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GENEVIEVE ROY
D~VELOPPEMENT D'UN AGENT DE LUTTE BlOLOGIQUE CONTRE
HE TEROBASIDION ANNOSUM
Thèse présentée
& la faculté des études supkrieures de I'Universitk Laval
pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
Département des sciences du bois et de la forêt FACULTE DE FORESTERIE ET DE GÉOMATIQUE
UNIVERSITE LAVAL QUEBEC
SEPTEMBRE 1999
O Geneviève Roy, 1999
National Library B+1 of Canada Bibliot heque nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions et Bibliographie Services seMces bibliographiques
395 WeUington Street 395, rue Wellington OItawaON K1AON4 Onawa ON K1A ON4 canada Canada
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L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant a la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de microfiche/fiim, de reproduction sur papier ou sur format électronique.
L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.
AVANT PROPOS
J'aimerais remercier mes directeurs de recherche Dr. Michel Dessureault et Dr. Gaston
Laflamme pour les encouragements et les conseils judicieux qu'ils m'ont prodigués tout au
long de ces études. J'adresse un merci tout spécial a M. Guy Bussières pour son support
professionnel et personnel. Je remercie également le Conseil national de recherche
scientifique, le Service canadien des forêts, le Centre de recherche en biologie forestière et
l'université Laval pour leur support financier.
Plusieurs personnes m'ont apporte une aide technique et je leur en suis très reconnaissante :
Line Asselin, Martine Blais, Robert Blais, Martine Cormier et André Dansereau. Je
remercie également M. Sylvain Boisclair et Mme Michele Bernier-Cardou pour leurs
conseils dans l'analyse statistique de mes résultats. Je ne pourrais pas oublier de remercier
M. René Cauchon pour l'identification des champignons.
Je tiens à remercier le Dr. Richard Hamelin du Service canadien des forêts de m'avoir
conseillé scientifiquement dans la réalisation du chapitre 4 qui a été publié en 1997 dans le
Journal Canadien de Botanique (Can. S. Bot. 75,2097-2104).
Se remercie également la Compagnie Premier Tech pour mon emploi actuel qui me permet
de poursuivre la recherche sur le développement d'agents de lutte biologique.
Finalement, a mes amis et parents Hélène, Marie, Javier, Paûick, Pierre et Dina qui m'ont
encouragé à persister jusqu'a la fin; à mon copain Denis et a sa fille Mélanie qui ont été à
mes côtés pour terminer la rédaction de la thèse et qui ont assumé les soirs et les fins de
semaines de non disponibilité, je dis spécialement merci.
TABLES DES MATIÈRES
RÉSUMÉ COURT ............................................................................................................. I
RÉSUMÉ LONG ............................................................................................................... II
................................................................................................................ AVANT-PROPOS III
TABLE DES MATIERES ........................................
........................................................................................... LISTE DES FIGURES ........JX
LISTE DES TABLEAUX .................................................................................................... XI
~NTRODUCTION GÉNÉRALE ......................................................................................... 1
.......................................................................................................................... Références .6
CHAPITRE 1 - BIOLOGICAL CONTROL OF HETEROBASIDION ANNOSUM BY
PHAEOTHECA DIMORPHOSPORA. 1. IN VITRO INVESTIGATION
STUDlES .................................................................................................. 15
RÉSUMÉ ........................................................................................................................... 1 s
................................................................................................... 1 .1 MTRODUCTION .16
................................................................................. 1.2 MATERIAL AM) METHODS 1 8
............................................................................*.............. ....**....* 1.2.1 Fungal culture ... 1 8
....................................................................................................... 1.2.2 Wood material 18
................................................................................................. 1.2.2 Bi-Iayer assay 1 8
1.2.3 Direct confrontation on wood .................... .... ............................................... 19
1.3 RESULTS ............................. ... .......... ........-21
.......................................................................................................... 1.3.1 Bi-Iayer assay 21
................................................................................. 1.3.2 Direct confrontation on wood 21
1.4 DISCUSSION ............................................................................................................. 27
1.5 REFERENCES ........................................................................................................... 31
CHAPITRE 2 . BIOLOGICAL CONTROL OF HETEROBASLDION AMVOSW BY
PHAEOTHECA DIMORPHOSPORA . II . FIELD INVESTIGATION
..................................................................................................... 2.1 DJTRODUCTION 37
................................................................................. 2.2 MATERIAL AND METHODS 39
........................................................................................................... 2.2.1 Fungal strains 39
2.2.2 Study sites ................................................................................................................ 39
2.2.3 Inoculum preparation ............................................................................................... 39
2.2.4 Log treatments ..................................... ... ................................................................. 40
2.2.5 Sampling method and assessrnent of colonization ..................................... ...... ....... 40
2.2.6 Statisticat methods ................................................................................................ 41
2.3 RESULTS .................................................................................................................. 42
2.4 DISCUSSION ............................................................................................................ 5 5
2.4.3 Rye grain controls ............................................................................................. 59
2.4.4 Mycodiversity .......... .. ......~.......................~.........~............................................ 60
2.5 CONCLUSION .............. ....... .................................................................................. 62
VI
........................................................................................................... 2.6 REFERENCES 64
CHAPITRE^ . ÉTUDE DE LA MYCOFLORE DES SOUCHES DE PIN ROUGE:
COLONISATION NATURELLE ET COLONISATION SUITE AU
.................................................... . TRAITEMENT AVEC P GIGANTEA 71
........................................................................ 3.1 MTRODUCTION ......................... .. 72
3.2 MATERIEL ET METHODE * ..............................................*...............**..............**...... 75
........................................................................................... 3 2 . 1 Culture du champignon 75
3.2.2 Sites d'essais ........................................................................................................... -75
........................................................................................... 3.2.3 Traitement des souches 75
............................................... 3.2.4 Méthode de récolte et évaluation de la colonisation 77
................................................................................ 3.3.1 Composition de la mycoflore 79
3.3.1.1 Après deux mois d'exposition ...........................................*........................4.... 79
.............................................................................. 3.3.1.2 Après 1 2 mois d'exposition 83
............................................................................. 3.3.1.3 Après 24 mois d'exposition 88
.............................................................................................. 3.3.2 Pénétration verticale 91
................................................................................ 3.3.2.1 Aprés 2 mois d'exposition 91
........................................................................... 3.3.2.2 Après 12 mois d'exposition 91
3.3.2.3 Après 24 mois d'exposition ............................................................................. 94
..................................... 3.3.4 Composition des groupes taxonomiques de champignon 94
........................ 3.3.4.1 Après 2 mois d'exposition ... ............................................... 96
3.3.4.2 Après 12 mois d'exposition ......................... .. ............................................... 98
.............................................................................. 3 .3.4.3 Après 24 mois d'exposition 98
3.5 DISCUSSION ........ .. ............................................................................................ 101
...................................................................... 3 .5 . 1 Inventaire de la mycoflore naturelle 102
.................................................. . 3 S.2 Mycoflore des souches traitées avec P gigantea 108
........................................................................................................ 3.6 CONCLUS ION 1 1 0
3.7 RÉFÉRENCES ....................................................................................................... I I i
CHAPITRE 4- COMPARISON OF RAPD TECHNIQUE AND SOMATIC
NCOMPATIBILITY TESTS FOR THE IDENTIFICATION OF
....................................................................... P . GIGANTEA STRAINS 117
RESUME ........................................................................................................................... 117
4.1 INTRODUCTION ......................................................................................... 1 18
............................................................................. 4.2 MATERIALS AND METHODS 120
................................. ...................................... 4.2.2 Somatic incompatibility testing .. 1 2 0
............................................................................ 4.2.3 DNA extraction .............. .... 1 2 2
........................................................................................... 4.2.4 DNA amplification 122
............................................................................................... 4.2.5 RAPD analysis 1 2 3
4.3 RESULTS ............................................................................................................ 124
..................................... 4.3.2 RAPD analysis ... ........................................................... 126
........................................................................................................... 4.4 DISCUSSION 132
4.5 REFERENCES ............... ................ ... .......... ................................................... 136
vm I I
CONCLUSION GENERALE ....... . .................... ...... ........ ... .................. . ................ ...... .... ... 142
Réfkences . . . . .. .. . . . . .. . . . . . ... . . . . . . .. . . . ... ...... .. . .. ..... .. . . .. . . ..... . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
LISTE DES FIGURES
CHAPITRE 2
Figure 2.1. Occurrence of Heterobasidiun annosum one month after red pine log
treatment ....................................................................................................... 43
Figure 2.2. Occurrence of Heterobasidion annosum two months after red pine log
treatment.. ........ .. ......................................................................................... 44
Figure 2.3. Relative occurrence of each taxonomic group in red pine logs one month
after treatmcnt on site A (a) and B (b).. .................................................... 53
Figure 2.4. Relative occurrence of each taxonomic group in red pine logs wo months
....................................................... afier treatment on site A (a) and B (b).. 54
CHAPITRE 3
Figure 3.1.
Figure 3.2.
Figure 3.3.
Figure 3.4.
Abondance relative des différents groupes taxonomiques de champignons
.................................. après 2 mois d'exposition dans les souches témoins. 97
Abondance relative des différents groupes taxonomiques de champignons
après 2 mois d'exposition dans les souches traitdes avec Phlebiopsis
gigantea. ..................................................................................................... 97
Abondance relative des différents groupes taxonomiques de champignons
après 12 mois d'exposition dans les souches témoins. ............................... 99
Abondance relative des différents groupes taxonomiques de champignons
après 2 mois d'exposition dans les souches traitées avec Phlebiopsis
....................................................................... gigantea ............................... 9 9
Figure 3.5. Abondance relative des différents groupes taxonomiques de champignons
après 24 mois d'exposition dans les souches coupées au mois de mai selon le
traitement .................................................................................................... 1ûû
CHAPITRE 4
Figure 4.1. Pairings among strains of P. gigantea afier three weeks on 1% malt extract
agar. (A) Somatic compatibility between P367 and PO37 as indicated by
intmingling mycelia. (B) Somatic incompatibility as showed by formation
of a reaction line between PO79 and P037. ................................................ 12 1
Figure 4.2. Gel electrophoresis of RAPD profiles of the test strains (Pl 04, P079, P037)
obtained with primers OPC-06 (A), OPJ-05 (B), and OPE09 (C).. ......... 128
LISTE DES TABLEAUX
CHAPITRE 1
Table 1.1. Growth inhibition of four strains (P and S types) of Heterobasidion annosum
caused by Phaeotheca dimorphospora on a g a and wood discs fiom the bi-
............................................................................................. layer assay. 2 2
Table 1.2. Isolation of Phaeotheca dimorphospora and Heterobasidion annosum (P and
S strains) from wood discs. ...................................................................... 2 3
Table 1.3. Logistic regression andysis and contrasts (C) of atternpted isolations of
Heterobasidion annosum ( P and S strains) fiom wood discs .................... ... 26
CHAPITRE 2
Table 2.1.
