molekuláris szintű változások
tanulmányozására is. Ezzel az eljárással a tisztán anyai génállományú diploid sejt in vitro
körülmények között szintén képes eljutni a hólyagcsíra állapotig. Élő állatot azonban nem lehet
így létrehozni, mert a petesejt érésekor lezajló imprinting eredményeképpen bizonyos
kulcsfontosságú gének inaktívak maradnak (Nagy és mtsai. 2003.a).
1.6.3 Krioprezerváció, vitrifikáció
A krioprezerváció (fagyasztva tartósítás, fagyasztás) lényege, hogy élő sejteket,
embriókat, vagy szöveteket a hőmérséklet megfelelő mértékű csökkentésével konzerválnak, és
egy későbbi időpontban - akár több évvel később - felhasználnak, így lehetővé teszi a
mintanyerés és felhasználás időbeli és térbeli elkülönítését (Nagy és mtsai. 2003.b).
Különleges, gyors fagyasztási eljárás a vitrifikáció (mélyhűtés): gyors fagyasztás szilárd
20
felületen (SSV), vagy műszalmában (ISV). A krioprezervációval szemben ezek során nagyobb
koncentrációban alkalmaznak krioprotektáns anyagokat, több lépésben történik az ekvilibráció és
nagy a hűtési sebesség, így a víztartalom amorf formában szilárdul meg, nincs ideje
kristályosodni. Egér embriókon alkalmazták először sikeresen (Rall és Fahy 1985.), azóta
egyszerűsége, olcsó és gyors kivitelezhetősége miatt széleskörűen elterjedt (Dinnyes és mtsai.
2000.; Vajta 2000.).
Nagyon kevés információ található az embrió mélyhűtést kísérő molekuláris biológiai
jelenségekről, a preimplantációs stádiumú embrió genom aktivációját, további fejlődését
befolyásoló hatásairól. A beavatkozást kísérő génexpressziós változások vizsgálata magyarázatot
adhat számos megfigyelt fejlődési különbségre, rendellenességre. A hűtési terhelés indukálta
sejtszintű válasz során elindul a sokat kutatott programozott sejthalál folyamata is, és a
felmelegítés során szintén számos gén aktiválódik (Sonna és mtsai. 2002.).
1.6.4 Klónozás
Mikromanipulációs technikával egy idegen sejt sejtmagját injektálva olyan petesejtbe,
amelyiknek előzőleg eltávolították a saját sejtmagját, majd mesterségesen aktiválva képes élő
állattá fejlődni (13. ábra). A testi sejtes sejtmagátültetés (SCNT) módszerét már 10 éve szinte
minden gazdasági haszonállatfajon „rutinszerűen” alkalmazzák, mindennek ellenére igen
alacsony hatékonyságú és növelése érdekében a technika összes lépésének javítása szükséges
(Wilmut és mtsai. 1997.; Dinnyes és mtsai. 2002.). Sejtmag átültetéses (vagy klónozási)
kísérletekből kiderült, hogy a két-, négy- és nyolcsejtes embriók, vagy a hólyagcsíra ICM és TE
sejtjeinek, sőt a felnőtt egyed testi sejtjének sejtmagja is képes élő állatot létrehozni, ha azt
petesejtbe viszik át (Cheong és mtsai. 1993a,b; Tsunoda és Kato 1998.; Wakayama és mtsai.
1998.). Ezt azt jelenti, hogy a petesejt citoplazmája hordozza azt a képességet, amivel át tudja
21
13. ábra: A testi sejtes sejtmagátültetés (klónozás) lépései.
programozni a sejtmagot.
Az értekezésnek nem lesz tárgya a továbbiakban, mégis itt említem meg a tenyésztési
nehézségek, a meddőség kikerülésére alkalmazott számos mesterséges reproduktív módszert,
összefoglaló nevükön asszisztált reprodukciós technikákat (ARTs), melyek az ivarsejtek
mindennemű manipulációját foglalják magukba. Sok tulajdonságuk közös a klónozással, és
gyakran együtt tárgyalják ezeket (Nagy és mtsai. 2003.c).
A szöveti, differenciálódott sejtek sejtmagjának rendkívüli alakíthatósága ellenére a
klónozás és más ARTs hatékonysága meglehetősen alacsony, eredménye nem jósolható, és
rendellenességek özönét írták le a klónozott embriókban, magzatokban és utódokban. Ezekben a
módszerekben az első testi sejtből klónozott emlős - Dolly nevű birka - előállítása óta sem
következett be nagy áttörés. Az állatok klónozásánál felmerült problémák közül a legfontosabbak
a korai vetélések gyakorisága, a vemhesség és a szülés során fellépő különféle problémák, az
utód születési és fejlődési rendellenességei, illetve a klónozott utódok gyakori korai elpusztulása,
melyek a gyakorlati felhasználás fő akadályai. Ezen problémák pontos oka még nem ismert, de a
rendszer bonyolultságából adódóan számos technikai tényező a felelős, valamint genom
újraprogramozódási hiányosságokra vezethetők vissza (Wilmut és mtsai. 2002). Az igen
alacsony hatékonyságnak az egyik legfőbb oka a nem teljes vagy nem tökéletes epigenetikai
újraprogramozódás, mely felveti az epimutációk jelentőségét, öröklődő jellegét is (Reik és mtsai.
2003.).
1.7 Molekuláris biológiai megközelítési lehetőségek
Az emlősök preimplantációs egyedfejlődése az egyik legnehezebben vizsgálható
folyamat, melynek több gyakorlati oka is van. Az állatvilágban az emlősök petesejtje az egyik
legkisebb méretű. Maradva az egér példájánál, egy frissen kiszabadult petesejt átlagosan 85 µm
átmérőjű, 8 pg DNS, 0,35-0,5 ng RNS - melyből csupán 1-20 pg az mRNS - és 23 ng fehérje
tartalommal, így nem meglepő, hogy nagyon nehéz kísérletekbe vonni, manipulálni. Másrészről
csak kis számban termelődik, általában kevesebb, mint 10 petesejt szabadul ki egy ciklusban.
Harmadsorban a beágyazódás előtti szakasz normálisan az anya szervezetén belül zajlik. Ezért a
petesejtek, embriók molekuláris biológiai vizsgálata nagy kihívást jelent (Nagy és mtsai. 2003.a;
Gilbert 2006.).
1.7.1 Módszertár
Korunk fejlődő molekuláris módszereinek az alkalmazásával újabb ismeretek szerezhetők
az emlősök korai egyedfejlődéséről, valamint segíthetnek az állattenyésztés különböző
22
biotechnológiai módszereinek, a klónozás és az ARTs hatékonyságának, és a terápiás
alkalmazások javításában (Kanka 2003.). Ilyen embrió genomikai és transzkriptomikai
módszerek: a teljes genom szekvenálások, a teljes cDNS könyvtárak és EST-szekvencia (cDNS-
ből származó rendszertelen DNS szakasz) gyűjtemények, az mRNS megkülönböztető
megjelenítés (differential display: DD), a szupresszív szubtraktív hibridizáció (suppression
subtractive hybridization: SSH), a szekvenáláson alapuló részleges génexpresszió vizsgálat
(serial analysis of gene-expression: SAGE), a reverz transzkripcióval (RT) kombinált polimeráz
láncreakció (PCR) (RT-PCR) különböző típusai (hagyományos-végpont, és kvantitatív, real-
time), és napjaink forradalmian új eszköze, a DNS mikrocsip technológia (DNS síkmátrix
technika) (Ko 2004., Diachenko és mtsai. 1996., Velculescu és mtsai. 1995., DeRisi és mtsai.
1996.). Az egyes azonosított expresszált embrionális gének jelentőségét és szerepét az RNS
interferenciával lehet tovább vizsgálni. A kromatin epigenetikai mintázatának vizsgálatára a
kromatin immunprecipitációs technika (chromatin immunoprecipitation: ChIP) szolgál. Ezeket
egészíti ki számos alap fehérjevizsgáló biokémiai módszer, mint a kétdimenziós SDS-
poliakrilamid gélelektroforézis, Western blot, fluoreszcens in situ hibridizáció (fluorescence in
situ hybridization: FISH).
1.7.2 A génexpresszió vizsgálata
A sejtben zajló folyamatok működésbeli változásai általában akkor történnek meg,
amikor a fehérjék aktivációs állapota, vagy mennyisége megváltozik. Ezzel együtt gyakran a
környezeti hatásokra, a differenciálódásra adott első sejtes válaszok a gének transzkripciójában
jelentkeznek, és sok nem kódoló mRNS is létezik, amelyek RNS formájában fejtik ki hatásukat
(Taylor és mtsai. 2003.). Mindezek alapján a sejtek környezeti hatásokra, például az eltérő
ingerekre a normális fejlődési folyamatokban, a különféle embrió technológiákra adott azonnali
reakcióját a gének transzkripciójának vizsgálatával, a génspecifikus mRNS-ek mennyiségének
meghatározásával, a szűkebb értelemben vett génexpresszió nyomon követésével lehet
kimutatni.
Az egy sejtben egy időpontban található átlagos mRNS mennyisége a 100000-es
nagyságrendnek felel meg, mely körülbelül 10000 gén expressziójából ered (részletesebben:
Függelékek: II. Egy sejt RNS tartalma). Ezek közül több ezer gén csak nagyon alacsony szinten
(≤ 10 mRNS/sejt) fejeződik ki, ami nagymértékben megnehezíti és problémássá teszi ezeknek a
globális elemzését (Kuznetsov és mtsai. 2002.). Amikor kis számú molekula határozza meg egy
kémiai egyensúlyban a reakció sorsát, bizonyos fokú véletlenszerű ingadozás várható. Ahogy
növekszik a molekulák (mRNS) száma, úgy nő a reakció jósolhatósága (a szintetizálódó fehérjék
23
száma) (Raser és O'Shea 2005.). Például ha egy transzkripciós aktivátor molekulából kevés
található a sejtekben, nagyfokú mRNS szint különbségek várhatók a sejtek között (Fiering és
mtsai. 2000.). Ezek a hatások hozzájárulnak a kimutatható nagy egyedi génexpressziós
különbségekhez, valamint ez a változékonyság előre vetíti fontos szerepüket az aszimmetria
létrehozásával a biológiai folyamatokban, például az egyedfejlődésben is, melyben a sejtek
differenciálódását határozza meg (Elowitz és mtsai. 2002.; Peixoto és mtsai. 2004.).
A sejtek génjei (DNS-e) viszonylag stabilnak, állandónak tekinthetők, ezzel szemben az
RNS, különösen az mRNS állományuk, összetételük nagymértékben változó, és tükrözi a gének
adott időben, adott helyen, adott környezeti tényezők melletti kifejeződését. Az RNS lényegesen
instabilabb a ribonukleáz (RNáz) fehérjék jelenlétének következtében, melyek az RNS
molekulákat bontják le. Az RNázok nagyon stabil enzimek, nem igényelnek kofaktorokat a
működésükhöz, igen kis mennyiségben is hatékonyak, nehéz őket inaktiválni, és gyakoriak. Az
RNáz szennyeződések megtalálhatók az ember bőrén, a levegőben, a porszemcséken is, ahol
baktériumok, gombák tenyésznek. Ezért az RNS tisztítása és vizsgálata sajátságos technikát,
különleges tisztaságot igényel.
A molekuláris biológia fejlődésének köszönhetően a korai embriófejlődés során
expresszált ismert gének száma fokozatosan növekszik. Mára már több mint 10000 gén
működését leírták a petesejttől a hólyagcsíra állapotig terjedő időszakban, az egér genom közel
egyharmadát (Ko és mtsai. 2000.; Zeng és mtsai. 2004.,2005.). Ezeknek a géneknek az mRNS
mintázata igen hasznos eszköz az embriók minősítésében, kulcsfontosságú gének funkciójának a
feltárásában, valamint az in vitro körülmények optimalizálásában. A normális egyedfejlődés
szabályozásáról ad információt az embrió stádium specifikus génexpressziós mintázatának
meghatározása. A különbségek azonosítása és a különböző rendellenes fenotípusokhoz társítása
hozzájárul a molekuláris folyamatok megismeréséhez. Ezenkívül a génexpresszió minőségi és
mennyiségi változásai, amik eltérést mutatnak a normálishoz képest, a későbbi fejlődési
rendellenességek lehetséges (rejtett) előjelei lehetnek. A génexpressziós mintázatok
összehasonlításával megállapítható, hogy a fejlődés normális vagy rendellenes, ami különösen
fontos a preimplantációs embrió technológiákban (ARTs, SCNT).
Az első alapvető lépések az összetett génszabályozó hálózatok megértése felé a
génexpressziós mintázatok jellemzése a különböző embrionális stádiumokban, valamint a
különböző módon előállított embriókban (in vivo, in vitro, parthenogenetikusan aktivált,
mélyhűtött, klónozott) és az újraprogramozódási folyamatok mechanizmusának,
szabályozásának megismerése (Lechniak 2002.). Azonban több nemrégen közölt génexpressziós
24
tanulmányban nem vettek figyelembe, illetve teljesen mellőztek fontos szempontokat az
eredmények értelmezésekor és tárgyalásakor. Sok génről írtak le rendellenes expressziót
különböző embrió technológiák alkalmazása során, melyek azonban nem álltak összefüggésben a
megfigyelt fenotípussal. Számos esetben pedig még ha a módszereket precízen alkalmazták is, a
kapott különbségek funkcionális jelentőségét ritkán értelmezték (Skern és mtsai. 2005.).
A génexpresszió végeredményben az egyedi sejtek szintjén szabályozódik. Ennek
ellenére ma a legtöbb génexpressziós vizsgálat még mindig több száz, ezer vagy akár millió sejt
felhasználásával történik gyakorlati megfontolásokból. Az így kapott „átlagos sejt” eredménye
elfedi az egyedek közti különbségeket, így nem valószínű, hogy ez kitűnik egy kis
sejtpopulációban, amikor teljes sejtkultúrát vagy szövetet vizsgálnak (Levsky és Singer 2003.;
Bengtsson és mtsai. 2005.).
1.7.3 Reverz transzkripcióval kombinált real-time polimeráz láncreakció
Az RT-PCR új lehetőséget teremtett a preimplantációs egyedfejlődés során zajló
génexpressziós változások tanulmányozásában. A módszer lényege, hogy a kis számú
petesejtből, embrióból kinyert RNS-t (mRNS-t) először cDNS-sé írják át (reverz transzkripció),
melyet a polimeráz láncreakció segítségével szekvencia (gén) specifikusan sokszorosítanak,
hogy valamilyen módszerrel aztán könnyen detektálható, akár számszerűsíthető jelet kapjanak. A
legáltalánosabban elfogadott és bevált technika a kvantitatív, reverz transzkripcióval kombinált
real-time polimeráz láncreakció (qRT-PCR) módszere. Összehasonlítva a hagyományos, vagy
más néven végpont RT-PCR-rel, számos előnye közül a legfontosabbak: érzékenyebb, sokkal
kényelmesebb (egyszerűbben kivitelezhető), szélesebb a kimutatási tartománya, pontosabban
reprodukálható (kisebb a variabilitása) és megbízhatóbb (Gal és mtsai. 2006.).
A real-time PCR az eredeti PCR egyszerű elméletét (Mullis és Faloona 1987.) párosítja a
fluoreszcens detektálás gyakorlatával, melyben a mennyiségi meghatározás újdonsága és alapja a
küszöbérték ciklusszám (Ct). A real-time PCR során a detektálási stratégia többféle is lehet. A
kísérletek során a fluoreszcens SYBR Green I festékre esett a választás, mely a szekvenciától
függetlenül minden kettős szálú DNS-hez kötődik, és ekkor megnő a fluoreszcencia intenzitása.
A mennyiségi mérések alapgondolata, hogy a PCR-be vitt specifikus DNS szekvencia és a
kimutatható termék mennyisége között számszerű összefüggés van. A PCR során minden
ciklusban egyszer, általában a végén mérik a kétszálú DNS termék fluoreszcens jelét. A mért
fluoreszcencia értékeknek az idő (itt a PCR ciklusok száma) függvényében ábrázolt görbéje
alapján számítható ki a Ct értéke, vagyis a PCR azon ciklusszám értéke, amelynél a reakcióban
felhalmozódó termék fluoreszcens jele először meghaladja a háttértől jól elkülöníthetően a
25
kimutatási küszöbértéket. A Ct fordítottan arányos a bevitt, mérni kívánt DNS mennyiségével,
vagy közvetve a kiindulási RNS mennyiségével a szigmoid görbe felfutó, exponenciális
szakaszában, ahol a PCR ideális körülményei feltételezhetők. Minél kisebb ciklusszámnál
mutatható ki a fluoreszcens jel, annál nagyobb a DNS/RNS kópiaszáma (Walker 2002.).
A fluoreszcens alapú PCR kémia az elmúlt 6 évben központi tudományos technológiává
fejlődött, és mára az „arany standard”-ként vált elfogadottá fertőző vírusok és baktériumok
mennyiségi meghatározásában a klinikai mintákból, egyszerű nukleotid polimorfizmus (single
nucleotide polymorphism: SNP) vizsgálatokban, genetikai változatok kimutatásában akár
egyetlen sejtből is, ivari meghatározásra emberi blasztomerekből, betegségek (például tumor)
diagnosztizálására, génterápia követésére, preimplantációs embriók RNS vizsgálatára, mikrochip
eredmények ellenőrzésére, vagy a biotechnológiai alkalmazásokban az élelmiszerek genetikai
módosításának mennyiségi meghatározására és a transzgenikus állatok zigóta jellegének, ploidia
fokának pontos meghatározására, és még több más alkalmazásban (Bustin 2004.).
1.7.4 Egyedi embriók és sejtek génexpressziós vizsgálata
Munkám során a génexpresszió (az mRNS mennyiség) változásának követésére,
összehasonlítására legalkalmasabb módszert, a qRT-PCR módszerét választom, mely
kiválasztásának indoklását a „4. Eredmények” fejezet: „4.1.2 Kvantitatív RT-PCR módszerek
összehasonlítása” részben ismertetem. A különböző felhasználási területen kipróbált módszer
számtalan változata közül kiválasztottam egyet, mely reményeim szerint alkalmazható és kellően
érzékeny az egyedi preimplantációs embrió minták vizsgálatára is. Részletes leírását a „3.
Anyagok, módszerek” fejezet „3.3.6 Real-time polimeráz láncreakció” és „3.3.8 Kvantitatív PCR
adatelemzés” részekben tárgyalom.
Általában a beágyazódás előtti embriók génexpressziós vizsgálatában 5-20 egybegyűjtött
embriót használnak fel a mérésekhez (Zhang és mtsai. 1994.; Gutierrez-Adan és mtsai. 1997.;
Lighten és mtsai. 1997.; Wrenzycki és mtsai. 1998.; Edashige és mtsai. 2000.), és csak kivételes
esetekben egyedi embriókat (Steuerwald és mtsai. 1999., Hartshorn és mtsai. 2003.). Így csak a
csoport átlagos génexpressziós értéke kapható meg statisztikai értékelés nélkül, az egyedi
különbségeket nem lehet vizsgálni. Az embriók közti morfológiai, fejlődési különbségek mögött
bizonyosan génexpressziós különbségek állnak, melyeket eltérő epigenetikai mintázatok
okoznak és így ezeknek egyéb közvetett hatásai is feltételezhetők. Fontos szempont tehát az
eredmények helyes értelmezéséhez, hogy nem heterogén mintákon, hanem egyedi embriókon
végezzenek kísérleteket.
26
1.8 Vizsgált gének
A különböző kísérletekben vizsgált gének teljes nevét, a dolgozatban használt rövidített
nevét, valamint leírását az 1. táblázatban gyűjtöttem össze.
Rövid név Gén neve FunkcióActb actin, beta, cytoplasmic A fehérje minden eukarióta sejtben megtalálható nagy számban. A sejt
alakjának fenntartásában és mozgásképességében játszik szerepet. Általában használják referenciának, mint háztartási gén (Cleveland és mtsai. 1980.; Alonso és mtsai. 1986.; Kreuzer és mtsai. 1999.).
Cenpf centromere protein F A kromoszómák szétválásában játszik szerepet a mitózis során, másik neve mitozin (Zhu és mtsai. 1995.).
Cirbp cold inducible RNA binding protein
Hűtési stresszben van szerepe a sejtmagban (Nishiyama és mtsai. 1997.).
Dazap2 DAZ associated protein 2 RNS kötő fehérje, a DAZ infertilitási faktorhoz kötődik (Yang és mtsai. 1997.).
Eef1e1 eukaryotic translation elongation factor 1 epsilon 1
A fehérje szintézisben van szerepe (Quevillon és Mirande 1996.).
Eif1a eukaryotic translation initiation factor 1A
A fehérje szintézis megkezdésében van szerepe, és a szállításban, mint membránfehérje (Roth és mtsai. 1987.).
Eif4e eukaryotic translation initiation factor 4E
A fehérje szintézis szabályozásában játszik szerepet a citoplazmában (Altmann és mtsai. 1989.).
G6pdx glucose-6-phosphate dehydrogenase X-linked
A sejt anyagcseréjében szerepet játszó enzim (Ruddle és Roderick 1968.).
Gapdh glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
Klasszikus háztartási gén, a glikolízis energiatermelő fázisában részt vevő enzim (Crew és Mirskaia 1931.).
H2afz H2A histone family, member Z
A kromoszómák szerveződésében és a nukleoszóma felépítésében játszik szerepet (Misawa és mtsai. 2000.).
Hist2h2aa2 histone cluster 2, H2aa2 A nukleoszóma felépítésében, a kromoszómák kondenzálódásában és feltekeredésében, a génexpresszió szabályozásában szerepet játszó hiszton fehérje. Háztartási gén, közismert neve H2A (Sittman és mtsai. 1983.).
Hprt1 hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase 1
A purinok bioszintézisét és lebontását, valamint a hipoxantin és dopamin lebontását végzi (Coleman 1962.).
Hspa1a heat shock protein 1A A hőhatásra adott stressz válaszban, a DNS hibák javításában, és a telomerek hosszának fenntartásában játszik szerepet, közismertebb neve Hsp70 (Lowe és Moran 1986.).
Nanog Nanog homeobox Egy újonnan felfedezett transzkripciós faktor. Expresszióját korai stádiumú embriókban, embrionális őssejtekben, és többféle szövetben mutatták ki. A hólyagcsírában csak az ICM-ben van jelen, azok pluripotenciáját tartja fenn, valamint gátolja az extraembrionális endodermává differenciálódását (Kawai és mtsai. 2001.).
Pgk1 phosphoglycerate kinase 1 A glikolízisben részt vevő transzferáz enzim (Kozak és mtsai. 1974.).Polr2a polymerase (RNA) II (DNA
directed) polypeptide AAz RNS polimeráz II legnagyobb alegysége, mRNS szintetizáló enzim (Pravtcheva és mtsai. 1986.).
Pou5f1 POU domain, class 5, transcription factor 1
Transzkripciós faktor, közismert neve Oct-4. Expresszióját korai stádiumú embriókban, embrionális őssejtekben, az érett petesejtben, és a csírasejtvonalban mutatták ki. A hólyagcsíra állapotú embrióban csak az ICM-ben van jelen, azok pluripotenciáját tartja fenn (Schöler és mtsai. 1989.; Palmieri és mtsai. 1994.).
Ppia peptidylprolyl isomerase A Peptidil-prolil cisz-transz izomeráz aktivitása révén a fehérjék feltekeredésében játszik szerepet, másik neve ciklofillin A (Handschumacher és mtsai. 1984.).
Rbm3 RNA binding motif protein 3
Szerepet játszik a hűtési stresszben, a transzlációban riboszóma-kötési képessége által, valamint a mikroRNS-ek közvetítette géncsöndesítésben (Derry és mtsai. 1995.).
27
Rövid név Gén neve FunkcióSfrs3 splicing factor,
arginine/serine-rich 3Az mRNS érésben játszik fontos szerepet, másik neve SRp20 (Ayane és mtsai. 1991.).
Slc2a3 solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 3
Egy plazmamembrán transzportfehérje, közismert neve Glut-3. Felnőtt egérben főként az agy neuronsejtjeiben található meg, és ez az egyik első embrionálisan kifejeződő glükóz-transzporter fehérje a korai hólyagcsíra állapotú embrió trofektoderma sejtjeiben (Kayano és mtsai. 1988.; Pantaleon és mtsai. 1997.).
Sod1 superoxide dismutase 1, soluble
Az oxidatív és hő stresszben, öregedésben játszik fontos szerepet. A reaktív oxigén gyökök eltávolítására képes a citoplazmában, részt vesz a DNS kettős szálú töréseinek javításában, másik neve CuSOD (Selander és mtsai. 1969.).
Sod2 superoxide dismutase 2, mitochondrial
Az előbbihez hasonló, de a mitokondriumban található enzim, másik neve MnSOD (Creagan és mtsai. 1973.).
Trp53 transformation related protein 53
Egy transzkripciós faktor, a sejtciklust blokkolja, kulcsszerepe van a DNS károsodást követő jelátvitelben, a programozott sejthalálban, közismertebb neve p53 fehérje (Oren és mtsai. 1983.).
Ubc ubiquitin C Fehérjék transzláció utáni módosítását végző kisméretű szabályozó fehérje (Board és mtsai. 1992.).
Ywhaz tyrosine 3-monooxygenase/ tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide
A jelátvitelben szereplő fehérje, foszforilált szerin oldalláncot képes megkötni (Suen és mtsai. 1995.).
Hiszton-deacetilázok: közös tulajdonságuk, hogy a kromatin szerkezet módosításával, a hisztonok deacetilációjával a transzkripció szabályozását végzik.Hdac1Hdac2Hdac3Hdac4Hdac5Hdac6Hdac7Hdac8Hdac9Hdac10Hdac11
histone deacetylase 1 (Yang és mtsai. 1996.)histone deacetylase 2 (Yang és mtsai. 1996.)histone deacetylase 3 (Mahlknecht és mtsai. 1999.)histone deacetylase 4 (Jeong és mtsai. 2004.)histone deacetylase 5 (Verdel és Khochbin 1999.)histone deacetylase 6 (Verdel és Khochbin 1999.)histone deacetylase 7 (Kao és mtsai. 2000.)histone deacetylase 8 (Kawai és mtsai. 2001.)histone deacetylase 9 (Zhang és mtsai. 2001.)histone deacetylase 10 (Kao és mtsai. 2002.)histone deacetylase 11 (Strausberg és mtsai. 2002.)
Hiszton acetil-transzferázok: hiszton acetil-transzferáz aktivitásuk révén a transzkripció szabályozását végzik.CrebbpEp300Gcn5l2Hat1HtatipPcafTaf1
CREB binding protein (Chrivia és mtsai. 1993.)E1A binding protein p300 (Missero és mtsai. 1993.)GCN5 general control of amino acid synthesis-like 2 (yeast) (Xu és mtsai. 1998.)histone aminotransferase 1 (Bulfield 1978.)HIV-1 tat interactive protein, homolog (human) (Ran és Pereira-Smith 2000.)p300/CBP-associated factor (Xu és mtsai. 1998.)TAF1 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor (Derry és Barnard 1989.)
1. táblázat: Az értekezésben szereplő vizsgált gének.
28
2. Célkitűzések
A Genetikai Újraprogramozás Csoport 2002-ben jött létre a Wellcome Trust és az EUFP6
támogatásával a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpontban. Elsődleges célja
Magyarországon meghonosítani, továbbfejleszteni és optimalizálni a különböző embrió
technológiákat emlősállatokon, mint az in vitro embrió előállítást, parthenogenetikus aktiválást,
mélyhűtést, embrionális őssejt tenyésztést és a testi sejtes sejtmagátültetést (klónozást). Ezek a
módszerek alapvető fontosságúak a hazai biotechnológiai kutatások szempontjából, mivel
lehetőséget nyújtanak új, genetikailag módosított, emberi betegségeket modellező állatok
létrehozására. Jelenleg egéren és nyúlon folynak kísérletek, valamint nemzetközi együttműködés
keretében patkányon, sertésen és szarvasmarhán is. A kutatások előrehaladását jelentősen
segítené, ha az egyedfejlődésben, a pluripotencia kialakításában szerepet játszó gének működése
vizsgálható lenne. Az értekezésben leírt kísérletek ezeket a célokat támogatták molekuláris
biológiai megközelítésben.
