1

Alexandra Benachi, Jean-Marc Costa

Hôpital Antoine Béclère. Clamart-France

Laboratoire CERBA-France

Diagnostic Prénatal Non Invasif

sur sang maternel

Diagnostic prénatal

• Quels prélèvements?

– Biopsie de trophoblaste (11SA)

– Amniocentèse (15SA)

– Sang fœtal

• Quels risques?

– Fausse-couche

– Prématurité

– Hémorragie

– Infection

1% Fausse-couche

Diagnostic prénatal

• Comment diminuer le nombre de pertes fœtales

– Réduire le risque du geste

• Expérience de l’opérateur

– Diminuer le nombre de gestes invasifs

• Améliorer le dépistage

– Développer des approches non invasives

• Imagerie fœtale

• Analyse du fœtus à partir d’un prélèvement maternel

Diagnostic prénatal à partir du sang

maternel

Un « nouveau » concept

L’ADN fœtal sérique ou plasmatique

(ADN et ARN fœtal libres circulants)

Cellules fœtales circulantes

Cellules fœtales circulantes

• Existence connue depuis 1893…

• 1 à 2 /ml de sang maternel

• Certaines persistent dans le sang ou

les tissus maternels

• Pas de culture possible

• Analyse unicellulaire délicate

• Isolement et enrichissement complexes

Saker, Prenat Diagn 2009

NIPD Workflow : Circulating Fetal Trophoblatic Cells isolated by ISET

Advantages :reliable, versatile

. 1 to 3 CFTC per mL in all mother tested so far (over 135 mothers)

. 100 % sensitivity, 100 % specificity : blind analysis of more than 1000 single cells microdissected from ISET filters in the SMA/CF clinical

validation (Mouawia et al, submitted)

. CFTC present as early as 5 weeks of gestation (Mouawia et al, submitted)

. Pure fetal DNA to test for different genetic or chromosomal conditions

Filtration

Mother blood

collection

lysisfilter staining microdissection

WGA

Partner blood or saliva collection

DNA extraction and

quantification (OD)

Genotyping

STR, SNPIdentification of fetal cells

Recessive diseases

spinal motor atrophy

cystic fibrosis

PCR and Sequencing

(Béroud et al 2003, Saker

2006)

Trisomy 21, 18, 13

CGH

Multiallelic, digital PCR

Paternity tests

Gender

Genotyping

PCR

6 Pr Patricia Paterlini, 2012

2

Diagnostic prénatal non invasif

ADN fœtal libre circulant

Lancet 1997;350:485-7.

Détection de séquences ADN dérivées du

chromosome Y : 80 % (24/30)

ADN circulant

• Source– Cellules fœtales circulantes (1/ml)

– ADN circulant (16 Geq/ml au 1er T) provenant des villosités choriales

• Plus de 99% des molécules circulent sous forme de fragment < 313bp

• Représente 5% de l’ADN libre dans la circulation maternelle

ADN circulant

• Détectable dès la 5e semaine de grossesse

• Concentration augmente au cours de la grossesse

• Disparition rapide (< 24h) après l’accouchement

• Ne persiste pas dans l’organisme maternel

ADN fœtal circulant et grossesse

ADN circulant-Indications

• Analyses restreintes aux séquences ADN absentes ou différentes du génome maternel

– Sexe fœtal

– Génotypage Rhésus D du fœtus

• Pathologies dominantes de novo

– Achondroplasie

• Trisomie 21 et autres anomalies chromosomiques

Détermination du sexe fœtal

• Maladies génétiques liées à l’X– Evite un geste invasif (BT) chez les patientes

conductrices qui portent un fœtus de sexe féminin (ne présentant aucun risque)

• Hyperplasie congénitales des surrénales (Déficit en 21-hydroxylase)

– Eviter le recours à un traitement corticoïde chez les patientes qui portent un foetus de sexe masculin (traitement inutile)