Table 2.2.
Table 2.3.
Table 2.4.
Table 2.5.
Frequencies (F) and occurrences (O) of Phlebiopsis gîgantea in r d pine logs
over the two sampling periods. ....................... .......... ............................... 46
Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant fùngi in red pine logs
on site A afier one month. ......................................................................... 4 7
Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant fun@ in red pine logs
on site B after one month. ............................................................. 48
Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant fun@ in red pine logs
on site A afier two months. ....................................... .- Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant h g i in red pine log~
on site B after two months. ................ ............ ............ ....... ...................... 50
XII
CHAPITRE 3
Tableau 3.1 .
Tableau 3.2.
Tableau 3.3.
Tableau 3.4.
Tableau 3.5.
Tableau 3.6.
Tableau 3.7.
Tableau 3 3 .
Tableau 3.9.
Description des trois sites expérimentaux. .......................................... 7 6
Fréquence (F) et abondance (A) des principales especes de champignons
dans les souches de pin rouge témoins après deux mois d'exposition. ........ 8 1
Fréquence (F) et abondance (A) des principales especes de champignons
dans les souches de pin rouge traitées avec P. gigantea dans les plantations
de Bristol et Grenville après deux mois d'exposition. ................................. 82
Fréquence (F) et abondance (A) des principales espèces de champignons
dans les souches de pin rouge témoins après 12 mois d'exposition. ........... 85
Fréquence (F) et abondance (A) des principales especes de champignons
dans les souches de pin rouge traitées avec P. gigantea après 12 mois . . ................................................................................................ d'exposition. .87
Fréquence (F) et abondance (A) des principales espèces de champignons
dans les souches de pin rouge témoins après 24 mois d'exposition pour la
coupe du mois de mai ................................................................................... 90
Fréquence (%) des souches de pin rouge colonisées par niveau pour les
principaux champignons après 2 mois d'exposition. ................................... 92
Fréquence (%) des souches de pin rouge coloniskes par niveau pour les
................................. principaux champignons après 12 mois d'exposition. 93
Fréquence (%) des souches de pin rouge colonisées par niveau pour les
principaux champignons après 24 mois d'exposition pour la période . . d'éclaircie de mai. .................................................................................. 95
CHAPITRE 4
Table 4.1. Number of strains of P. gigantea showing compatible reaction and identical
RAPD Gngerprint to the introduced test strains P037, PO79 and P l 04. .... 125
Table 4.2. RAPD pattern of P. gigantea for OPC-06 primer. ................................... 129
Table 4.3. RAPD patterns of P . gigantea for OPJ-05 primer ..................................... 129
Table 4.4. RAPD patterns of P . gigcntea for OPJ-09 primer ...................... ..... ....... 129
Table 4.5. RAPD profiles of P . gigcntea strains used in stmp inoculations and of
strains fiom the nahiral population prior to inoculation ............................. 130
Table 4.6. RAPD profiles and somatic incompatibility interactions with test straias of
P . gigantea strains fiom the population collected one year after inoculation .
INTRODUCTION G $ ~ M ~ U E
La maladie du rond causée par le champignon Heterobasidion annomm (Fr.) Bref.
(=Fumes annosus (Fr.) Karst.) est depuis longtemps considérée comme un problème
dévastateur dans les plantations résineuses à travers le monde principalement dans les
forêts tempérées et boréales de l'hémisphère Nord (Hodges 1969; Woodward et al. 1998).
Dans l'Est du Canada, elle a été rapportée pour la première fois dans le sud de l'Ontario en
1955 (Hord et Quirke 1955). Depuis, la maladie a été observée a plusieurs endroits dans
cette province, particulièrement au sud de celle-ci (Whitney 1988). Elle affecte
principalement les plantations de pin rouge (Pinus resinosa Ait.) mais également de pin
sylvestre (Phus sylvestris L.) et de pin blanc (Pinus strobus L.). Au Québec, la première
mention vérifiée de la présence de cette maladie est beaucoup plus récente et date de 1989
(Laflamme et Blais 1995). Ce premier foyer d'infection connu est localisé dans une
plantation de pin rouge située près du Lac LaBlanche dans la région de l'Outaouais.
Depuis, de nouveaux sites d'infection ont été détectés au Québec (Laflamme et al. 1998).
Cette maladie qui cause une pourriture des racines des arbres vivants est particulièrement
insidieuse car elle peut se propager dans un peuplement longtemps avant l'observation des
dégâts (Punter 1968). L'âge relativement jeune des plantations de pin rouge au Quebec a
permis, jusqu'a présent, d'éviter une situation similaire a ce qui se passe ailleurs dans le
monde. Toutefois, dans les prochaines années, l'augmentation de la fréquence des éclaircies
risque d'aggraver la situation actuelle.
Dans le monde, il existe actuellement un besoin croissant de remplacer les méthodes
traditionnelles de lutte chimique contre les maladies des plantes par des m&hodes plus
naturelles qui n'affectent pas I'envimmement. Ce besoin est devenu évident par la
présence de problèmes considérables d'accumulation de résidus toxiques dans les sols et
dans l'eau (Coderre et Vincent 1992). Cela a incite les gouvernements canadien et
québécois à établir des stratégies de protection des forêts visant 1'6limination complète de
l'usage de pesticides en milieu forestier (Anonyme 1992; Anonyme 1994). Le
dbveloppement d'une approche de lutte biologique pour le contrôle de K. annosum dans
les plantations de pin rouge au Québec correspond a un moyen pouvant être utilisé ii
f'échetle forestière sans pour autant affecter l'environnement. De nombreux micro-
organismes ont été testés pour lutter contre cet agent pathogène (Holdenrieder et Greig
1998). Malgré tous les travaux, le seul véritable succès obtenu à ce jour consiste ê inoculer
des souches fraîchement coupées de pins avec le champignon Phlebiopsk gigantea (Fr.) Jül
(=Peniophora gigantea (Fr.) Massee.) afin de prévenir l'infection par le champignon
H. annosum (Rishbeth 1963). Il est actuellement utilisé de façon opérationnelle dans
quelques pays européens (Greig 1976; Korhonen et al. 1994; Sierota 1997).
Des travaux récents ont laissé entrevoir la possibilité d'utiliser un autre agent biologique, le
champignon deutéromycète Phaeotheca dimorphospora DesRochers & Ouellette, une
nouvelle espèce isolée a partir du bois d'orme (Umus urnericana L.) (DesRochers et
Ouellette 1994; Yang et al. 1993). Ce champignon a présente une activité antifongique
contre un bon nombre de champignons pathogènes d'arbre lors d'expériences réalisées Ni
vitro et in vivo (Bernier et al. 1996; DesRochers, 1992; DesRochers et Ouellette 1988;
Yang et al. 1993; Yang et al. 1994; Yang et al. 1995a, b). Son principal mécanisme
d'action comme agent de lutte biologique est relié a la production de métabolites
antifongiques. Ces substances ont fortement inhibé la croissance de H. annosum in vitro
(Yang et al. 1993). Cependant, la capacité de production des metabolites antifongiques par
P. dimorphospora dans le substrat naturel est encore inconnue. Trop souvent, les agents de
lutte biologique démontrent une efficacité dans des tests effectués sur un milieu gdosé qui
ne se manifeste pas sur le substrat naturel à traiter même sous des conditions contrôlées
(Bruce et al. 199 1 ; Cook et Baker 1983; Holmer et al. 1994; Nicolotti et Varese 1996;
Schoeman et al. 1996; Srinivasan et al. 1992). Ce matdriel est trop fiQuemment déficient
en éléments nutritifs essentiels a la production des substances toxiques. De même, les
résultats obtenus dans un substrat naturel sous des conditions contrôlées peuvent être
différents de ceux obtenus sous des conditions naturelles sur le terrain. Cette variabilité et
les succès limites sont relies à des facteurs tels les conditions environnementales, l'état du
substrat (pH, humidité) ainsi que la compétition avec les autres micro-organismes (Bruce et
King 1986; Ejechi et ûbuekwe 1994; Etheridge 1972; Morell et Sexton 1990; Nelson et
Thies 1985). Il est reconnu que les agents de lutte biologique agissent par parasitisme,
compétition pour la niche ou production de substances inhibitrices. indirectement, ces
mécanismes peuvent s'avérer efficaces en modifiant la composition de la microflore
naturelle et les interactions entre les organismes (Schoeman et al. 1996; Yang et al. 1995a).
Inversement, la compétition par d'autres espèces peut interférer sur le taux de colonisation
par l'agent de lutte (Meredith 1960; Roll-Hansen et Roll-Hansen 1980). Tous ces facteurs
peuvent avoir un impact sur le succès de l'utilisation d'un agent de lutte biologique et sont
donc à considérer au cours du développement du produit.
Malgré le succès de P. gigantea dans le traitement des souches de pins dans les pays
européens, son potentiel d'utilisation dans les plantations de pin rouge du Québec et de
l'Ontario est encore peu connu. Des travaux de Myren et Punter (1972) ont démontré
l'inefficacité du traitement des souches de pin rouge avec P. gigantea contre H. annosum
en Ontario. Cependant, ils n'ont pas fait mention du succès de la colonisation des souches
par P. gigantea qui est un facteur essentiel à l'efficacité du traitement. Phlebiopsis gigantea
est un saprophyte communément associé au processus de dégradation du bois dans les
forêts résineuses boréales et tempérées a travers le monde (Holdenrieder et Greig 1998;
Korhonen et al. 1998). En Angleterre, il est l'un des champignons les plus fréquents de la
colonisation primaire des souches de pins (P. sylvestris, Pinw nigru var calubrica Schneid)
qu'il dégrade rapidement (Meredith 1959; Meredith 1960; Rishbeth 1963). Puisque
l'introduction d'isolats exotiques d'un agent de lutte biologique dans l'écosystème peut
prbsenter un risque potentiel, l'utilisation de souches indigènes est plus appropriée. Sous les
conditions environnementales prévalant dans l'Est du Canada, il existe peu d'information
sur P. giguntea, et encore moins sur son écologie sur le pin rouge. Basham (1957) a
ultérieurement fait mention de sa présence fréquente dans les troncs de pin blanc, de pin
rouge et de pin gris (Pinus banhiana L.) dans les quelques annbes suivant un feu.
L'utilisation massive et efficace de P. gigantea requiert donc de nouvelles connaissances
concernant son écologie sous nos conditions environnementales. Pour les raisons déjà
exprimées, il serait également intéressant d'étudier son effet sur la diversite des myc&es
dégradant les tissus de pin rouge. Cette étude petmettrait d'entrwoir les effets secondaires
reliés a l'utilisation massive de P. gigantea.