Céljaim között szerepeltek a következő vizsgálatok.
(1) Egy olyan új érzékeny módszer kifejlesztése, mellyel a sejtek, embriók génexpressziós
aktivitását egyedi szinten vizsgálni tudom, és nem csak csoportátlagokat, hanem a csoporton
belül az egyedek közti eltéréseket, a csoport homogenitását is értékelni lehet. Kétféle reverz
transzkripcióval kombinált polimeráz láncreakció (RT-PCR) módszer összehasonlítására
vállalkoztam (végpont RT-PCR és real-time RT-PCR), majd egy teljes protokoll
kifejlesztésére és jellemzésére. Az ellenőrzésére négy-nyolcsejtes egér embriók egyedi
blasztomer sejtjeiben vizsgáltam a génexpressziót.
(2) Az embrionális genom aktiváció (EGA) előtti és utáni egér embrióknak a mélyhűtésre, és az
azt követő felmelegítésre, mint stresszre (terhelésre) adott válaszának összehasonlítása két
különböző embrió mélyhűtési módszer alkalmazása során (gyors fagyasztás szilárd felületen
és műszalmában). A referencia génnek használt Actb expressziójában tapasztalt változás
miatt újabb referencia gének kiválasztása vált szükségessé.
(3) Az in vitro tenyésztési körülmények és a parthenogenetikus aktiválás hatásának vizsgálata az
egyedfejlődésre egér embriókban több háztartási gén expressziójának meghatározásával és
ezek alapján megfelelő referencia gének kiválasztása.
(4) Alkalmas referencia gének kiválasztása in vivo és in vitro előállított nyúl embriókban,
valamint két, a nyúlban eddig le nem írt pluripotencia fenntartásáért felelős gén (Pou5f1
(Oct-4), Nanog) azonosítása és jellemzése.
(5) Az egér és szarvasmarha preimplantációs egyedfejlődésének vizsgálata a kisebb genom
29
aktiváció és az EGA vonatkozásában.
(6) Különböző hiszton acetil-transzferáz (HAT) és hiszton-deacetiláz (HDAC) enzimeket kódoló
gének expressziós mintázatának meghatározása és mennyiségi jellemzése egér embriókban.
Óriási előrelépést jelentene, ha a széles spektrumból ki lehetne választani azokat, amelyek
aktívan szerepet játszanak a preimplantációs egyedfejlődés során lezajló újraprogramozódás
molekuláris folyamataiban, valamint az EGA alatt.
30
3. Anyagok, módszerek
Külön alfejezetekre bontva tárgyalom 1) a felhasznált anyagokat és vegyszereket, 2) az
állatok, élő sejtek, embriók, valamint szöveti minták kezelését, és 3) az alkalmazott molekuláris
biológiai módszereket.
3.1 Anyagok, vegyszerek
Az értekezésben szereplő összes kémiai anyag, vegyszer a Sigma-Aldrich Kft-től (Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO, USA) származik, kivéve ahol az eltérő eredetet zárójelben jelölöm.
3.1.1 Tápoldatok petesejt és embrió kinyeréséhez, tartásához és kezeléséhez
CZB tápoldat : 81,62 mM NaCl, 4,83 mM KCl, 1,18 mM KH2PO4, 1,18 mM MgSO4, 1,7
mM CaCl2, 25,12 mM NaHCO3, 31,3 mM nátrium-laktát, 0,27 mM nátrium-piruvát, 1 mM L-
glutamin, 0,11 mM EDTA, 3 mg/ml szarvasmarha szérum albumin (BSA), 10 µg/ml gentamicin,
10 µg/ml fenolvörös (Chatot és mtsai. 1989.).
M2 tápoldat: 94,62 mM NaCl, 4,78 mM KCl, 1,19 mM KH2PO4, 1,19 mM MgSO4, 4,15
mM NaHCO3, 1,71 mM CaCl2, 5,56 mM D-glükóz, 23,28 mM nátrium-laktát, 0,33 mM nátrium-
piruvát, 4 mg/ml BSA, 100 egység/ml nátrium-penicillin G, 50 µg/ml streptomicin, 10 µg/ml
fenolvörös, 20,85 mM HEPES.
módosított TCM 199 : TCM 199 (Biochrom, Berlin, Germany) kiegészítve: L-glutamin,
25 mM HEPES, 22 µg/ml piruvát, 2,2 µg/ml NaHCO3, 50 µg/ml gentamicin, 10 egység/ml
vemhes kanca placentájában termelődő hormon (eCG), 5 egység/ml emberi korion gonadotróp
hormon (hCG), 10 % ösztruszban lévő szarvasmarha szérum (ECS).
EBSS (Earl-féle kiegyensúlyozott sóoldat) : 200 µg/ml CaCl2, 6,8 mg/ml NaCl, 400 µg/ml
KCl, 140 µg/ml NaH2PO4, 200 µg/ml MgSO4, 2,2 mg/ml NaHCO3, 1 mg/ml D-glükóz, 10 µg/ml
fenolvörös (Earle és mtsai. 1943.).
3.1.2 Molekuláris biológiai módszerekhez használt anyagok, oldatok
G élfuttató puffer : 25 % Ficoll 400, 0,25 % xiléncianol, 25 mM EDTA.
Agaróz/ TAE gél (2 %) : 8 g agaróz por oldva 400 ml TAE pufferben.
TAE puffer: 50x TAE puffer (242 g Tris, 57,1 ml jégecetsav, 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8),
1 l-re kiegészítve desztillált vízzel) desztillált vízzel hígítva 50-szeresre.
31
A többi felhasznált anyag, oldat leírása megtalálható „Sambrook: Molecular cloning
Appendix 1” fejezetében (Sambrook és Russel. 2001.a).
3.2 Állatok, élő sejtek, embriók kezelése
3.2.1 Állatvédelmi szabályok
A kísérletekbe vont állatok (egér és nyúl) tartása, a rajtuk alkalmazott kísérleti eljárások,
valamint az állatokból kinyert petesejtek, embriók kezelése a Munkahelyi Állatvédelmi Bizottság
„Állatkísérlet végzésre szóló engedély”-ével történtek (Mezőgazdasági Biotechnológiai
Kutatóközpont, Gödöllő; engedély szám: 126/3/2003.).
3.2.2 Petesejt kinyerése
A nagyobb mennyiségű petesejt minta kinyerésére a többszörös ovulációt
(szuperovulációt) kiváltó gyakorlati módszert alkalmaztuk.
Svájci albínó ICR (CD1) kültenyésztett egértörzsből 8 hetes nőstényeket kezeltünk
intraperitoneálisan 5 egység vemhes kanca szérum gonadotróp hormonjával (PMSG, Folligon®
Intervet, The Netherlands), majd 48 órát követően 5 egység hCG-vel (Choragon® Richter
Gedeon Rt., Hungary). A hCG kezelés után 16 órával a nyak eltörésével (cervikális diszlokáció)
megölt állatokból kivettük a petevezetéket. A kumulusz sejtektől körülvett érett petesejteket
(COC) kimostuk a petevezeték ampulla részéből. A kumulusz sejteket CZB-HEPES tápoldatban
(Millipore, Billerica, MA, USA) oldott 1 mg/ml hialuronidázzal távolítottuk el.
Nőstény Hycole hibrid nyulakat 120 egység PMSG intramuszkuláris, majd 72 órával
később 170 egység hCG intraperitoneális beadással kezeltük. A hCG kezelés után 16 órával a
petesejteket kimostuk a megölt állatok petevezetékének ampulla részéből. A kumulusz sejteket
M2 tápoldatban oldott 0,1 %-os hialuronidázzal távolítottuk el és a meiózis második szakaszában
lévő érett petesejteket kiválogattuk.
A vágóhídi szarvasmarha petefészkekből kivágott 20-25 COC-et szilikonolajjal fedett
módosított TCM 199 tápoldat cseppekben tartottuk párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 39 °C-
on. 24 óra múlva a morfológiailag érett petesejteket elkülönítettük a kumulusz sejtektől (Eckert
és Niemann 1995.).
A petesejteket átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam
további felhasználásig -80 °C-on.
32
3.2.3 Embriók kinyerése
A petesejthez hasonlóan a nagyobb mennyiségű embrió minta kinyerésére a
szuperovulációs módszert alkalmaztuk a fent leírtak szerint.
A PMSG-val és hCG-val kezelt ICR nőstény egereket pároztattuk hím egyedekkel. A
hCG kezelés után 20 órával a kumulusz sejtektől körülvett zigótákat kimostuk a megölt állatok
petevezetékéből. A kumulusz sejteket CZB-HEPES tápoldatban oldott 1 mg/ml hialuronidázzal
távolítottuk el. A későbbi stádiumú embriókat a hCG oltást követő 38 (korai kétsejtes), 46 (késői
kétsejtes), 58 (négysejtes), 65 (nyolcsejtes), 78 (szedercsíra), 93 (hólyagcsíra és késői
hólyagcsíra) órában megölt állatok petevezetékéből, illetve méhéből mostuk ki.
A PMSG-val és hCG-val kezelt nőstény Hycole hibrid nyulakat pároztattuk hím
egyedekkel. A hCG kezelés után 20 órával a zigótákat kimostuk a megölt állatok petevezetékéből
M2 tápoldattal. Morfológiájuk alapján minősítve mikroszkóp alatt válogattuk ki a két
elősejtmaggal, két sarki testtel, tömör sejtplazmával rendelkezőket. A későbbi stádiumú
embriókat a hCG oltást követő 26 (kétsejtes), 41 (korai nyolcsejtes), 47 (késői nyolcsejtes), 62
(szedercsíra), 98 (hólyagcsíra) órával megölt állatok petevezetékéből, illetve méhéből mostuk ki.
Az embriókat átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam
további felhasználásig -80 °C-on.
3.2.4 Embriók tenyésztése
A fent leírt módon kinyert egér zigótákat 20 µl 5 mg/ml BSA tartalmú CZB-HEPES
oldatcseppekben, ásványolaj alatt tartottuk párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 37 °C-on. A
későbbi stádiumú embriókat a hCG oltást követő 38 (korai kétsejtes), 46 (késői kétsejtes), 65
(nyolcsejtes), 93 (hólyagcsíra és késői hólyagcsíra) óráig tenyésztettük.
A fent leírt módon kinyert nyúl zigótákat 50 µl EBSS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)
cseppekben, ásványolaj alatt tartottuk párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 38,5 °C-on
(Mitalipov és mtsai. 1999.). Az embriókat a hCG oltást követő 26 (kétsejtes), 44 (korai
nyolcsejtes), 54 (késői nyolcsejtes), 68 (szedercsíra), 103 (hólyagcsíra) óráig tenyésztettük.
Az embriókat átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam
további felhasználásig -80 °C-on.
3.2.5 Embriók mélyhűtése, felmelegítése
Gyors fagyasztás szilárd felületen (SSV) (Dinnyes 2000.): Az egér embriókat
alapoldatban (4 mg/ml BSA-tartalmú CZB-tápoldat) való mosásuk után ekvilibráló oldatban (4
33
% etilénglikol az alapoldatban) tartottuk szobahőmérsékleten 5-10 percig. Háromszor öblítettük
vitrifikációs oldat cseppekben (35 % etilénglikol, 5 % poli(vinil-pirrolidon), 400 mM trehalóz az
alapoldatban) fél-fél percig, majd egy félig folyékony nitrogénbe merülő (körülbelül -180 °C-ra
lehűtött) acélkocka száraz felszínére csöppentettük. Az 1-2 µl-es cseppekben vitrifikált
embriókat kriocsövekben tároltuk további felhasználásig -196 °C-on folyékony nitrogénben.
Felmelegítéskor a mélyhűtött mintákat 37 °C-os 300 mM trehalóz oldatba tettük 1 percre, majd
rehidratáltuk szobahőmérsékleten: 150 mM trehalóz oldatba tettük 2 percre, majd 75 mM
trehalóz oldatba 2 percre, aztán alapoldatba további 2 percre, végül CZB-tápoldatban tartottuk a
további vizsgálatokig.
Gyors fagyasztás műszalmában (ISV) (Kasai és mtsai. 1990.) módosított oldatokkal: A
vitrifikációs oldat 40 % etilénglikolt, 5 % poli(vinil-pirrolidon)t, 400 mM trehalózt tartalmaz a
fent leírt alapoldatban, mely így nem képez látható jégkristályokat sem a folyékony nitrogén
hőmérsékletére való lehűtéskor, sem a felolvasztáskor. Az egér embriókat 4 % etilénglikol
tartalmú alapoldatban tartottuk szobahőmérsékleten 5-10 percig, majd ekvilibráló oldatban 1
percig. A mintákat 250 µl-es műszalmába töltöttük, és lezárás után folyékony nitrogén gőzébe
helyeztük 3 percig, végül folyékony nitrogénbe merítve tároltuk további felhasználásig -196 °C-
on. Felmelegítéskor a mélyhűtött mintákat 10 másodperc levegőn tartás után 37 °C-os vízfürdőbe
tettük 15-20 másodpercre, majd 37 °C-os 300 mM trehalóz oldatba további 1 percre, végül
rehidratáltuk a fent leírt módon.
3.2.6 Embriók szétválasztása blasztomer sejtekre
A kinyert négy- és nyolcsejtes egér embriókról savas Tyrode-oldattal (Nagy és mtsai.
2003.d) távolítottuk el a petesejt burkát (zóna pellucida) (Nicolson és mtsai. 1975.). A blasztomer
sejteket tompa végű kapillárissal való finom pipettázással, mechanikusan választottuk el
egymástól. Az ép, szétválasztott sejteket átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként
fagyasztva tároltam további felhasználásig -80 °C-on.
3.2.7 Parthenogenetikus aktiválás
A kinyert érett egér petesejteket kezeltük 10 mM SrCl2-dal Ca2+-mentes, 5 µg/ml
citokalazin B-vel kiegészített CZB-tápoldatban 5 órát. A sikeresen aktivált petesejteket,
melyekben kialakult az egy, vagy mindkét elősejtmag, tenyésztettük tovább CZB-
oldatcseppekben, ásványolaj alatt, párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 37 °C-on a korai
kétsejtes, késői kétsejtes, nyolcsejtes, hólyagcsíra stádiumig. Az embriókat átmosva, RNáz
mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam további felhasználásig -80 °C-on.
34
3.3 Alkalmazott molekuláris vizsgálómódszerek
3.3.1 Totál RNS izolálás emlős szövetből
A különböző állati szövetekből (pl. máj) az RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)
segítségével izoláltam nagy mennyiségű RNS-t a további RT-PCR alkalmazásokhoz a használati
utasításnak megfelelően. Röviden összefoglalva: 20 mg frissen fagyasztott szövetdarab
homogenizálása és lízise után a 200 bp-nál hosszabb RNS-eket szilikagél membránhoz kötöttem,
majd többszöri tisztító mosás után leoldottam RNáz mentes desztillált vízzel. A kinyert RNS
minta koncentrációját 260 nm-en mért abszorpciója alapján határoztam meg, tisztaságát 260/280
nm-en mért abszorpciós hányadossal (> 1,95) ellenőriztem. További felhasználásig fagyasztva
tároltam -80 °C-on.
3.3.2 mRNS izolálás
A különböző stádiumú embriókból, petesejtből a Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit
(Invitrogen Dynal, CA, USA) segítségével izoláltam mRNS-t a további RT-PCR
alkalmazásokhoz a használati utasításnak megfelelően. A módszer lényege, hogy mágneses
polisztirol gyöngyökhöz kapcsolt 25 nukleotid hosszú dT szekvcenciák (oligo (dT)25)
segítségével a feltárt sejtekben lévő, 3' végen poliA farokkal bíró mRNS-eket a bázispárosodás
révén igen tisztán elválasztja a sejt többi alkotójától. Röviden összefoglalva: A sejtek, embriók
lízise után hozzáadtam az oligo (dT)25 szuszpenzióját, majd a rövid inkubáció leteltével speciális
mágnesre helyezve a mintákat a felülúszó többszöri lecserélésével átmostam a kötött mRNS
mintát, végül rövid hőkezeléssel RNáz mentes desztillált vízben leoldottam a mágneses
gyöngyökről. Az mRNS-t azonnal átírtam cDNS-sé, tisztaságát (genomi DNS szennyezés
jelenlétét) az úgynevezett -RT reakcióval ellenőriztem.
3.3.3 Reverz transzkripció
Az általam használt reverz transzkripció (RT) reakcióját Sambrook: Molecular cloning 8.
fejezetében leírt általános ismertetéséből, és az ajánlott módszeréből kiindulva alkalmaztam
(Sambrook és Russel 2001.b). Az MMLV RT kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)
felhasználásával összemért reakcióelegy a következőket tartalmazta: enzim puffer, 5 mM MgCl2,
1 mM dNTP, 2,5 µM random hexamer primer, 20 egység RNáz inhibitor, 50 egység MMLV
reverz transzkriptáz enzim, RNáz mentes desztillált vízzel kiegészítve. A frissen izolált mRNS
mintát, vagy fagyasztva tárolt szöveti RNS mintát (maximum 1 µg/reakció) 5 perces 70 °C-on
történő hőkezelés után a reakcióelegyhez adtam 20 µl végtérfogatban. A reakció inkubációs
35
körülményei: 10 perc 25 °C-on (primer feltapadás), 60 perc 42 °C-on (cDNS szintézis), 5 perc
99 °C-on (inaktiválás). Az átírt cDNS-t -20 °C-on tároltam a későbbi felhasználásig. A genomi
DNS szennyezés jelenlétét -RT reakcióval ellenőriztem, amelyben a reverz transzkriptáz enzim
kihagyásával az inkubáció során a minta RNS tartalma elbomlik, míg az esetleges, épen maradt
DNS tartalom az ellenőrző PCR vizsgálattal kimutatható.
3.3.4 Polimeráz láncreakció
Az általam használt polimeráz láncreakciót (PCR) Sambrook: Molecular cloning 8.
fejezetében leírt általános ismertetéséből, és az ajánlott módszeréből kiindulva alkalmaztam
(Sambrook és Russel 2001.b). Az összemért reakcióelegy a következőket tartalmazta: enzim
puffer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,5-0,5 µM specifikus primer, 1 egység Taq DNS
polimeráz enzim (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), cDNS minta, desztillált vízzel kiegészítve 50
µl végtérfogatra. A reakció inkubációs programját MJ PT-200 PCR készüléken (MJ Research,
Waltham, MA, USA) futtattam: 2 perc 97 °C-on (cDNS denaturálás), 2 perc 72 °C-on (enzim
hozzáadás), majd 25-43 ciklusban: 15 másodperc 95 °C-on (denaturálás), 15 másodperc 57 °C-
on (primer feltapadás), 15 másodperc 72 °C-on (cDNS szintézis). A ciklusok után 5 perc 72 °C-
os cDNS szintézis, végül 5 perc 8 °C-on történő leállítás következett. A reakció termékét agaróz
gélen futtattam meg.
3.3.5 Agaróz gél-elektroforézis
Az agaróz gél-elektroforézist Sambrook: Molecular cloning 5. fejezetében leírt általános
ismertetéséből, és az ajánlott módszeréből kiindulva alkalmaztam (Sambrook és Russel 2001.c).
A PCR leállítását követően a mintákhoz gélfuttató puffert adtam. Az előre elkészített, 0,5 µg/ml
etídium-bromidot tartalmazó, 2 %-os agaróz/TAE gélre 25 µl mintát vittem fel és futtattam meg
4,5 V/cm elektromos térerőn 1 órán át. A gélt High Performance Ultraviolet Transilluminator
(Ultraviolet Products, Cambridge, UK) ultraibolya fényében Quantix digitális kamerával
(Photometrics, Tucson, AZ, USA) fényképeztem le és az IPLab-Gel denzitometriás képelemző
program (Scanalytics, Fairfax, VA, USA) segítségével értékeltem.
3.3.6 Real-time polimeráz láncreakció
A különböző kísérletekben eltérő készülékeket, reagenseket, inkubációs programokat
használtam, az azonos kísérlethez tartozókat zárójelbe tett római számmal (I-II-III-IV) jelölöm
(Bustin és Nolan 2004.). Az összemért reakcióelegy a következőket tartalmazta:
- QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Germantown, MD, USA) (I), QuantiTect iQ
36
SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) (II), SYBR Green PCR
Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) (III), SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix
(IV);
- 0,3 (II, III, IV)-0,5 (I) µM specifikus primer;
- cDNS minta;
- desztillált vízzel kiegészítve 10 (I)-25 (II, III, IV) µl végtérfogatra.
A reakció inkubációs programját LightCycler (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)
(I), iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)
(II), ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) (III),
Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Mortlake, Australia) (IV) real-time PCR készüléken
futtattam:
- 2 (II, IV)-10 (III)-15 (I) perc 95 °C-on (cDNS denaturálás, enzim aktiválás);
- majd 45 (III, IV)-50 (I, II)-55 (I) ciklusban (a denaturálás-primer feltapadás-cDNS szintézis):
15 másodperc 94 °C-on - 20 másodperc 57 °C-on - 20 másodperc 72 °C-on (I), 20 másodperc 95
°C-on - 20 másodperc 60 °C-on - 20 másodperc 72 °C-on (II), 15 másodperc 95 °C-on - 60
másodperc 60 °C-on (III), 15 másodperc 95 °C-on - 20 másodperc 60 °C-on - 30 másodperc 72
°C-on (IV). Minden ciklus végén mértem a kétszálú DNS termék fluoreszcens jelét.
A küszöbérték ciklusszámokat (Ct), ahol a készülék először mért fluoreszcens jelet a
háttérzaj fölött, a Rotor-Gene Real-Time Analysis Software (version 6.0.27) (Corbett Research,
Mortlake, Australia) programmal határoztam meg, melyet a kétszer derivált görbék
maximumának 20 %-ánál állapít meg (14. ábra).
A szekvencia specifikus termék tisztaságát a reakció lezajlása után olvadáspont méréssel
ellenőriztem: 30 másodperc 95 °C-on, majd visszahűtés 30 másodperc 65 °C, végül 0,1
°C/másodperc sebességgel felmelegítve 98 °C-ra folyamatosan mérve a fluoreszcens jelet. A
fluoreszcencia intenzitás hirtelen csökkenése a DNS két szálának hő hatására történő szétválását,
“felolvadását” jelzi. A felvett DNS olvadási görbe alapján ábrázolható a mért fluoreszcencia
negatív első deriváltja a hőmérséklet függvényében (15. ábra). A kapott görbe csúcsa megadja a
PCR termék olvadáspontját, a görbe alatti terület pedig arányos a termék mennyiségével (Ririe
1997.).
37
38
14. ábra: A küszöbérték ciklusszám (Ct) meghatározása egy hígítási sor 5 mintájában.
Felül: Jellegzetes real-time PCR grafikon. A vízszintes tengelyen a ciklusszám (idő), a függőlegesen a fluoreszcencia intenzitása van feltüntetve; a görbék színárnyalata a kiindulási minta koncentrációját, a zöld görbe a negatív kontrollt jelzi. Alul: A görbék maximumának 20 %-ánál meghúzott kék vízszintes vonal és a görbék metszéspontjánál leolvashatók a Ct értékek (függőleges kék vonal).
15. ábra: PCR termékek olvadáspontjának meghatározása emlős mintákból.
Felül: Jellegzetes olvadási görbe a real-time PCR specifikusságának ellenőrzésére. Alul: A leolvasható PCR termékek olvadáspontja: 24 egér minta: 89,5°C; 7 szarvasmarha minta: 86°C; a negatív kontrollban mért primer dimer: 73,5°C. (Forrás: Gal és mtsai. 2006.)
3.3.7 Primer tervezés
A kísérleteimben vizsgált gének szekvencia adatait (teljes szekvencia, exon-intron
határok) az Ensembl (Ensembl Project database, http://www.ensembl.org) (Hubbard és mtsai.
2007.) és az NCBI (National Center for Biotechnology Information;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov) adatbázisaiból gyűjtöttem ki. A gének szekvencia adatai
részletesebben megtalálhatók: Függelékek: III. A vizsgált gének szekvencia adatai. A
génspecifikus primerek tervezését a Primer Express Software (Applied Biosystems, Foster City,
CA, USA) és az Oligo 6 primer elemző program (Molecular Biology Insights, Cascade, CO,
USA) segítségével végeztem.
A tervezés során számos feltételnek próbáltam eleget tenni:
- az esetleges genomi DNS szennyezés PCR-t zavaró hatásának elkerülésére az 5' és 3'
primereket eltérő exonokra helyeztem;
- a primer párok legyenek hasonló hosszúak (15-30 nukleotid), és hasonló G és C nukleotid
tartalmúak;
- a primerek lehetőleg hasonló magas feltapadási hőmérsékletűek legyenek (± 2 °C), mely a nem
specifikus feltapadás és a reakció gátlásának lehetőségét csökkenti;
- a termék mérete kicsi, 80-200 bp közötti, a primerektől eltérő olvadáspontú legyen;
- a cél mRNS molekula térbeli szerkezetét az RNAstructure (Version 4.5) program segítségével
modelleztem (Mathews és mtsai. 2004.). Ezzel ellenőriztem, hogy a primerek megfelelő
szakaszra tapadnak fel, ahol az RNS nyitottabb hurokszerű szerkezetet vesz fel és nem
bázispárosodik önmagával;
- a nem specifikus bázispárosodás elkerülésére nem ismétlődő szakaszokat kerestem;
- az RNS tisztítás, kezelés során előforduló töredezés zavaró hatása miatt főként a gének 3' végét
részesítettem előnyben, mely nagyobb valószínűséggel marad épen;
- lehetőleg hasonló sokszorosítási hatékonyságúak legyenek a primer párok;
- primer dimer képződés ne legyen (számottevő), a primerek 3' vége ne legyen gazdag G és C
nukleotidokban, vagyis a primerek összetapadásának energiája lényegesen kisebb legyen a
primer 3' vége és a termék bázispárosodási energiájánál;
- a kiválasztás segítésére az Amplify 3 (Version 3.1.4) programmal modelleztem a reakciót
(Engels 1993.);
39
- a nem génspecifikus bázispárosodás ellenőrzésére az összes primer párt összevetettem az NCBI
nukleotid gyűjtemény, illetve egér genomi és transzkripciós adatbázisával (Nucleotide collection;
Mouse genomic + transcript) a BLASTN 2.2.18 program segítségével (Basic BLAST: nucleotide
blast: blastn (blastn)) (Altschul és mtsai. 1997.).
Végül azokat a primer párokat választottam ki, melyek a legtöbb feltételnek eleget tettek,
és a kísérleteket csak ezekkel végeztem el.
3.3.8 Kvantitatív PCR adatelemzés
A real-time PCR készüléken mért nagy mennyiségű számadatokat a megfelelő
LightCycler Quantification Software 3.5 (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) (I), Bio-Rad
iCycler iQ Multicolor Real-Time PCR Optical System Software Version 3.1. (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA, USA) (II), ABI PRISM 7000 SDS Software (Applied Biosystems,
Foster City, CA) (III), és a Rotor-Gene Real-Time Analysis Software (version 6.0.27) (Corbett
Research, Mortlake, Australia) (IV) programokkal dolgoztam fel elsődlegesen, hogy
kiértékelhető, összehasonlítható adatokhoz jussak. Az eljárásnak jelentős hatása van a végső
eredményre, ezért ennek a menetét részletesen tárgyalom.
Kísérleteimben általában a standard görbe módszerrel számítottam ki a relatív mRNS
mennyiségeket a mért Ct értékekből (Rasmussen 2001.).
Ennek lényege, hogy először megmértem ismert
mennyiségű kiindulási standard mintából - májból, vagy 5-
10 egybegyűjtött embrióból előállított cDNS törzsoldatból -
készített hígítási sor Ct értékeit minden egyes génre,
melyből megállapítható a két mennyiség közti összefüggés.