• Ambiguïtés sexuelles échographiques, discordances caryotypes/échographie

– Aide à la prise en charge

3

Génotypage RH D fœtal

• Alloimmunisation Rhésus D

– Plus de recours à l’amniocentèse chez

les patientes allo-immunisées pour

évaluation fœtale

– Pas d’injection systématique d’anti D

– Environ 35% des fœtus sont Rh-D

négatifs

RHD+ RHD-

JM Costa, CERBA

Recherche de mutation ponctuelle

• Mutation de novo: achondroplasie

– Recherche de la mutation G380R du

gène FGFR3

– Complément de l’analyse

échographique

JM Costa, CERBA

Proportion de l’allèle

muté au sein d’un

background « sauvage »

DPNI et sexe fœtal

• Analyse de l’ADN circulant est un acte de DPN

– Laboratoires: Autorisation de DPN par l’ARS

– Praticiens: Agrément par l’ABM

– Déclaration annuelle des activités diagnostiques

DPNI et sexe fœtal

Garçon

Fille

Garçon

Fille

Fiabilité = 70, 98 et 100%

à 11,12 et 13 SA

M.A. England

• 600.000 références

• Diagnostic de sexe

– 10 SA

• Test de paternité

– 14 SA

En 2013

4

DPNI et sexe fœtal

• Choix du sexe masculin

– Inde

• 500.000 fœtus féminins/an

• Avortement sur le sexe illégal depuis 1996 en Inde

• Interdiction de révéler le sexe à l’écho depuis 1994

• Déséquilibre démographique, 60M de filles manquantes en 2005 (1.1milliard)

– Même pratique suspectée dans certaines population aux USA (Egan JF, Prenat Diagn,

2011)

• Equilibrage des fratries

Dépistage de la trisomie 21

• Depuis 1997

• Juillet 2009– Mesure de la CN entre 11+0 et 13+6 SA

– Marqueurs sériques du 1er T

entre 11+0 et 13+6 SA

• ß-hCG libre

• PAPP-A

Dépistage combiné

Seuil 1/250

Détection environ 86% de diagnostic de T 21 pour un taux de faux positif de 5%

Moins de fausse-couche

IMG plus précoce

Depuis 10/2010….DPNI et trisomie 21

Chr21 mère

Foetus Euploïde Foetus T21

Chr21 paternel

• Par quantification du nombre

de chromosomes du fœtus

- Marqueurs spécifiques du fœtus:

ARN fœtaux placentaires ou

marqueurs épigénétiques

(méthylation)

- Marqueurs non spécifiques

- Dosage chromosomique relatif par

Digital PCR

- Massively parallel sequencing

Lo YM, Nat Med,2007; Wright CF, BMJ, 2009; Tong YK, Clin Chem, 2010

DPNI et trisomie 21 ADN fœtal plasmatique et trisomie 21� ~10% des fragments d’ADN dans le sang d’une

femme enceinte sont d’origine fœtale ( )

� ~90% sont d’origine maternelle( )

Schéma des fragments d’ADN isolés du plasma maternel

Contenant de l’ADN maternel et de l’ADN de fœtus

euploIde

Schéma des fragments d’ADN isolés du plasma maternel

Contenant de l’ADN maternel et de l’ADN de fœtus en

surnombre provenant d’un fœtus porteur de Trisomie 21

Euploid Fetus Fetus with Trisomy 21

5

GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10GACACGGTGGAGCTCGGCCACACCAGGCCCAGCTGG chr14GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10ACAGTGGTGGGGCCCATCCCTGGGTGAGGCTCAGTT chr21GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10

Principe du diagnostic de la T21 fœtale par le

séquençage de l’ADN

GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10TCCGCCCAGGCCATGAGGGACCTGGAAATGGCTGAT chr21GACACGGTGGAGCTCGGCCACACCAGGCCCAGCTGG chr14GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10ACAGTGGTGGGGCCCATCCCTGGGTGAGGCTCAGTT chr21GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10

GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10GACACGGTGGAGCTCGGCCACACCAGGCCCAGCTGG chr14GGCCCTGGGGACAGTCTCCAATCCACTGAGTCATCT chr10