Afin d'obtenir une information plus juste sur les performances de P. gigantea sur le terrain,
il serait utile de développer des méthodes permettant de discriminer les souches introduites
artificiellement de la population naturelle. Ces méthodes permettront de confirmer
l'établissement des souches introduites et de suivre leur devenir dans l'environnement.
Plusieurs études ont comparé le potentiel de méthodes classiques, particulièrement les tests
d'incompatibilité somatique, mais aussi des méthodes plus &entes utilisant les marqueurs
moléculaires pour distinguer les souches d'une méme espèce (Holmer er al. 1994; Jacobson
et al. 1993; Kohn et al. 199 1 ; Meijer et al. 1994; Mueller et al. 1996; Eüuo et al. 1995;
Rodrigues et al. 1995; Sen 1990; Stenlid 1985). Nous avons sélectionné deux méthodes. La
première, les tests d'incompatibilité somatique, repose sur le mécanisme de rejet entre deux
individus qui se caractérise par la formation d'une zone d'interaction entre les deux
lorsqu'ils sont confrontés sur un milieu gélosé. C'est une mdthode simple qui a et6 utilisée
pour déterminer la distribution de la population et les mécanismes de dispersion de
plusieurs champignons décornposeurs de bois mais aussi comme un outil pour identifier des
dicaryons (Adams et Roth 1967; Adaskaveg et Gilbertson 1987; Lewis et Hansen 1991;
Rayner et aL 1984; Wilson 199 1). La deuxième, l'amplification au hasard d'ADN
polymorphe (RAPD), est une méthode moléculaire particulièrement avantageuse
puisqu'elle ne nécessite pas de comaissances préalables de la génétique de l'organisme
visé pour la production de profils (Williams et al. 1990). Les marqueurs RAPD ont été
utilisés dans plusieurs études pour distinguer des espèces, des souches, des races et des
pathotypes de champignons (Garbelotto et al. 1993; Gosselin et al. 1995; Guthrie et al.
1992; Hamelin et al. 1996; Jungehiilsing et Tudzynski 1997; Raina et al. 1997; Smith et al.
1992).
Le but principal de la présente recherche est de développer un moyen de lutte biologique
efficace contre H. annosum dans les plantations de pin rouge au Québec. Plus
spécifiquement, nous voulons 1) vérifier la capacitb de P. dimotphospora h inhiber la
croissance de H annosum in vitro sur milieu gélosé et sur rondelles de bois (chapitre 1); 2)
comparer l'efficacité de P. dimotphospora et de P. gigantea à prévenir l'infection de
bûches de pin rouge par H. anrrosum sur le terrain et leur influence sur la colonisation
naturelle par les champignons (chapitre 2); 3) effectuer l'inventaire de la mycoflore
indigène des souches de pin rouge, acquérir des comaissances sur l'écologie de P. gigantea
et déterminer l'impact de son introduction artificiel (chapitre 3); développer une méthode
pour distinguer les isolats de P. gigantea introduits de la population naturelle (chapitre 4).
Adams, D.H.; Roth, L.F., 1967: Demarcation lines in paired cultures of Fomes cajunderi as
a basis for detecting genetically distinct mycelia. Can. J. Bot. 45, 1583- 1 589.
Adaskaveg, LE.; Gilbertson, R.L., 1987: Vegetative incompatibility between intraspecific
dikaryotic p a i ~ g s of Ganodenna lucidum and G. tsugae. Mycologia 79,603-6 13.
Anonyme, 1 992 : L'état des forêts au Canada 1992. Troisième rapport du parlement. Le
plan vert du Canada. 1 12p.
Anonyme, 1994 : Aménager pour mieux protéger sa forêt. Gouvernement du Québec,
Ministère des ressources naturelles.
Basham, J.T., 1957: The deterioration by fun@ of jack, red, and white pine killed by fire in
Ontario. Can. J. Bot. 35, 155-1 72.
Bernier, L.; Yang, D.; Ouellette, G.B.; Dessureault, M., 1996: Assessrnent of Phaeotheca
dimo rphosporu for biological controi of the Dutch elm disease pathogen, Ophiostonta ulmi
and 0. novo-ulmi. Plant Pathology 45,609-6 17.
Bruce, A.; King, B., 1986: Biological control of decay in creosote treated distribution poles.
II. Control of decay in poles by immunizing commensal h g i . Mater. Org. 2 1, 165- 1 79.
Bruce, A.; King, B.; Highiey, T.L., 1991: Decay resistance of wood removed h m poles
biologicaily treated with Tdchodenna. Holzforschung 45,307-3 1 1.
Codeme, D.; Vincent, C., 1992: La lutte biologique : toile de fond de la situation. In La lutte
biologique. Vincent, C.; Coderre, D., éds. Gaétan Morin, Boucherville, Québec, Canada.
pp.3- 16
Cook, R.J.; Baker, KF., 1983: The nature and practice of biological control of plant
pathogens. APS Press, St. Paul, Minnesota. 539 p.
DesRochers, P., 1992: Aspects biochimiques et ultrastructuraux de l'inhibition
d'Ophiostoma ulmi par Phaeotheca dimorphospora sp. nov. Thèse de doctorat.
Département des sciences forestières. Université Laval, Québec, Canada. 23 1 p.
DesRochers, P.; Ouellette, G.B., 1988: inhibition in vitro d'Ophiostoma ulmi par un
champignon deuteromycete. Naturaliste can. 1 15, 169- 172.
DesRochers, P .; Ouellette, G.B., 1994: Phaeotheca dimo*phospora spnov.: description et
caratéristiques culturales. Can. J. Bot. 72,808-8 17.
Ejechi, B.O.; Obuekwe, C.O., 1994: The effect of mixed culhues of some microfiingi and
Basidiomycetes on the decay of three tropical timbers. International Biodeterioration and
Biodegradation 33, L 73- 185.
Etheridge, D.E., 1972: Antagonistic interactions in wood-inhabiting microorganisms and
biological control of decay. In: Biological control of forest diseases, XV WFRO meeting,
Gainsville, Florida, 197 1. Nordin, V.J., éd. Ottawa: Canadian Forestry Service, pp. 37-53.
Garbelotto, M.; Bruns, T.D.; Cobb, F.W.; Otrosina, W.J., 1993: Differentiation of
intersterility groups and geographic provenances arnong isolates of Heterobmidion
annosum detected by random amplified polymorphic DNA assays. Cm. I. Bot. 71, 565-
569.
Gosselin, L.; Jobidon, R.; Bernier, L., 1995: Assessment of genetic variation within
Chondrostereum pupureum fiom Quebec by random amplified polymorphic DNA
anal ysis. Mycol. Res. 100, 1 5 1 - 158.
Greig, B.J.W., 1976: Biological control of Fomes annosus by Peniophorrr gigontea. Eur. J.
For. Path. 6 ,657 1.
Guthrie, P.A.I.; Magill, C.W.; Fredenksen, R.A.; Odvody, G.N., 1992: Random amplified
polymorphic DNA markers: a system for identifjmg and differentiating isolates of
Colletotrichum graminicola. Phytopathology 82, 832-835.
Hamelin, R.C.; Lecours, N.; Hansson, P.; Hellgren, M.; Laflamme, G., 1996: Genetic
differentiation within the European race of Gremmeniella abietina. Mycol. Res. 100,4946.
Hodges, CS. , 1969: Modes of infection and spread of Fomes annosur. AM. Rev.
Phytopath. 7,247-266.
Holdenrieder, O.; Greig, B.I. W., 1998 : Biologicd methods of control. In : Heterobusidion
annosun. Biology, ecology, impact and control. Woodward, S.; Stenlid, J.; Kajalainen, R.;
Hüttennann, A., éds. CAB international, Oxon, U.K. pp. 235-258.
Holmer, L.; Nitare, L.; and Stenlid, J., 1994: Population structure and decay pattern of
Phellinus tremulae in Populus tremula as determined by somatic incompatiibility. Can. J.
Bot. 72, 1391-1396.
Hord, H.H.V.; Quirke, D.A., 1955: Province of Ontario: Forest disease survey. In : Annual
report of the forest insect and disease survey. Dep. Agtic., Ottawa, Ontario. pp. 56-69.
Jacobson, KM., Miller, O.K., Tumer, B.J., 1993: Randomly amplified polymorphic DNA
markers are superior to somatic incompatibility tests for discriminating genotypes in natural
populations of the ectomycorrhizal f'ungus Suilhîs grmuIatus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A
90,9159-9163.
Jungehülsing, U.; Tudzynski, P., 1997: Analysis of genetic diversity in Clavicepspurpurea
by RAPD markers. Mycol. Res. 10 1, 1-6.
Kohn, L.M.; Stasovski, E.; Carbone, L; Royer, J.; Anderson, J.B., 1991: Mycelial
incompatibility and molecular markers identify genetic variability in field populations of
Scelerotinia sclerotiorum. Phytopathology 8 1,480485.
Korhonen, K.; Lipponen, K.; Ben&, M.; Johansson, M.; Ryen, 1.; Vem, K.; Seiskari, P.;
Niemi, M., 1994: Control of H. annomm by stump treatrnent with "Rotstop", a new
commercial formulation of P. gigantea. In: Proc. of the 8th Int. Conf. Root and Butt Rots,
Wik, Sweden and Haikko, Finland, August 9-1 6, 1993. Johansson, M.; Stenlid, J., éds.
Uppsala: Swed. Univ. Agric. Sci. pp. 675-685.
Korhonen, K.; Kannelsuo, S.; Vainio, E.; Hantula, J., 1998: Population structure of
Phlebiopsis gigantea in Europe. In: Root and Butt Rots (9& International Conference on
Root and Butt Rots). Delatour, C.; Guillaumin, JJ.; Lung-Escarmant, B.; Marçais, B., a s .
INRA Edition, Les Colloques n089, p. 438.
Laflamme, G.; Blais, R., 1995: Détection du Heterobasidion annosum au Québec.
Phytoprotection 76,3943.
Laflamme, G.; Blais, R.; Bussières, G., 1998: Eradication trial of annosus root rot in red
pine plantations. In: Root and Butt Rots (grh International Conference on Root and Butt
Rots). Delatour, C.; Guillaumin, JJ.; Lung-Escmant, B.; Marçais, B., éds. INRA Edition,
Les Colloques n089, pp. 375-380.
Lewis, K.J.; Hansen, E.M., 199 1 : Vegetative compatibility groups and protein
electrophoresis indicate a role for basidiospores in spread of Inonohrs tumentosus in spruce
forests of British Colombia. Cm. J. Bot. 69, 1756- 1763.
Meijer, G.; Megnegneau, B.; Linders, E .G. A., 1 994: Variability for isozyrne, vegetative
compatibility and RAPD markers in natural populations of Phomopsis subordinaria.
Mycol. Res. 98,267-276.