Minden hígítási sort háromszor ismételtem meg. A kapott
adatsorra féllogaritmikus ábrázolásban lineáris trendvonalat
illesztve számítható a regressziós egyenes (standard görbe)
egyenlete: a meredekség és az y-tengellyel való
metszéspont, valamint a korreláció négyzete, vagyis a
determinációs együttható (R2), mely az illeszkedés jóságát
jellemzi, és esetlegesen megállapítható a kimutathatósági
határ is (16. ábra).
A reakció exponenciális szakaszában elméletileg a
PCR hatékonysága 100 %-os, vagyis minden ciklusban
40
16. ábra: Standard görbe módszer.
Három független hígítási sor 5-5 mintájában mért Ct értékei különböző színnel vannak ábrázolva, valamint kékkel a rájuk illesztett trendvonal egyenlete, determinációs együtthatója (R2), és az ebből számítható PCR hatékonysága (E). Az alsó kimutathatósági határ ebben az esetben a körülbelül 0,001 embrióból kapott cDNS mennyiség.
megkétszereződik a kiindulási célszekvencia mennyisége. A gyakorlatban ez általában nem
teljesül és szekvenciánként, primerenként, mintánként, reakciónként is eltérő lehet, ezért a DNS,
és közvetve az RNS mennyiségi meghatározásánál nagyon fontos a reakció hatékonyságát
figyelembe venni: Xn = X0(1+E)n
ahol Xn az n ciklus után mért cDNS mennyiség, X0 a kiindulási (meghatározandó) mennyiség, E
a PCR hatékonysága (PCR efficiency), és n a ciklusszám. Meghatározására többféle módszer is
használatos, mely jól közelíti a valós értéket (Rasmussen 2001.; Tichopad és mtsai. 2003.;
Ramakers és mtsai. 2003.). A standard görbe meredekségéből számítható a PCR hatékonysága a
következő képlettel: E = (10-1/meredekség)-1.
A másik általam alkalmazott számítási módszerrel a reakciónkénti egyedi hatékonyságot vettem
figyelembe a Rotor-Gene Real-Time Analysis Software (version 6.0.27) (Corbett Research,
Mortlake, Australia) program Comparative Quantitation Analysis alkalmazásának segítségével.
Mint minden mennyiségi értékelés esetén, az mRNS szintek összehasonlító vizsgálatánál
is alapvetően szükséges az adatokat azonos viszonyítási alapra hozni, normalizálni, mely során a
génexpressziós értékeket korrigálom a minták közti sejtszám, RNS tartalom és degradáció,
valamint az RT hatékonyság eltéréseire, és az esetleges bemérési különbségekre. A szakirodalom
sokféle lehetőséget kínál, melyek közül a háztartási gén (HKG) expressziós értékével történő
normalizálás széles körben elterjedt módszer a legkülönbözőbb kísérletekben (Bustin 2000.,
2002.; Huggett és mtsai. 2005.). Ezek olyan folyamatosan expresszálódó gének, amelyek
termékei általában alapvetőek és nélkülözhetetlenek a minimális sejtfunkciók fenntartásában,
mint például a transzkripciót, transzlációt, vagy jelátvitelt szabályozó fehérjék (Butte és mtsai.
2001.). A vizsgált gének (GOI) expressziós értékeit normalizáltam a referenciának választott
gén(ek) - általában valamilyen, a kísérleti körülményektől, fejlődési stádiumoktól függetlenül
változatlanul, stabilan expresszálódó háztartási gén(ek) - értékeivel: az egyes mintákban mért
adott gén RNS mennyiségét elosztottam az ugyanabban a mintában mért referencia, vagy több
referencia RNS mennyisége mértani középértékével.
A mintákban mért küszöbérték ciklusszámokból, és a meghatározott PCR
hatékonyságokból ki tudtam számítani egy adott mintához, mint kontrollhoz - általában
petesejthez, vagy blasztomer sejthez, egysejtes embrióhoz - viszonyított relatív RNS
mennyiségeket (R). Az alábbi képlet leírja a számítás menetét: R = (EGOI)ΔCt(GOI)/(EHKG)Ct(HKG)
ahol ΔCt = Ctkontroll-Ctminta (Livak 1997., Livak és Schmittgen 2001.; Pfaffl 2001., Pfaffl és mtsai.
2002.). Ezeket az R értékeket tüntettem fel az ábrákon.
41
Részletesebben az adott kísérlet eredményeinél, illetve a megfelelő ábráknál tárgyalom
ettől az általános kiértékeléstől való eltéréseket, készülék specifikus számításokat.
3.3.9 Génexpresszió stabilitás vizsgálat
A legmegfelelőbb referencia gének kiválasztását, valamint a különböző embrió
stádiumok közti génexpresszió stabilitás vizsgálatát a geNorm Visual Basic application for
Microsoft Excel program segítségével végeztem (Vandesompele és mtsai. 2002.). A
meghatározásnak az az alapelve, hogy két ideális referencia gén expressziójának (mRNS
mennyiségének) aránya azonos minden mintában függetlenül azok eredetétől, típusától.
Számítása az expressziós arányok logaritmusának szórásából történik. Egy választott gén
stabilitási értéke (M) egyenlő a többi génnel páronkénti összehasonlításából kapott szórások
átlagával. Az M értékek alapján sorba rendezhetők a gének, és minél kisebb az M, annál
stabilabb az expresszió a vizsgált minták között. Végül a kiválasztott 3 legstabilabb referencia
gén expressziójából számítható az általános normalizációs faktor (NF) is, mely a későbbiekben
használható a vizsgálni kívánt gének expressziójának normalizálására.
3.3.10 Egyéb molekuláris biológiai módszerek
Az egyéb alapvető módszereket (plazmid DNS gyors alkalikus tisztítása, kompetens sejt
készítése, transzformálás, DNS izolálás emlős szövetből, DNS izolálás vérből, koncentráció
mérés spektrofotométerrel, DNS fenolos tisztítása, ligálás, emésztés) Sambrook: Molecular
cloning 1., 6., és Appendix 8 fejezeteiből vettem át (Sambrook és Russel 2001.d).
42
4. Eredmények
4.1 Egyedi embriókon alapuló génexpressziós protokoll kifejlesztése és validálása
4.1.1 Primerek tervezési eljárásának validálása
A módszer validálása (megerősítése) több vizsgálattal történt:
– A PCR optimalizálására különböző primer koncentráció kombinációkat (0,1/0,1; 0,1/0,3;
0,3/0,1; 0,3/0,3; 0,1/0,5; 0,3/0,5; 0,5/0,1; 0,5/0,3; 0,5/0,5 µM) alkalmazva választottam ki a
leghatékonyabb párosítást.
– Az esetleges PCR-t gátló anyagok (sejtalkotók, vegyszerek) jelenlétét a minta cDNS-ben az
úgynevezett SPUD módszerrel ellenőriztem (Nolan és mtsai. 2006.a).
– Minden reakció után a felvett hőmérsékleti görbe segítségével megmértem a termék(ek)
olvadáspontját, mely jellemzően szekvenciaspecifikus (15. ábra).
– A PCR termék(ek) méretét először agaróz gél-
elektroforézissel ellenőriztem (17. ábra). Ehhez
rendeltem hozzá az olvadáspont értékeket, így a
későbbiekben ezeket használhattam a
célszekvencia azonosítására.
– Ahhoz, hogy mennyiségileg összehasonlítható
legyen a különböző gének különböző szakaszának
expressziója különböző PCR-ben, számításba kell
venni a primerek PCR hatékonyságát is. Ezt
általában hólyagcsíra cDNS hígítási sorral
határoztam meg, mivel a korai embrionális gének
mindegyike kifejeződik ebben a mintában.
Összesítettem az általam sikeresen megtervezett, és a különböző kísérletekben felhasznált
primer párok adatait: szekvenciájukat, pozíciójukat, ideális feltapadási hőmérsékletüket, és a
specifikus PCR termék méretét (2. táblázat). A standard görbék adatait, a PCR hatékonyságokat,
és a PCR termékek olvadáspontját a 3. táblázatban adom meg.
43
17. ábra: PCR termékek agaróz gél-elektroforézis fényképe emlős mintákból.
A negatív kontrollban (Ne) a primer dimer képződése, az egér (E) és szarvasmarha (Sz) mintákban 182 bp nagyságú termék mutatható ki. M: molekulatömeg marker.
Gén rövid neve Primer párokSzekvencia (5' → 3') Pozíció
Ta (°C)
Termék mérete (bp)
Actb ATGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATC TGGTACCACCAGACAGCACTGTGTTG
798-823 964-989
60 192
Actb (NY) TCCGCCGCCGGCCCACACTAGTCCTTCTGGCCCATGC
42-60 212-229
60 188
Cenpf (SZ) CCAGCTGTTGGTTTGGAGG TTGTAAAGAAAGGGTTTGC
8992-9011 9145-9164
50 173
Cirpb AGCTCGGGAGGGTCCTACA GACGCGGAGGGCTTTTACT
545-565 597-615
60 71
Crebbp GGCCAGGACCGCTTTGTTTAT GGGCTCTTGGACTGTGGCTCACC
5282-5302 5456-5478
60 197
Dazap2 CTTATTATCCAGTTGGTCCC GTTACAAGGACGTTGGC
319-328 483-499
55 181
Eef1e1 GCGGAGTTGAGGCTGCTGGAGA AGACTCGGGCCATTGTTTGTCTG
30-51 117-139
60 110
Eef1e1 (EEF1E1) (NY) ACCGCAGAAGAGAAAGCCATAG AGCGATGTAGCCCATAGTAGAGGA
103-124 269-292
68 190
Eif1a AAGAAGTCTGAAGGCCTATG CAGAGAACTTGGAATGTAGC
654-670 805-824
55 171
Eif4e ACTGCTGTGCCTTATTGGAG CGGAGGAAGTCCTAACCTTT
413-432 568-587
55 175
Ep300 ATCCAGCGGTCAAGCACCAGTGTC CGGCTAGGAACAGGAGAAGGTGAA
2770-2793 2905-2928
60 159
G6pdx (G6PD) (NY) AGCCCGCCTCCACTGACTCC ACCACGTTGTCCGCCTGCAC
842-861 910-929
60 88
Gapdh TGACGTGCCGCCTGGAGAAA AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG
728-747 802-825
60 98
Gapdh (NY) CAAGTTCCACGGCACGGTCA CTCGGCACCAGCATCACCC
230-249 329-347
68 118
Gcn5l2 GGGAAAGGAGAAGGGCAAGGAG CGACTGCGCAACCGTTCTGTCAT
2184-2205 2359-2381
60 198
H2afz ACAGCGCAGCCATCCTGGAGTA TTCCCGATCAGCGATTTGTGGA
314-335 494-515
60 202
H2afz (H2AV_RABIT) (NY) AGAGCCGGCTGCCAGTTCCCAGTCGCGCCCACACGTCC
61-79127-145
59 85
Hat1 GTGGATGATGAAAGATGGCACTACT GTGGCCCTGACCTTGAAATGGA
612-636 767-788
60 177
Hdac1 TTCAACTTGCCCATGCTGATGC TGGTCATGTTGGAAGGGCTGATGT
885-906 1045-1068
60 184
Hdac2 CCGGTGTTTGATGGACTCTTTGAGTTTCCAGCCCAATTGACAGCCATATCAG
512-537 597-622
56 111
Hdac3 CACCCGCATCGAGAATCAGAAC TCGGCCTCGTCAGTCCTGTCATAC
1029-1050 1158-1181
60 153
Hdac4 ACCGCTATGACGATGGGAACTTCT AGGCCACCCGTGAAAGCCATGTTG
2672-2695 2754-2777
60 106
Hdac5 ACCGCCATCTGTGATGCCTCTGA AGTGTGGCAACCGCATTGACGCT
3305-3327 3398-3420
60 116
Hdac6 GTTATGCCCACCTCACCCACCTAC TGGATGACCTCACTGATTGAAACC
1472-2495 2650-2673
60 202
Hdac7 GGGCTTCAATGTCAACGTGGCTTGG AGCAAACTCTCGGGCAATGG
2365-2389 2457-2476
60 112
Hdac8 TACTATTGCCGGAGATCCAATGTGT CGAGCCGTGTTGGCAAGGTTATAGC
885-909 998-1022
60 138
44
Gén rövid neve Primer párokSzekvencia (5' → 3') Pozíció
Ta (°C)
Termék mérete (bp)
Hdac9 CGTCCCTGCCCAATATCACTCTG AACGTGGCTGGAGGACGCTGCAATG
974-996 1113-1137
60 164
Hdac10 TGGAATCATGGATGGGCAGATAAGA TGTCCCAGGGCCACACAGAG
1611-1635 1726-1745
60 135
Hdac11 CATCTTTCTTCCCAACTTCCTTGTG CTCCACAGCCAGCTTCCCTGC
336-360 412-432
60 97
Hist2h2aa2 GTCGTGGCAAGCAAGGAG GATCTCGGCCGTTAGGTACTC
51-68 212-232
60 182
Hprt1 GCTTGCTGGTGAAAAGGACCTCTCGAAG CCCTGAAGTACTCATTATAGTCAAGGGCAT
579-606 666-695
60 117
Hprt1 (O46381_RABIT) (NY) ACGTCGAGGACTTGGAAAGGGTGTT GGCCTCCCATCTCCTTCATCACATC
83-107 154-178
68 96
Hspa1a AAGAACGCGCTCGAGTCCTAT TTGTCAGCCTCGCTGAGCTT
1618-1638 1684-1703
60 86
Htatip CCGCCTCAAGCCGTGGTACTTC GAGATGGTGCCCTTGCGGTAAAT
720-741 877-899
60 180
Nanog TGGTTGAAGACTAGCAATGGT GTCTGGCTGCCCCACAT
664-684 778-794
60 131
Pcaf TAAAGAGCCCAAAGACCCTGAGCA CCCGGAGCTTCTGTTCTCTTCACT
2115-2138 2211-2234
60 120
Pgk1 (PGK1) (NY) TGTTGGTCGGGCGAAGCAG CAGTGTCTCCACCGCCGATG
972-989 1101-1120
60 149
Polr2a (POLR2A) (NY) AGACTTCTCGGCCCGCACTG ACTTGGCGCCTGGGTACTGG
1077-1096 1233-1252
68 176
Pou5f1 CCACCATCTGTCGCTTCG CACCAGGGTCTCCGATTTG
573-590 691-710
60 138
Pou5f1 (ember) AGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAG AGGAGTACAGTGCAGTGAAGTGAG
628-653 1039-1062
60 435
Pou5f1 (ENSOCUG00000017160) (NY)
CGAGTGAGAGGCAACTTGGCGGTTACAGAACCACACACG
718-736 823-842
57 125
Ppia CGCGTCTCCTTCGAGCTGTTTG TGTAAAGTCACCACCCTGGCACAT
100-121 226-249
60 150
Ppia (PPIA_RABIT) (NY) TCCAGGGTTTATGTGCCAGGGTG CGTTTGCCATGGACAAGATGCC
102-124 217-238
68 137
Rbm3 CACCTTCACAAACCCAGAGCAT GATTTGGCGCCCATCCA
232-253 291-307
60 76
Sfrs3 GCGCAGATCCCCAAGAAGG ATCGGCTACGAGACCTAGAGA
336-354 472-452
60 137
Slc2a3 CTTCTGAGAGCGGCTTCTG CAACAGTCACGGCGAACA
29-47 163-181
60 153
Sod1 ACCTCATTTTAATCCTCACTCTAAGAAAC ATTGGCCACACCGTCCTTT
302-330 389-407
60 106
Sod2 TTACAGATTGCTGCCTGCTCTAAT ATCCCCAGCAGCGGAATAA
543-566 595-613
60 71
Taf1 CCCCGTGTGCTTCAAGAGAATAC GGGTGTTGGACTTGGGATCAGG
3547-3569 3679-3700
60 154
Trp53 GCTTCTCCGAAGACTGGATGA AGAGGGAGCTCGAGGCTGAT
520-540 567-586
60 67
Ubc CGTCGAGCCCAGTGTTACCACCAAGAAGG CCCCCATCACACCCAAGAACAAGCACAAG
1920-1948 2003-2031
60 112
45
Gén rövid neve Primer párokSzekvencia (5' → 3') Pozíció
Ta (°C)
Termék mérete (bp)
Ywhaz (YWHAZ) (NY) GGTCTGGCCCTTAACTTCTCTGTGTTCTA GCGTGCTGTCTTTGTATGATTCTTCACTT
505-533 618-646
68 142
2. táblázat: Primer adatok.
Ta: feltapadási hőmérséklet; NY: nyúl szekvenciára tervezett primerek; SZ: szarvasmarha szekvenciára tervezett primerek.
Gén rövid neve Y tengely metszéspontja
Meredekség Determinációs együttható (R2)
PCR hatékonyság (E)
Tm (°C)
Actb 22,16 -2,96 0,99 1,17 86
Actb (NY) 21,88 -3,37 0,98 0,98 92
Cirpb 36,56 -2,64 0,97 1,40 78
Eef1e1 26,95 -2,87 0,96 1,23 86
Eef1e1 (EEF1E1) (NY) 20,73 -3,51 0,97 0,93 84
G6pdx (G6PD) (NY) 23,84 -3,48 0,99 0,94 86
Gapdh 21,69 -3,49 0,98 0,93 86
Gapdh (NY) 18,58 -3,43 0,99 0,96 87
H2afz 21,20 -3,81 0,99 0,83 86
H2afz (H2AV_RABIT) (NY) 19,18 -3,62 0,99 0,89 88
Hist2h2aa2 41,43 -3,72 0,98 0,86 89,5
Hprt1 23,02 -3,57 0,97 0,91 82
Hprt1 (O46381_RABIT) (NY) 22,87 -3,44 0,99 0,95 82
Hspa1a 37,83 -2,58 0,96 1,44 83
Nanog 38,52 -3,50 0,97 0,93 86,5
Pgk1 (PGK1) (NY) 17,12 -3,55 0,99 0,91 86
Polr2a (POLR2A) (NY) 22,33 -3,42 0,96 0,96 89
Pou5f1 29,51 -3,65 0,99 0,88 87
Pou5f1 (ENSOCUG00000017160) (NY)
17,32 -3,83 1,00 0,82 88
Ppia 20,84 -3,71 0,98 0,86 84
Ppia (PPIA_RABIT) (NY) 16,31 -3,55 1,00 0,91 86
Rbm3 35,04 -2,54 0,93 1,48 79
Slc2a3 44,72 -3,32 0,96 1,00 86
Sod1 33,48 -3,20 0,99 1,05 82
Sod2 33,03 -3,01 1,00 1,15 78
Trp53 37,41 -2,98 0,95 1,17 79
Ubc 23,32 -3,67 0,97 0,87 84
Ywhaz (YWHAZ) (NY) 20,09 -3,42 0,99 0,96 82
3. táblázat: Standard görbe, PCR hatékonyság, és olvadáspont adatok.
Tm: a PCR termékek olvadáspontja; NY: nyúlban mért értékek.
46
4.1.2 Kvantitatív RT-PCR módszerek összehasonlítása
A kvantitatív végpont és real-time RT-PCR (I) összehasonlításakor vizsgáltam a két
módszer érzékenységét (alsó kimutatási határát), mérési tartományát, és a megbízhatóságát
(reprodukálhatóságát). Egér máj cDNS törzsoldatból készített hígítási sorában mértem a
Hist2h2aa2 (H2A) gén expresszióját, melyből azt az eredményt kaptam, hogy a real-time RT-PCR:
– több mint két nagyságrenddel érzékenyebb, vagyis alacsonyabb az alsó kimutatási határa (1
pg mRNS) szemben a végpont RT-PCR-rel (50 pg mRNS);
– legalább két nagyságrenddel nagyobb a mérési tartománya (1 pg-50 ng mRNS) szemben a
végpont RT-PCR-rel (50 pg-50 ng mRNS), azonban a felső határt nem sikerült elérni;
– standard görbéjének determinációs együtthatója jobban közelít az 1-hez (R2=0,982) szemben
a végpont RT-PCR-rel (R2=0,937), vagyis az illeszkedés jósága miatt megbízhatóbbak az így
mért eredmények (18. ábra) (4. táblázat).
Jellemzők Real-time RT-PCR Végpont RT-PCRMérési tartomány 1 pg - 50 ng cDNS 50 pg - 50 ng cDNSAlsó kimutatási határ 1 pg cDNS 50 pg cDNSStandard görbe determinációs együtthatója R2 = 0,982 R2 = 0,937Mért értékek Ct: 35,43 ± 0,29 Denzitometriás érték: 134789 ± 50893Relatív szórás CV = 18,63 % CV = 37,76 %Mintaszám n = 32 n = 31Kiindulási minta 50 pg cDNS 500 pg cDNS
4. táblázat: A kétféle RT-PCR módszer összehasonlítása.
Egy-egy kiválasztott hígítási ponton mérve a reprodukálhatóságot, a 30 mérés ismétlése
alapján a real-time RT-PCR bizonyult megbízhatóbbnak. Az adott standard törzsoldathoz
viszonyított RNS mennyiségek relatív szórás értéke (CV=18,63 %) kevesebb, mint fele volt a
végpont RT-PCR értékénél (CV=37,76 %) (4. táblázat). A minta számának növekedésével ez a
47
18. ábra: A kétféle RT-PCR módszerrel kapott standard görbék.
különbség az n=8 mintáig nem volt kimutatható (19. ábra).
4.1.3 Protokoll kidolgozása, jellemzése
A kiválasztott real-time RT-PCR módszer lépéseinek - az mRNS tisztítás, RT és PCR -
technikai hibáját úgy mértem meg, hogy az egér máj RNS törzsoldat egy kiválasztott, az egyedi
egér embriók expressziós szintjét közelítő hígítása
A) 10 azonos mennyiségű mintájából izoláltam mRNS-t, átírtam cDNS-sé;
B) 10-szeres mennyiségű mintájából izoláltam mRNS-t, és 10 egyenlő részét átírtam cDNS-sé;
C) 10-szeres mennyiségű mintájából izoláltam mRNS-t, átírtam cDNS-sé, és 10 egyenlő részre
osztottam;
majd real-time PCR-rel (I) mértem a Hist2h2aa2 gén expresszióját minden mintában. Az így
kapott 10-10-10 ismétlés relatív szórása: A) az mRNS tisztítás, RT és PCR együttes technikai
hibája (CV=27,43 %); B) az RT és PCR (CV=12,74 %); C) a PCR technikai hibája (CV=21,21
%). A protokollban rejlő hibát összehasonlítottam 4-6 egyedi, in vivo egér zigótában, nyolcsejtes
embrióban és hólyagcsírában mért CV értékeivel: 58,28 %, 159,06 % és 49,62 %, melyek a
minták közti egyedi eltérésekből - a biológiai különbségekből - és a mérés technikai hibájából
tevődnek össze (5. táblázat). Az embrió minták CV értékei 2-5,5-szer nagyobbak voltak a
technikai hibáknál, vagyis a „mérési zaj”-on túl is kimutathatók az embriók, egyedi sejtek közti
expressziós különbségek.
Lépések, minták Szórás Megjegyzésreal-time PCR CV = 21,21 % (Ct: 35,41 ± 0,33) C) cDNS standardból (n = 10)RT + real-time PCR CV = 12,74 % (Ct: 35,11 ± 0,21) B) mRNS standardból (n = 10)mRNS tisztítás + RT + real-time PCR CV = 27,43 % (Ct: 35,21 ± 0,48) A) RNS standardból (n = 10)Zigóta CV = 58,28 % (Ct: 34,66 ± 0,50) (n = 5)Nyolcsejtes embrió CV = 159,06 % (Ct: 34,54 ± 1,48) (n = 6)Hólyagcsíra CV = 49,62 % (Ct: 35,28 ± 0,56) (n = 4)
5. táblázat: A real-time PCR-en alapuló protokoll egyes lépéseinek technikai hibái és a biológiai különbségek.
48
19. ábra: A kétféle RT-PCR módszer reprodukálhatósága.
4.1.4 Protokoll ellenőrzése
Hat darab négy- és hat darab nyolcsejtes egér embriót blasztomer sejtjeire szétválasztva
vizsgáltam az egyedi sejtekben a kiválasztott gének expresszióját: Actb (referencia), Nanog,
Pou5f1, Slc2a3 (II). Sikerült a négysejtes embriók 21 sejtjéből kimutatni a Nanog és a Pou5f1
géneket (20. ábra). A nyolcsejtes
embriók 60 sejtjéből mindhárom
vizsgált gén relatív mRNS szintjét
meghatároztam (21. ábra). Egyes
sejtekben semmilyen mRNS-t nem
sikerült kimutatni, feltehetőleg azok
a szétválasztás, és gyűjtés során
sérültek meg, illetve vesztek el. A
négysejtes embriók
blasztomerjeiben nem találtam
Slc2a3 expressziót, a Nanog
expressziójában 9-szeres, a Pou5f1
expressziójában 10-szeres
különbségeket mértem egy embrió 4
sejtje között. A nyolcsejtes embriók
sejtjeiben a Nanog génnél nagyobb,
28-szoros expressziós
különbségeket, a Pou5f1-nél kisebb,
2-8-szoros, és a Slc2a3 génnél 12-
szeres különbségeket kaptam.
Egyazon embrió blasztomer sejtjei
között egy a négyből kiemelkedően magas Pou5f1 expressziót mutatott a négysejtes embriókban,
és kettő a nyolcból kiemelkedően magas Nanog expressziót a nyolcsejtes embriókban.
49
20. ábra: Génexpresszió négysejtes embriók egyedi sejtjeiben.
Az azonos embrióból származó értékek azonos színnel és betűvel vannak jelölve: A, B, C, D, E, F jelű embriók 1, 2, 3, 4 számú sejtjei. X jellel vannak megkülönböztetve azok a minták (E/1; F/1; F/2), amikben nem volt kimutatható génexpresszió.
4.2 Embrió mélyhűtési módszerek összehasonlítása
A kísérletben vizsgáltam a Cirpb, Hspa1a, Rbm3, Sod1, Sod2, Trp53 és Actb (referencia)
gének expressziójának változását egy- és nyolcsejtes egér embriók szilárd felületen (SSV) és
műszalmában (ISV) történő vitrifikációja során. A felmelegítés után 3 órával az RNS szintjén
azonnal bekövetkező gyors reakciót, a felmelegítés után 10 órával jelentkező lassú reakciót,
50
21. ábra: Génexpresszió nyolcsejtes embriók egyedi sejtjeiben.
Az azonos embrióból származó értékek azonos színnel és betűvel vannak jelölve: G, H, I, J, K, L jelű embriók 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 számú sejtjei. X jellel vannak megkülönböztetve azok a minták (I/8; J/7; J/8; K/7), amikben nem volt kimutatható génexpresszió. Egy mintánál két sejtet nem sikerült szétválasztani, ott két sejtből (G/1-2) történtek a mérések.
amikor a sejtosztódások már elkezdődtek, vagy teljesen le is zajlottak, valamint a hólyagcsíra
állapotig in vitro tovább tenyésztett embriókban az esetleges maradandó változásokat mértem
csoportonként 6-6 egyedben. A közös viszonyítási pont az in vivo egy- és nyolcsejtes egér
embriók, kontrollként a mélyhűtés nélkül in vitro tenyésztett, megfelelő időpontokban vett
embriók génexpressziós értékei szolgáltak (III).
Az egysejtes embriókban az ISV-nél a 3 órás időpontban mind a hat vizsgált gén
expressziója megemelkedett a kontrollhoz képest 2-33-szoros mértékben, míg az SSV-t követően
csak kisebb mértékű (0,3-2-szeres) változásokat mértem. Az ISV embriókban 10 órával a
felmelegítés után mind a hat gén expressziós értéke visszacsökkent a kontrollhoz közeli értékre,
a Cirbp, a Hsp70 és a Trp53 értéke szignifikánsan kisebb a 3 órás értékekhez képest. Az SSV-nél
ugyanakkor csak kismértékű eltérések találhatók a kontrollhoz és a 3 órás értékekhez képest is.
Figyelemre méltó a Trp53 csökkenése 10 óránál mindkét kezelésnél (22. ábra).