Le séquençage permet d’établir de quel chromosome provient le fragment d’ADN

TCCGCCCAGGCCATGAGGGACCTGGAAATGGCTGAT chr21

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

Principe du diagnostic de la T21 fœtale par le

séquençage de l’ADN

ADN MPS* ne différencie pas les fragments d’origine maternelle ou paternelle

Fœtus sain Fœtus T21

La surexpression des

fragments de T21 du fœtus

atteint est significative et peut

être mesurée avec précision

* MPS - Massively Parallel Sequencing

• Quantification par « Massively Parallel sequencing »

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21

15 patientes (terme médian: 14 semaines)

Tous les cas (9) correctement identifiés

18 patientes (terme médian: 18 semaines)

Tous les cas (9) correctement identifiés

• Quantification par « Massively Parallel sequencing »

- 28 patientes

- Population sélectionnée

- 13 SA

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21

• ~10 million, sequence tags par échantillon

• « Digital Analysis of Selected Regions » DANSR

- Sélection de locus du génome à séquencer

- Score de risque FORTE (Fetal-fraction Optimised Risq of Trisomy Evaluation)=

Odds ratio pour la T21 basé sur le comptage de cfDNA, la fraction d’ADN

fœtal dans l’échantillon. Cet OR est appliqué comme rapport de

vraisemblance au calcul du risque à priori de T21 calculé sur l’âge et le

terme

- Population: patiente avec indication d’amniocentèse

- 3 pays, 3228 patientes

- 1,8% exclus car <4% d’cfDNA et 2,8% pour echec de la technique

- 16,9 SA

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21

Norton M, AJOG, 2012

Etat des lieux

Auteurs Type d’études N T21 Se/SP Pas de

résultat

Technique

Palomaki 2011 Multicentrique 1971 212 98,6/99,8 0,8% MPS

Ehrich 2011 Prospective 480 39 100/99,7 6,4% MPS

Chiu 2011 Evaluation 753 86 100/97,9 ? MPS

Bianchi 2012 Prospective 532 89 100/100 5,8% MPS

Ashoor 2012 Cas/Témoins 400 50 100/100 1% Targeted MPS

Norton 2012 Prospective 3228 81 100/99,97 4,6% Targeted MPS

Dan 2012 Prospective 11105 143 100/99,96% 1,5% MPS

Nicolaides 2012 Prospective 2049 8 100/99,9% 4,9% Targeted MPS

Fairbrother 2013 Prospective 289 0 100/? 1,4% MPS

Population à risque Mixte Population générale

6

Anomalies découvertes devant un risque > 1/250

Rapport ABM, 2011

2,5%

3,5%

Nombre total de marqueurs sériques: 714928

Taux >1/250: 4% (mais environ 15% de ces patientes décline le

prélèvement)

Prélèvements effectués: 28199

3,8 % de faux positifs

Fausse-couche théoriques: 140-280

VPP du dépistage 1/20

Trisomie 21: 711 (2,5%)

Autres anomalies que T 21, 13 et 18: 208 (0,7%)

27418 (97%) gestes invasifs évités

Dépistage de la T21

Rapport ABM, 2011

Dépistage ou Diagnostic Non Invasif ?

Dépistage

Test offert à une

population sans risque

connu

Diagnostic

Test offert à une

population avec des

symptômes ou à risque

Ce n’est pas la précision (sensibilité et spécificité) du

test qui en fait un test de dépistage ou de diagnostic

En dépistage on privilégie la sensibilité (identifier

correctement ceux qui ont la maladie) et en diagnostic la

spécificité (identifier ceux qui n’ont pas la maladie)

Dépistage ou Diagnostic?

