diagnostic prénatal non invasif sur sang maternel
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1
Alexandra Benachi, Jean-Marc Costa
Hôpital Antoine Béclère. Clamart-France
Laboratoire CERBA-France
Diagnostic Prénatal Non Invasif
sur sang maternel
Diagnostic prénatal
• Quels prélèvements?
– Biopsie de trophoblaste (11SA)
– Amniocentèse (15SA)
– Sang fœtal
• Quels risques?
– Fausse-couche
– Prématurité
– Hémorragie
– Infection
1% Fausse-couche
Diagnostic prénatal
• Comment diminuer le nombre de pertes fœtales
– Réduire le risque du geste
• Expérience de l’opérateur
– Diminuer le nombre de gestes invasifs
• Améliorer le dépistage
– Développer des approches non invasives
• Imagerie fœtale
• Analyse du fœtus à partir d’un prélèvement maternel
Diagnostic prénatal à partir du sang
maternel
Un « nouveau » concept
L’ADN fœtal sérique ou plasmatique
(ADN et ARN fœtal libres circulants)
Cellules fœtales circulantes
Cellules fœtales circulantes
• Existence connue depuis 1893…
• 1 à 2 /ml de sang maternel
• Certaines persistent dans le sang ou
les tissus maternels
• Pas de culture possible
• Analyse unicellulaire délicate
• Isolement et enrichissement complexes
Saker, Prenat Diagn 2009
NIPD Workflow : Circulating Fetal Trophoblatic Cells isolated by ISET
Advantages :reliable, versatile
. 1 to 3 CFTC per mL in all mother tested so far (over 135 mothers)
. 100 % sensitivity, 100 % specificity : blind analysis of more than 1000 single cells microdissected from ISET filters in the SMA/CF clinical
validation (Mouawia et al, submitted)
. CFTC present as early as 5 weeks of gestation (Mouawia et al, submitted)
. Pure fetal DNA to test for different genetic or chromosomal conditions
Filtration
Mother blood
collection
lysisfilter staining microdissection
WGA
Partner blood or saliva collection
DNA extraction and
quantification (OD)
Genotyping
STR, SNPIdentification of fetal cells
Recessive diseases
spinal motor atrophy
cystic fibrosis
PCR and Sequencing
(Béroud et al 2003, Saker
2006)
Trisomy 21, 18, 13
CGH
Multiallelic, digital PCR
Paternity tests
Gender
Genotyping
PCR
6 Pr Patricia Paterlini, 2012
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Diagnostic prénatal non invasif
ADN fœtal libre circulant
Lancet 1997;350:485-7.
Détection de séquences ADN dérivées du
chromosome Y : 80 % (24/30)
ADN circulant
• Source– Cellules fœtales circulantes (1/ml)
– ADN circulant (16 Geq/ml au 1er T) provenant des villosités choriales
• Plus de 99% des molécules circulent sous forme de fragment < 313bp
• Représente 5% de l’ADN libre dans la circulation maternelle
ADN circulant
• Détectable dès la 5e semaine de grossesse
• Concentration augmente au cours de la grossesse
• Disparition rapide (< 24h) après l’accouchement
• Ne persiste pas dans l’organisme maternel
ADN fœtal circulant et grossesse
ADN circulant-Indications
• Analyses restreintes aux séquences ADN absentes ou différentes du génome maternel
– Sexe fœtal
– Génotypage Rhésus D du fœtus
• Pathologies dominantes de novo
– Achondroplasie
• Trisomie 21 et autres anomalies chromosomiques
Détermination du sexe fœtal
• Maladies génétiques liées à l’X– Evite un geste invasif (BT) chez les patientes
conductrices qui portent un fœtus de sexe féminin (ne présentant aucun risque)
• Hyperplasie congénitales des surrénales (Déficit en 21-hydroxylase)