A nyolcsejtes embriókban eltérő génexpressziós mintázatot kaptam. Az ISV-nél a 3 órás
időpontban hasonlóan az egysejtes embriókhoz mind a hat vizsgált gén expressziója
51
22. ábra: Mélyhűtés hatása a génexpresszióra egysejtes egér embriókban.
A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve; a és b: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05). K: in vivo kontroll; V: in vitro kontroll; SSV: gyors fagyasztás szilárd felületen; ISV: gyors fagyasztás műszalmában; 3 és 10: a felmelegítéstől eltelt idő órában.
megemelkedett - közülük a Cirbp és a Sod2 szignifikánsan. Ezzel ellentétben az SSV-t követően
a Hsp70 és a Trp53 mutatott jelentős növekedést. Mindkét kezelésben 10 órával a felmelegítés
után hasonló expressziós mintázatot, megemelkedett szinteket kaptam, kivéve az Rbm3 esetében,
valamint az ISV-nél a Sod1 és a Trp53 esetén (23. ábra). Fontos felhívni a figyelmet arra, hogy a
referencia Actb gén expressziója a nyolcsejtes ISV embriókban váratlanul megemelkedett, míg
az összes többi esetben nem tapasztaltam eltérést, viszonylag állandó szintet mértem (24. ábra).
Ebből kifolyólag a nyolcsejtes eredményeket nem sikerült normalizálni, melyet az ábrán is külön
kihangsúlyoztam.
A hólyagcsírákban nem találtam szignifikáns különbségeket, az egysejtes embriók
esetében 2,6-szoros, a nyolcsejtes embrióknál 5-szörös volt a legnagyobb eltérés a különböző
csoportok között.
52
23. ábra: Mélyhűtés hatása a génexpresszióra nyolcsejtes egér embriókban.
A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a és b: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05). K: in vivo kontroll; V: in vitro kontroll; SSV: gyors fagyasztás szilárd felületen; ISV: gyors fagyasztás műszalmában; 3 és 10: a felmelegítéstől eltelt idő órában.
4.3 Egér egyedfejlődésének összehasonlítása különböző körülmények között
A kísérlet célja volt több különböző és független sejtfunkciókban szerepet játszó, az
irodalomban klasszikusnak számító háztartási gén alkalmasságának vizsgálata egér petesejtekben
és embriókban. A gének expressziós stabilitásának meghatározásával és sorba rendezésével
kiválaszthatók a normalizálásra legalkalmasabbak a jövőbeni kísérletekhez. A kiindulási 12
génből (Actb, Bmp7, Eef1e1, Gapdh, H2afz, Hist2h2aa2, Hprt1, Polr2a, Ppia, Tbp, Tubb4, Ubc)
elővizsgálatok és optimalizálás után választottam ki az összehasonlító vizsgálatba vont 7
legalkalmasabbat: Actb, Gapdh, Eef1e1, H2afz, Hprt1, Ppia, Ubc. A három különböző kezelési-
tenyésztési csoport (in vivo, in vitro, valamint a parthenogenetikus aktivált és in vitro tenyésztett)
közös viszonyítási pontjául az in vivo kinyert petesejtek szolgáltak. A vizsgálatban a korai és
késői kétsejtes, nyolcsejtes, hólyagcsíra és késői (kibújó) hólyagcsíra stádiumú embriókban
mértem csoportonként 6-6 egyedben a kiválasztott 7 gén expresszióját, kivéve a
parthenogenetikus aktivációt, ahol a késői hólyagcsíra állapotig nem jutnak el az embriók (IV).
Általánosságban mindhárom csoportban a legtöbb gén expressziója növekedett a korai
kétsejtes állapotban, legnagyobb mértékben az Eef1e1 (4-8-szorosan), majd lecsökkent a késői
kétsejtes állapotban, kivéve a H2afz és a Ppia géneket, melyek folyamatos emelkedést mutattak.
A kétsejtes állapottól kezdve a késői hólyagcsíráig mindegyik gén expressziója növekedett a
fejlődés előrehaladtával és a sejtszám növekedésével. Az összehasonlításból jól látható, hogy az
in vivo embriókban a két hólyagcsíra állapot között a növekedés tovább folytatódott (1,3-2,6-
szoros), ezzel szemben az in vitro mintákban hasonló expressziós szinteket kaptam (25-27.
ábrák).
53
24. ábra: Az Actb gén expressziójának változása a mélyhűtés hatására.
A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a és b: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05). K: in vivo kontroll; V: in vitro kontroll; SSV: gyors fagyasztás szilárd felületen; ISV: gyors fagyasztás műszalmában; 3 és 10: a felmelegítéstől eltelt idő órában.
54
25. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vivo egér embriókban.
A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c és d: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).
55
26. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vitro egér embriókban.
A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c és d: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).
A csoportok közti eltéréseket értékelve a kétsejtes állapotban hasonló expressziót
mutattak a különböző csoportok, kivéve a korai kétsejtes állapotban a H2afz és Ppia gének, ahol
szignifikánsan alacsonyabbak voltak az in vitro és parthenogenetikus minták értékei, valamint a
késői kétsejtes állapotban a Gapdh gén, melynél szignifikánsan magasabb volt az in vitro minták
értéke. A nyolcsejtes állapotban az in vitro értékek valamivel magasabbak voltak, a hólyagcsíra
állapotokban ellenben az in vitro és parthenogenetikus minták értékei alacsonyabbak voltak,
melyek közül szignifikánsan eltértek az Actb, Eef1e1 és H2afz géneké (28. ábra).
56
27. ábra: A referencia gének expressziós mintázata parthenogenetikusan aktivált egér embriókban.
A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b és c: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).
A gének expressziós stabilitási értékeit (M) a geNorm Visual Basic application for
Microsoft Excel program segítségével határoztam meg a három csoportban külön-külön (29.
ábra). A H2afz, Hprt1 és Ppia gének
mutatkoztak a legstabilabbaknak, majd
sorra következtek: Ubc, Gapdh, Eef1e1,
és Actb gének. A legkevésbé stabil az
Actb volt az in vivo és az in vitro
csoportok esetében, míg a
parthenogenetikus csoportban az Eef1e1.
A három csoportból az in vivo M értékek
voltak a legalacsonyabbak, és a
parthenogenetikusé a legmagasabbak.
4.4 Nyúl egyedfejlődésének vizsgálata
A kiindulási 13 génből (Actb, B2m, Eef1e1, G6pdx, Gapdh, H2afz, Hprt1, Pgk1, Polr2a,
Ppia, Tbp, Ubc, Ywhaz) elővizsgálatok és optimalizálás után választottam ki az összehasonlító
vizsgálatba vont 10 legalkalmasabbat: Actb, Eef1e1, G6pdx, Gapdh, H2afz, Hprt1, Pgk1, Polr2a,
Ppia, Ywhaz. A választott 10 referencia gén expresszióját sikerült megmérni és azonosítani
57
28. ábra: A referencia gének expressziójának összehasonlítása a különböző egér embriókban.
A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; * az in vivo mintáktól, # az in vitro mintáktól való szignifikáns eltéréseket jelöli (p<0,05).
29. ábra: A referencia gének expressziós stabilitási értékei a különböző egér embriókban.
petesejtben, egysejtes embriókban, az in vivo és in vitro kétsejtes, korai és késői nyolcsejtes, és
hólyagcsíra stádiumú embriókban csoportonként 5-5 mintában (IV). A más fajokban már
meghatározott homológ Pou5f1 és Nanog szekvenciák összehasonlításából kiindulva próbáltam
azonosítani ezeket a géneket nyúlban is. A kiindulási viszonyítási pont az in vivo gyűjtött
petesejtek voltak, az egysejtes embriók szintén csak in vivo álltak rendelkezésre. Az Actb gén
esetében különös körültekintéssel jártam el. Három különböző szekvenciára is terveztem
primereket, melyek közül végül az X60733 azonosítójú, és hibásan „ACT-5”-nek (gamma non-
muscle actin) nevezett NCBI referencia szekvenciát választottam. A nukleotid és az aminosav
szekvenciák ortológ szekvenciákkal történő összehasonlítása is megerősítette, hogy ez hasonlít a
legjobban a többi fajban leírt Actb génhez, és az adatbázis kezelői is visszajeleztek, hogy a
megnevezésük valóban hibás.
Az egysejtes állapotra csökkent az Eef1e1, G6pdx, H2afz, Hprt1, Pgk1 és Ppia gének
expressziós szintje, ellenben növekedett az Actb, Gapdh és Polr2a géneké. Általában a referencia
gének expressziós mintázata hasonló volt mindkét tenyésztési körülmények között: a nyolcsejtes
állapotig csökkenő mRNS szinteket, majd a szedercsíra és hólyagcsíra állapotokban kimagaslóan
magas értékeket mértem az Actb, Gapdh és Ppia esetében. A H2afz, Hprt1, Ywhaz géneknél
folyamatos emelkedett az expresszió, és a nyolcsejtes állapotban sem történt visszaesés (30-31.
ábrák).
58
59
30. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vivo nyúl embriókban.
A grafikonon az n=5 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c, d és e: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).
Az in vitro tenyésztés hatását elemezve a génexpressziós mintázatok nagy hasonlóságot
mutattak mind a 10 referencia génre. Általában az in vivo embriókban mért expresszió magasabb
volt (kivéve az Actb és Pgk1) szignifikáns eltéréssel a kétsejtes állapotban az Eef1e1, G6pdx,
60
31. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vitro nyúl embriókban.
A grafikonon az n=5 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c, d és e: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05); * az in vivo mintáktól való szignifikáns eltéréseket jelöli (p<0,05).
Ppia és Ywhaz géneknél, a szedercsíra állapotban az Actb, Gapdh, H2afz, Ppia és Ywhaz
géneknél, valamint a hólyagcsíra állapotban a Hprt1 és Polr2a gének esetében. Ezzel szemben a
nyolcsejtes állapotban az in vitro embriókban volt magasabb az expressziós érték, az Actb,
Eef1e1, Gapdh és Ywhaz géneknél szignifikáns különbséggel (30-31. ábrák).
A gének expressziójának stabilitását elemezve hasonló M értékeket és a sorrendben
kisebb eltérést kaptam az in vivo és in
vitro mintákban. A három legstabilabb
gén az in vivo minták esetén: H2afz,
Hprt1, Ywhaz, majd sorra: Actb, Ppia,
G6pdx, Gapdh, Eef1e1, Polr2a, Pgk1. Az
in vitro minták esetén: H2afz, Ywhaz,
Hprt1, majd G6pdx, Ppia, Gapdh, Eef1e1,
Polr2a, Actb, Pgk1, vagyis a három
legstabilabb gén mindkét esetben ugyanaz
volt (32. ábra).
Az egyes fajokból származó ismert Nanog és Pou5f1 szekvenciákat számítógépes
programok segítségével elemezve a konzervált régiók homológ szakaszaira olyan univerzális
PCR primer párokat terveztem, melyekkel reményeim szerint a nyúl embrió mintákból
génspecifikus cDNS szakaszokat lehet kimutatni, kinyerni és azonosítani. A teljes genom szintű
összehasonlítások alapján a nyúl genomja az ismertek közül az emberéhez hasonlít a legjobban.
Az emberi szekvenciára optimalizált univerzális primer párokkal sikerült egy 131 nukleotid
hosszú Nanog, és egy 435 nukleotid hosszú Pou5f1 cDNS részletet kimutatni 10 egybegyűjtött
embrió mintából, valamint meghatározni a szekvenciáját a nyúlban elsőként. Szekvencia
elemzésnek alávetve, a homológiaviszonyok alapján csak a több más fajban már leírt Pou5f1
génekkel mutatott nagyfokú hasonlóságot (Függelékek: IV. A nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának
összehasonlítása), míg a feltételezett nyúl Nanog
szekvencia egér és emberi pszeudogénekhez is
hasonlított. Ezek alapján új, már nyúl specifikus
primerekkel és a kiválasztott referencia génekkel
lehetett a Pou5f1 expresszióját meghatározni a
különböző szöveti mintákban, és embrió
stádiumokban. A szövetspecifikus vizsgálatban a
Pou5f1 gén expresszióját mutattam ki agyban,
lépben, vesében és a petefészekben (33. ábra).
61
32. ábra: A referencia gének expressziós stabilitási értékei a különböző nyúl embriókban.
33. ábra: A Pou5f1 gén szövetspecifikus expressziója nyúlban.
A PCR termékek agaróz gél-elektroforézis fényképe különböző szöveti mintákból: A: agy; I: izom; B: bőr; L: lép; M: máj; V: vese; P: petefészek; MM: molekulatömeg marker.
Az in vitro embrió
mintákban kapott fejlődési stádium-
specifikus expressziós mintázat: a
petesejtekben és a zigótákban
viszonylag magas mRNS szinteket
mértem, majd a megtermékenyítést
követően folyamatosan csökkent a
nyolcsejtes stádiumig, és ettől
kezdve enyhén növekedni kezdett
(34. ábra).
4.5 Egér és szarvasmarha egyedfejlődésének összehasonlítása
Az alapelgondolás szerint olyan petesejt/embrió specifikus, egyedfejlődésben szerepet
játszó transzkripciós faktorokat és géneket választottam, amelyeket a szarvasmarhában korábban
azonosítottak a kisebb genom aktiváció során: Cenpf, Dazap2, Eif1a, Eif4e, Sfrs3. A
szarvasmarha genomja még nem ismert minden részletében, így a kiválasztásra került, vizsgált
gének közül néhánynak a teljes szekvenciája helyett csak töredék szekvenciákra alapoztam a
primerek tervezését, az expressziójuk mérését. A két fajban közösen használt primereket egy
meghatározott, a két szekvencia homológiaviszonyain alapuló, úgynevezett konszenzus
szekvenciára terveztem, melyek az Eif1a kivételével minden gén esetében mindkét fajban jól
működtek. Mivel a két fajban az embrionális genom aktiváció más stádiumban zajlik le, az
egérnél különválasztottam a korai és késői kétsejtes, míg a szarvasmarhánál a korai és késői
nyolcsejtes állapotokat. A szarvasmarha esetében 8-20 egybegyűjtött embrió minták átlagos egy
embrió egyenértékű részében mértem az mRNS szinteket (IV). A protokolltól eltérően ebben a
kísérletben nem referencia gén expressziós értékével normalizáltam, hanem külső referenciával,
vagyis egy idegen eredetű, a mintákhoz hozzáadott ismert és azonos mennyiségű kontroll RNS -
észak-amerikai szentjánosbogár (Photinus pyralis) luciferáz gén (Promega, Madison, WI, USA)
- mért értékével. További eltérés volt a mennyiségi kiértékelésben, hogy a reakciónkénti egyedi
hatékonyságot vettem figyelembe a PCR készülék programjának (Comparative Quantitation
Analysis) segítségével.
Szarvasmarhában az Eif1a gén expresszióját nem sikerült mérni, a többi 4 gén a
petesejthez képest 3-5-szörös emelkedést mutatott a nyolcsejtes állapotig, ahol lecsökkent az
expressziójuk, majd a hólyagcsíra állapotig újra emelkedett (35. ábra). Az egérben nem kaptam
hasonló mintázatot. A késői kétsejtes állapotig enyhe csökkenést mutattak, és egyedül az Eif4e
62
34. ábra: A Pou5f1 gén expressziós mintázata in vitro nyúl embriókban.
A grafikonon az n=5 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve; a, b és c: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).
gén mutatott kisebb expressziós növekedést a késői kétsejtes állapottól kezdve (36. ábra).
63
35. ábra: A vizsgált gének expressziós mintázata szarvasmarha embriókban.
36. ábra: A vizsgált gének expressziós mintázata egér embriókban.
A grafikonon az n=3 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve.
4.6 HDAC és HAT gének expressziójának meghatározása egér embriókban
A rendelkezésre álló ismeretek birtokában az eddig leírt 11 HDAC, 7 HAT gén és 3
referencia gén expressziós mintázatának mennyiségi összehasonlítására vállalkoztam az egér
preimplantációs egyedfejlődése során in vivo petesejtekben és a különböző stádiumú
embriókban. Az összesen 21 gén (Crebbp, Ep300, Gcn5l2, Hat1, Hdac1, Hdac2, Hdac3, Hdac4,
Hdac5, Hdac6, Hdac7, Hdac8, Hdac9, Hdac10, Hdac11, Htatip, Pcaf, Taf1, és referenciának:
H2afz, Hprt1, Ppia) expressziójának méréséhez az egy embrió korlátozott mennyisége miatt a
stádiumonként (petesejt, egy-korai és késői két-négy-nyolcsejtes, szedercsíra és hólyagcsíra) 6-6
egyedet kettéválasztottam, és csak háromban mértem a Hdac1-7 géneket, a másik háromban a
többi gént (IV). A működési és szerkezeti (szekvencia) hasonlóság nagyfokú a HDAC enzimek
esetében, ezért nagy hangsúlyt kapott a génspecifikus primerek tervezése a keresztreakciók
elkerülése miatt. A Hdac1 és Hdac2 géneket különös figyelemmel kísértem, mivel az
adatbázisban fellelhető információk a kísérlet tervezése és kivitelezése alatt megváltoztak.
Esetükben új primerek és mérések váltak szükségessé. A mennyiségi kiértékelésben a
reakciónkénti egyedi hatékonyságot vettem figyelembe a PCR készülék programjának
(Comparative Quantitation Analysis) segítségével. Több gén nem volt kimutatható a petesejtben,
mint kiindulási alapban (Hdac5, Hdac6, Hdac10, Pcaf), vagy egyik stádiumban sem (Hdac7,
Hdac11), így ezek esetében más, általában a kétsejtes stádiumhoz viszonyított expressziós
értékeket tüntettem fel.
A korai és késői kétsejtes állapotok közötti EGA, mint fontos választóvonal
szempontjából tekintve az eredményeket:
– a Hdac1 expressziója a petesejttől kezdve folyamatosan csökkent, majd az EGA alatt újra
megemelkedett és lassan csökkent le a további sejtosztódások alatt;
– a HDAC gének közül a Hdac3, Hdac8 és Hdac9 expressziója mutatott növekedést a kisebb
genom aktiváció alatt, a korai kétsejtes állapotig, majd folyamatos csökkent;
– az EGA alatt fejeződött ki legerősebben a Hdac5, Hdac6 és Hdac10, hasonlóan a HAT gének
közül a Crebbp és Pcaf;
– a petesejttől kezdve folyamatos csökkenés volt tapasztalható függetlenül az EGA-tól a Hdac2
és Hdac4, valamint az Ep300, Gcn5l2, Hat1, Htatip és Taf1 gének esetében (37-38. ábrák).
64
65
37. ábra: A HDAC gének expressziós mintázata egér embriókban.
A grafikonon az n=3 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve.
38. ábra: A HAT gének expressziós mintázata egér embriókban.
A grafikonon az n=3 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve.
5. Tárgyalás
5.1 Módszer fejlesztés
A két RT-PCR módszer összehasonlításából kiderült, hogy a real-time RT-PCR több mint
két nagyságrenddel érzékenyebb a végpont RT-PCR-nél, melyet a nagyobb mennyiségű
kiindulási mintával, embriók egybegyűjtésével lehet valamiképpen ellensúlyozni. Az egyedi
embriók, blasztomer sejtek génexpressziójának mennyiségi méréséhez azonban a real-time RT-
PCR az alkalmasabb. A megbízhatóság, a reprodukálhatóság tekintetében szintén ez a módszer
adott szignifikánsan jobb eredményt. Ez következik abból, hogy míg a real-time RT-PCR
esetében a reakcióelegy összeállítása után zárt csőben folyik a mérés a kísérletező személy
minden további beavatkozása nélkül, addig a végpont RT-PCR-nél több lépés is szükséges még,
amíg a denzitometriás mennyiségi értékek meghatározhatóak. Ezek a lépések egyenként növelik
a bevitt hibát, rontva a megbízhatóságot. A sokkal nagyobb különbségek másik oka, hogy a
reakció befejezésekor a végpontján mért értékek nem csak a kiindulási minta mennyiségével,
hanem a reakciót befolyásoló tényezőkkel, mint például a PCR hatékonyságának változásával, a
kiindulási anyagok csökkenésével, gátló anyagok felhalmozódásával is kapcsolatosak. Sok
esetben mégis használható eredményt ad a végpont RT-PCR is, amikor az embriók különböző
kezelések hatására adott átlagos, nagymértékű reakcióját vizsgálják és nem az egyedi, finom
különbségek kimutatása a cél. Az eredményeim összefüggésben állnak a mások által
tapasztaltakkal. A real-time RT-PCR-re korábban meghatározott 0,4 % relatív szórás a Ct-re
számítva (Wittwer és mtsai. 1997.), vagy 0-5 % (Bustin 2000.) és 14 % (Schmittgen és mtsai.
2000.) az RNS mennyiségére számítva, valamint a végpont RT-PCR 14 % (Zhang és mtsai.
1997.) és 45 % (Schmittgen és mtsai. 2000.) relatív szórás értékei összevethetők a sajátommal:
CV = 19 % (real-time RT-PCR) és CV = 38 % (végpont RT-PCR). A kismértékű eltérés az
általam alkalmazott magas mintaszámmal (n=30) magyarázható.
Ezt a real-time RT-PCR módszert sikerült tovább fejlesztenem egy teljes génexpressziós
protokollá a petesejtek, embriók gyűjtésétől kezdve az RNS kinyerésén és átírásán keresztül a
mennyiségi meghatározásig, illetve az adatok helyes kiértékeléséig, valamint jellemeztem a
rendszer alkalmasságát, érzékenységét. A protokoll kidolgozása során a technikai hibák két fő
összetevőjét határoztam meg: a PCR a teljes hiba nagy részét képezte és hasonló arányban járult
hozzá az mRNS izolálás is, míg az RT lépésnek nem volt számottevő szerepe. A teljes hibát a 6-6
embrió mintában mért relatív szóráshoz viszonyítva megállapítható, hogy az egyedek közt
kimutatható különbségek lényegesen nagyobbak a teljes protokoll technikai hibájánál, vagyis a
66
mért különbségek valóban a köztük lévő biológiai különbségekből eredtek, nem a mérési hibák
összességéből. Felvethető ugyanakkor, hogy a preimplantációs stádiumú embriók rendkívül
rugalmasak és képesek átmenetileg a génexpresszió szélsőséges változásait is elviselni. Ilyen
összehasonlítást eddig az irodalomban nem írtak le, ezt először állapítottam meg. Az általam
kidolgozott módszer ennél fogva alkalmas a biológiai különbségek okainak feltárására és újabb
tényezők azonosítására is. A mennyiségi, egy sejten alapuló mRNS expressziós kísérletekkel
ezeket az alapvető kérdéseket lehet megcélozni.
Emellett más real-time RT-PCR módszereket is leírtak, melyek szintén megbízhatóak,
azonban többségében csak egyes lépései, mint például az RNS kinyerés, az RT, a PCR, vagy az
adatelemzés alkalmazhatóságát tárgyalják részletesen és nem adnak egy teljes átfogó
módszertant (Jeong és mtsai. 2005., Stahlberg és mtsai. 2004., Larionov és mtsai. 2005., Skern és
mtsai. 2005.). Egyik tanulmányban például kétlépcsős egyesített (multiplex) PCR módszert
dolgoztak ki, mely egyszerre 20 gén mérésére is alkalmas egyetlen sejtből (Peixoto és mtsai.
2004.). Egy másik módszer, a PurAmp protokoll szintén új próbálkozás az egyedi sejtekből
egyszerre történő DNS és RNS tisztítás után a real-time PCR-rel való mennyiségi
meghatározásra, azonban gyakorlati megvalósítása komolyabb laboratóriumi felkészültséget,
speciális felszerelést is igényel, mint a steril környezet, termosztálható mikroszkópos berendezés,
pontos nl-es nagyságrendű kimérés üvegkapillárissal (Hartshorn és mtsai. 2005.). Az értekezés
készítése közben jelent meg egy új közlemény, melyben teljes körűen leírnak többféle mRNS
mennyiségi meghatározására szolgáló real-time RT-PCR módszert (Nolan és mtsai. 2006.b).
Hasonlóan a kidolgozott protokollomhoz az alapvető technikai lépések egységesítését célozza
meg a bennük rejlő ismert, de általában figyelembe nem vett hibalehetőségek kiküszöbölésére.
Másik megközelítési lehetőség akár egy minta összes mRNS-ének, a teljes
génexpressziós mintázatnak a mennyiségi meghatározására, összehasonlítására a mikrocsipen
alapuló kísérletek. Ezek óriási hátránya jelenleg, hogy az egyedi sejtekből kinyerhető mRNS
mennyiség nem elég a kimutatáshoz, ezért a mérést megelőzően a kiindulási kevés nukleinsav
mennyiségét RNS polimerázzal vagy PCR-rel sokszorosítják, mely a különböző szekvenciák
eloszlásának tekintetében nagyfokú hibalehetőséget rejt magában (Kamme és Erlander 2003.;
Kurimoto és mtsai. 2006.; Hartmann és Klein 2006.). Végeredményben a real-time RT-PCR
módszer nagyobb érzékenységet, megbízhatóságot és mérési tartományt nyújt összehasonlítva
más alternatív génexpressziós módszerekkel (Bustin 2000., Peixoto és mtsai. 2004.).
Hangsúlyozni kell azonban, hogy az ezzel a módszerrel nyert adatok csupán
pillanatfelvételek arról, hogy az adott mRNS-ből mennyi található az adott időpontban, az adott
67
sejtben, embrióban, vagy szöveti mintában. Amellett, hogy az értelmezhető eredmények
megszületéséhez precízen kell megtervezni a kísérletet és kiértékelni a mért adatokat, a
szabályozó RNS-ek, fehérjék mennyiségéről, aktivitásáról, és lehetőség szerint a metabolizmus
funkcióinak méréséről, valamint az epigenetikai változásokról nyert információkat is szükséges
hozzátenni a változó mRNS szintekből történő minden további biológiai következtetés
levonásához, diagnosztikai jelzőként való alkalmazásához (Taylor és mtsai. 2003.; Nolan és
mtsai. 2006.b).
A protokoll ellenőrzése során jelentős egyedi különbségeket tudtam kimutatni a
négysejtes egér embriók blasztomer sejtjei között a Nanog és Pou5f1 expressziójában, valamint a
nyolcsejtes embrióknál a Nanog expressziójában. Hasonló vizsgálatokban korábban már találtak
különbségeket egyedi emberi blasztomer sejtekben a Pou5f1 expressziójában (Hansis és mtsai.
2001.). Mindkét gén a később kialakuló hólyagcsíra állapotú embrió belső sejtcsomójában (ICM)
kifejeződő transzkripciós faktor. Amennyiben következetesen tapasztalható az ICM specifikus
gének expressziós különbsége a blasztomer sejtek között, feltehető, hogy ezek a különbségek
nagyon korai jelei a sejtek egy bizonyos fejlődési irányban való elköteleződésének. Ehhez
hasonló következtetésekre jutottak mások is az egérben, melyben a különbségek okainak térbeli
polaritásokat feltételeznek. Ennek bizonyítása azonban további kutatásokat igényel (Zernicka-
Goetz 2002.).
5.2 Mélyhűtés
A mélyhűtés hatására előidézett molekuláris változások ismeretének hiányosságait tártam
fel különböző stádiumú egér embriókban két különböző vitrifikációs módszer
összehasonlításával (vitrifikáció szilárd felületen (SSV) és műszalmában (ISV)). Az ISV
módszernél az egysejtes embriókban megemelkedett expressziós aktivitást tapasztaltam a
különböző stressz válaszban szerepet játszó vizsgált géneknél a felmelegítést követően 3 órával.