Tout dépend

-Du risque accepté

-De la prévalence de l’anomalie dans la population

étudiée

-De la nécessité d’un test de contrôle

Une

spécificité à

99% = 1 faux

positif /100

Prévalence de la

T21 dans les

populations

générales=1/400

et à risque 1/40

Actuellement une

amniocentèse est

indispensable

DPNI et T21

– Test supplémentaire améliorant l’évaluation du risque

– En remplacement de l’actuel test de dépistage

– En remplacement de l’actuel test diagnostic

– En remplacement des deux

– Test intermédiaire entre évaluation du risque et diagnostic invasif pour les patientes à haut risque

Avec une sensibilité de 100%, spécificité à 99,7%, et une

prévalence à 1/500, la VPP d’un test sera environ de 40%

Echographie ou DPNI?

+Echographie + DPNI

L’échographie T1 est indispensable

Echographie

- Datation

- Multiples

- Morphologie - Col

- Placenta

- Doppler

7

La CGH permet d’identifier

1,6 % d’anomalies chez des

fœtus avec caryotypes et

échographie normaux

Ne seront pas détectées

• Les anomalies

chromosomiques sans

manifestation

échographiques

– 0,7 % d’anomalies autres

que T21,18,13

• Les triploïdies

• Certaines mosaïques

• Microdélétions et

duplications?

• Les patientes à risque de PE

Seront détectées

• Les anomalies confinées

au placenta

• Les mosaïques

maternelles

Wapner R, AJOG, 2012

Risque > 1/250 et CN< 95eP

BT ou Amnio

Résultat

Suivi

DPNI

Pas de

résultat

Négatif

Suivi

Résultat

positif

Anomalies

échographiques

Population des 2-4

%: quel risque?

2-4%

As a result of the initial experience with NIPT,

Obstetrics and Gynecology of Atlanta now offers

NIPT as a first-line screening test to patients with

singleton pregnancies of at least 10weeks

gestational age. Patients are scheduled for a

follow-up visit 2weeks after their NIPT to review

their results and receive counseling. If at the 2-

week follow-up visit an NIPT result is not available,

patients are advised to undergo conventional FTS.

Prenat Diagn 2013

Paris, le 29 janvier 2013Paris, le 29 janvier 2013Paris, le 29 janvier 2013Paris, le 29 janvier 2013

Evaluation des coûts

Song K, J Mater Fetal Neonat Med, 2013

-99%

-95%

8

Projet SEHDA*

*SEquençage à Haut Débit et Aneuploïdies (projet SE HDA)

Titre long : Diagnostic non invasif des aneuploïdies fœtales chez les patientes à haut risque par analyse de l’ADN fœtal circulant dans le plasma maternel au cours de la grossesse

• 2 fœtus porteur du Syndrome de

Di Georges

Jensen J, Clin Chem, 2012

DPNI et del 22q11.2

• Déterminer si le fœtus a hérité

de la mutation maternelle sur le

chromosome X

• Relative mutation dosage

approach: Concentration de

l’allèle mutante est sur-exprimée

dans le plasma des patientes

hétérozygotes

– 7 patientes

Chiu RWK, Blood, 2011

DPNI et HémophilieGénome fœtal

• Reconstruction de tout le génome fœtal

• En 2 ans amélioration majeure de la technique

Lo YD , Sc Transl Med, 2010,

Kitzmann, , Sc Transl Med, 2012

• Tant qu’un prélèvement de contrôle est nécessaire ne sera

pas un test diagnostic

• Non Invasive Prenatal Testing (NIPT)

• Pour les patientes à risque (1/250 ou 1/1000 ?)

• Pourrait remplacer les marqueurs sériques

– En détectant plus de T21

– Si possible avant 13SA

– En générant 90% en moins de prélèvements inutiles car moins de

faux positif

– Mais au prix d’une perte d’information et d’un coût élevé

– Facile à expliquer (pas certain…)

• Difficultés financières

– Dépistage T1 détecte 86% des T21, on va passer à 99,5% mais le

coût de chaque cas dépisté en plus risque d’excèder le budget de la

plupart des systèmes de santé

• Difficultés logistiques

• Etudes cliniques prospectives nécessaires

• Nécessité de mettre en place ce test en France afin d’éviter

une inégalité d’accès aux soins

9

Nature Reviews Genetics, 2009