Meredith, D.S., 1959: The infection of Pine stumps by Fomes annosus and other fùngi.
Am. Bot. 23,455476.
Meredith, D.S., 1960: Further observations on fungi inhabiting pine stumps. Ann. Bot. 24,
63-78.
Morrell, I.J.; Sexton, C.M., 1990: Evduation of a biological agent for confrolling
Basidiom ycete attack of Douglas-fir and Southern pine. Wood and Fiber Science 22, 1 0-2 1.
Mueller, U.G.; Lipari, S.E.; Milgroom, M.G., 1996 : Amplified fiagrnent length
polymorphism (AFLP) fingerprinting of symbiotic fun@ cultwed by the fùngus-growing
ant Cyphonyrmex minuius. Mol. Ecol. 5, 119-122.
Myren, D.T.; Punter, D., 1972: An evaluation of six methods for protecting pine stump tops
tiom infection by Fomes annosus in Ontario. Cm. For. Sem., Sault Ste. Marie, Ontario, hf.
Rep, O-X-164,9p.
Nelson, E.E.; Thies, W.G., 1985: Colonization of Phellinus werii-infested stumps by
Trichoderma viride. 1. Effect of isolate and inoculum base. Eur. J. For. Path. 15,42543 1.
Nicolotti, G.; Varese, G.C., 1996: Screening of antagonistic fun@ against air-borne
infection by Heterobasidion annosum on Nonvay spmce. Forest Ecology and Management
88,249-257.
Punter, D., 1968 : F m e s annosus mot rot in Ontario. No. Inf Rep. 0-X-82. Forest research
laboratory Ontario region, Sault Ste.Marie, Ontario.
Raina, K.; Jackson, N.; Chandlee, J.M., 1997: Detection of genetic variation in Sclerotinia
homoeocarpa isolates using RAPD analysis. Mycol. Res. 10 1,585-590.
Rayner, A.D.M.; Coates, D.; Ainsworth, A.M.; Adams, J.T.H.; Willims, E.N.D.; Todd,
N.K., 1984 : The biological consequences of individudistic mycelium. In : The ecology
and physiology of the fiuigal mycelium. lennings, D.H.; Rayner, A.D.M., Us. Cambridge
University Press, Cambridge, U.K. pp. 509-540.
Rishbeth, J., 1963 : Stump protection against Fomes annosus. III. Inoculation with
Peniophora gigantea. Ann. Appl. Bi01 52,63077.
Rizzo, D.M.; Blanchene, R.A.; May, G., 1995: Distribution of Amillaria ostoyae genets in
a Pinus resinosa - Pinus banksiana forest. Can. J. Bot. 73,776-787.
Rodrigues, K.F.; Petrini, O.; Leuchhnann, A., 1995: Variability arnong isolates of Xylaria
nrbensis as detemined by isozyme analysis and somatic incompatibility tests. Mycologia
87,592-596.
Roll-Hansen, F.; Roll-Hansen, H., 1980: Microorganisms which invades Picea abies in
seasonal stem wounds. 1. General aspects. Hymenoniycetes. Eur. J. For. Path. 1 O, 32 1-339.
Schoeman, M.J.; Webber, J.F.; Dickinson, D.J., 1996: The efTect of diffisible metabolites
of Trichudenna harzianurn on in viiro interactions beîween basidiomycete isolates at two
different temperature regimes. Mycol. Res. 100, 1454- 1458.
Sen, R., 1990: Intraspecific variation in two species of Suillus fiom Scots pine (Pinw
sylvestris L.) forests based on somatic incompatibility and isozyme analyses. New Phytol.
1 14,607-6 1 6.
Sierota, Z.H., 1997: Dry weight loss of wood after the inoculation of Scots pine stumps
with Phlebiopsis gigantea. Eur. J. For. Path. 27, 179-1 85.
Smith, M.L.; Bnihn, LN.; Anderson, J.B., 1992: The fiingus Amillano bulbosa is arnong
the largest and oldest living organisms. Nature 356,42843 1.
Srinivasan, U.; Staines, H.J.; Bruce, A., 1992: Influence of media type on antagoaistic
modes of Trichoderma spp. against wood decay basidiomycetes. Mat. Org. 27,30 1-32 1.
Stedid, J., 1985: Population structure of Heterobasidion annomm as determinal by
somatic incompatibility, sexual incompatibility, and isoenzyme patterns. Can. J. Bot. 63,
2268-2273.
Williams, I.G.K.; Kubelik, A.R.; Livak, K.J.; Rafalski, LA.; Tingey, S.V., 1990 : DNA
polymorphisms amplified by arbitrary primers are usefid as genetic markers. Nucl. Ac. Res.
18,653 1-6535.
Wilson, A.D., 199 1 : Somatic incompatibility in dikaryotic-monokaryotic and dikaryotic
pairings of Echinodontium tinctorium. Can. J . Bot. 69,271602723.
Whitney, R.D., 1988 : L'ennemi caché. Transfert de la technologie concernant les
pourridiés. Min. Rich. Nat. Ont. Et S m . Can. For., Sault Ste. Marie, Ontario. 35 p.
Woodward, S.; Stenlid, J.; Karjalainen, R.; Hüttennann, A., 1998 : Heterobasidion
annosum. Biology, ecology, impact and control. CAB Internationai, Oxon, U.K. 589p.
Yang, D.; Bernier, L.; Dessureault, M., 1994: Biological control of Septoria leaf spot of
poplar by Phaeotheca dimorphopsora. Plant Dis. 78,82 1-825.
Yang, D.; Bernier, L.; Dessureault, M., L995a: Phaeotheca dimorphospora increases
Trichodema honianum density in soi1 and mppresses red pine dampingsff caused by
Cylindrocludium scoparium. Can. I. Bot. 73,693-700.
Yang, D. ; Laflamme, G.; Bernier, L. ; Dessureault, M., 1 995b: Pheotheca dimorphospora
as a potentiai biocontrol agent for shoot blight caused by Gremmenieh abietina. Cm. J.
Plant Pathol. 17,7- 12.
Yang, D.; Plante, F.; Bernier, L.; Piché, Y.; Dessureault, M.; Laflamme, G.; Ouellette,
G.B., 1993: Evaluation of a fungal antagonist, Phaeotheca dimorphospora, for biological
control of tree diseases. Can. J. Bot. 7 1,426433.
CHAPITRE 1
Biological control of Heterobasidion annosum by Phaeotheca diniorphosporrr.
1. In vitro investigation studies.
Le champignon antagoniste Phaeorhecu dimolphosporn a été teste in vitro, sur milieu
gélosé et sur des disques de bois irradiés, pour évaluer son efficacité contre des souches de
type P (Est du Canada) et S (Finlande) de Heterobasidion annosum. La technique en double
couche a démontré la production de substances antifongiques difhsibles sur un milieu
gélosé ainsi que dans des disques de bois de pin rouge et d'épinette de Norvège. Les
métabolites ont inhibé la croissance de l'agent pathogène sur les deux types de substrat.
Parallèlement, des confrontations directes effectuées dans des disques de bois ont montre
que l'application de P. dimo*phospora 7 jours avant annosum assure une protection
complète alors qu'elle n'est que partielle si I'antagoniste ne dispose que d'une seule
journée d'avance. L'inhibition de la croissance a été supérieure pour les isolats de type S
sur l'épinette de Norvège. La méthode de confrontation directe sur bois s'est avérée plus
sensible que celle en double couche car elle a décelé des différences significatives entre les
résultats obtenus pour les deux isolats de type P sur les rondelles de pin rouge. Les résultats
in vitro ont donc démontré que P. dimorphospora colonise les tissus du pin rouge et de
l'épinette de Norvége et y utilise les composés présents dans le bois pour la production de
substances antifongiques.
1.1 INTRODUCTION
Heterobasidion annosum (Fr.) Bref is an imporiant root and butt rot disease of many
conifers throughout the northem hemisphere (Woodward et al. 1998). This pathogen is
characterized b y at least three different intersterility groups, named P (pine), S (spruce) and
F (fir), depending on host preferences and differential pathogenicity (Capretti et al. 1990;
Garbelotto et al. 1996; Korhonen 1978). Each group has its own physiological,
epidemiological and ecological characteristics (Korhonen and Stenlid 1998). in eastern
Canada, H annomm has been present in Ontario since 1955, and only recently (1989) in
Québec, where it has been exclusively found in red pine (Pinus resinosa Ait.) plantations
(Hord and Quirke 1955; Laflamme and Blais 1995). Research into potential biological
controls to prevent the spread of this pathogen in eastern Canada has recently been
stimulated to develo p environrnentall y safe al tematives to replace chemical products. S ince
the pioneering work done by Meredith (1959) and Rishbeth (1963), many organisms,
mainly fungi, have been studied for their potential as biological control agents against
H. annosum on pine, spnice and fir species (Holdenrieder and Greig 1998). Until now, the
only real successfÙ1 one, the basidiomycete Phlebiopsis giga~tea (Fr.:Fr.) Jül., is presentiy
being used at an operational scale in a few countries (Greig 1976; Korhonen et al. 1994;
Sieiota 1997).
In earlier experiments conducted in vitro, the deuteromycete Phaeotheca dimorphospura
DesRochers & Ouellette, a recently desaibed species isolat4 fiom white elm (Ulmus
americana L.), has shown antagonistic activity against a wide range of fungi causing tree
diseases (DesRochers and Ouellette 1994; Yang et al. 1993). In more specific studies,
P. dimorphospora reduced the severity and the rate of development of leaf spot (Septuria
musiva Peck) on poplar cuttings (Yang et ai. L994), shoot blight (Gremmeniella abietina
( Lagerb.) Morelet) (Yang et al. 1 99913, and damping-o ff (Cylindroc/udiim scopanùm
Morg.) on red pine seedlings (Yang et al. 1995a); as well as Dutch elm disease
(Ophiostuma ulmi (Buism.) Nannf) on white elm seeâlings (Bernier et al. 1996).
Phaeotheca dimophospoa opefates as a biologîcal control agent mostiy by the production
of antifungai met abolites. In vifro assays showed that these antifungai compounds strongl y
inhibited the mycelial growth of H. annosum (Yang et al. 1993). Thus, P. dimorphospora
appears to be a promising biological control agent against this pathogen. However, W e r
investigation is necessary to ascertain its potential and obtain a better understanding of its
effect against H. annosum.
Production of antifungal cornpounds by P. dimorphospora have been demonstrated on agar
and in liquid media (DesRochers and Ouellette 1988; Yang et al. 1993). However, treated
material in the field is fiequently deficient in essential nutrients, consequently limiting
production of antifungal metabolites (Bruce et al. 1991). Thus, production of such
substances in natural substrates by P. dimorphospora has yet to be demonstrated. A large
number of potential biocontrol agents have too often shown promising potential afier
primary screening in agar test systems and failed to succeed when tested on natural
substrates under control conditions or in the field (Bruce et al. 199 1 ; Cook and Baker 1983;
Schoeman et al. 1996; Srinivasan et al. 1992).