Ezek a különbségek eltűntek 10 órára, valamint később a hólyagcsíra állapotban. Érdekessége,
hogy az eljárás képes volt már az embrionális genom aktiváció előtt is gyors, kiugró
génexpressziót indukálni, mely aztán hamar lecsengett. Ezek a változások korai jelei lehetnek az
ISV-n átesett embriók csökkent életképességének. A nyolcsejtes embriók esetében nem találtam
ilyen egyértelmű összefüggéseket. Ennek okai lehetnek, hogy a 8 blasztomer sejt sokkal
összetettebb rendszert képez, melyben az egyedi sejtek is eltérően reagálhatnak, kiegyenlítve
egymás expressziós aktivitását, és hogy ilyenkor már az embrionális genom teljes aktivitással
működik. Több gén bevonásával, esetleg az egyedi sejtek vizsgálatával tovább lehet finomítani
az eredményeket. Az SSV embriók morfológiailag nem különböztek a kontrollhoz képest, a
68
génexpresszióban mégis észleltem finom különbségeket. Összehasonlítva a két mélyhűtési
módszert az SSV hatására kevésbé változott a különböző stressz gének expressziója és a
morfológiai, életképességbeli megfigyelések alapján is ez bizonyult hatékonyabbnak.
A referenciának választott háztartási gén (Actb) mérési eredménye arra mutat, hogy az
ISV hatással volt az expressziójára. Elképzelhető, hogy közvetve kihatott a gén szintű reakcióra
is a nagy mennyiségben alkalmazott krioprotektáns anyag a sejtek vázszerkezetének
befolyásával. Az irodalomban többen leírták például az Actb és a Gapdh alkalmatlanságát, mint
referencia gén (Radonić és mtsai. 2004.). Ebből levonható a következtetés, miszerint az Actb gén
nem megfelelő referencia az embrió mélyhűtési vizsgálatokban, és több más háztartási gén
vizsgálata is szükséges a legalkalmasabb(ak) kiválasztásához.
5.3 Egér embriók tenyésztése és a parthenogenetikus aktiválás
Az egérben a kétsejtes embrióban zajlik le az EGA, ezért a korai és késői kétsejtes
stádiumok különválasztásával a várható génexpressziós aktivitás változások is nyomon
követhetőek. Érdekes, eddig nem vizsgált megfigyelést tettem, miszerint a korai és késői
kétsejtes stádiumok között a legtöbb háztartási gén aktivitása is jelentősen változik az egér
embrióban. E mögött az a jelenség áll, hogy az anyai RNS-eket felváltják az embrió genomjáról
átíródó RNS-ek. Különösen fontos ezért a két stádium elkülönített vizsgálata, hogy az ilyenkor is
stabil referencia géneket ki lehessen választani.
A tenyésztési körülményeknek a génexpressziós mintázatra gyakorolt hatása régóta
ismert (Rinaudo és Schultz 2004.), azonban a háztartási génekre ilyen kiterjedten és egyedi,
különböző stádiumú embriókon még nem vizsgálták egyszerre in vivo, in vitro tenyésztésben és
parthenogenetikus aktiválásban is. A hólyagcsírák között talált szignifikáns különbségeket
részben magyarázza, hogy az in vitro és parthenogenetikus hólyagcsírák sejtszáma is
alacsonyabb volt. További összehasonlító vizsgálatokra van szükség azonban, hogy ennek a
pontosabb biológiai okai feltáruljanak.
A parthenogenetikus aktiválás nem váltott ki nagy hatást a különböző háztartási gének
expressziójára a korai egyedfejlődés során. A nyolcsejtes állapotban szinte azonos mintázatot
mutatott, mint az in vivo embrióké, ugyanakkor az in vitro tenyésztés önmagában is magasabb
expressziót eredményezett. Elsőként írtam le a parthenogenetikusan aktivált embriók
génexpressziójának vizsgálatát. Az aktiváció a testi sejtes klónozási eljárásnak (SCNT) is fontos
része, így az eredmények megfelelő kontrollként szolgálhatnak a későbbiekben.
A vizsgálat alapján sikerült kiválasztani három olyan stabilan expresszáló referencia gént
69
(H2afz, Hprt1 és Ppia), amelyek viszonylag állandó szinten fejeződnek ki a különböző
stádiumokban, beleértve a korai és késői kétsejtes állapotokat is, valamint az in vivo, in vitro és
parthenogenetikusan aktivált embriókban. Nagy előnye a megbízhatóságot tekintve, hogy egyedi
embriókban mértem a gének expresszióját. Hasonló vizsgálatokat végeztek már egéren, de
egyikben sem vállalkoztak ilyen kiterjedt és részletes elemzésre (Jeong és mtsai. 2005.; Willems
és mtsai. 2006.). A három legstabilabb gén expressziós értékei alapján kiszámoltam azokat a
normalizációs faktor értékeket, melyekkel elvégezhető a vizsgált gének normalizálása. Fontos
hangsúlyozni, hogy ezeket az értékeket csak abban az esetben lehet felhasználni a
kiértékelésekben, ha ugyanezeket a módszereket, protokollt, ugyanezen embrió stádiumokat és
tenyésztési körülményeket alkalmazták. A gyakran referenciának használt Actb gén mutatkozott
a legkevésbé stabilnak, melyet alátámaszt a korábban leírt mélyhűtési kísérletben tapasztalt
expressziós változás is.
5.4 Nyúl embriók egyedfejlődése és tenyésztése
A korábban egérben elvégzett referencia gének kiválasztásának mintájára a nyúlban is
hasonlóképpen jártam el. Ezidáig ilyen vizsgálatot - egyszerre 10 referencia gén, 7 stádiumon, in
vivo és in vitro egyedi embriókban - nem végeztek el annak ellenére, hogy a normalizáláshoz
megfelelő helyes referencia génekre nagy szükség van. A nyúlban a nyolcsejtes embrióban zajlik
le az EGA, ezért itt a korai és késői nyolcsejtes stádiumok különválasztása volt indokolt. Az
egérnél tapasztalt jelenséget itt is tapasztaltam, mely szerint több háztartási gén a legalacsonyabb
expressziót az EGA alatt mutatta, vagyis a nyolcsejtes állapotban.
A két tenyésztési csoportban mért génexpressziós stabilitási értékek hasonlósága alapján
feltehető, hogy az in vitro körülmények nagyon jól közelítik az in vivo állapotot, illetve a nyúl
embriók kevésbé érzékenyek az in vitro tenyésztési eltérésekre a háztartási gének
expressziójának vonatkozásában. Érdekes eredményt adott az Actb gén, mely az in vivo
mintákban stabil, ellenben az in vitro mintákban az egyik legkevésbé stabil volt. Ez ismét felveti,
hogy mint azt korábban az egérnél is tapasztaltam, az Actb gén a nyúlban sem alkalmas
referenciának a különböző kezelések során. Ennek biológiai okainak kiderítése a jövőben
tervezett. A három választott referencia gén (H2afz, Hprt1 és Ywhaz) mért expressziós értékeiből
kiszámolhatók a normalizációs faktor értékek, melyek általánosan felhasználhatók a jövőben
nyúlon végzendő génexpressziós vizsgálatokban.
Munkám során sikerült először azonosítani a két gént (Pou5f1 és Nanog) nyúlban, majd
meghatározni a Pou5f1 gén expressziójának szövet és fejlődési stádium specifikus mintázatát. Az
70
embriókban kapott eredményből látszik, hogy a petesejtből származó mRNS mennyisége
lecsökkent a nyolcsejtes állapotra és az ekkor lezajló EGA alatt maradt a legalacsonyabb szinten,
majd már az embrió genomjáról szintetizálódva újra emelkedett. Nagyon hasonlít az
irodalomban található, emberben (Abdel-Rahman és mtsai. 1995., Cauffman és mtsai. 2005.),
egérben (Pan és mtsai. 2002.) és szarvasmarhában (van Eijk és mtsai. 1999.) leírt expressziós
mintázatokra, mely további igazolást ad a referencia gének helytállóságához, a génexpressziós
protokoll megerősítéséhez is. A feltételezett Pou5f1 cDNS részlet az összehasonlító szekvencia
elemzések alapján a többi fajban leírt hasonló génekkel mutatott csak hasonlóságot, a DNS kötő
POU doménen belül (Pan és mtsai. 2002.). Időközben az emberi genom projekt kiterjesztése más
fajokra, többek között a nyúlra is, felgyorsította a nyúlon, mint modellállaton végzett kutatások
ütemét és leírták a Pou5f1 teljes szekvenciáját is a nyúl genom szekvenálás eredményeként (Shi
és mtsai. 2008.). Az általam leírt szekvencia összehasonlításakor teljes egyezést mutatott vele,
mely megerősítette a Pou5f1 gén azonosítását. A Nanog szekvenciánál egérben és emberben
nemrég leírt pszeudogének jelenlétéből eredő ellentmondások miatt a további vizsgálatokat
felfüggesztettem (Booth és Holland 2004.).
A nyúlon folytatott embriológiai kísérleteim úttörő jellegűek, jelenleg igen csekély
információ áll rendelkezésre a nyúl embrió preimplantációs fejlődését irányító gének
expressziójáról. Közvetlen felhasználója a kutatócsoport nyúl klónozási csoportja, ahol a sejtmag
átültetéses kísérletekből nyert klónozott embriók fejlődési potenciáljának elemzéseben
nélkülözhetetlenek a kapott eredmények. Továbbiakban célom a két gén teljes kódoló régiójának
molekuláris klónozása, a szekvencia meghatározása, valamint az általuk kódolt fehérjék nyúl
embrióban mutatott aktivitásának in situ hibridizációval történő vizsgálata. Várakozásaim szerint
eredményeim a pluripotencia kialakításában szerepet játszó gének és mechanizmusok jobb
megértéséhez vezetnek. Hosszabb távon pedig a csoport által végzett molekuláris biológiai
kutatás fontos eredményekkel szolgálhat az orvosbiológiai és biotechnológiai tudományok
számára.
5.5 Egér és szarvasmarha összehasonlítása
A szarvasmarhában leírt, választott gének expressziós mintázata jól követte a várt kisebb
és embrionális genom aktiváció eseményeit. Ugyanez az egérben kevéssé volt szembetűnő.
Ennek egyik magyarázata lehet, hogy a kiválasztott gének fajspecifikus expressziós különbségeit
sikerült kimutatni. Másrészről az egér esetében nehezebb szétválasztani a két genom aktivációt,
mivel az EGA korán, már a kétsejtes állapotban lezajlik, így az egysejtes állapotban lehet csak a
kisebb genom aktivációt kimutatni. Itt további, különböző időpontokban kinyert egysejtes
71
embriókat is bevonok a vizsgálatba, melyek mérése és kiértékelése jelenleg még folyik.
Az egyedfejlődés korai szakaszában az egyes fajok közötti különbségek jelentősek
lehetnek a génexpresszió, és a molekuláris szintű újraprogramozódás folyamatainak
vonatkozásában is. A kérődzők és az egér génexpressziós mintázata közti különbségek
természetének és következményeinek feltárására nem csak a haszonállatok tenyésztése, hanem
az ember egyedfejlődésének jobb, nagy testű emlősökön való modellezése tekintetében is
szükség van. A szarvasmarha embriók egyedfejlődése több vonatkozásban is sokkal inkább
hasonlít az emberéhez, mint az egéré, például a petesejt érésének időzítése, és ciklikus
természete, az embrionális genom késői aktivációja, a magzat fiziológiája és fejlődése, a hosszú
terhesség, és az ikerterhesség (Taylor és mtsai. 2003.). Ezért felvethető, hogy az egér általánosan
mégsem használható modell szervezetként. A szarvasmarhán (kérődzőkön) végzett
génexpressziós vizsgálatok lényegesen informatívabbak az emberben hasonlóan lejátszódó
folyamatok modellezésére. Ellenben alátámasztják az egér használhatóságát azok a jelenlegi,
emberi genomban tárolt információ „lefordítására” irányuló kezdeményezések a betegségek
nagyon pontos modellezéséhez, melyek során az egér összes génjének funkcióját jellemzik
mutagenezissel, molekuláris vizsgálatokkal és fenotipizálással. Ezek az egerek olyan
biogyógyászati kísérletekbe vonhatók majd be, amelyek beteg embereken nem lennének
lehetségesek (Rosenthal és Brown 2007.). Az ilyen és ehhez hasonló fajok közti
összehasonlítások hozzájárulnak továbbá az egyedfejlődési folyamatok evolúciós változásainak
megértéséhez is.
5.6 Hiszton kód szabályozása
Először sikerült részletesen meghatározni az összes eddig ismert hiszton-deacetiláz és
néhány fontosabb hiszton acetil-transzferáz gén expressziós mintázatát az egér preimplantációs
egyedfejlődése alatt, különös hangsúllyal a korai és késői kétsejtes állapotok közt lezajló EGA-
ra. Az eredmények érdekessége, hogy szinte mindegyik gén aktívan jelen volt már a petesejtben
is, és a különböző gének jellegzetes expressziós mintázatokat mutattak. Különösen a HDAC
gének közül többnek az expressziója is fokozódott a kisebb genom aktivációban, másik
részüknek pedig csak a embrionális genom aktiváció alatt volt magas az expressziós szintje. Ez
arra enged következtetni, hogy a különböző HDAC gének jól szabályozottan, egymást váltva
töltik be funkciójukat a preimplantációs egyedfejlődés során. Elképzelhető, hogy funkcionálisan
gén fölösleg (redundancia) áll fenn, vagyis az egyik gén működésének meghibásodása esetén a
többi képes ellensúlyozni annak speciális szerepét. Ugyanakkor a HAT gének legtöbbje már a
petesejtben felhalmozva jelen volt, és később a fejlődés alatt nem expresszálódtak kivéve kettőt,
72
melyek az EGA alatt szintén aktív expressziós szintet mutattak.
Ismerve a hiszton-deacetiláz és hiszton acetil-transzferáz enzimek epigenetikai
újraprogramozódásban betöltött szerepét a kromatin és a nukleoszómák betömörítésén és
fellazításán keresztül, feltehetően fontos szabályozó funkciót látnak el a génexpresszióban és
végeredményben a normálisan működő embrionális genomot eredményezik. A teljes expressziós
mintázat leírása elősegíti a hiszton acetiláció szabályozásának megértését és ezáltal a kritikus
összetevők meghatározását az újraprogramozódás során.
Ehhez hasonló érdekes megfigyelést közöltek egy tanulmányban nemrégiben, miszerint a
petesejtben a hímivarsejt eredetű kromatinon a HAT aktivitás van túlsúlyban, ezzel szemben a
testi sejtből átültetett sejtmagban az ellenkezője, vagyis a HDAC dominál a HAT aktivitás fölött
(Yoshida és mtsai. 2007.). Ez azt jelzi, hogy a petesejt képes szabályozni a hiszton acetiláció
homeosztázisát a kétféle aktivitás egyensúlyának változtatásával. Mások mikrochip mérések és
génszabályozó hálózatok elemzésével jutottak arra a következtetésre, hogy az összes jelenlévő
HDAC közül csak a Hdac1-nek van központi szerepe az egérben kétsejtes állapotra jellemző
általános transzkripciós gátoltság kialakításában (Zeng és Schultz 2005.; Schultz 2005.). A
megkezdett kísérletek folytatása egyéb embrió technológiával előállított (például klónozott)
embriók bevonásával segíteni fog a jelenség pontosabb hátterének, szereplőinek feltárásában.
5.7 Gyakorlati felhasználás, távlatok
A fehérjék és nukleinsavak olyan kivételes tulajdonságokkal rendelkező anyagok,
amelyek kiválóan alkalmasak önszerveződő molekuláris rendszerek építésére. Érdemes ellesni az
élő szervezetektől a bennük található, alulról építkező, molekuláris nanotechnológiát használó
rendszerek szerveződési elveit, megfejteni működésük mechanizmusát, hogy ezután létre
lehessen hozni új nanoméretű biotechnológiai eszközöket, gyógyászati alkalmazásokat.
A preimplantációs egyedfejlődés során több olyan kritikus molekuláris esemény zajlik,
például az EGA és az első sejt differenciálódás, melyek mögött epigenetikai folyamatok állnak és
amelyekhez szorosan kapcsolódnak a gének expressziós változásai is. Ezek molekuláris szintű
vizsgálata és jellemzése segíteni fog a különböző módon előállított (in vitro tenyésztett,
mélyhűtött, parthenogenetikusan aktivált, klónozott) „mesterséges” embriók életképességének,
valamint a módszerek hatékonyságának javításában, a klónozási problémák megoldásában, a
rendellenes egyedfejlődés okainak feltárásában, betegségek alapokainak tisztázásában, és új
gyakorlati alkalmazásokban való felhasználásában. Az eredmények a szaporodásbiológiában és a
jövő gyógyászatában (klinikai felhasználásban, sejtterápiákban és a regeneráló gyógyításban),
73
valamint a gyógyszerkutatás és fejlesztés folyamatában hasznosulhatnak. A genomika, a
farmakogenetika alkalmazása, az új biotechnológiai kutatási módszerek és az adatbázisok
összekapcsolása ma már nem csupán új gyógyszer célpontok azonosításában kínál eredményekre
vezető, gyors előrejutási lehetőséget, hanem olyan új gyógyszer-hatóanyagok kifejlesztésében is,
amelyek a fejlődési rendellenességekben (mint például a szellemi visszamaradottság) és a rákos
elváltozásokban nélkülözhetetlen, megváltozott epigenetikai állapotokat okozó szabályozókat
céloznak meg. Ezáltal az új generációs, biztonságos és hatékony gyógyszerek kifejlesztése az
orvostudomány gyakorlatát tökéletesítik (Li 2002.; Shi és mtsai. 2003.; Roses 2005.).
Hazánkban a gödöllői kutatócsoport állított elő elsőként testi sejtből klónozott állatot.
Klonilla, a klónozott egér 2006. november 6-án született meg. Kézenfekvő, hogy a jövőben
számos epigenetikai újraprogramozódási folyamat és génexpressziós változás vizsgálata válik
lehetővé klónozott, különböző fejlődési stádiumú embriókon is, melyhez kész, teljesen
kidolgozott, validált molekuláris eszközrendszert sikerült felállítani. Ennek révén remélhetőleg
felgyorsul az emlősök egyedfejlődését szabályozó epigenetikai folyamatok megismerése.
A tudományos kihívás az egyedi molekulák szerepének leírásán túl az, hogy érthetővé
váljon a különböző fehérjék összeállása szabályozó komplexekké és hogy ezek a fehérje
komplexek hogyan célozzák meg a specifikus géneket és kromoszómális régiókat. A napjainkban
kezdődő poszt-genomikai, epigenomikai kutatások célja pedig megérteni a genom egészének
komplexitását, szerkezetét és rendszerként való működését (Mikkelsen és mtsai. 2007.; Barski és
mtsai. 2007.). Az értekezésben leírt eredmények minden bizonnyal hozzájárulnak majd ezeknek
az epigenomikai eredményeknek a finomításához és igazolásához is.
74
6. Következtetések
Az értekezésben leírt kísérletekből született új tudományos eredményeim röviden
összegyűjtve:
(1) Kidolgoztam egy teljes mennyiségi génexpressziós protokollt a primer tervezési
eljárástól kezdve az adatok helyes kiértékeléséig, mely az egyedi embriók között kimutatott
biológiai különbségeknél jóval alacsonyabb technikai hibája révén alkalmas egyedi sejtekből,
embriókból egyszerre 10-15 gén mRNS szintjének meghatározására is. Alkalmazásával lehetővé
válik a biológiai különbségek okainak felismerése, a génexpresszió finomabb különbségeinek
felfedése és az eredmények pontosabb statisztikai elemzése. A négy- és nyolcsejtes embriók
blasztomer sejtjei között jelentős expressziós különbségeket mutattam ki, melyek a bizonyos
fejlődési irányban való elköteleződésük korai jelei lehetnek.
(2) A két mélyhűtési módszer összehasonlításából kiderült, hogy a gyors fagyasztás
sokkal hatékonyabb szilárd felületen, mint műszalmában. A vizsgált gének expressziós
változásait sikerült összefüggésbe hozni az embriók morfológiai, és életképességben tapasztalt
eltéréseivel. Az egyéni embriók szintjén történő real-time RT-PCR módszer új lehetőséget nyújt a
mélyhűtés okozta molekuláris események megértéséhez, olyan kulcsfontosságú marker gének
azonosításához, melyek a mélyhűtési módszerek további fejlesztését segítik.
(3) Kimutattam, hogy az in vitro tenyésztésnek és a parthenogenetikus aktiválásnak
jelentős hatása van a háztartási gének expressziójára a preimplantációs egyedfejlődés során,
vagyis alapos körültekintéssel kell meghatározni minden kísérlet előtt a normalizáláshoz
alkalmazott legstabilabb referencia géneket a félrevezető következtetések levonásának elkerülése
érdekében. Az egér embriók esetében egységesen a H2afz, Hprt1 és Ppia géneket találtam
alkalmasnak a különböző preimplantációs stádiumokban.
(4) A nyúl embriókban a H2afz, Hprt1 és Ywhaz génekről sikerült igazolni, hogy
expressziójuk a legstabilabb a korai egyedfejlődés alatt az in vivo és in vitro mintákban.
Azonosítottam a Pou5f1 (Oct-4) transzkripciós faktort a nyúlban és igazoltam, hogy jelen van a
preimplantációs egyedfejlődése során hasonlóan más emlős fajokhoz.
(5) A szarvasmarhában és az egérben jelentős és feltehetőleg fajspecifikus génexpressziós
különbségeket sikerült kimutatni az embrionális genom aktivációhoz kapcsoltan, mely mutatja az
egér, mint modell állat korlátait. A különböző fajokból nyert génexpressziós mintázatok
összehasonlításából következtetni lehet a molekuláris szintű újraprogramozódás folyamatainak
eltéréseire, azok konzervált voltára, valamint az evolúciós változásokra is.
75
(6) A preimplantációs egyedfejlődés alatt több hiszton-deacetiláz és hiszton acetil-
transzferáz együttes expresszióját mutattam ki, mely arra világít rá, hogy nem csak egy-egy gén
felelős az újraprogramozódásért és az embrionális genom aktivációért, hanem feltehetőleg
közösen, egymást kiegészítve töltik be a szerepüket. A folyamat részletes megértéséhez még
további átfogó vizsgálatok szükségesek.
Összegzésül: A kutatócsoport általános céljaihoz sikerült megteremtenem a molekuláris
biológiai hátteret és információt nyerni a génexpressziós eszközrendszer segítségével több, az
embrió technológiákat támogató vizsgálatban. A munkám során elvégzett kísérletek eredményei
igazolják a felállított rendszer alapelveinek helyességét a többváltozós elemzésekre és
bizonyítékát adják a széles spektrumú alkalmazhatóságának. Nyilvánvaló azonban, hogy még
jelentős erőfeszítést igényel az emlősök egyedfejlődésében szerepet játszó epigenetikai
folyamatoknak, a betegségekben megnyilvánuló zavaruknak a megismerése, és mesterséges
befolyásolása.
Az újonnan létrehozott eszközökkel jelentős előrelépés várható, idézve a szakterület
úttörőjének véleményét (Vastag 2001.):
Sheep cloner Ian Wilmut recently said that for human cloning to succeed,
"we need a step as big as the one that produced Dolly".
If that step ever comes, it will likely involve the nascent field of epigenetics.
76
Köszönetnyilvánítás
Mindenekelőtt köszönöm családomnak kitartó támogatásukat: Feleségemnek, hogy
szívvel-lélekkel velem volt mindvégig, és mindhárom Gyerekemnek, akik időközben sorba
„bekapcsolódhattak” munkámba.
Köszönettel tartozom Dr. Dinnyés Andrásnak, vezetőmnek mind a kutatócsoportban
biztosított kutatási lehetőségek, mind a felelősségteljes feladat felvállalása tekintetében.
Külön megköszönöm Prof. Gráf Lászlónak, és az ELTE Biokémia Tanszékének, hogy
szakmai műhelyükben folytathattam tanulmányaimat és bár kísérletes munkámat Gödöllőn
végeztem, hozzájuk is ugyanolyan szervesen tartoztam.
Hálásan köszönöm a gödöllői Genetikai Újraprogramozás Csoport alapító tagjainak,
kutatótársaimnak, valamint a kutatócsoport külföldi partnereinek a kísérleti munkában nyújtott
mindennemű segítőkészségüket, név szerint: Dr. Adorján Márta, Dr. Balogh Emese, Bara
Sándorné, Dr. Bodó Szilárd, Deák Edit, Dr. Görhöny Botond, Kungl Györgyi, Polgár
Zsuzsanna, Táncos Zsuzsanna, különösen: Duangjai Boonkusol, Dr. Mamo Solomon, Lucie
Nemcova, Jiri Kanka, Joseph W. Carnwath.
Munkám létrejöttéhez nyújtott legmeghatározóbb támogatását külön megköszönöm
oktatóimnak: Tania Nolan, Vladimir Benes, Stephen A. Bustin, Mikael Kubista.
Köszönöm a „B.E.Sz.T.”-nek a lelkesítő háttér biztosítását:
Végezetül de nem utolsó sorban szeretném ajánlani jelen munkámat volt tanáraimnak,
Klotz Istvánnénak, Wittmayer Zsuzsannának, Bálint Miklósnak, és volt vezetőimnek, Olasz
Ferencnek, Csomor Katalinnak, Dr. Thaler Györgynek, akik tudtukon kívül segítettek a
doktori iskola megkezdéséhez. Megköszönöm nekik is közvetett hozzájárulásukat.
77
A Kárpátok tetején
Irodalomjegyzék
Abdel-Rahman B, Fiddler M, Rappolee D, Pergament E. 1995 Expression of transcription regulating genes in human preimplantation embryos. Hum Reprod.; 10(10):2787-92.
Adenot PG, Mercier Y, Renard JP, Thompson EM. 1997 Differential H4 acetylation of paternal and maternal chromatin precedes DNA replication and differential transcriptional activity in pronuclei of 1-cell mouse embryos. Development.; 124(22):4615-25.
Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002a DNA and Chromosomes (The Global Structure of Chromosomes); in Molecular Biology of the Cell (Fourth Edition, Garland Science) pp. 191-234.
Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002b Cell Chemistry and Biosynthesis (The Chemical Components of a Cell); How Cells Read the Genome: From DNA to Protein (From DNA to RNA); in Molecular Biology of the Cell (Fourth Edition, Garland Science) pp. 47-128.; pp. 299-374.
Alonso S, Minty A, Bourlet Y, Buckingham M. 1986 Comparison of three actin-coding sequences in the mouse; evolutionary relationships between the actin genes of warm-blooded vertebrates. J Mol Evol.; 23(1):11-22.
Altmann M, Müller PP, Pelletier J, Sonenberg N, Trachsel H. 1989 A mammalian translation initiation factor can substitute for its yeast homologue in vivo. J Biol Chem.; 264(21):12145-7.
Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. 1997 Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res.; 25(17):3389-402.
Antequera F. 2003 Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cell Mol Life Sci.; 60(8):1647-58.
Aoki F, Worrad DM, Schultz RM. 1997 Regulation of transcriptional activity during the first and second cell cycles in the preimplantation mouse embryo. Dev Biol.; 181(2):296-307.
Ayane M, Preuss U, Köhler G, Nielsen PJ. 1991 A differentially expressed murine RNA encoding a protein with similarities to two types of nucleic acid binding motifs. Nucleic Acids Res.; 19(6):1273-8.
Bachvarova R. 1985 Gene expression during oogenesis and oocyte development in mammals. Dev Biol; 1:453-524.
Barski A, Cuddapah S, Cui K, Roh TY, Schones DE, Wang Z, Wei G, Chepelev I, Zhao K. 2007 High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell.; 129(4):823-37.
Bartolomei MS, Bickmore AW. 2005 Editorial Hum Mol Genet.; 14 Spec No 1:R1-2.
Beard C, Li E, Jaenisch R. 1995 Loss of methylation activates Xist in somatic but not in embryonic cells. Genes Dev.; 9(19):2325-34.
Bengtsson M, Stahlberg A, Rorsman P, Kubista M. 2005 Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Res.; 15(10):1388-92.
Blewitt ME, Vickaryous NK, Paldi A, Koseki H, Whitelaw E. 2006 Dynamic reprogramming of DNA methylation at an epigenetically sensitive allele in mice. PLoS Genet.; 2(4):e49.
Board PG, Coggan M, Baker RT, Vuust J, Webb GC. 1992 Localization of the human UBC
78
polyubiquitin gene to chromosome band 12q24.3. Genomics.; 12(4):639-42.