– Eviter le recours à un traitement corticoïde chez les patientes qui portent un foetus de sexe masculin (traitement inutile)
• Ambiguïtés sexuelles échographiques, discordances caryotypes/échographie
– Aide à la prise en charge
3
Génotypage RH D fœtal
• Alloimmunisation Rhésus D
– Plus de recours à l’amniocentèse chez
les patientes allo-immunisées pour
évaluation fœtale
– Pas d’injection systématique d’anti D
– Environ 35% des fœtus sont Rh-D
négatifs
RHD+ RHD-
JM Costa, CERBA
Recherche de mutation ponctuelle
• Mutation de novo: achondroplasie
– Recherche de la mutation G380R du
gène FGFR3
– Complément de l’analyse
échographique
JM Costa, CERBA
Proportion de l’allèle
muté au sein d’un
background « sauvage »
DPNI et sexe fœtal
• Analyse de l’ADN circulant est un acte de DPN
– Laboratoires: Autorisation de DPN par l’ARS
– Praticiens: Agrément par l’ABM
– Déclaration annuelle des activités diagnostiques
DPNI et sexe fœtal
Garçon
Fille
Garçon
Fille
Fiabilité = 70, 98 et 100%
à 11,12 et 13 SA
M.A. England
• 600.000 références
• Diagnostic de sexe
– 10 SA
• Test de paternité
– 14 SA
En 2013
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DPNI et sexe fœtal
• Choix du sexe masculin
– Inde
• 500.000 fœtus féminins/an
• Avortement sur le sexe illégal depuis 1996 en Inde
• Interdiction de révéler le sexe à l’écho depuis 1994
• Déséquilibre démographique, 60M de filles manquantes en 2005 (1.1milliard)
– Même pratique suspectée dans certaines population aux USA (Egan JF, Prenat Diagn,
2011)
• Equilibrage des fratries
Dépistage de la trisomie 21
• Depuis 1997
• Juillet 2009– Mesure de la CN entre 11+0 et 13+6 SA
– Marqueurs sériques du 1er T
entre 11+0 et 13+6 SA
• ß-hCG libre
• PAPP-A
Dépistage combiné
Seuil 1/250
Détection environ 86% de diagnostic de T 21 pour un taux de faux positif de 5%
Moins de fausse-couche
IMG plus précoce
Depuis 10/2010….DPNI et trisomie 21
Chr21 mère
Foetus Euploïde Foetus T21
Chr21 paternel
• Par quantification du nombre
de chromosomes du fœtus
- Marqueurs spécifiques du fœtus:
ARN fœtaux placentaires ou
marqueurs épigénétiques
(méthylation)
- Marqueurs non spécifiques
- Dosage chromosomique relatif par
Digital PCR
- Massively parallel sequencing
Lo YM, Nat Med,2007; Wright CF, BMJ, 2009; Tong YK, Clin Chem, 2010
DPNI et trisomie 21 ADN fœtal plasmatique et trisomie 21� ~10% des fragments d’ADN dans le sang d’une
femme enceinte sont d’origine fœtale ( )
� ~90% sont d’origine maternelle( )
Schéma des fragments d’ADN isolés du plasma maternel
Contenant de l’ADN maternel et de l’ADN de fœtus
euploIde
Schéma des fragments d’ADN isolés du plasma maternel
Contenant de l’ADN maternel et de l’ADN de fœtus en
surnombre provenant d’un fœtus porteur de Trisomie 21
Euploid Fetus Fetus with Trisomy 21
5
GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10GACACGGTGGAGCTCGGCCACACCAGGCCCAGCTGG chr14GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10ACAGTGGTGGGGCCCATCCCTGGGTGAGGCTCAGTT chr21GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10
Principe du diagnostic de la T21 fœtale par le
séquençage de l’ADN
GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10TCCGCCCAGGCCATGAGGGACCTGGAAATGGCTGAT chr21GACACGGTGGAGCTCGGCCACACCAGGCCCAGCTGG chr14GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10ACAGTGGTGGGGCCCATCCCTGGGTGAGGCTCAGTT chr21GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10
GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10GACACGGTGGAGCTCGGCCACACCAGGCCCAGCTGG chr14GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10
Le séquençage permet d’établir de quel chromosome provient le fragment d’ADN
TCCGCCCAGGCCATGAGGGACCTGGAAATGGCTGAT chr21
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Principe du diagnostic de la T21 fœtale par le
séquençage de l’ADN
ADN MPS* ne différencie pas les fragments d’origine maternelle ou paternelle
Fœtus sain Fœtus T21
La surexpression des
fragments de T21 du fœtus
atteint est significative et peut
être mesurée avec précision
* MPS - Massively Parallel Sequencing
• Quantification par « Massively Parallel sequencing »
ADN fœtal plasmatique et trisomie 21
15 patientes (terme médian: 14 semaines)
Tous les cas (9) correctement identifiés
18 patientes (terme médian: 18 semaines)
Tous les cas (9) correctement identifiés
• Quantification par « Massively Parallel sequencing »
- 28 patientes
- Population sélectionnée
- 13 SA
ADN fœtal plasmatique et trisomie 21
• ~10 million, sequence tags par échantillon
• « Digital Analysis of Selected Regions » DANSR
- Sélection de locus du génome à séquencer
- Score de risque FORTE (Fetal-fraction Optimised Risq of Trisomy Evaluation)=
Odds ratio pour la T21 basé sur le comptage de cfDNA, la fraction d’ADN
fœtal dans l’échantillon. Cet OR est appliqué comme rapport de
vraisemblance au calcul du risque à priori de T21 calculé sur l’âge et le
terme
- Population: patiente avec indication d’amniocentèse
- 3 pays, 3228 patientes
- 1,8% exclus car <4% d’cfDNA et 2,8% pour echec de la technique
- 16,9 SA
ADN fœtal plasmatique et trisomie 21
Norton M, AJOG, 2012
Etat des lieux
Auteurs Type d’études N T21 Se/SP Pas de
résultat
Technique
Palomaki 2011 Multicentrique 1971 212 98,6/99,8 0,8% MPS
Ehrich 2011 Prospective 480 39 100/99,7 6,4% MPS
Chiu 2011 Evaluation 753 86 100/97,9 ? MPS
Bianchi 2012 Prospective 532 89 100/100 5,8% MPS
Ashoor 2012 Cas/Témoins 400 50 100/100 1% Targeted MPS
Norton 2012 Prospective 3228 81 100/99,97 4,6% Targeted MPS
Dan 2012 Prospective 11105 143 100/99,96% 1,5% MPS
Nicolaides 2012 Prospective 2049 8 100/99,9% 4,9% Targeted MPS
Fairbrother 2013 Prospective 289 0 100/? 1,4% MPS
Population à risque Mixte Population générale
6
Anomalies découvertes devant un risque > 1/250
Rapport ABM, 2011
2,5%
3,5%
Nombre total de marqueurs sériques: 714928
Taux >1/250: 4% (mais environ 15% de ces patientes décline le
prélèvement)
Prélèvements effectués: 28199
3,8 % de faux positifs
Fausse-couche théoriques: 140-280
VPP du dépistage 1/20
Trisomie 21: 711 (2,5%)
Autres anomalies que T 21, 13 et 18: 208 (0,7%)
27418 (97%) gestes invasifs évités
Dépistage de la T21
Rapport ABM, 2011
Dépistage ou Diagnostic Non Invasif ?
Dépistage
Test offert à une
population sans risque
connu
Diagnostic
Test offert à une
population avec des
symptômes ou à risque
Ce n’est pas la précision (sensibilité et spécificité) du
test qui en fait un test de dépistage ou de diagnostic
En dépistage on privilégie la sensibilité (identifier
correctement ceux qui ont la maladie) et en diagnostic la
spécificité (identifier ceux qui n’ont pas la maladie)
Dépistage ou Diagnostic?