The aims of the present study were to venfy the production of antifungal metabolites by
P. dimorphospora in red pine and Norway spruce (Picea abies L.) stem discs, as well as to
establish the capacity of P. dimorphospora to colonize wood in viho and to rapidly
suppress the infection caused by H. annosum (P and S types). Two different methods were
used. The first method, the bi-layer test has proved to be a rapid and relevant method for
screening potential control agents of wood decay (Etheridge and Craig 1973; Schoeman et
al. 1994). This technique allows for the production of antifùngal metabolites in wood and
makes it possible to compare with production on agar. In a second method, direct
confrontation between fungi on wood discs was used to mimic interactions o c c h g in the
field. This test has been successfulIy used with other antagonistic agents (Lundborg 1986;
Rose et al. 1980).
1.2 MATERML AND METHODS
1.2.1 Fungal culture
The Phaeotheca dimorphospora strain (QFB 19795) was isolated fiom an e h tree in
Québec city (DesRochers and Ouellette 1988). Four strains of H. annosum were used in
this study. Two P type strains were recovered nom h i t bodies found on red pine stumps
from Lac LaBlanche, Québec (Ha014) and Larose Forest, Ontario (Ha044). They were
selected for their site of origin. Two S type cultures fiom Finland were provided by Dr.
Korhonen (92 119 and 92033). All strains were maintained in test tubes on 3% malt agar
(MA) at 4OC.
1.22 Wood material
Stem discs, 7 to 8 cm in diarneter and 1 cm in thickness, were cut from about 10 year-old
living red pine and Norway spruce trees near Quebec city. Bark was removed and discs
were stenlized by gamma irradiating with 3 Mrads (25 KGy) for 6 h p r e s e ~ n g the
biochemical features of the wood. They were then stored at -20°C until used.
1.2.2 BCIayer assay
Inhibition of mycelial growth of H annosum by antagonistic metabolites produced by
P. dimorphospora was evaluated by a modified bi-layer technique (Schoeman et al. 1994).
Tests were carrieci out on agar and wood discs simultaneously to compare the results and
estimate the relevance of agar tests. The antagonist fùngus was first cultured in 125-mL
Erlenmeyer flasks containing 50 mL of 2% Difco potato dextrose broth (PDB). The
cultures were incubated for two weeks at room temperature (ca. 22OC). The flasks were
hand shaken twice a week. Mycelium fiom the flasks was harvested by filtration, washed to
removed nutrients and exudates, and blended with sterile distilled water. The concentration
of the colony forming unit (cfù) suspension, composed of hyphal and microsclerotial
fragments, was adjusteci to 1.5 x 106 cWmL of water. Two milliliters of suspension was
spread uniformly on the surface of 3% MA in Petri dishes (90 x IS mm) or on wood discs
that were previously put on top of a wet filter paper matman, no 2), to maintain a high
relative humidity, in deep glass Petri dishes (100 x 20 mm). A total of 7.0 x 10' cfii/cm2
were applied on both agar and wood discs. Al1 Petri dishes were wrapped with parafilm and
incubated in the dark at 24OC for one week to allow for growth of the fungus and the
production of antifungal metabolites.
Following incubation, plates or wood discs were overlaid with a 10 mL aliquot of 2% water
agar, cooled to about 45OC. AAer the agar had set, seven mycelial plugs, cut with a 5 mm
cork borer fiom actively growing colonies of the four H. annosum strains, were placed
facing d o m on the fresh agar surface of each plate or disc. One plug was put into the
centre and the other six at equal distances from each other, 1 .O cm from the margin. The P
strains were put ont0 red pine discs and the S strains, onto Norway spruce discs. After a
fiirther 48 h incubation, H. annosum growth was evaluated with the aid of a dissection
microscope. B a d on work done by Schoeman et al. (1994), inoculum plugs were assessed
according to six distinct categories: 0 = no mycelial growth; 1 = presence of a few
dispersed mycelial bristles (short filaments) coming out of the plug; 2 = cuntinuous growth
of mycelial bnstles around the plug periphery; 3 = plug completely covered with myceliurn
but no growth ont0 the adjoining aga; 4 = mycelial growth on the piug and extending
linearly up to 1 cm ont0 the bi-layer surface; 5 = mycelial growth extending to more than
1 cm beyond the plug ont0 the bi-layer surface. A randomized comptete block design was
used for the factorial experiment with two substrate levels and four H. annomm strain
levels. Each block consisted of a shelf inside an incubator. Each treatmeat combination
included five replicates. Data were treated by analysis of variance (ANOVA) uskg the
GLM procedure (SAS 1989).
1.2.3 Direct confrontation on wood
Direct confrontation on wood discs was pedomed to detetmine the potential of
P. dimorphospora to colonize wood and to restrict the level of infecfion caused by conidia
of H. annosum. A propagule suspension (1.5 x 1 o6 cWmL of water) of P. dimophospora
was prepared and 2 mL was spread over the surface of the imdiated wood discs (red pine
and Norway spmce) as described for the bi-layer assay. In the Petri dishes, maIl glas b a h
were put between the filter paper and the disc to avoid any over moistening of the latter.
Control discs to be only treated with H. annosum were spread with 2 mL of sterile distilled
water. The wood segments were incubated in the dark at 24T.
Afler an incubation period of either one or seven days, discs were treated with H. annosum.
Conidial suspensions ( 1.1 x 1 o3 conidialml) of the four strains (HaOi4, Ha044, 92 1 19 and
92033) were prepared by washing the surface of 2-week-old actively growing colonies
grown on 1.5% Difco malt extract agar (MEA) with stede distilled water. Two milJiliters
of suspension was spread uniformly over the surface of the wood discs. A total of
50 conidia/m2 were poured. The P strains were put ont0 red pine discs and the S strains,
ont0 Norway spruce discs. Control discs to only contain P. dimorphospora were c o v d
with 2 mL of sterile distilled water. Discs were placed back in the incubator at 24OC. Petri
dishes were lefi unwrapped for 24 h after H. anriosum inoculation to allow for better
germination. Colonization of the wood by both fimgi was evaluated five weeks afier 1s t
inoculation of the pathogen. Discs were split in six parts through the center and wood chips
(ca. 2 x 2 x 1 mm) were aseptically taken from 15 positions, 12 in sapwood and three in
heartwood, at 5 mm from the upper surface of the disc. Samples were put ont0 1.5% MEA,
and grown at room temperature (ca. 22OC) for one week.
A randomized cornplete block design was used for the factorial experiment with four
H annosum strain levels, two P. dimorphospora levels, and two days of pre-inoculation
leveIs. Each block consisteci of a shelf inside an incubator. Each treatment combination
included six replicates. A total of 96 wood discs were treated. Data fiom attempted
isolations (presence or absence) of H. annosum in wood chips were treated by logistic
regression analysis using the CATMOD procedure (SAS 1989). Conûasts were performed
to generate the probabilities of differences between types (P, S) and between sûains within
the same type.
1.3 RESULTS
13.1 Bi-Iayer assay
The results obtained for the bi-layer technique showed the production of antagonistic
metabolites by P. dimorphosporu. Both agar and wood discs allowed for sufficient growth
of the h g i for effective antagonistic action. Growth of P. dimorphospora on the surface
of agar and wood was visually observed within 24 h after the inoculation, showing a rapid
colonkation. Presence of P. dimorphospora on these substrates restricted the mycelial
growth of dl four strains of H. annosum in the two systems (Table 1.1). Most often the
growth was restricted to a few scattered mycelial brides on the plugs. This should be
considered as evidence for the presence of antifbngal substances. Statistical analysis
showed no significant (P=0.05) interactions nor differences between the four strains nor
between agar or wood discs. However, we observed that on wood discs, there was almost
no reduction of the growth of H. annosum (results reached category 4) for plugs put over
the centre. This was not the case for those put in the centre of the agar system where growth
of P. dimorphospora was uniform. In the absence of P. dimorphospora, type of substrate or
shains had no influence on H. annosum growth (data not shown). No inhibition (category
5) of the myceiial growth was observed except for plugs put over the centre on red pine
discs where the growth was often scored in category 4.
13.2 Direct confrontation on wood
For al1 spruce and red pine discs not inoculated with H. annosum, P. dimorphospora
occurred in more than 83% (1 2.W 5) of the samples (Table 1.2). Lower success in isolating
the antagonist was associated with high presence of the pathogen inside the red pine discs.
Thus, less isolations of P. dimorphosporo were obtained in red pine discs, when Ha014
(lO.Ul5) and Ha044 (7.3115) were inoculated only one day afier the antagonist. Presence
of both b g i on the same sample only happened once on both red pine, and Norway spruce
discs. Isolation of P. dimorphospora was extremely variable within each treatment, so no
statistical analysis was done. The antagonist was isolated h m al1 parts of the wood discs.
Table 1.1. Growth inhibitiona of four strains (P and S types) of
Heterobasidion annosum caused by Phaeotheca diniorphospora on
agar and wood discs fiom the bi-layer assay.
-
H. annosum Substratum
(isolates)
Ha0 14 (P)
Ha044 (P)
92033 (S)
92 1 19 (S)
Values in table are the average scores for five agar plates or wood discs. Each score is the mean of seven plugs, Maximum inhibition = O, no inhibition = 5.
Red pine and Norway spnice discs were used for P and S saains respectively. No significant interactions nor differences were observed (ANOVA,
P=0.05).
Table 1.2. Isolation of Phaeoiheca dimorphospora and Heterobasidion annosum
(P and S strains) fiom wood discs.
Treatment Pre-inocuIation Isolation (n= 15)'
(days) P. dimorphospora H annowrn
H. annosum (Ha0 14 , P)
P. dimorphospora + H. annosum (Ha0 14 , P)
H. annosum (Ha044, P )
P. dimorphospora -1- H. annosum (Ha044 P)
H. annosum (92033, S )
P. dimorphospora + H. annosum (92033, S )
H. annosum (92 1 19, S)
P. dimorphospora + H. annosum (92 1 19, S)
P. dimorphospora (P. resinosa)
P. dimorphospora 1 12.5 (P. abies) 7 14.3
' Values in table are the mean for six wood discs.
(-) indicates that the fungus was neither inoculated nor isolated.
Most of the the, a yellow colour was produced almost dl over the disc for red pine.
Spnice discs reacted differently, the yellow pigment was resûicted to the periphery of the
dis% corresponding to a very dense sapwood. Wood sarnples taken close to the centre
almost never exhibited the pigmentation. The yellow wood samples were mainly associated
with the presence of P. dimorphospora, whereas the fungus was present even if &ere was
no pigmentation. No isolation of the pathogen was made in coloured samples.