Boiani M, Eckardt S, Scholer HR, McLaughlin KJ. 2002 Oct4 distribution and level in mouse clones: consequences for pluripotency. Genes Dev.; 16(10):1209-19.
Booth HA, Holland PW. 2004 Eleven daughters of NANOG. Genomics.; 84(2):229-38.
Braun RE. 2001 Packaging paternal chromosomes with protamine. Nat Genet.; 28:10-12.
Brown TA. 2002 Transcriptomes and Proteomes; in Genomes (2nd Edition, Wiley-Liss) pp. 69-92.
Bulfield G. 1978 Genetic variation in the activity of the histidine catabolic enzymes between inbred strains of mice: a structural locus for a cytosol histidine aminotransferase isozyme (Hat-1). Biochem Genet.; 16(11-12):1233-41.
Bustin SA, Nolan T. 2004 Chemistries; Instrumentation; The PCR Step; in A-Z of Quantitative PCR (Ed) Bustin SA. (International University Line Biotechnology Series, 5) pp. 215-278.; pp. 329-358.; pp. 397-438.
Bustin SA. 2000 Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol.; 25(2):169-93.
Bustin SA. 2002 Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol.; 29(1):23-39.
Bustin SA. 2004 Quantification of nucleic acids by PCR; in A-Z of Quantitative PCR (Ed) Bustin SA. (International University Line Biotechnology Series, 5) pp. 3-46.
Butte AJ, Dzau VJ, Glueck SB. 2001 Further defining housekeeping, or "maintenance," genes Focus on "A compendium of gene expression in normal human tissues". Physiol Genomics.; 7(2):95-6.
Carrozza MJ, Utley RT, Workman JL, Côté J. The diverse functions of histone acetyltransferase complexes. Trends Genet. 2003 Jun;19(6):321-9.
Cauffman G, Van de Velde H, Liebaers I, Van Steirteghem A. 2005 Oct-4 mRNA and protein expression during human preimplantation development. Mol Hum Reprod.; 11(3):173-81.
Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD, Lewis JL, Torres I. 1989 An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil.; 86(2):679-88.
Cheong HT, Kanagawa H. 1993a Assessment of cytoplasmic effects on the development of mouse embryonic nuclei transferred to enucleated zygotes. Theriogenology.; 39(2):451-61.
Cheong HT, Takahashi Y, Kanagawa H. 1993b Birth of mice after transplantation of early cell-cycle-stage embryonic nuclei into enucleated oocytes. Biol Reprod.; 48(5):958-63.
Cheung P, Lau P. 2005 Epigenetic regulation by histone methylation and histone variants. Mol Endocrinol.; 19(3):563-73.
Chrivia JC, Kwok RP, Lamb N, Hagiwara M, Montminy MR, Goodman RH. 1993 Phosphorylated CREB binds specifically to the nuclear protein CBP. Nature.; 365(6449):855-9.
Clegg KB, Piko L. 1983 Poly(A) length, cytoplasmic adenylation and synthesis of poly(A)+ RNA in early mouse embryos. Dev Biol.; 95(2):331-41.
Cleveland DW, Lopata MA, MacDonald RJ, Cowan NJ, Rutter WJ, Kirschner MW. 1980 Number and evolutionary conservation of alpha- and beta-tubulin and cytoplasmic beta- and gamma-actin genes using specific cloned cDNA probes. Cell.; 20(1):95-105.
79
Coleman DL. 1962 Effect of genic substitution on the incorporation of tyrosine into the melanin of mouse skin. Arch Biochem Biophys.; 96:562-8.
Creagan R, Tischfield J, Ricciuti F, Ruddle FH. 1973 Chromosome assignments of genes in man using mouse-human somatic cell hybrids: mitochondrial superoxide dismutase (indophenol oxidase-B, tetrameric) to chromosome 6. Humangenetik.; 20(3):203-9.
Crew FAE, Mirskaia L. 1931 The character of "hairless" in the mouse. J Genet; 25:17-24
Crick F. 1970 Central dogma of molecular biology. Nature.; 227(5258):561-3.
de Ruijter AJ, van Gennip AH, Caron HN, Kemp S, van Kuilenburg AB. 2003 Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family. Biochem J.; 370(Pt 3):737-49.
DeRisi J, Penland L, Brown PO, Bittner ML, Meltzer PS, Ray M, Chen Y, Su YA, Trent JM. 1996 Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nat Genet.; 14(4):457-60.
Derry JM, Barnard PJ. 1989 Localisation of the Ccg-1. gene on the mouse X chromosome. Cytogenet Cell Genet.; 51:988.
Derry JM, Kerns JA, Francke U. 1995 RBM3, a novel human gene in Xp11.23 with a putative RNA-binding domain. Hum Mol Genet.; 4(12):2307-11.
Diachenko L, Lau YF, Campbell AP, Chenchik A, Mogadam F, Huang B, Lukyanov S, Lukyanov K, Gurskaya N, Sverdlov ED, Siebert D. 1996 Suppression Subtracive Hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.; 93(12): 6025-6030.
Dinnyes A, Dai Y, Jiang S, Yang X. 2000 High developmental rates of vitrified bovine oocytes following parthenogenetic activation, in vitro fertilization, and somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod.; 63(2):513-8.
Dinnyes A, De Sousa P, King T, Wilmut I. 2002 Somatic cell nuclear transfer: recent progress and challenges. Cloning Stem Cells.; 4(1):81-90.
Earle WR, Schilling EL, Stark TH, Straus NP, Brown MF, Sbelton E. 1943 Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Nat. Cancer Inst.; 4:165-212.
Eberharter A, Becker PB. 2002 Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. Second in review series on chromatin dynamics. EMBO Rep.; 3(3):224-9.
Eckert J, Niemann H. 1995 In vitro maturation, fertilization and culture to blastocysts of bovine oocytes in protein-free media. Theriogenology.; 43(7):1211-25.
Edashige K, Sakamoto M, Kasai M. 2000 Expression of mRNAs of the aquaporin family in mouse oocytes and embryos. Cryobiology.; 40(2):171-5.
Edwards RG. 2003 Aspects of the molecular regulation of early mammalian development. Reprod Biomed Online.; 6(1):97-113.
Elowitz MB, Levine AJ, Siggia ED, Swain PS. 2002 Stochastic gene expression in a single cell Science.; 297(5584):1183-6.
Engels WR. 1993 Contributing software to the internet: the Amplify program. Trends Biochem Sci.; 18(11):448-50.
FDA: A Risk-Based Approach to Evaluate Animal Clones and Their Progeny (http://www.fda.gov/cvm/CloningRA_ChapterIV.htm)
80
Fiering S, Whitelaw E, Martin DI. 2000 To be or not to be active: the stochastic nature of enhancer action. Bioessays.; 22(4):381-7.
Fuks F. 2005 DNA methylation and histone modifications: teaming up to silence genes. Curr Opin Genet Dev.; 15(5):490-5.
Gal AB, Carnwath JW, Dinnyes A, Herrmann D, Niemann H, Wrenzycki C. 2006 Comparison of real-time polymerase chain reaction and end-point polymerase chain reaction for the analysis of gene expression in preimplantation embryos. Reprod Fertil Dev.; 18(3):365-371.
Gilbert SF. 2006 The early development of vertebrates: Fish, birds, and mammals; in Developmental Biology (Eighth Edition, Sinauer Associates, Inc., Publishers) pp. 325-372.
Graves KH, Moreadith RW. 1993 Derivation and characterization of putative pluripotential embryonic stem cells from preimplantation rabbit embryos. Mol Reprod Dev.; 36(4):424-33.
Greider CW. 1990 Telomeres, telomerase and senescence. Bioessays.; 12(8):363-9.
Grunstein M. 1997 Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature.; 389(6649):349-52.
Gutierrez-Adan A, Behboodi E, Murray JD, Anderson GB. 1997 Early transcription of the SRY gene by bovine preimplantation embryos. Mol Reprod Dev.; 48(2):246-50.
Handschumacher RE, Harding MW, Rice J, Drugge RJ, Speicher DW. 1984 Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for cyclosporin A. Science.; 226(4674):544-7.
Hansis C, Tang YX, Grifo JA, Krey LC. 2001 Analysis of Oct-4 expression and ploidy in individual human blastomeres. Mol Hum Reprod.; 7(2):155-61.
Harlow GM, Quinn P. 1982 Development of preimplantation mouse embryos in vivo and in vitro. Aust J Biol Sci.; 35(2):187-93.
Hartmann CH, Klein CA. 2006 Gene expression profiling of single cells on large-scale oligonucleotide arrays. Nucleic Acids Res.; 34(21):e143.
Hartshorn C, Anshelevich A, Wangh LJ. 2005 Rapid, single-tube method for quantitative preparation and analysis of RNA and DNA in samples as small as one cell. BMC Biotechnol.; 5(1):2.
Hartshorn C, Rice JE, Wangh LJ. 2003 Differential pattern of Xist RNA accumulation in single blastomeres isolated from 8-cell stage mouse embryos following laser zona drilling. Mol Reprod Dev.; 64(1):41-51.
Hayashi S, Yang J, Christenson L, Yanagimachi R, Hecht NB. 2003 Mouse preimplantation embryos developed from oocytes injected with round spermatids or spermatozoa have similar but distinct patterns of early messenger RNA expression. Biol Reprod.; 69(4):1170-6.
Hoffert KA, Anderson GB, Wildt DE, Roth TL. 1997 Transition from maternal to embryonic control of development in IVM/IVF domestic cat embryos. Mol Reprod Dev.; 48(2):208-15.
Holliday R. 2005 DNA methylation and epigenotypes. Biochemistry (Mosc).; 70(5):500-4.
Hubbard TJ, Aken BL, Beal K, Ballester B, Caccamo M, Chen Y, Clarke L, Coates G, Cunningham F, Cutts T, Down T, Dyer SC, Fitzgerald S, Fernandez-Banet J, Graf S, Haider S, Hammond M, Herrero J, Holland R, Howe K, Howe K, Johnson N, Kahari A, Keefe D, Kokocinski F, Kulesha E, Lawson D, Longden I, Melsopp C, Megy K, Meidl P, Ouverdin B, Parker A, Prlic A, Rice S, Rios D, Schuster M, Sealy I, Severin J, Slater G, Smedley D, Spudich G, Trevanion S, Vilella A, Vogel J, White S, Wood M, Cox T, Curwen V, Durbin R, Fernandez-Suarez XM, Flicek P, Kasprzyk A, Proctor G, Searle S, Smith J, Ureta-Vidal A, Birney E. 2007 Ensembl 2007. Nucleic Acids Res.; 35(Database issue):D610-7.
81
Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A. 2005 Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes Immun.; 6(4):279-84.
Jaenisch R, Bird A. 2003 Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet.; 33 Suppl:245-54.
Jenuwein T, Allis CD. 2001 Translating the histone code. Science.; 293(5532):1074-80.
Jeong BC, Hong CY, Chattopadhyay S, Park JH, Gong EY, Kim HJ, Chun SY, Lee K. 2004 Androgen receptor corepressor-19 kDa (ARR19), a leucine-rich protein that represses the transcriptional activity of androgen receptor through recruitment of histone deacetylase. Mol Endocrinol.; 18(1):13-25.
Jeong YJ, Choi HW, Shin HS, Cui XS, Kim NH, Gerton GL, Jun JH. 2005 Optimization of real time RT-PCR methods for the analysis of gene expression in mouse eggs and preimplantation embryos. Mol Reprod Dev.; 71(3):284-9.
Jones PA, Takai D. 2001 The role of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science.; 293(5532):1068-70.
Kamme F, Erlander MG. 2003 Global gene expression analysis of single cells. Curr Opin Drug Discov Devel.; 6(2):231-6.
Kanka J. 2003 Gene expression and chromatin structure in the pre-implantation embryo. Theriogenology.; 59(1):3-19.
Kao HY, Downes M, Ordentlich P, Evans RM. 2000 Isolation of a novel histone deacetylase reveals that class I and class II deacetylases promote SMRT-mediated repression. Genes Dev.; 14(1):55-66.
Kao HY, Lee CH, Komarov A, Han CC, Evans RM. 2002 Isolation and characterization of mammalian HDAC10, a novel histone deacetylase. J Biol Chem.; 277(1):187-93.
Kasai M, Komi JH, Takakamo A, Tsudera H, Sakurai T, Machida T. 1990 A simple method for mouse embryo cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J Reprod Fertil.; 89(1):91-7.
Kawai J, Shinagawa A, Shibata K, Yoshino M, Itoh M, Ishii Y, Arakawa T, Hara A, Fukunishi Y, Konno H, Adachi J, Fukuda S, Aizawa K, Izawa M, Nishi K, Kiyosawa H, Kondo S, Yamanaka I, Saito T, Okazaki Y, Gojobori T, Bono H, Kasukawa T, Saito R, Kadota K, Matsuda H, Ashburner M, Batalov S, Casavant T, Fleischmann W, Gaasterland T, Gissi C, King B, Kochiwa H, Kuehl P, Lewis S, Matsuo Y, Nikaido I, Pesole G, Quackenbush J, Schriml LM, Staubli F, Suzuki R, Tomita M, Wagner L, Washio T, Sakai K, Okido T, Furuno M, Aono H, Baldarelli R, Barsh G, Blake J, Boffelli D, Bojunga N, Carninci P, de Bonaldo MF, Brownstein MJ, Bult C, Fletcher C, Fujita M, Gariboldi M, Gustincich S, Hill D, Hofmann M, Hume DA, Kamiya M, Lee NH, Lyons P, Marchionni L, Mashima J, Mazzarelli J, Mombaerts P, Nordone P, Ring B, Ringwald M, Rodriguez I, Sakamoto N, Sasaki H, Sato K, Schönbach C, Seya T, Shibata Y, Storch KF, Suzuki H, Toyo-oka K, Wang KH, Weitz C, Whittaker C, Wilming L, Wynshaw-Boris A, Yoshida K, Hasegawa Y, Kawaji H, Kohtsuki S, Hayashizaki Y; RIKEN Genome Exploration Research Group Phase II Team and the FANTOM Consortium. 2001 Functional annotation of a full-length mouse cDNA collection. Nature.; 409(6821):685-90.
Kayano T, Fukumoto H, Eddy RL, Fan YS, Byers MG, Shows TB, Bell GI. 1988 Evidence for a family of human glucose transporter-like proteins. Sequence and gene localization of a protein expressed in fetal skeletal muscle and other tissues. J Biol Chem.; 263(30):15245-8.
82
Khochbin S, Verdel A, Lemercier C, Seigneurin-Berny D. 2001 Functional significance of histone deacetylase diversity. Curr Opin Genet Dev.; 11(2):162-6.
Kidder GM. 2002 Trophectoderm development and function: the roles of Na+/K(+)-ATPase subunit isoforms. Can J Physiol Pharmacol.; 80(2):110-5.
Ko MS, Kitchen JR, Wang X, Threat TA, Wang X, Hasegawa A, Sun T, Grahovac MJ, Kargul GJ, Lim MK, Cui Y, Sano Y, Tanaka T, Liang Y, Mason S, Paonessa PD, Sauls AD, DePalma GE, Sharara R, Rowe LB, Eppig J, Morrell C, Doi H. 2000 Large-scale cDNA analysis reveals phased gene expression patterns during preimplantation mouse development. Development.; 127(8):1737-49.
Ko MS. 2004 Embryogenomics of pre-implantation mammalian development: current status. Reprod Fertil Dev.; 16(2):79-85.
Kozak LP, McLean GK, Eicher EM. 1974 X linkage of phosphoglycerate kinase in the mouse. Biochem Genet.; 11(1):41-7.
Kreuzer KA, Lass U, Landt O, Nitsche A, Laser J, Ellerbrok H, Pauli G, Huhn D, Schmidt CA. 1999 Highly sensitive and specific fluorescence reverse transcription-PCR assay for the pseudogene-free detection of beta-actin transcripts as quantitative reference. Clin Chem.; 45(2):297-300.
Kurdistani SK, Tavazoie S, Grunstein M. 2004 Mapping global histone acetylation patterns to gene expression. Cell.; 117(6):721-33.
Kurimoto K, Yabuta Y, Ohinata Y, Ono Y, Uno KD, Yamada RG, Ueda HR, Saitou M. 2006 An improved single-cell cDNA amplification method for efficient high-density oligonucleotide microarray analysis. Nucleic Acids Res.; 34(5):e42.
Kuznetsov VA, Knott GD, Bonner RF. 2002 General statistics of stochastic process of gene expression in eukaryotic cells. Genetics.; 161(3):1321-32.
Larionov A, Krause A, Miller W. 2005 A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics.; 6(1):62.
Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. 2007 Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics.; 23(21):2947-8.
Lechniak D. 2002 Quantitative aspect of gene expression analysis in mammalian oocytes and embryos. Reprod Biol.; 2(3):229-41.
Levsky JM, Singer RH. 2003 Gene expression and the myth of the average cell. Trends Cell Biol.; 13(1):4-6.
Li E, Beard C, Jaenisch R. 1993 Role for DNA methylation in genomic imprinting. Nature.; 366(6453):362-5.
Li E. 2002 Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development. Nat Rev Genet.; 3(9):662-73.
Lighten AD, Hardy K, Winston RM, Moore GE. 1997 Expression of mRNA for the insulin-like growth factors and their receptors in human preimplantation embryos. Mol Reprod Dev.; 47(2):134-9.
Livak KJ, Schmittgen TD. 2001 Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods.; 25(4):402-8.
Livak KJ. 1997 ABI Prims 7700 Sequencer detection system. User bulletin 2. PE Applied Biosystems: 1-36.
83
Lowe DG, Moran LA. 1986 Molecular cloning and analysis of DNA complementary to three mouse Mr = 68,000 heat shock protein mRNAs. J Biol Chem.; 261(5):2102-12.
Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. 1997 Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature.; 389(6648):251-60.
Mahlknecht U, Bucala R, Verdin E. 1999 Assignment of the histone deacetylase gene (Hdac3) to mouse chromosome 18B3 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet.; 84(3-4):192-3.
Mann MR, Bartolomei MS. 2002 Epigenetic reprogramming in the mammalian embryo: struggle of the clones. Genome Biol.; 3(2):REVIEWS1003.
Marmorstein R, Roth SY. 2001 Histone acetyltransferases: function, structure, and catalysis. Curr Opin Genet Dev.; 11(2):155-61.
Mathews DH, Disney MD, Childs JL, Schroeder SJ, Zuker M, Turner DH. 2004 Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proc Natl Acad Sci U S A.; 101(19):7287-92.
McGraw S, Robert C, Massicotte L, Sirard MA. 2003 Quantification of histone acetyltransferase and histone deacetylase transcripts during early bovine embryo development. Biol Reprod.; 68(2):383-9.
Memili E, First NL. 2000 Zygotic and embryonic gene expression in cow: a review of timing and mechanisms of early gene expression as compared with other species. Zygote.; 8(1):87-96.
Mikkelsen TS, Ku M, Jaffe DB, Issac B, Lieberman E, Giannoukos G, Alvarez P, Brockman W, Kim TK, Koche RP, Lee W, Mendenhall E, O'Donovan A, Presser A, Russ C, Xie X, Meissner A, Wernig M, Jaenisch R, Nusbaum C, Lander ES, Bernstein BE. 2007 Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature.;448(7153):553-60.
Misawa K, Nosaka T, Morita S, Kaneko A, Nakahata T, Asano S, Kitamura T. 2000 A method to identify cDNAs based on localization of green fluorescent protein fusion products. Proc Natl Acad Sci U S A.; 97(7):3062-6.
Missero C, Serra C, Stenn K, Dotto GP. 1993 Skin-specific expression of a truncated E1a oncoprotein binding to p105-Rb leads to abnormal hair follicle maturation without increased epidermal proliferation. J Cell Biol.; 121(5):1109-20.
Mitalipov SM, White KL, Farrar VR, Morrey J, Reed WA. 1999 Development of nuclear transfer and parthenogenetic rabbit embryos activated with inositol 1,4,5-trisphosphate. Biol Reprod.; 60(4):821-7.
Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, Segawa K, Murakami M, Takahashi K, Maruyama M, Maeda M, Yamanaka S. 2003 The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell.; 113(5):631-42.
Morgan HD, Santos F, Green K, Dean W, Reik W. 2005 Epigenetic reprogramming in mammals. Hum Mol Genet.; 14 Spec No 1:R47-58.
Mullis KB, Faloona FA. 1987 Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol.; 155:335-50.
Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003a Summary of mouse development; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 31-140.
Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003b Cryopreservation, rederivation,
84
and transport of mice; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 599-628.
Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003c Parthenogenesis, pronuclear transfer, and mouse cloning; Assisted reproduction: ovary transplantation, in vitro fertilization, artificial insemination, and intracytoplasmic sperm injection; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 541-564.; pp. 565-598.
Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003d Appendix 1: Buffers and Solutions; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 725-734.
Nicolson GL, Yanagimachi R, Yanagimachi H. 1975 Ultrastructural localization of lectin-binding sites on the zonae pellucidae and plasma membranes of mammalian eggs. J Cell Biol.; 66(2):263-74.
Niemann H, Wrenzycki C, Lucas-Hahn A, Brambrink T, Kues WA, Carnwath JW. 2002 Gene expression patterns in bovine in vitro-produced and nuclear transfer-derived embryos and their implications for early development. Cloning Stem Cells.; 4(1):29-38.
Nightingale KP, O'Neill LP, Turner BM. 2006 Histone modifications: signalling receptors and potential elements of a heritable epigenetic code. Curr Opin Genet Dev.; 16(2):125-36.
Nishiyama H, Itoh K, Kaneko Y, Kishishita M, Yoshida O, Fujita J. 1997 A glycine-rich RNA-binding protein mediating cold-inducible suppression of mammalian cell growth. J Cell Biol.; 137(4):899-908.
Nolan T, Hands RE, Bustin SA 2006b Quantification of mRNA using real-time RT-PCR Nat Protoc.; 1(3):1559-82.
Nolan T, Hands RE, Ogunkolade W, Bustin SA. 2006a SPUD: a quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations. Anal Biochem.; 351(2):308-10.
Oren M, Levine AJ. 1983 Molecular cloning of a cDNA specific for the murine p53 cellular tumor antigen. Proc Natl Acad Sci U S A.; 80(1):56-9.
Owen DJ, Ornaghi P, Yang JC, Lowe N, Evans PR, Ballario P, Neuhaus D, Filetici P, Travers AA. 2000 The structural basis for the recognition of acetylated histone H4 by the bromodomain of histone acetyltransferase gcn5p. EMBO J.; 19(22):6141-9.
Palmieri SL, Peter W, Hess H, Scholer HR. 1994 Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev Biol.; 166(1):259-67.
Pan GJ, Chang ZY, Schöler HR, Pei D. 2002 Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4. Cell Res.; 12(5-6):321-9.
Pantaleon M, Harvey MB, Pascoe WS, James DE, Kaye PL. 1997 Glucose transporter GLUT3: ontogeny, targeting, and role in the mouse blastocyst. Proc Natl Acad Sci U S A.; 94(8):3795-800.
Peixoto A, Monteiro M, Rocha B, Veiga-Fernandes H. 2004 Quantification of multiple gene expression in individual cells. Genome Res.; 14(10A):1938-47.
Peterson CL, Laniel MA. 2004 Histones and histone modifications. Curr Biol.; 14(14):R546-51.
Pettersen EF, Goddard TD, Huang CC, Couch GS, Greenblatt DM, Meng EC, Ferrin TE. 2004 UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem.; 25(13):1605-12.
85
Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. 2002 Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res.; 30(9):e36.
Pfaffl MW. 2001 A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res.; 29(9):e45.
Piko L, Clegg KB. 1982 Quantitative changes in total RNA, total poly(A), and ribosomes in early mouse embryos. Dev Biol.; 89(2):362-78.
Pravtcheva D, Rabin M, Bartolomei M, Corden J, Ruddle FH. 1986 Chromosomal assignment of gene encoding the largest subunit of RNA polymerase II in the mouse. Somat Cell Mol Genet.; 12(5):523-8.
Quevillon S, Mirande M. 1996 The p18 component of the multisynthetase complex shares a protein motif with the beta and gamma subunits of eukaryotic elongation factor 1. FEBS Lett.; 395(1):63-7.
Quivy V, Calomme C, Dekoninck A, Demonte D, Bex F, Lamsoul I, Vanhulle C, Burny A, Van Lint C. 2004 Gene activation and gene silencing: a subtle equilibrium. Cloning Stem Cells.; 6(2):140-9.
Radonić A, Thulke S, Mackay IM, Landt O, Siegert W, Nitsche A. 2004 Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun.; 313(4):856-62.
Rall WF, Fahy GM. 1985 Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification. Nature.; 313(6003):573-5.
Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. 2003 Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci Lett.; 339(1):62-6.
Ran Q, Pereira-Smith OM. 2000 Identification of an alternatively spliced form of the Tat interactive protein (Tip60), Tip60(beta). Gene.; 258(1-2):141-6.
Raser JM, O'Shea EK. 2005 Noise in gene expression: origins, consequences, and control. Science.; 309(5743):2010-3.
Rasmussen R. 2001 Quantification on the LightCycler; in Rapid Cycle Real-time PCR, Methods and Applications (eds) Meuer S, Wittwer C, Nakagawara K. (Springer Press, Heidelberg) pp. 21-34.
Reik W, Santos F, Dean W. 2003 Mammalian epigenomics: reprogramming the genome for development and therapy. Theriogenology.; 59(1):21-32.
Rinaudo P, Schultz RM. 2004 Effects of embryo culture on global pattern of gene expression in preimplantation mouse embryos. Reproduction.; 128(3):301-11.
Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT. 1997 Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem.; 245(2):154-60.
Rosenthal N, Brown S. 2007 The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol.; 9(9):993-9.
Roses AD. 2005 Applying technologies towards safe and effective medicines. Biotechniques.;39(4):563-4.
Roth WW, Bragg PW, Corrias MV, Reddy NS, Dholakia JN, Wahba AJ. 1987 Expression of a gene for mouse eucaryotic elongation factor Tu during murine erythroleukemic cell differentiation. Mol Cell Biol.; 7(11):3929-36.
86
Ruddle FH, Roderick TH. 1968 Allelically-determined isozyme polymorphisms in laboratory populations of mice. Ann N Y Acad Sci.; 151(1):531-9.
Rudenko L, Matheson JC, Sundlof SF. 2007a Animal cloning and the FDA--the risk assessment paradigm under public scrutiny. Nat Biotechnol.; 25(1):39-43.
Rudenko L, Matheson JC. 2007b The US FDA and animal cloning: risk and regulatory approach. Theriogenology.; 67(1):198-206.
Sakkas D, Batt PA, Cameron AW. 1989 Development of preimplantation goat (Capra hircus) embryos in vivo and in vitro. J Reprod Fertil.; 87(1):359-65.
Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001a Appendix 1: Preparation of Reagents and Buffers Used in Molecular Cloning; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. A1.1
Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001b In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 8.1-8.113.
Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001c Gel Electrophoresis of DNA and Pulsed-field Agarose Gel Electrophoresis; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 5.1-5.86.
Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001d Plasmids and Their Usefulness in Molecular Cloning; Preparation and Analysis of Eukaryotic Genomic DNA; Appendix 8: Commonly Used Techniques in Molecular Cloning; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 1.1-1.162.; pp. 6.1-6.62.; pp. A8.1
Santoro R, Li J, Grummt I. 2002 The nucleolar remodeling complex NoRC mediates heterochromatin formation and silencing of ribosomal gene transcription. Nat Genet.; 32(3):393-6.
Santos F, Dean W. 2004 Epigenetic reprogramming during early development in mammals. Reproduction.; 127(6):643-51.
Scarano MI, Strazzullo M, Matarazzo MR, D'Esposito M. 2005 DNA methylation 40 years later: Its role in human health and disease. J Cell Physiol.; 204(1):21-35.
Schmittgen TD, Zakrajsek BA, Mills AG, Gorn V, Singer MJ, Reed MW. 2000 Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods. Anal Biochem.; 285(2):194-204.