Tout dépend
-Du risque accepté
-De la prévalence de l’anomalie dans la population
étudiée
-De la nécessité d’un test de contrôle
Une
spécificité à
99% = 1 faux
positif /100
Prévalence de la
T21 dans les
populations
générales=1/400
et à risque 1/40
Actuellement une
amniocentèse est
indispensable
DPNI et T21
– Test supplémentaire améliorant l’évaluation du risque
– En remplacement de l’actuel test de dépistage
– En remplacement de l’actuel test diagnostic
– En remplacement des deux
– Test intermédiaire entre évaluation du risque et diagnostic invasif pour les patientes à haut risque
Avec une sensibilité de 100%, spécificité à 99,7%, et une
prévalence à 1/500, la VPP d’un test sera environ de 40%
Echographie ou DPNI?
+Echographie + DPNI
L’échographie T1 est indispensable
Echographie
- Datation
- Multiples
- Morphologie - Col
- Placenta
- Doppler
7
La CGH permet d’identifier
1,6 % d’anomalies chez des
fœtus avec caryotypes et
échographie normaux
Ne seront pas détectées
• Les anomalies
chromosomiques sans
manifestation
échographiques
– 0,7 % d’anomalies autres
que T21,18,13
• Les triploïdies
• Certaines mosaïques
• Microdélétions et
duplications?
• Les patientes à risque de PE
Seront détectées
• Les anomalies confinées
au placenta
• Les mosaïques
maternelles
Wapner R, AJOG, 2012
Risque > 1/250 et CN< 95eP
BT ou Amnio
Résultat
Suivi
DPNI
Pas de
résultat
Négatif
Suivi
Résultat
positif
Anomalies
échographiques
Population des 2-4
%: quel risque?
2-4%
As a result of the initial experience with NIPT,
Obstetrics and Gynecology of Atlanta now offers
NIPT as a first-line screening test to patients with
singleton pregnancies of at least 10weeks
gestational age. Patients are scheduled for a
follow-up visit 2weeks after their NIPT to review
their results and receive counseling. If at the 2-
week follow-up visit an NIPT result is not available,
patients are advised to undergo conventional FTS.
Prenat Diagn 2013
Paris, le 29 janvier 2013Paris, le 29 janvier 2013Paris, le 29 janvier 2013Paris, le 29 janvier 2013
Evaluation des coûts
Song K, J Mater Fetal Neonat Med, 2013
-99%
-95%
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Projet SEHDA*
*SEquençage à Haut Débit et Aneuploïdies (projet SE HDA)
Titre long : Diagnostic non invasif des aneuploïdies fœtales chez les patientes à haut risque par analyse de l’ADN fœtal circulant dans le plasma maternel au cours de la grossesse
• 2 fœtus porteur du Syndrome de
Di Georges
Jensen J, Clin Chem, 2012
DPNI et del 22q11.2
• Déterminer si le fœtus a hérité
de la mutation maternelle sur le
chromosome X
• Relative mutation dosage
approach: Concentration de
l’allèle mutante est sur-exprimée
dans le plasma des patientes
hétérozygotes
– 7 patientes
Chiu RWK, Blood, 2011
DPNI et HémophilieGénome fœtal
• Reconstruction de tout le génome fœtal
• En 2 ans amélioration majeure de la technique
Lo YD , Sc Transl Med, 2010,
Kitzmann, , Sc Transl Med, 2012
• Tant qu’un prélèvement de contrôle est nécessaire ne sera
pas un test diagnostic
• Non Invasive Prenatal Testing (NIPT)
• Pour les patientes à risque (1/250 ou 1/1000 ?)
• Pourrait remplacer les marqueurs sériques
– En détectant plus de T21
– Si possible avant 13SA
– En générant 90% en moins de prélèvements inutiles car moins de
faux positif
– Mais au prix d’une perte d’information et d’un coût élevé
– Facile à expliquer (pas certain…)
• Difficultés financières
– Dépistage T1 détecte 86% des T21, on va passer à 99,5% mais le
coût de chaque cas dépisté en plus risque d’excèder le budget de la
plupart des systèmes de santé
• Difficultés logistiques
• Etudes cliniques prospectives nécessaires
• Nécessité de mettre en place ce test en France afin d’éviter
une inégalité d’accès aux soins
9
Nature Reviews Genetics, 2009
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