Presence of H. annosum was first detected by visual observations on the upper surface of
control discs not inoculated with P. dimorphospora. Red pine control discs were entirely
covered by a myceliurn layer of H. annosum in seven days, while it took between 10 to 15
days on spruce discs. Isolation attempts of the pathogen fiom the control discs were
successfûl. They yielded an average isolation rate of l4/ 15 (93.3%) for red pine discs, and
13.74 5 (9 1 .O%) for spnice (Table 1.2). The protective effect of P. dimorphospora was
clearly observed in this experiment. Wood discs inoculated with the antagonist seven days
before K. annosum were not colonized by the pathogen at all. This treatment did not reveal
any visual growth of the pathogen on the surface of both tree species discs. However, a one
day incubation was not sufficient to completely inhibit the pathogen. More red pine discs
(83% for both strains) conditioned for one day with the antagonist were colonized on the
surface by the pathogen than spruce discs (17% for 921 19; 33% for 92033) (data not
shown). The surface ma colonized by strain Ha014 was about IO%, while 25% was
covered by strain Ha044 We estimated that less then 5% of the surface of spruce discs was
colonized by the S strains.
Logistic regression analysis was undertaken to determine if the reduction in the isolation of
H. annosum was dependent on the presence of P. dimorphospora, the strains of
H. unnosum or the number of days of pre-inoculation (Table 1.3). For the analysis, the
mode1 could be fitted well (iikelihood ratio not significant at PSO.05) excluding the three
factor interaction and the "strains x days" interaction. Heterobasidion unnosum strains had
a significant (P10.01) impact on îhe isolation. However it was influenced by the presence
of the antagonist as demonstrated by a significant (PSO.01) ''strains x P. dimorphosporu"
interaction. A significant (PSO.05) contrast showed that in the presence of
P. dimorphospora, both types (P, S) gave different results. When discs were conditioned
with the antagonist, type P strains had greater decrease in the isolation of H. annosum than
S type strains. Contrasts also showed a significant diffaence (PS0.05) between strains
Ha0 14 and Ha044 in interaction with the presence of P. dimorphospora. The pathogen was
detected in 67% of the discs for strain Ha014 and only 50% for Ha044 No difference in
isolation was observed between the two S strains on spruce discs. Strain 92033 was
isolat& only fiom one disc and strain 921 19 could not be isolated at al1 even if it was
visually detected on the disc surface. The nurnber of days of advanced growth by the
antagonist pnor to the application of H. unnosum affected the presence of the pathogen
significantly (PS0.0 1). However, this effect depended on the presence of the antagonist as
demonstrated by a significant (PS0.05) "days x P. dimorphospora" interaction. Seven day
growth by P. dimorphospora caused the greatest decrease in the isolation of H annosum in
wood tissue compared with one day. No decrease was observed in control discs (without
P. dimorphospora).
Table 1.3. Logistic regression analysis and contrasts (C) of attempted isolations of
Heterobasidion annosum ( P and S strains) fiom wood discs.
Source of variation d f Chi-Square P
Btocks
S trains
C 1 : Ha0 14-Ha044 vs 92033-92 1 19 C2: Ha014 vs Ha044 C3: 92033 vs 921 19
P. dimorphospora
Strains x P. dimorphospora
Cl x P. dimorphospora C2 x P. dimorpliospora C3 x P. dimorphospora
Da YS
Days x P. dimorphospora
Likelihood ratio - - - - - - -
Note: df, degrees of freedom; ns, not significant at PS 0.05. * significant at P 5 0.05 ** significant at P S 0.01 *** significant at P S 0.00 1
1.4 DISCUSSION
In previous in vitro dual culture tests on agar, presence of an important inhibition zone
suggested that the antagonistic factor was a product of actively p w i n g mycelium of
P. dimorphospora (Yang et al. 1993). Results obtained by the bi-layer technique in this in
vitro study demonstrated the production of fùngitoxic diffisible substances by
P. dimorphospora in a nanual substrate. This method was used by Schoeman et al. (1994)
to show the production of metabolites by Trichodema spp. Contrary to other hngi studied
as biocontrol agents, P. dimophospora displayed similar activity on agar and wood
systems in vitro (Ejechi and Obuekwe 1994; Holrner and Stenlid 1994; Lundborg and
Unestam 1980; Nicolotti and Varese 1996). Agar media contain an abundant sugar source
that does not necessarily represent the nutritional statu of wood (Srhivasan et al. 1992).
This might affect fungal growth rate and interactions between the antagonist and the
pathogen (More11 and Sexton 1990). The importance of media composition for the
production of antifungal metabolites by P. dimorphospora has been demonstrated by
DesRochers (1992). In the present study, this antagonist was able to use compounds
present in the wood, probably non-structural carbohydrates such as simple sugars, to
produce inhibitory substances.
Results from agar tests are in agreement with those obtained by Yang et ai. (1993), where
hyphae and conidia of H. annosum were very sensitive to metabolites produced by
P. dimorphospora, and lysis was obtained within 24h in vitro. In the present investigation,
50 growth occurred on the second layer of agar on both substrates, suggesting that lysis
and death of hyphae occurred through contact with diffisible metabolites except on the
plugs put over the centre. This may be due to toxic compounds found in heartwood tissues
that could inhibit the growth of P. dimorplrospora. Afier seven days, growth of
P. dimorphospora seemed to be reduced in that part of the disc associated with heartwood
tissues. However, isolation atternpts made after five and six weeks of growth revealed
colonization of the wood tissue close to the centre. Phaeotheca d i ~ h i o s p o r a must have
outgrown it afkr the first week. Further investigation would be needed to clearly
dernonstrate this.
In the direct confrontation test, propagules (ch) from the suspension grew on the surface
and into the wood tissue. The capacity of P. dimorphospora to colonize the wood
suggested by the hi& yield of isolation, was associated with antagonistic activity. An
advantage of this method over the bi-layer technique is the possibility to observe the achial
competition between both fun@ for nutrients. This type of competition is unlikely to occur
on agar, a rich medium (Lundborg and Unestam 1980). Reduction in the colonization
incidence by the antagonist on red pine discs when H. annosum was applied after ody 24h
strongly suggests competition for substrate between both fungi. This indicates the
importance of tests allowing for direct confrontation. Furthemore, results revealed that the
bi-layer method is not as sensitive as the direct confrontation on wood. Indeed, the latter
allowed to discriminate between tree species and even between P strains. Faster
germination and growth of the different H. annosum strains on wood or better resistance to
the antifungal substances could explain these results. However, previous dual culture on
MA (3%) had not demonstrated significant differences between the two P sûains
(un pu blis hed data). Moreover, those two were not signi ficantl y di fferent fkom the S strains.
This seems to confinn the sensitivity of the technique, and supports the need to reproduce
conditions similar to field situations in the laboratory. In addition, it reflects the fact that
several factors are involved for the antagonistic effect in a natuml substrate. As we saw by
the different degree of control for the two P strains in stem discs it is clear that an
evaluation of more strains of both types would be required. Reaves and Crowford (1994)
underlined the importance of screening numerous antagonistic isolates against several
isolates of the target fun@ to detemine which are most effective. For P. dimorphospora
only one isolate has been identified until now. Work aimed at finding new isolates is
presently being canied out.
The presence of a yellow pigment in wood tissue of both tree species is probably
associated to the release of difîùsible metabolites by P. dimorphospora. These metabolites
were composed of antifùngal compounds as demonstrateci by the bi-layer assay. The
production of the pigment was much more important in red pine discs. This must be relatai
to the differences in the characteristics of woody tissues between the two species. Despite
this difference, control of H. annosum was better on spnice discs for a one day
conditioning. Inhibition was induced even in many non coloud wood portions.
Suppression of H. annosurn by other uncoloureà antifungal substances or simple
cornpetition for nutrients and space could also explain these results.
For both techniques and substrates, seven days of conditioning with P. dimorphospora
were sufficient for completely inhibiting the growth of H. annosum. However, one day
provided only partial control particularly on red pine discs. Success on Nonvay spnice
might be a consequence of, as it appeared visually, the slower growth rate of S strains on
the wood discs. In light of these results, P. dimorphospora can be seen as an agent of
prevention not as a cure. This is dso in agreement with results obtained by Bernier et al.
(1996) using this fungus against 0. ulmi. Despite this, it still causes a strong inhibition of
H. annosum growth especially on spruce. Control of H. annosum when it is already present
in a plantation is difficult since it can spread by root-to-root contacts. The Québec situation
actually allows to focus on preventative means to inhibit air-bome stump infection
(Laflamme and Blais 1995).
Even if P. dimorphospora was isolateci fiom an e h tree, it can colonize red pine and
Norway spnice, to use the naturd substrate for antifungal metabolite production, and
survive in the wood for at least six weeks under controlled conditions. Colonization
incidence and survival of the antagonistic agent are two important factors which cm limit
the success in controlling the pathogen (Bruce et al. 1991; Ejechi 1997; Lundborg and
Unestam 1980). It is believed that H. annosuni can enter into fiesh stumps and infect
tissues only in the first two weeks after cutting (Hodge 1969). Survival of
P. dimorphospora over a long period appeared not to be absolutely necessary as long as
other organisrns dso wlonized the stumps. The use of stem discs provided a suitable
mode1 to study the interaction between the two h g i . nie success on wood discs in vitro is
an indication for the potential use of P. dimorphospora in the field. Its ability to grow and
to survive long enough for restricting the penetration of H. annosum in a natural
environment where temperature, humidity and corn petit ion wi th other organisms are not
controlled, still has to be verified.
1s REFERENCES
Bernier, L.; Y mg, D. ; Ouellette, G.B. ; Dessweault, M., 1 996: Assessrnent of Phaeoiheca
dimorphospom for biological control of the Dutch elm disease pathogen, Ophiostoma ulmi
and 0. novo-ulrni. Plant Pathology 45,609-6 17.
Bruce, A.; King, B.; Highley, T.C., 1991: Decay resistance of wood rernoved fiom poles
biologicdly treated with Trichoderma. Holzfonchung 45,307-3 1 1.
Capretti, P.; Korhonen, K.; Mugnai, L.; Romagnoli, C., 1990: An interstenlity group of
Heterobasidion annosum specialized to Abies alba. Eur. J. For. Path. 20,23 1-240.
Cook, R.J.; Baker, K.F., 1983: The nature and practice of biological control of plant
pathogens. APS Press, St. Paul, Mimesota. 539 p.
DesRochers, P., 1992: Aspects biochimiques et ultrastructuraux de l'inhibition
d'Ophiostoma ulmi par Phaeoiheca dimorphospora sp. nov. Ph. D. Thesis, Département
des sciences forestières. Univenité Laval. Québec. Canada. 23 1p.