Schöler HR, Hatzopoulos AK, Balling R, Suzuki N, Gruss P. 1989 A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germline-specific expression of an Oct factor. EMBO J.; 8(9):2543-50.
Schuettengruber B, Simboeck E, Khier H, Seiser C. 2003 Autoregulation of mouse histone deacetylase 1 expression. Mol Cell Biol.; 23(19):6993-7004.
Schultz GA. 1986 Molecular bioology of the early mouse embryo. Biol Bull.; 171: 291-309.
Schultz RM. 2002 The molecular foundations of the maternal to zygotic transition in the preimplantation embryo. Hum Reprod Update.; 8(4):323-31.
Schultz RM. 2005 From egg to embryo: a peripatetic journey. Reproduction.; 130(6):825-8.
Selander RK, Hunt WG, Yang SY. 1969 Protein polymorphism and genie heterozygosity in two European subspecies of the house mouse. Evolution.; 23:379-90.
87
Seshagiri PB, McKenzie DI, Bavister BD, Williamson JL, Aiken JM. 1992 Golden hamster embryonic genome activation occurs at the two-cell stage: correlation with major developmental changes. Mol Reprod Dev.; 32(3):229-35.
Shi JJ, Cai DH, Chen XJ, Sheng HZ. 2008 Cloning and characterization of the rabbit POU5F1 gene. DNA Seq.; 19(1):56-61.
Shi W, Zakhartchenko V, Wolf E. 2003 Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer. Differentiation.; 71(2):91-113.
Sittman DB, Graves RA, Marzluff WF. 1983 Structure of a cluster of mouse histone genes. Nucleic Acids Res.; 11(19):6679-97.
Skern R, Frost P, Nilsen F. 2005 Relative transcript quantification by quantitative PCR: roughly right or precisely wrong? BMC Mol Biol.; 6(1):10.
Smith CM, Haimberger ZW, Johnson CO, Wolf AJ, Gafken PR, Zhang Z, Parthun MR, Gottschling DE. 2002 Heritable chromatin structure: mapping "memory" in histones H3 and H4. Proc Natl Acad Sci U S A.; 99 Suppl 4:16454-61.
Sonna LA, Fujita J, Gaffin SL, Lilly CM. 2002 Invited review: Effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. J Appl Physiol.; 92(4):1725-42.
Stahlberg A, Kubista M, Pfaffl M. 2004 Comparison of reverse transcriptases in gene expression analysis. Clin Chem.; 50(9):1678-80.
Steuerwald N, Cohen J, Herrera RJ, Brenner CA. 1999 Analysis of gene expression in single oocytes and embryos by real-time rapid cycle fluorescence monitored RT-PCR. Mol Hum Reprod.; 5(11):1034-9.
Strahl BD, Allis CD. 2000 The language of covalent histone modifications. Nature.; 403(6765):41-5.
Strausberg RL, Feingold EA, Grouse LH, Derge JG, Klausner RD, Collins FS, Wagner L, Shenmen CM, Schuler GD, Altschul SF, Zeeberg B, Buetow KH, Schaefer CF, Bhat NK, Hopkins RF, Jordan H, Moore T, Max SI, Wang J, Hsieh F, Diatchenko L, Marusina K, Farmer AA, Rubin GM, Hong L, Stapleton M, Soares MB, Bonaldo MF, Casavant TL, Scheetz TE, Brownstein MJ, Usdin TB, Toshiyuki S, Carninci P, Prange C, Raha SS, Loquellano NA, Peters GJ, Abramson RD, Mullahy SJ, Bosak SA, McEwan PJ, McKernan KJ, Malek JA, Gunaratne PH, Richards S, Worley KC, Hale S, Garcia AM, Gay LJ, Hulyk SW, Villalon DK, Muzny DM, Sodergren EJ, Lu X, Gibbs RA, Fahey J, Helton E, Ketteman M, Madan A, Rodrigues S, Sanchez A, Whiting M, Madan A, Young AC, Shevchenko Y, Bouffard GG, Blakesley RW, Touchman JW, Green ED, Dickson MC, Rodriguez AC, Grimwood J, Schmutz J, Myers RM, Butterfield YS, Krzywinski MI, Skalska U, Smailus DE, Schnerch A, Schein JE, Jones SJ, Marra MA; Mammalian Gene Collection Program Team. 2002 Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. Proc Natl Acad Sci U S A.; 99(26):16899-903.
Suen KL, Bustelo XR, Barbacid M. 1995 Lack of evidence for the activation of the Ras/Raf mitogenic pathway by 14-3-3 proteins in mammalian cells. Oncogene.; 11(5):825-31.
Surani MA, Barton SC, Norris ML. 1984 Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature.; 308(5959):548-50.
Taylor J, Fairburn H, Beaujean N, Meehan R, Young L. 2003 Gene expression in the developing embryo and fetus. Reprod Suppl.; 61:151-65.
Telford NA, Watson AJ, Schultz GA. 1990 Transition from maternal to embryonic control in early mammalian development: a comparison of several species. Mol Reprod Dev.;
88
26(1):90-100.
Tichopad A, Dilger M, Schwarz G, Pfaffl MW. 2003 Standardized determination of real-time PCR efficiency from a single reaction set-up. Nucleic Acids Res.; 31(20):e122.
Tsunaka Y, Kajimura N, Tate S, Morikawa K. 2005 Alteration of the nucleosomal DNA path in the crystal structure of a human nucleosome core particle. Nucleic Acids Res.; 33(10):3424-34.
Tsunoda Y, Kato Y. 1998 Not only inner cell mass cell nuclei but also trophectoderm nuclei of mouse blastocysts have a developmental totipotency. J Reprod Fertil.; 113(2):181-4.
Turner BM. 2000 Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays.; 22(9):836-45.
Vajta G. 2000 Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals. Anim Reprod Sci.; 60-61:357-64.
van Eijk MJ, van Rooijen MA, Modina S, Scesi L, Folkers G, van Tol HT, Bevers MM, Fisher SR, Lewin HA, Rakacolli D, Galli C, de Vaureix C, Trounson AO, Mummery CL, Gandolfi F. 1999 Molecular cloning, genetic mapping, and developmental expression of bovine POU5F1. Biol Reprod.; 60(5):1093-103.
Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. 2002 Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol.; 3(7):RESEARCH0034.
Vastag B. 2001 Epigenetics is seen as possible key to cloning. JAMA.; 286(12):1438-40.
Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. 1995 Serial analysis of gene expression. Science.; 270(5235):484-7.
Verdel A, Khochbin S. 1999 Identification of a new family of higher eukaryotic histone deacetylases. Coordinate expression of differentiation-dependent chromatin modifiers. J Biol Chem.; 274(4):2440-5.
Verschure PJ, van der Kraan I, de Leeuw W, van der Vlag J, Carpenter AE, Belmont AS, van Driel R. 2005 In vivo HP1 targeting causes large-scale chromatin condensation and enhanced histone lysine methylation. Mol Cell Biol.; 25(11):4552-64.
Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R. 1998 Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature.; 394(6691):369-74.
Walker NJ. 2002 Tech.Sight. A technique whose time has come. Science.; 296(5567):557-9.
Willems E, Mateizel I, Kemp C, Cauffman G, Sermon K, Leyns L. 2006 Selection of reference genes in mouse embryos and in differentiating human and mouse ES cells. Int J Dev Biol.;50(7):627-35.
Wilmut I, Beaujean N, de Sousa PA, Dinnyes A, King TJ, Paterson LA, Wells DN, Young LE. 2002 Somatic cell nuclear transfer. Nature.; 419(6907):583-6.
Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. 1997 Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature.; 385(6619):810-3.
Winston F, Allis CD. 1999 The bromodomain: a chromatin-targeting module? Nat Struct Biol.; 6(7):601-4.
Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, Rasmussen RP. 1997 Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques.; 22(1):130-1, 134-8.
Wrenzycki C, Herrmann D, Carnwath JW, Niemann H. 1998 Expression of RNA from
89
developmentally important genes in preimplantation bovine embryos produced in TCM supplemented with BSA. J Reprod Fertil.; 112(2):387-98.
Xu W, Edmondson DG, Roth SY. 1998 Mammalian GCN5 and P/CAF acetyltransferases have homologous amino-terminal domains important for recognition of nucleosomal substrates. Mol Cell Biol.; 18(10):5659-69.
Yang W, Musci TS, Mansour SL.1997 Trapping genes expressed in the developing mouse inner ear. Hear Res.; 114(1-2):53-61.
Yang WM, Inouye C, Zeng Y, Bearss D, Seto E. 1996 Transcriptional repression by YY1 is mediated by interaction with a mammalian homolog of the yeast global regulator RPD3. Proc Natl Acad Sci U S A.; 93(23):12845-50.
Yoshida N, Brahmajosyula M, Shoji S, Amanai M, Perry AC. 2007 Epigenetic discrimination by mouse metaphase II oocytes mediates asymmetric chromatin remodeling independently of meiotic exit. Dev Biol.; 301(2):464-77.
Zeng F, Baldwin DA, Schultz RM. 2004 Transcript profiling during preimplantation mouse development. Dev Biol.; 272(2):483-96.
Zeng F, Schultz RM. 2005 RNA transcript profiling during zygotic gene activation in the preimplantation mouse embryo. Dev Biol.; 283(1):40-57.
Zernicka-Goetz M. 1994 Activation of embryonic genes during preimplantation rat development. Mol Reprod Dev.; 38(1):30-5.
Zernicka-Goetz M. 2002 Patterning of the embryo: the first spatial decisions in the life of a mouse. Development.; 129(4):815-29.
Zhang CL, McKinsey TA, Lu JR, Olson EN. 2001 Association of COOH-terminal-binding protein (CtBP) and MEF2-interacting transcription repressor (MITR) contributes to transcriptional repression of the MEF2 transcription factor. J Biol Chem.; 276(1):35-9.
Zhang J, Desai M, Ozanne SE, Doherty C, Hales CN, Byrne CD. 1997 Two variants of quantitative reverse transcriptase PCR used to show differential expression of alpha-, beta- and gamma-fibrinogen genes in rat liver lobes. Biochem J.; 321 (Pt 3):769-75.
Zhang K, Sridhar VV, Zhu J, Kapoor A, Zhu JK. 2007 Distinctive Core Histone Post-Translational Modification Patterns in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE.; 2(11):e1210.
Zhang X, Kidder GM, Zhang C, Khamsi F, Armstrong DT. 1994 Expression of plasminogen activator genes and enzymatic activities in rat preimplantation embryos. J Reprod Fertil.; 101(1):235-40.
Zheng P, Patel B, McMenamin M, Paprocki AM, Schramm RD, Nagl NG Jr, Wilsker D, Wang X, Moran E, Latham KE. 2004 Expression of genes encoding chromatin regulatory factors in developing rhesus monkey oocytes and preimplantation stage embryos: possible roles in genome activation. Biol Reprod.; 70(5):1419-27.
Zhu X, Chang KH, He D, Mancini MA, Brinkley WR, Lee WH. 1995 The C terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem.; 270(33):19545-50.
90
Függelékek
I. Hiszton módosítások és funkcióik
A napjainkig leírt és ismert hiszton módosításokat és a hozzájuk rendelt feltételezett
funkciókat a 6. táblázat tartalmazza.
Hiszton Aminosav Módosítás Feltételezett funkcióH2A S1 P Mitózis
K5 Ac Transzkripció aktiválásaK9 Ac Transzkripció aktiválásaK119 U SpermiogenezisT120 P Mitózis
H2AX S139 P DNS hibajavításH2B K5 Ac Transzkripció aktiválása
K12 Ac Transzkripció aktiválásaS14 P Programozott sejthalálK15 Ac Transzkripció aktiválásaK20 Ac Transzkripció aktiválásaS32 P Programozott sejthalálK120 U Meiózis
H3 T3 P MitózisK4 Ac Transzkripció aktiválásaK4 Me Aktív eukromatin (tri-Me), transzkripció elongáció/memória (tri-Me), transzkripció aktiválásaK9 Ac Hiszton depozíció, transzkripció aktiválásaK9 Me Géncsöndesítés (tri-Me), DNS metiláció (tri-Me), imprintingS10 P Mitózis, meiózis, transzkripció aktiválásaT11 P MitózisK14 Ac Transzkripció aktiválása, DNS hibajavítás, transzkripció elongációR17 Me Transzkripció aktiválásaK18 Ac Transzkripció aktiválása, DNS hibajavítás, DNS replikációK23 Ac Transzkripció aktiválása, DNS hibajavításK27 Ac Transzkripció aktiválásaK27 Me Géncsöndesítés, X kromoszóma inaktiváció (tri-Me)S28 P MitózisK36 Me Transzkripció elongáció, géncsöndesítés?K79 Me Aktív eukromatin, transzkripció elongáció/memória? U Spermiogenezis
H4 S1 P MitózisR3 Me Transzkripció aktiválásaK5 Ac Hiszton depozíció, transzkripció aktiválása, DNS hibajavításK8 Ac Transzkripció aktiválása, DNS hibajavításK12 Ac Hiszton depozíció, telomer csöndesítés, transzkripció aktiválása, DNS hibajavításK16 Ac Transzkripció aktiválása, DNS hibajavításK20 Me Géncsöndesítés (mono-Me)K59 Me Géncsöndesítés?
6. táblázat: Az ismert hiszton módosítások.
Ac: acetiláció, Me: metiláció, P: foszforiláció, U: ubiquitináció.
91
II. Egy sejt RNS tartalma
Egy tipikus emlős sejt 10-30 pg RNS-t tartalmaz, mely nem több mint a sejt egészének 1
%-a. A többsége, mint a transzfer RNS (tRNS) és riboszómális RNS (rRNS) nem tartozik a
fehérjéket kódoló hírvivő RNS-ekhez (mRNS), melynek mennyisége csupán 1-5 %-ot tesz ki,
függően a sejt típusától és fiziológiás állapotától (39. ábra). Ez körülbelül 360000 molekulának
felel meg, mely 12000 különböző génről íródik át, átlagosan 10-100 példányban vannak jelen és
átlagos méretük 1900 nukleotid (7. táblázat). Egyes mRNS-ek a teljes mRNS tartalomnak a 3 %-
át is kiteszik (gyakoriak), míg a nagy hányaduk nem éri el a 0,01 %-ot sem (8. táblázat). Ezek a
ritka mRNS molekulák csupán 1-10 példányban találhatóak meg a sejtekben, de 11000-féle gén
termékei és összességében az mRNS állomány 45 %-át alkotják (Alberts és mtsai 2002.b)
Totál RNS 10-30 pg
rRNS (28S, 18S, 5S) 80-85 %
tRNS, snRNS, alacsony molekulasúlyú RNS-ek
10-15 %
mRNS (átlagos méret: 1900 nukleotid)
2 (1–5) % (360000 (200000-2000000) darab)
7. táblázat: Egy tipikus emlős sejt RNS tartalma.
Csoport Darab/sejt (gyakoriság)
mRNS féleség/sejt
Ritka <30 (<0,004 %) >11000
Közepes 100-500 (<0,1 %) 500-1000
Gyakori >10000 (<3 %) <10
8. táblázat: Az mRNS-ek megoszlása a gyakoriságuk alapján.
Ettől az átlagos megközelítéstől nagymértékben eltérhet a preimplantációs állapotú
embrió sejtek RNS tartalma. Folytatva az egér példáján, a petesejttől hólyagcsíra stádiumig
meghatározták egy embrió mRNS és totál RNS mennyiségét is: 9. táblázat (Piko és Clegg 1982.,
Clegg és Piko 1983.).
Stádium RNS mennyiség mRNS darabszám
petesejt 0,35-0,43 ng 17000000 (20 pg)
egysejtes nincs adat 24000000
kétsejtes 0,24 ng 7000000
szedercsíra (8-16 sejt) 0,69 ng 13000000
hólyagcsíra (32 sejt) 1,47 ng 34000000
13 napos embrió 450 µg (13 µg)
9. táblázat: Különböző fejlődési stádiumú egér embriók RNS-tartalma.
92
39. ábra: Az RNS-ek megoszlása.
Zölddel az eukarióta, kékkel a bakteriális, pirossal a közös RNS fajták vannak jelölve; snRNS: kis sejtmagi RNS; snoRNS: kis sejtmagvacskában található RNS; scRNS: kis citoplazmatikus RNS; tmRNS: transzfer-hírvivő RNS. (Forrás: Brown 2002.)
III. A vizsgált gének szekvencia adatai
A szekvencia adatokat külön csoportosítottam egérre (10. táblázat), szarvasmarhára (11.
táblázat) és nyúlra (12. táblázat).
Gén rövid neve
Ensembl gén azonosító (kromoszóma: pozíció)
Ensembl mRNS azonosító (NCBI referencia szekvencia)
mRNS hossza (nukleotid)/exonok száma/fehérje hossza (aminosav)
Actb ENSMUSG00000029580 (5: 143,664,795-143,668,403)
ENSMUST00000031564 (NM_007393.3)
1889/6/375
Bmp7 ENSMUSG00000008999 (2: 172,695,191-172,765,794)
ENSMUST00000009143 (NM_007557.2)
1964/7/430
Cenpf ENSMUSG00000026605 (1: 191,464,495-191,511,965)
ENSMUST00000027900 (NM_001081363.1)
11093/19/2,98
Cirbp ENSMUSG00000045193 (10: 79,630,584-79,634,398)
ENSMUST00000105365 (NM_007705.2)
1258/7/172
Crebbp ENSMUSG00000022521 (16: 4,084,048-4,213,390)
ENSMUST00000023165 (NM_001025432.1)
7493/31/2441
Dazap2 ENSMUSG00000000346 (15: 100,446,057-100,451,162)
ENSMUST00000000356 (NM_011873.2)
1828/4/168
Eef1e1 ENSMUSG00000001707 (13: 38,737,567-38,750,897)
ENSMUST00000001757 (NM_025380.2)
1032/4/174
Eif1a ENSMUSG00000057561 (18: 46,757,358-46,769,862)
ENSMUST00000078079 (NM_010120.4)
2862/3/144
Eif4e ENSMUSG00000028156 (3: 138,189,155-138,220,563)
ENSMUST00000029803 (NM_007917.3)
2882/8/217
Ep300 ENSMUSG00000055024 (15: 81,416,644-81,482,507)
ENSMUST00000068387 (NM_177821.6)
8749/31/2412
Gapdh ENSMUSG00000057666 (6: 125,111,872-125,115,613)
ENSMUST00000073605 (NM_008084.2)
1242/7/337
Gcn5l2 ENSMUSG00000020918 (11: 100,566,062-100,573,766)
ENSMUST00000006973 (NM_001038010.1; NM_020004.4)
3028/18/829
H2afz ENSMUSG00000037894 (3: 137,527,505-137,529,882)
ENSMUST00000041045 (NM_016750.2)
1011/5/128
Hat1 ENSMUSG00000027018 (2: 71,227,314-71,279,679)
ENSMUST00000028408 (NM_026115.3)
1579/11/416
Hdac1 ENSMUSG00000028800 (4: 129,193,348-129,219,890)
ENSMUST00000102597 (NM_008228.2)
1971/14/482
Hdac2 ENSMUSG00000019777 (10: 36,694,350-36,721,694)
ENSMUST00000019911 (NM_008229.2)
2004/14/488
Hdac3 ENSMUSG00000024454 (18: 38,096,625-38,114,642)
ENSMUST00000043498 (NM_010411.2)
2005/15/428
Hdac4 ENSMUSG00000026313 (1: 93,829,334-94,044,970)
ENSMUST00000008995 (NM_207225.1)
3952/26/910
Hdac5 ENSMUSG00000008855 (11: 102,057,063-102,091,486)
ENSMUST00000107152 (NM_001077696.1; NM_010412.3)
3796/27/1115
Hdac6 ENSMUSG00000031161 (X: 7,507,256-7,524,953)
ENSMUST00000033501 (NM_010413.2)
4006/29/1152
Hdac7 ENSMUSG00000022475 (15: 97,623,119-97,662,102)
ENSMUST00000088402 (NM_019572.2)
4120/24/938
93
Gén rövid neve
Ensembl gén azonosító (kromoszóma: pozíció)
Ensembl mRNS azonosító (NCBI referencia szekvencia)
mRNS hossza (nukleotid)/exonok száma/fehérje hossza (aminosav)
Hdac8 ENSMUSG00000067567 (X: 99,479,978-99,700,698)
ENSMUST00000087916 (NM_027382.3)
1936/11/377
Hdac9 ENSMUSG00000004698 (12: 34,737,166-35,213,213)
ENSMUST00000085463 (NM_024124.2)
3248/25/582
Hdac10 ENSMUSG00000062906 (15: 88,953,741-88,959,057)
ENSMUST00000082197 (NM_199198.1)
2335/20/666
Hdac11 ENSMUSG00000034245 (6: 91,106,798-91,124,682)
ENSMUST00000041736 (NM_144919.2)
2510/10/347
Hist2h2aa2 ENSMUSG00000063954 (3: 96,049,461-96,050,038)
ENSMUST00000074976 (NM_178212.1)
578/1/130
Hprt1 ENSMUSG00000025630 (X: 50,341,255-50,374,829)
ENSMUST00000026723 (NM_013556.2)
1341/9/218
Hspa1a ENSMUSG00000067283 (17: 35,106,945-35,108,873)
ENSMUST00000087328 (NM_010479.2)
1929/1/642
Htatip ENSMUSG00000024926 (19: 5,603,017-5,610,050)
ENSMUST00000025865 (NM_178637.1)
1964/14/513
Nanog ENSMUSG00000012396 (6: 122,657,611-122,664,651)
ENSMUST00000012540 (NM_028016.2)
2186/4/305
Pcaf ENSMUSG00000000708 (17: 53,706,296-53,812,045)
ENSMUST00000000724 (NM_020005.3)
4653/18/813
Polr2a ENSMUSG00000005198 (11: 69,547,612-69,571,795)
ENSMUST00000058470 (NM_009089.2)
6283/29/1970
Pou5f1 ENSMUSG00000024406 (17: 35,642,984-35,647,722)
ENSMUST00000025271 (NM_013633.2)
1346/5/352
Ppia ENSMUSG00000071866 (11: 6,315,782-6,319,796)
ENSMUST00000090749 (NM_008907.1)
810/5/164
Rbm3 ENSMUSG00000031167 (X: 7,720,398-7,722,862)
ENSMUST00000115620 (NM_016809.4)
579/6/154
Sfrs3 ENSMUSG00000071172 (17: 29,169,618-29,179,039)
ENSMUST00000037776 (NM_013663.4)
1294/6/164
Slc2a3 ENSMUSG00000003153 (6: 122,677,843-122,692,537)
ENSMUST00000032476 (NM_011401.3)
3717/10/493
Sod1 ENSMUSG00000022982 (16: 90,220,987-90,226,567)
ENSMUST00000023707 (NM_011434.1)
646/5/154
Sod2 ENSMUSG00000006818 (17: 13,200,705-13,210,985)
ENSMUST00000007012 (NM_013671.3)
3824/5/222
Taf1 ENSMUSG00000031314 (X: 98,728,098-98,794,864)
ENSMUST00000033676 (NM_001081008.1)
5739/38/1891
Tbp ENSMUSG00000014767 (17: 15,636,852-15,654,373)
ENSMUST00000080441 (NM_013684.2)
1656/7/260
Trp53 ENSMUSG00000059552 (11: 69,393,483-69,405,373)
ENSMUST00000108658 (NM_011640.2)
1742/11/390
Tubb4 ENSMUSG00000062591 (17: 57,219,489-57,227,205)
ENSMUST00000071135 (NM_009451.3)
2228/4/444
Ubc ENSMUSG00000008348 (5: 125,866,347-125,870,111)
ENSMUST00000091367 (NM_019639.4)
2109/2/658
10. táblázat: Egér szekvencia adatok. (Utoljára frissítve: 2008. április.)
94
Gén neve(Szarvasmarha gén
rövid neve)
Ensembl gén azonosító (kromoszóma: pozíció)
Ensembl mRNS azonosító (NCBI referencia
szekvencia)
mRNS hossz (nukleotid)/exon száma/
fehérje hossz (aminosav)
Cenpf - - (XM_612376.3) -
Dazap2 (NP_001029873.1)
ENSBTAG00000004349 (5: 27,873,627-27,877,833)
ENSBTAT00000002573 (NM_001034701.1)
1855/4/168
Eif1a - - (AF051848.1) -
Eif4e ENSBTAG00000007883 (26: 8,979,376-8,980,152)
ENSBTAT00000010367 (NM_174310.3)
654/4/217
Hist2h2aa2 (Q2VT23_BOVIN)
ENSBTAG00000032456 (3: 18,496,498-18,496,890)
ENSBTAT00000046028 (XM_001255499.1)
393/1/130
Sfrs3 (NP_001029872.1)
ENSBTAG00000003197 (5: 100,918,030-100,918,524)
ENSBTAT00000004154 (NM_001034700.1)
495/1/164
11. táblázat: Szarvasmarha szekvencia adatok. (Utoljára frissítve: 2008. április.)
Gén neve(Nyúl gén rövid neve)
Ensembl gén azonosító Ensembl mRNS azonosító (NCBI referencia
szekvencia)
mRNS hossz (nukleotid)/exon száma/
fehérje hossz (aminosav)
Actb - - (X60733) -
Eef1e1 (EEF1E1) ENSOCUG00000012587 ENSOCUT00000012580 (-)
297/2/99
G6pdx (G6PD) ENSOCUG00000007866 ENSOCUT00000007866 (-)
1302/12/434
Gapdh - - (NM_001082253.1) -
H2afz (H2AV_RABIT) ENSOCUG00000001888 ENSOCUT00000001883 (AF030235.1)
381/5/126
Hprt1 (O46381_RABIT) ENSOCUG00000003186 ENSOCUT00000003188 (AF020294.1)
657/10/218
Pgk1 (PGK1) ENSOCUG00000014726 ENSOCUT00000014723 (-)
1203/11/401
Polr2a (POLR2A) ENSOCUG00000017929 ENSOCUT00000017930 (-)
4950/42/1650
Pou5f1 (ENSOCUG00000017160)
ENSOCUG00000017160 ENSOCUT00000017155 (NM_001099957.1)
1083/6/360
Ppia (PPIA_RABIT) ENSOCUG00000016662 ENSOCUT00000016662 (AF139893.1)
426/5/142
Ywhaz (YWHAZ) ENSOCUG00000000734 ENSOCUT00000000734 (-)
738/6/245
12. táblázat: Nyúl szekvencia adatok. (Utoljára frissítve: 2008. április.)
95
IV. A nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának összehasonlítása
A nyúl embrió mintában kimutatott PCR termék szekvenciájának összevetése az NCBI
referencia szekvencia adatbázisával (Reference mRNA sequences) a BLASTN 2.2.18 program
segítségével (Basic BLAST: nucleotide blast: blastn (blastn)) a következő eredményre vezetett:
89 %-os hasonlóság az emberi Pou5f1 génnel, 88 %-os hasonlóság a csimpánz (Pan troglodytes)
és szarvasmarha Pou5f1 génnel, 84 %-os hasonlóság az egér és patkány Pou5f1 génnel (40. ábra)
(Altschul és mtsai. 1997.). Az így talált ortológ szekvenciák homológia viszonyait a CLUSTAL
2.0.5 multiple sequence alignment program segítségével (ClustalW2) lehetett meghatározni: 41.
ábra (Larkin és mtsai. 2007.).