DesRochers, P.; Ouellette, G.B., 1988: Inhibition in vitro d'ophiostomu ulmi par un
champignon deuteromycète. Naturaliste c m . 1 1 5, 169- 1 72.
DesRochers, P.; Ouellette, G.B., 1 994: Phaeotheca dimorphospora sp.nov. : description et
caratéristiques culturales. Can. L Bot. 72,808-8 17.
Ejechi, B.O., 1997: Biologicai control of wood decay in an open tropical environment with
Penicillium sp. and Trichoderma viride. International Biodeterioration and Biodegradation
39,295-299.
Ejechi, B.O.; Obuekwe, C.O., 1994: The effect of mixed cultures of some microhngi and
Basidiomycetes on the decay of three tropical timben. International Biodeterioration and
Biodegradation 33, 173- 1 85.
Etheridge, D.E.; Craig, H.M., 1973: A bilayer plate technique to detect broad spectrum
antagonism in microorganisms and its application to wood inhabiting fungi. Can. J.
Microbiol. 19, 1455-1458.
Garbelotto, M.; Ratcliff, A.; Bruns, T.D.; Cobb, F.W.; Otrosina, W.J., 1996: Use of Won
specific competitive priming PCR to study host speceficity, hybridation, and intergroup
gene flow in intersterility groups of Heterobasidion annosum. Phytopathology 86,543-55 1.
Greig, B.J.W., 1976: Biological control of Fomes annosur by Penioplroro gigunteo. Ew. L
For. Path. 6,6S-7 1.
Hodge, C.S., 1969: Modes of infection and spread of Fomes annosus. Ann. Rev.
Phytopathol. 7,2470266.
Holdenrieder, O.; Greig, B.J.W., 1998 : Biological methods of control. In : Heterobasidion
annosuni. Biology, ecology, impact and control. Ed. by Woodward, S.; Stenlid, J.;
Karjalainen, R.; Hüttermann, A. CAB International, Oxon, U.K. pp. 235-258.
Hoimer, L.; Stdid, J., 1994: Biologicai control of Heterobasidion annosum by cord-
forming Basidiomycetes. in: Proc. of the 8" Int. Co& Root and Butt Rots, Wi Sweden
and Haikko, Finland, August 9-16, 1993. Ed. by Johansson, M.; Stenlid, J. Uppsala: Swed.
Univ. Agric. Sci. pp. 686-695.
Hord, H.H.V.; Quirke, D.A., 1955: Province of Ontario: Forest disease survey. In: Anaual
report of the forest insect and disease survey. Dep. Agric., Ottawa, Ontario. pp. 56-69.
Korhonen, K., 1 978: htersterility groups of Heterobasidion annosum. Communications
institute Forestalia Fenniae 94, 1-25.
Korhonen, K.; Lipponen, K.; Bendz, M.; Johansson, M.; Ryen, L; Venn, K.; Seiskan*, P.;
Niemi, M., 1994: Control of H. annosum by stump treatment with "Rotstop", a new
commercial formulation of P. gigantea. In: Proc. of the 8" Int. Conf Root and Butt Rots,
Wik, Sweden and Haikko, Finland, August 9-16, 1993. Ed. by Johansson, M.; Stenlid, J.
Uppsala: Swed. Univ. Agric. Sci. pp. 675-685.
Korhonen, K.; Stenlid, J., 1998 : Biology of Heterobasidion annosum. ui : Heterobasidion
annosum. Biology, ecology, impact and control. Ed. by Woodward, S.; Steniid, J.;
Karjalainen, R.; Hüttenann, A. CAB International, Oxon, U.K. pp. 43-70.
Laflamme, O.; Blais, R., 1995: Détection du Heterobasidion annosun, au Québec.
Phytoprotection 76,3943.
Lundborg, A., 1986: Two antagonistic fiingi, 'D37' and Scytalidium album, reduce the
formation of bore holes by Heterobasidion annosum in Norway spruce (Picea ab&). Can.
J, Bot. 65: 916-920.
Lundborg, A.; Unestam, T., 1980: Antagonism against Fonres annosur. Cornparison
between different methods in viîro and in vivo. Mycopathologia 70, 107- L 15.
Meredith, D.S., 1959: The infection of pine sturnps by Fomes annosus and other h g i .
AM. Bot. 23,455476.
Morrell, J.J.; Sexton, C.M., 1990: Evaluation of a biological agent for controlling
Basidiomycete attack of Douglas-fir and Southeni pine. Wood and Fiber Science 22, 10-2 1.
Nicolotti, G.; Varese, G.C., 1996: Screening of antagonistic fungi against air-bome
infection by Heterobasidion annosum on Norway spmce. Forest Ecology and Management
88,249-257.
Reaves, J.L.; Crowford, R.H., 1994: In vifro antagonism by Ufocladium botrytis of
Phellinus weirii, Hetero basidion annosum, and Amillaria osioyae. Eur. J. For. Path. 24,
364-375.
Rishbeth, J., 1963: Stump protection against Fomes annosus. III. Inoculation with
Peniophora gigantea. Ann. Appl. Biol. 52,63-77.
Rose, S.L.; Li, C.-Y.; Hutchins, A.S., 1980: A Sîreptomyces species antagonist to Phellinus
weirii, Fomes annosus, and Phytophtora cinnamomi. Can. J. Microbiol. 26,583 -5 87.
SAS institute Inc., 1989: SAWSTAT user's guide, version 6. 4h ed. Vol. 1. SAS Institute
inc., Cary, N.C.
Schoeman, M.J.; Webber, J.F.; Dickinson, D.J., 1994: A rapid method for screening
potentid biological control agents of wood decay. Eur. J. For. Path. 24,154159.
Schoeman, M.J.; Webber, J.F.; Dickinson, D.J., 1996: The effect of diffisible metabolites
of Trichodenna harrianum on in vitro interactions between basidiomycete isolates at two
di fferent temperature regimes. Mycol. Res. 1 00, 1 454- 1 458.
Sierota, Z.H., 1997: Dry weight loss of wood after the inoculation of Scots pine stumps
with Phlebiopsis gigantea. Eur. J . For. Path. 27, 179- 185.
Srinivasan, U.; Staines, H.J.; Bruce, A., 1992: Influence of media type on antagonistic
modes of Trichodenna spp. against wood decay basidiomycetes. Mat. Org. 27,301-32 1.
Woodward, S.; Stenlid, J.; Karjalainen, R.; Hüttemann, A., 1998 : Heterobasidion
annosum. Biology, ecology, impact and control. CAB international, Oxon, U.K. 589p.
Yang, D.; Bernier, L.; Dessureault, M., 1994: Biological control of Septoria leaf spot of
poplar by Phaeotheca dimorphopsora. Plant Dis. 78,82 1-825.
Yang, D.; Bernier, L.; Dessureault, M., 1995a: Phaeotheca dimorphospora increases
Trichodenna honianum density in soi1 and suppresses red pine dampingsff caused by
Cylindrocladium scoparium. Can. J. Bot. 73,693-700.
Yang, D.; Laflamme, G.; Bernier, L.; Dessureault, M., 199%: Phaeotheca dimorphospora
as a potential biocontrol agent for shoot blight caused by Gremmeniella abietina. Can. J.
Plant Pathol. 17,742.
Yang, D.; Plante, F.; Bernier, L.; Piché, Y.; Desswault, M.; Laflamme, G.; Ouellette,
G.B., 1993: Evaluation of a fùngal antagonist, Phaeotheca dhorphospora, for biologicai
control of tree diseases. Can. J. Bot. 7 1,426-433.
Biological con trol of Heterobasidim unnosum by Phueotheca dinr orphospora.
11. Field investigation study.
Des essais réalisés sur le terrain sur des bûches de pin rouge partiellement enterrées ont
indiqué que le meilleur traitement pour inhiber l'infection par Heterobusidion annomm est
l'application de Phlebiopsis gigantea. Ce dernier a complètement inhibé la colonisation par
l'agent pathogene principalement en occupant abondamment et rapidement les tissus du
bois. L'application de Phaeotheca dimorphospora sous forme d'une suspension liquide n'a
démontré aucune efficacité, elle a même favorise la colonisation des tissus par H. annosum
aprés les deux mois d'exposition. Cependant, le traitement à L'aide de grains de seigle pré-
colonisés par P. dimorphospora a, quant à lui, réduit l'infection. La production de
métabolites antifongiques dans les grains et une meilleure colonisation des tissus ont été
observées avec cette formulation. La colonisation naturelle par les champignons a varié en
fonction du traitement, du site, de la période de coupe et du temps d'exposition. C'est en
favorisant la présence de nombreux zygomycètes et deutt5romycètes que le traitement
témoin à base de grains de seigle a réduit la présence de H. annosum après le premier mois
d'exposition. Les principales espèces qui colonisent les bûches de pin rouge sont
Homonema sp., MortierelLa spp., Mucor hiemaIis var. hiemalis. Nechia sp., Pesotunt sp.,
P. gi'ntea, Tympanis sp. 1, Tympanis sp.2, Tnchodennn spp. et un basidiomycéte inconnu
B9.
2.1 INTRODUCTION
The pathogenic fungus Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. causes major problems of root
and butt rot disease of many conifers throughout the Northem hernisphere (Woodward et
al. 1998). This pathogen has recently been spreading in red pine plantations in Québec
(Canada) to a point where prevention treatrnents are needed (Laflamme and Biais 1995).
Many biological control mesures to prevent conifer stump infection have been studied in
the past forty years, but until now the basidiomycete Phlebiopsis giguntea (Fr.:Fr.) Jül. has
been the only successfùl one. It is being used in few countnes for pine snimp treatrnents
(Greig 1976; Korhonen et al. 1994; Sierrota 1997). Recent experiments conducted in vitro
showed the promising use of an other fungus, Phaeotheca dimophospora DesRochers and
Ouellette, as a biological control agent against H. annomm (Chapter 1 ) . The antagonistic
potential of this deuteromycete against this pathogen was well demonstrated in vitro on
agar as well as on red pine (Pinus resinosa Ait) and Norway spmce (Picea abies L. Karst)
wood discs. Inhibition appeared to be primarily due to antifungal metabolites. Phaeotheca
dimophospora has demonstrated, in vitro and in greenhouse experiments, potential for the
control of a wide variety of forest pathogens, including Ophiostoma ulrni (Buism.) Nannf.,
Gremmeniella abietina (Lagerb.) Morelet, Cylindtocludium scoparium Morg. and Septoriri
musiva Peck (Benller et ai. 1996; Yang et al. 1993; Yang et al. 1994; Yang et al. 1995a, b).
Relative to the extent of experimental work conducted, few biological control products are
available on the market. This is mainly related to the fact that, for many biocontrol agents,
results obtained in field testing are ofien not correlated with those fiom controlled
environments (Cook and Baker 1983; Morell and Sexton 1990; Schoeman et al. 1996).