________________________________________________________________________________NCBI/ BLAST/ blastn/ Job Title: Nucleotide sequence (385 letters)BLASTN 2.2.18 (Mar-02-2008) Database: NCBI Transcript Reference Sequences (1,381,018 sequences; 2,272,579,530 total letters)Length=385
Sequences producing significant alignments:
Accession Description Total score Max identgi|116235490|NM_203289.3
Homo sapiens POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), transcript variant 2, mRNA
517 89%
gi|114588002|XM_001135162.1
PREDICTED: Pan troglodytes similar to POU-type homeodomain-containing DNA-binding protein, transcript variant 2 (LOC735657), mRNA
499 88%
gi|27807048|NM_174580.1
Bos taurus POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), mRNA
493 88%
gi|125490391|NM_013633.2
Mus musculus POU domain, class 5, transcription factor 1 (Pou5f1), mRNA
421 84%
gi|57164004|NM_001009178.1
Rattus norvegicus POU domain, class 5, transcription factor 1 (Pou5f1), mRNA
421 84%
Alignments
>gi|116235490|ref|NM_203289.3| Homo sapiens POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), transcript variant 2, mRNALength=1155
GENE ID: 5460 POU5F1 | POU class 5 homeobox 1 [Homo sapiens](Over 10 PubMed links)
Score = 517 bits (572), Expect = 2e-144 Identities = 345/385 (89%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 1 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 60 ||||||||| |||||||||| ||||||||||| || |||||||| || || |||||||||Sbjct 396 CTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAG 455
Query 61 ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC 120 || |||||||| || ||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||| ||||||Sbjct 456 ATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAAC 515
Query 121 CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG 180 ||||||||||||||| ||||||| ||||||||||||||||||||||||| |||||||||Sbjct 516 CGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAG 575
Query 181 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT 240 ||||||||||||||||||||||| ||||||||||| || |||||||| ||||||||||||Sbjct 576 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGT 635
96
Query 241 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG 300 |||||||||||||||||||| ||||||||||| |||| | | ||||||||||||||||||Sbjct 636 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAG 695
Query 301 GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT 360 || | || ||||| ||| ||||||| || |||| ||||||||||| || |||||||||Sbjct 696 GCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCAT 755
Query 361 TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC 385 || ||||||||||||||||| ||||Sbjct 756 TTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCC 780
>gi|114588002|ref|XM_001135162.1| PREDICTED: Pan troglodytes similar to POU-type homeodomain-containing DNA-binding protein, transcript variant 2 (LOC735657), mRNALength=1392
GENE ID: 735657 POU5F1 | POU class 5 homeobox 1 [Pan troglodytes]
Score = 499 bits (552), Expect = 5e-139 Identities = 341/385 (88%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 1 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 60 ||||||||| |||||||||| |||||||| || || |||||||| || || |||||||||Sbjct 646 CTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGACGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAG 705
Query 61 ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC 120 || |||||||| || ||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||| ||||||Sbjct 706 ATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAAC 765
Query 121 CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG 180 ||||||||||||||| ||||||| |||||| |||||||||||||||||| |||||||||Sbjct 766 CGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCGGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAG 825
Query 181 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT 240 ||||||||||||||||||||||| ||||||||||| || |||||||| | ||||||||||Sbjct 826 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGCGTGGTTCTGT 885
Query 241 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG 300 |||||||||||||||||||| |||||||||||||||| | | ||||||||||||||||||Sbjct 886 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGTGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAG 945
Query 301 GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT 360 || | || ||| | ||| ||||||| || |||| ||||||||||| || |||||| ||Sbjct 946 GCTGCTGGGTCTTCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCTAT 1005
Query 361 TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC 385 || ||||||||||||||||| ||||Sbjct 1006 TTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCC 1030
>gi|27807048|ref|NM_174580.1| Bos taurus POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), mRNALength=1615
GENE ID: 282316 POU5F1 | POU class 5 homeobox 1 [Bos taurus](10 or fewer PubMed links)
Score = 493 bits (546), Expect = 2e-137 Identities = 337/380 (88%), Gaps = 0/380 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 1 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 60 |||||||||||||||||||| ||||||||||| || |||||||||||||| || ||||||Sbjct 898 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAATCTGCAGGAG 957
Query 61 ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC 120 || ||||| || |||||||| ||||||||||| ||||||||||| |||||||| ||||||Sbjct 958 ATATGCAAGGCAGAGACCCTTGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGGACGAGTATCGAGAAC 1017
Query 121 CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG 180 ||||||||||||||| |||||| ||||||||||||||||||||| ||||| |||||||| Sbjct 1018 CGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAGCATGTTCCTGCAGTGCCCGAAGCCCACCCTGCAGCAA 1077
Query 181 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT 240 || |||||||||||||||||||| ||||| ||||||||||||||||| |||||||| || Sbjct 1078 ATTAGCCACATCGCCCAGCAGCTCGGGCTGGAGAAAGACGTGGTCCGAGTGTGGTTTTGC 1137
97
Query 241 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG 300 ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| ||||||||||||Sbjct 1138 AACCGTCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTACTCCCAACGTGAGGATTTTGAG 1197
Query 301 GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT 360 || | || ||||| ||| ||||||| || | || | ||||||||| || |||||||||Sbjct 1198 GCTGCTGGGTCTCCTTTCACAGGGGGACCCGTATCCTCTCCTCTGGCGCCAGGGCCCCAT 1257
Query 361 TTCGGTACCCCAGGCTATGG 380 || |||||||||||||| ||Sbjct 1258 TTTGGTACCCCAGGCTACGG 1277
>gi|125490391|ref|NM_013633.2| Mus musculus POU domain, class 5, transcription factor 1 (Pou5f1), mRNALength=1346
GENE ID: 18999 Pou5f1 | POU domain, class 5, transcription factor 1[Mus musculus] (Over 100 PubMed links)
Score = 421 bits (466), Expect = 1e-115 Identities = 324/385 (84%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 1 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 60 ||||||||||||||| |||| ||||||||||| ||||||||||| |||||||||||||||Sbjct 638 CTGCGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCCGACAACAATGAGAACCTTCAGGAG 697
Query 61 ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC 120 || |||||| |||||||||| |||||||||||||||||||||||||| || |||||||||Sbjct 698 ATATGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAAC 757
Query 121 CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG 180 || ||||| | | |||||| |||||| ||| |||||||||| ||| | || ||||||Sbjct 758 CGTGTGAGGTGGAGTCTGGAGACCATGTTTCTGAAGTGCCCGAAGCCCTCCCTACAGCAG 817
Query 181 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT 240 |||| ||||||||| | ||||| ||||| ||||| || ||||| || || |||||||||Sbjct 818 ATCACTCACATCGCCAATCAGCTTGGGCTAGAGAAGGATGTGGTTCGAGTATGGTTCTGT 877
Query 241 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG 300 ||||||||||||||||||||| ||||||| | ||| | |||||||||||| || | ||||Sbjct 878 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAAAGATCAAGTATTGAGTATTCCCAACGAGAAGAGTATGAG 937
Query 301 GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT 360 || || || | || ||| |||||||| || | || ||||||||| | || || ||||| Sbjct 938 GCTACAGGGACACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTATCCTTTCCTCTGCCCCCAGGTCCCCAC 997
Query 361 TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC 385 || || |||||||||||||| ||||Sbjct 998 TTTGGCACCCCAGGCTATGGAAGCC 1022
>gi|57164004|ref|NM_001009178.1| Rattus norvegicus POU domain, class 5, transcription factor 1 (Pou5f1), mRNALength=1141
GENE ID: 294562 Pou5f1 | POU domain, class 5, transcription factor 1[Rattus norvegicus] (10 or fewer PubMed links)
Score = 421 bits (466), Expect = 1e-115 Identities = 324/385 (84%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 1 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 60 ||||||||||||||| |||| ||||||||||| || ||||||||||||||||||||||||Sbjct 577 CTGCGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 636
Query 61 ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC 120 || |||||| |||||||||| ||||||||||||||||||||||| || || |||||||||Sbjct 637 ATATGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGGACTAGCATTGAGAAC 696
Query 121 CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG 180 || ||||| | ||| ||||||||||||| |||||||||||||| ||| | |||||||||Sbjct 697 CGTGTGAGGTGGAACCTGGAGAACATGTTTCTGCAGTGCCCGAAGCCCTCCCTGCAGCAG 756
98
Query 181 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT 240 |||| ||| ||| ||||||| ||||| |||| || ||||| || ||||||||||||Sbjct 757 ATCACTAGCATTGCCAAGCAGCTTGGGCTGGAGAGGGATGTGGTTCGAGTGTGGTTCTGT 816
Query 241 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG 300 ||||||||||||||||| ||| |||| |||| ||| | |||||||||||| || | ||||Sbjct 817 AACCGGCGCCAGAAGGGGAAAAGATCGAGCATTGAATATTCCCAACGAGAAGAGTATGAG 876
Query 301 GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT 360 ||| | || || ||| |||||||| || |||| ||||||||| | || || ||||| Sbjct 877 GCCGCGGGGAAACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTGTCCTTTCCTCTGCCCCCAGGCCCCCAC 936
Query 361 TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC 385 || ||| | ||||||||||| ||||Sbjct 937 TTTGGTGCTCCAGGCTATGGGAGCC 961________________________________________________________________________________
40. ábra: A feltételezett nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának elemzése.
Az ábra rövidített és egyszerűsített formában mutatja az NCBI adatbázisban talált leghasonlóbb referencia szekvenciákat, és az illeszkedésüket.
________________________________________________________________________________ClustalW2 Results
Scores Table
SeqA Name Len(nt) SeqB Name Len(nt) Score===============================================================1 nyúl 385 2 ember 1417 89 1 nyúl 385 3 egér 1324 84 1 nyúl 385 4 patkány 1059 84 1 nyúl 385 5 szarvasmarha 1615 87 1 nyúl 385 6 csimpánz 1389 89 2 ember 1417 3 egér 1324 81 2 ember 1417 4 patkány 1059 83 2 ember 1417 5 szarvasmarha 1615 85 2 ember 1417 6 csimpánz 1389 99 3 egér 1324 4 patkány 1059 93 3 egér 1324 5 szarvasmarha 1615 78 3 egér 1324 6 csimpánz 1389 81 4 patkány 1059 5 szarvasmarha 1615 81 4 patkány 1059 6 csimpánz 1389 83 5 szarvasmarha 1615 6 csimpánz 1389 86 ===============================================================
Alignment
CLUSTAL 2.0.5 multiple sequence alignment
ember ------------------------------------------------------------csimpánz ------------------------------------------------------------nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GGAGCTGGAAGTGAAGGCCCGCATGGGGGACCTGCACCGAGAGTCTAGGAGTCTGGGGGC 60egér ------------------------------------------------------------patkány ------------------------------------------------------------
ember ------------------------------------------------------------csimpánz ------------------------------------------------------------nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha TGGAGAGGGGCCTGGGTGGAGATCCCTGGCTTTCCCCTTCCAGACACCACCGCCACCAGC 120egér ------------------------------------------------------------patkány ------------------------------------------------------------
ember ------------------------------------------------------------csimpánz ------------------------------------------------------------nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha AGGCAAACACCCTCCGCCTCAGTTTCTCCCACCCCCACGGTCCCTTCCCCCCACCCATCC 180egér ------------------------------------------------------------patkány ------------------------------------------------------------
99
ember ------------------------------------------------------------csimpánz ------------------------------------------------------------nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha AGGGGGCGGGGCCAGAGGTCAAGGCTAGTGGGTGGGATTGGGGAGGGAGAGAGGTGTTGA 240egér ------------------------------------------------------------patkány ------------------------------------------------------------
ember ----TCCCTTCGCAAGCCCTCATTTCACCAGGCCCCCGGCTTGGGGCGCCTTCCTTCCCC 56csimpánz -----------------CCTCATTTCACCAGGCCCCCGGCTTGGGGCGCCTTCCTTCCCC 43nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GCAGTCTCTAGGAGATCCCTCGTTTTCCTAGGCCCCCGGCTCGGGGTGCCTTCCTTCCCC 300egér -----------GTGAGCCGTCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTCGGGGTGCCCACCTTCCCC 49patkány ------------------------------------------------------------
ember ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGAT 116csimpánz ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGAT 103nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha ATGGCGGGACACCTCGCTTCTGACTTCGCCTTCTCGCCCCCGCCGGGCGGTGGAGGCGAT 360egér ATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTTCGCCTCCTCACCCCCACCAGG---TGGGGGTGAT 106patkány ATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTTCGCCTTCTCACCCCCACCTGG---TGGGGGTGAT 57
ember GGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGC 176csimpánz GGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGC 163nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GGGCCGGGAGGGCCAGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGATGAGCTTCCAAGGG 420egér GGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTGGGTGGATTCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAAGGG 166patkány GGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTGGGTGGACCCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAGGGG 117
ember CCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATT 236csimpánz CCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATT 223nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha CCTCCCGGTGGGTCGGGGATCGGGCCGGGGGTTGTGCCTGGCGCCGAGGTGTGGGGGCTT 480egér CCTCCAGGTGGGCCTGGAATCGGACCAGG------------CTCAGAGGTATTGGGGATC 214patkány CCTCCAAGTGGGCCTGGAATCGGACCAGG------------TTCAGAGGTGCTGGGGATC 165
ember CCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTT 296csimpánz CCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTT 283nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha CCCCCGTGCCCCCCGCCCTATGACTTGTGTGGAGGGATGGCCTACTGTGCGCCGCAGGTT 540egér TCCCCATGTCCGCCCGCATACGAGTTCTGCGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTT 274patkány TCCCCGTGTCCCCCAGCATACGAGTTCTGTGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTT 225
ember GGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGA 356csimpánz GGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGA 343nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GGAGTGGGGCCGGTGCCCCCAGGCGGCCTGGAGACCCCTCAGCCCGAGGGCGAGGCGGGA 600egér GGACTGGGCCTAGTCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTTTGCAGCCTGAGGGCCAGGCAGGA 334patkány GGACTGGGCCTAGTCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTCTGCAGCCCGAGGGCCAGGCAGGA 285
ember GTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGT 416csimpánz GTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGT 403nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GCCGGGGTGGAGAGCAACTCCGAGGGGGCCTCCCCGGACCCCTGCGCCGCACCCGCAGGC 660egér GCACGAGTGGAAAGCAACTCAGAGGGAACCTCCTCTGAGCCCTGTGCCGACCGCCCCAAT 394patkány GCACGAGTGGAGAGCAACTCGGAGGGAGCCTCCTCTGGGCCCTGTACTGCCCGCCCCAGC 345
ember GCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAA 476csimpánz GCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAA 463nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GCCCCGAAGCTGGACAAGGAGAAGCTGGAGCCGAACCCTGAGGAGTCCCAGGACATCAAA 720egér GCCGTGAAGTTGGAGAAGG------TGGAACCAACTCCCGAGGAGTCCCAGGACATGAAA 448patkány GCCGTGAAGTTGGAGAAGG------TGGAACCTAGTCCCGAGGAGTCCCAGGATATGAAA 399
ember GCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTG 536csimpánz GCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTG 523nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GCTCTTCAGAAAGACCTTGAACAATTTGCCAAGCTCCTAAAGCAGAAGAGGATCACACTA 780egér GCCCTGCAGAAGGAGCTAGAACAGTTTGCCAAGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCACCTTG 508patkány GCCCTGCAGAAGGAGCTAGAGCAGTTTGCCAAGCTGCTGAAACAGAAGAGGATCACCTTG 459
100
ember GGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGC 596csimpánz GGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGC 583nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GGATATACCCAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGC 840egér GGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCTCACCCTGGGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGC 568patkány GGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCTCACCCTGGGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGC 519
ember CAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTG 656csimpánz CAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTG 643nyúl ---------------------------------------------------------CTG 3szarvasmarha CAAACGACTATCTGCCGTTTTGAGGCTTTGCAGCTCAGTTTCAAGAACATGTGTAAGCTG 900egér CAGACCACCATCTGTCGCTTCGAGGCCTTGCAGCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGCTG 628patkány CAGACAACCATCTGCCGCTTCGAGGCCCTGCAGCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGCTG 579 ***
ember CGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATA 716csimpánz CGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATA 703nyúl CGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAGATT 63szarvasmarha CGGCCCCTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAATCTGCAGGAGATA 960egér CGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCCGACAACAATGAGAACCTTCAGGAGATA 688patkány CGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAACCTTCAGGAGATA 639 ****** ***** **** *********** ** ******** ** ** ** ********
ember TGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGA 776csimpánz TGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGA 763nyúl TGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAACCGA 123szarvasmarha TGCAAGGCAGAGACCCTTGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGGACGAGTATCGAGAACCGA 1020egér TGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAACCGT 748patkány TGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGGACTAGCATTGAGAACCGT 699 ***** * ** ***** *********** *********** ** ** ** ********
ember GTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATC 836csimpánz GTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATC 823nyúl GTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAGATC 183szarvasmarha GTGAGAGGCAACCTGGAGAGCATGTTCCTGCAGTGCCCGAAGCCCACCCTGCAGCAAATT 1080egér GTGAGGTGGAGTCTGGAGACCATGTTTCTGAAGTGCCCGAAGCCCTCCCTACAGCAGATC 808patkány GTGAGGTGGAACCTGGAGAACATGTTTCTGCAGTGCCCGAAGCCCTCCCTGCAGCAGATC 759 ***** * * ****** **** *** ********** *** * ** ***** **
ember AGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAAC 896csimpánz AGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAAC 883nyúl AGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGTAAC 243szarvasmarha AGCCACATCGCCCAGCAGCTCGGGCTGGAGAAAGACGTGGTCCGAGTGTGGTTTTGCAAC 1140egér ACTCACATCGCCAATCAGCTTGGGCTAGAGAAGGATGTGGTTCGAGTATGGTTCTGTAAC 868patkány ACTAGCATTGCCAAGCAGCTTGGGCTGGAGAGGGATGTGGTTCGAGTGTGGTTCTGTAAC 819 * *** *** * ***** ***** **** ** ***** ** ** ***** ** ***
ember CGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCT 956csimpánz CGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGTGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCT 943nyúl CGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAGGCC 303szarvasmarha CGTCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTACTCCCAACGTGAGGATTTTGAGGCT 1200egér CGGCGCCAGAAGGGCAAAAGATCAAGTATTGAGTATTCCCAACGAGAAGAGTATGAGGCT 928patkány CGGCGCCAGAAGGGGAAAAGATCGAGCATTGAATATTCCCAACGAGAAGAGTATGAGGCC 879 ** *********** ** **** ** * ** * * ***** ** ** * ******
ember GCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTT 1016csimpánz GCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTT 1003nyúl ACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCATTTC 363szarvasmarha GCTGGGTCTCCTTTCACAGGGGGACCCGTATCCTCTCCTCTGGCGCCAGGGCCCCATTTT 1260egér ACAGG-ACACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTATCCTTTCCTCTGCCCCCAGGTCCCCACTTT 987patkány GCGGGGAAACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTGTCCTTTCCTCTGCCCCCAGGCCCCCACTTT 939 * ** ** *** ******* * * ** * ******* * ** ** ***** **
ember GGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCT 1076csimpánz GGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCT 1063nyúl GGTACCCCAGGCTATGGCAGCC-------------------------------------- 385szarvasmarha GGTACCCCAGGCTACGGGGGGCCTCACTTCACTACTCTGTACTCTTCGGTCCCATTCCCT 1320egér GGCACCCCAGGCTATGGAAGCCCCCACTTCACCACACTCTACT---CAGTCCCTTTTCCT 1044patkány GGTGCTCCAGGCTATGGGAGCCCCCATTTCACCACACTCTACT---CGGTCCCTTTTCCT 996 ** * ******** ** * *
ember GAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCCGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC 1136csimpánz GAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCCGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC 1123nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GAGGGTGAGGTCTTTCCCTCGGTGTCTGTCACCGCTCTGGGCTCCCCTATGCATGCAAAC 1380egér GAGGGCGAGGCCTTTCCCTCTGTTCCCGTCACTGCTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC 1104patkány GAGGGCGAGGCCTTTCCCTCTGTTCCTGTCACTGCTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC 1056
101
ember TGAGGTGCCTGCCC-TTCTAGGAATGGGGGACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGGGAAAGAA 1195csimpánz TGAGGTGCCTGCCC-TTCTAGGAATGGGGGACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGGGAAAGAA 1182nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha TGAGGTGCCTGATCACCCCAGGAATAGGGGGCAGAGGAAGGGGAG-AGCTAGGGAGAGAA 1439egér TGAGGCACCAGCCCTCCCTGGGGATGCTGTG-AGCCAAGGCAAGGGAGGTAGACAAGAGA 1163patkány TGA--------------------------------------------------------- 1059
ember AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTTTTGGGATTAAGTTCTTCATTCACTAAGGAAGGAATT 1255csimpánz AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTTTTGGGATTAAGTTCTTCATTCACTAAGGAAGGAATT 1242nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha C-CCTGGGGTTTGTACCAGG-CCTTTGGGATTAAGTTTTTCATTCACTAAGAAAGGAATT 1497egér ACCTGGAGCTTTGGGGTTAAATTCTTTTACTGAGGAGGGATTAAAAGCACAACAGGGGTG 1223patkány ------------------------------------------------------------
ember GGGAACACAAAGGGTGG-GGGCAGGGGAGTTTGGGGCAACTGGTTGGAGGGAAGGTGAAG 1314csimpánz GGGAACACAAAGGGTGG-GGGCAGGGGAGTTTGGGGCAACTGGTTGGAGGGAAGGTGAAG 1301nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GGGAACACAATGGGTGTTGGGGCAGGGAGTTTGGGGAAACTGGTTGGAGGGAAGGTGAAG 1557egér GGGGGTGGGATGGGGAAAGAAGCTCAGTGATGCTGTTGATCAGGAGCCTGGCCTGTCTG- 1282patkány ------------------------------------------------------------
ember TTCAATGATGCTCTTGATTTTAATCCC-ACATCATGTATCACTTTTTTCTTAAATAAAGA 1373csimpánz TTCAATGATGCTCTTGATTTTAATCCC-ACATCATGTATCACTTTTTTCTTAAATAAAGA 1360nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha TTCAATGATGCTCTTGACTTTAATCCCCACATCACTCATCACTTTGTTCTTAAATAAA-- 1615egér -TCACTCATCATTTTGTTCTTAAATAAAGACTGGACACACAGT----------------- 1324patkány ------------------------------------------------------------
ember AGCCTGGGACACAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1417csimpánz AGCCTGGGACACAGTAGATAGACACACTT--------------- 1389nyúl --------------------------------------------szarvasmarha --------------------------------------------egér --------------------------------------------patkány --------------------------------------------________________________________________________________________________________
41. ábra: A feltételezett nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának összehasonlítása.
A tervezett primerek szürke kiemeléssel vannak jelölve a megfelelő szekvenciákon.
102
ÖsszefoglalásAz emlősök egyedfejlődésének kezdetén számos kulcsfontosságú molekuláris esemény jól
szervezetten megy végbe a preimplantációs embrióban, többek között az embrionális genom aktiváció és
az első sejt differenciálódás. A háttérben a két ivarsejt genetikai információja és annak leolvasása,
epigenetikai szabályozása, mint a DNS metiláció, a genomi imprinting, vagy a kromatin szerkezet
átrendeződése és a hiszton fehérjék módosításai állnak, melyek a génexpresszió szabályozásán keresztül
alakítják ki az embriók fejlődési programját. A modern embrió technológiai módszerek során a
megtermékenyítés és természetes folyamatok helyett mesterséges beavatkozással sikerül beindítani az
embrió fejlődését és a genom epigenetikai újraprogramozódását. Ezek a folyamatok és betegségekben
megnyilvánuló zavaruk feltárhatók lesznek, valamint az embriológiai módszerek alacsony hatékonysága is
javítható lesz a normális és a különböző módon előállított emlősállatokban való tanulmányozásukkal,
melyek összességében a mai modern biotechnológiai kutatásokat is szolgálják.
Az értekezésben leírt kutatások eredményeként sikerült kifejleszteni és jellemezni egy olyan
érzékeny, real-time RT-PCR-en alapuló mennyiségi génexpressziós módszert, mely alkalmas egyedi
embriókból és sejtekből egyszerre 10-15 gén mRNS szintjének meghatározására is (Gal és mtsai. 2006.
Reprod Fertil Dev. 18(3): 365-371.). A protokoll segítségével többféle alkalmazásban vizsgáltam az
embrió technológiai módszerek hatását és a preimplantációs egyedfejlődésben részt vevő gének szerepét.
Feltehetőleg a korai elköteleződés jeleit tudtam kimutatni négy- és nyolcsejtes egér embriók
blasztomer sejtjeiben (Baji Gál és mtsai. 2005. Állattenyésztés és Takarmányozás 54(3): 285-292.).
Az egér embriók szilárd felületen és műszalmában történő mélyhűtése során sikerült visszavezetni
az életképességbeli és hatékonyságbeli eltéréseket különböző stressz gének expressziós változásaira
(Boonkusol és mtsai. 2006. Mol Reprod Dev. 73(6): 700-708.).
Meghatároztam az in vivo, in vitro tenyésztett és parthenogenetikusan aktivált különböző stádiumú
egér és nyúl embriókban is a stabilan expresszáló háztartási géneket, melyek a későbbiekben alkalmasak
referenciának a génexpressziós vizsgálatok során. Az egér esetén ezek: H2afz, Hprt1 és Ppia (Mamo és
mtsai. 2007. BMC Dev Biol. 7(1): 14). A nyúl esetében: H2afz, Hprt1 és Ywhaz (Mamo és mtsai. 2008.
BMC Mol Biol. benyújtva). A nyúlban először mutattam ki a Pou5f1 (Oct-4) transzkripciós faktor
jelenlétét a preimplantációs egyedfejlődés során (Kiss és mtsai. 2008. Mol Reprod Dev. benyújtva).
Összehasonlítottam az egér és szarvasmarha embriókban több korai egyedfejlődésben szerepet
játszó gén expresszióját. A fajok között talált különbségek jelentős eltérésekre vezethetnek vissza a
molekuláris szintű újraprogramozódás és az embrionális genom aktiváció folyamataiban is.
Átfogó kísérletben vizsgáltam a hiszton acetilációs mechanizmus szabályozását, melyben több
hiszton acetil-transzferáz és a hiszton-deacetiláz együttes jelenlétét mutattam ki az egér embriókban.
103
SummaryDuring mammalian embryo preimplantation development, a number of key molecular events take
place, including the embryonic genome activation and the first cell differentiation among others. The genetic
information of the two gametes and their epigenetic regulation like DNA methylation, genomic imprinting,
chromatin remodeling and histone modifications stand behind them which together control embryonic
developmental program through gene expression. Currently, the new modern embryo technologies can
substitute natural fertilization and these artificial interventions can induce embryo development and
epigenetic reprogramming of the genome. Therefore, study of these embryos will bring new knowledge
about the molecular processes, underlying causes of developmental disorders and will help to improve the
biotechnological procedures. The new scientific results described in this thesis work are summarized below.
I successfully worked out a full sensitive real-time RT-PCR protocol for studying gene expression
quantitatively which makes it suitable to determine mRNA level of 10-15 genes simultaneously even from
single cells and embryos (Gal et al. 2006 Reprod Fertil Dev. 18(3): 365-371.). With its application I
measured effects of the embryo technologies and selected genes expressed during preimplantation
development.
I could presumably measure a very early sign of cell fate determination in blastomere cells of 4-cell
and 8-cell stage mouse embryos (Baji Gal et al. 2005 (Hungarian Journal of) Animal Production 54(3):
285-292.).
Comparison of solid surface vitrification and in-straw vitrification revealed direct correlation
between expression of the studied genes, and morphological alterations and survival rates of the mouse
embryos (Boonkusol et al. 2006 Mol Reprod Dev. 73(6): 700-708.).
I determined the most stable housekeeping genes in in vivo, in vitro cultured and
parthenogenetically activated mouse and rabbit embryos that are suitable for further gene expression studies.
For mouse, I selected H2afz, Hprt1 and Ppia genes (Mamo et al. 2007 BMC Dev Biol. 7(1): 14). For rabbit,
I selected H2afz, Hprt1 and Ywhaz genes (Mamo et al. 2008 BMC Mol Biol. submitted). Moreover, I also
identified and detected successfully the transcription factor Pou5f1 (Oct-4) during rabbit preimplantation
development (Kiss et al. 2008 Mol Reprod Dev. submitted).
I compared bovine and mouse gene expression changes through preimplantation development, and
the species-specific differences identified might point out differences in molecular processes of
reprogramming and embryonic genome activation.
I studied extensively the regulation of histone acetilation mechanism and detected several histone
deacetylases and acetyltransferases simultaneously in mouse preimplantation stage embryos.
104
top related