Variable results and limited success are due to factors such as environmental conditions,
substrate statu (nutrient, pH) and competition with other miaosrganisms (Bruce and
King 1986; Ejechi and Obuekwe 1994; Etheridge 1972; Morell and Sexton 1990; Nelson
and Thies 1985). The mode of action of biocontrol agents include mywparasitism,
competition, and the production of diffusible toxic compounds. However, they can also be
effective by altering microfloral interactions and composition allowing for the growth of
beneficial or non beneficial organisms (Schoeman et al. 1996; Yang et ai. 1995a). in
addition, cornpetition from other fùngi might interfere with colonization success (Meredith
1960). Al1 these factors have a substantial impact on the efficacy of a biocontrol agent,
hence they have to be considerd
In spite of the significant reduction of H annosum growth by P. dimorphospora under
controlled conditions, its potential in the nahird environment has yet to be demonstrated
(Chapter 1). More information is needed on how well this antagonist will lirnit colonization
by H. annosum in the field. The main objectives of the present study were to 1) detemine
the effectiveness of P. dimorphospora in a natural environment, 2)compare
P. dimorphosporu treatments with P. gigantea treatments, and 3) investigate the effect of
the two biocontrol agents on the indigenous fùngal community colonizing rd pine logs.
For this, field testing was carried out using tieshly cut red pine logs. This approach was
used by Coates and Rayner (1985) for snidies on b g a l development of populations and
communities in decaying beech wood. The main advantage of this systern is to allow rapid
observations of the succession in the decaying process including penetration of tissues by
H. annosum.
2.2 MATERIAL AND METHODS
2.2.1 Fungal strains
Phaeotheca dimorphospora, strain QFB 19795, was isolated fiom a white elm (Ulmus
americonct L.) branch during a survey for Dutch elm disease in Québec city (DesRochers
and Ouellette 1994). Phlebiopsis gigrintea, strain P 104, was isolated fiom a red pine stump
in the southwestern part of Québec (Canada) and selected for its ongin and its oidial
production capacity. The H. annosum strain (Ha044) was isolated fiom a red pine stump on
site B from the Larose Forest (Ontario). Al1 strains were kept at 4°C on 3% Difco malt agar
(MA)*
22.2 Study sites
The two experimental sites (A and B) were located in the Larose Forest, 40 Km east of
Ottawa (Ontario) in a approximately 50-year-old red pine plantation. Sites were about 1 km
apart. On both sites, experimental plots were established in a H. annosum infected area. A
thinning was performed on site B few months before the experiment.
The experiment included two types of inoculum for P. dimorphosporo. The first inoculum
was prepared as described previously in chapter 1 with slight modifications. The mycelial
mat was harvested, but no filtration or cleaning was done, and it was blended in the filtrate.
The concentration of the suspension was adjusted with distilled tap water to inoculate 7.0 x
10' cfu/cm2. For the second inoculum, 5 kg of rye grains were mixed with 37.5 g of CaCOl
and 1.25 L of distilled water until complete absorption (about 30 min.) o c c u d . One
hundred and seventy gram of rye grains were put in bags into which 120 mL of water was
added. Bags were autoclaved twice for 45 min. An interval of 24h was lefk between cycles.
Then, they were kept at 4OC for one week in the dark. AAer that period, half the bags were
inoculated with 2 mL of a P. dirnophosopa suspension (c. 1.5 x 106 cWmL). The other
half (control bags) were inoculated with 2 mL of sterile distilled water. The fungus was
allowed to grow for four weeks at 24OC in the dark. Grains in the bags were mixed once a
week. in the field, one bag was used for each block. For the P. gigantea aqueous
suspension inoculurn, oidia were harvested by washing out the surface of Cweek-old
cultures on 2% Difco malt extract agar (MEA). The concentration was adjusted to apply
200 living oidia/cm2. Finally, a conidial suspension of H. annosum was prepared with
conidia collected from 2-week-old culhues on MA (3%). Concentration was adjusted to
apply 50 conidia/crn2. AI! suspensions were prepared the day of the inoculation using tap
water. The total arnount of liquid sprayed ont0 the log section was 30 mL.
2.24 Log treatmeats
Treatments were designed to evaluate the potential survival and efficiency of two types of
inoculum of P. dimorphospora, and to compare it with P. gigantea. In Septernber 1994,
about 25 red pine trees of approximately 15 to 20 cm in diameter were felled. Within 48 h,
they were cut with a chah saw into 300 logs 40 cm long that were buried upright into the
ground to 10 cm on both sites. On each site, a randomized complete block design with five
replicates was used for the expenment. Thirty logs were placed 50 cm apart one from
another within each experimental block (2.0 x 2.5 m) containing five rows. Logs were
treated few hom a b cutting. Treatments consisted oE 1- tap water (control); 2-
P. gigantea liquid suspension; 3- P. dimorphospora liquid suspension; 4- colonized
P. dimorphospora rye grains; 5- rye grain control. Suspensions fkom treahnents 1,2 and 3
were inoculated with a sprayer evenly over the aerial cut surface. Inoculum fiom treatrnents
4 and 5 were applied to cover the entire cut surface of the log. To ensure that infection by
the pathogen would reach the minimum level, a conidial suspension of H. annosum was
spread over the section of al1 logs 30 min after the first inoculation. Al1 treatments were
included six t hes within each block and were randomly assigneci to sampling periods.
22.5 Sampiing method and assessrnent of colonization
One and two months after inoculation, sUnace slices (15 cm thick) of 50 logs (2 sites x 5
treatments x 5 replicates) were removed h m the field and taken back to the laboratory for
fùngaî isolations. The remaining logs were not sampled. Discs were stored for up to 12
months at -20°C in plastic bags until examined. At the time of isolation, wood sections
were split in four through the center with a hatchet. Isolations were done at 0.2, and 1 .O cm
fiom the surface, every 1 .O cm fkom each other (same level) dong the two diameters. Small
pieces of wood (ca. 2 x 2 x 1 mm) were removed aseptically and put ont0 1 25% MEA
culture medium arnended with penicillin-G (50 ppm) and chlortetracycline (40 ppm) as
well as 1.5% MEA amended with benornyl(1 ppm). Benomyl was incorporated into MEA
to prevent the growth of severai common imperfect h g i such as Tnchoderma spp. and
Penicillium spp. but allowed for normal growth of basidiomycetes (Maloy 1974). Plates
were incubated at room temperature (ca. 22°C) for up to three weeks. Each h g a l colony
was transferred to ffesh media for identification.
To determine the efficacy of the different treatments occurrences of H. annosum into the
logs were assessed. Occurrence represented the percentage of wood chips colonized by the
fungus. The ability of P. gigantea and P. dimorphospora to penetrate and survive in the
wood tissue, were evaluated by two parameters, occurrence and frequency. Frequency
represented the percentage of logs colonized by the fimgus. Both parameters wae
calculated by the addition of the results from the two levels and fiom two diagonals.
Concurrently, colonization by the natural mycoflora was evaluated with the same
parameters allowing for information to be obtained on the influence of the treatments on
fungal populations. For a global understanding of the n a d colonization, relative
occurrences of the diffaent taxonomie groups were evaluated.
2.2.6 Statistical methods
Treatment success was evaluated by the occurrence of H. annomm. Data expressed in
percentages were corrected for uneven distribution by arcsine transfomation. For each
sampling period, an anaiysis of variance (ANOVA) was cwed out on the transformed
values using the SAS cornputer program (SAS Institute hc. 1989). Means were then
compareci and ranked by the Waller-Duncan multiple range test. Differences were judged
significant at P4.05.
2.3 RESULTS
Statistical analysis showed no difference between sites A and B for the efficacy of
treatment against H annosam one month after inoculation (P=0.05). Occurrence of the
pathogen was significantly (P=0.05) reduced by al1 treatments compared to the control
(Fig. 2.1). All the control logs were infected by H. annosum on both sites with an average
occurrence of 10.9%. The pathogen was not detected in logs treated with P. gigantea and
P. dimophospora pre-inoculated rye grains (Pd/R) with the sarnpling method used. These
treatments did not significantly (P=0.05) differ fkom the rye grain (Rye) control treatment
that allowed a lX annosum occurrence of 1.4%. Water suspension of P. dhorphospora
significantl y (P=0.05) limited the infection (6.2%) b y the pathogen compared to control.
While treatments applied in the two sites presented similar results after one month
exposure, overall results differed significantly (P=0.05) between sites after two months.
Logs treated with oidia of P. gigantea cornpletely inhibited H. annosum on both sites
(Fig. 2.2). Pd/R treated logs presented an important reduction in the occwence of
H. annosum, less than 2%. This reduction was significantly (P=0.05) different fkom the
controls oniy on site B. The Rye treatments significantly (P=0.05) reduced the occurrence
of H. annosum only on site A. Results fiom site B were not significantly diffixent (P=0.05)
fiom the controls. Treatments with the P. dimorphospom suspension significantly (F0.05)
promoted the presence of H. annosum on both sites with occurrences of 15.4 and 17.4% for
site A and B, respectively.
Figure 2.1. Occurrence of Heterobasidion annosum one month afier red pine log
treatment. Each colurnn represents the mean of the two sites as they were not significantly
di fferent (P>0 .OS). Treatments w ith different letters were si gni ficantl y di fferent (P=0.05)
using Waller-Duncan multiple range test. (Pg, P. gigantea; Pd, P. dimorphospora
suspension; Pd/R, P. dhorphospora pre-colonized rye grains; Rye, rye grain control)
Treatments
Figure 2.2. Occurrence of Heterobasidion annosum two months a f k red pine log
treatment. Each column represents the mean of five blocks in each site. Within each site,
treatments with different letters were significantly different (P=0.05) using Waller-Duncan
multiple range test. (Pg, P. gigantea; Pd, P. dimorphospora suspension; Pd/R,
P. dimorphospora pre-colonized rye grains; Rye, rye grain control)
Artificial application of the basidiomycete P. gigantea completely inhibited the penetration
of tissues by H. annosum. This was strongly associated with the high level of colonization
by this biocontrol agent (F=100%). AAer one rnonth, occurrences of 70% were obtained for
P. gigantea on both sites (Table 2.1). AAer two months, occurrence of P. giguntea in these
logs was 38.4 and 60.3% on site A and B, respectively. Naturd colonization was also
observed especially on site B with a relatively high level (F280%, 0224.8%) in the controls
during both periods. Treatments Pd/R and Rye limited the naturai colonization by
P. gigantea. The reduction was particularly important on site A (FS20%, 010.4%).
Attempts to recover P. dimorphospora were not very successful. This antagonist was
isolated h m tissues only after one month and mostly in treatment Pm, with occurrences
of 9.4 and 2.0% for site A and £3, respectively. Even if low rates were obtained,
P. dimorphospora was still present in 100% of the logs on site A for this treatment. For the
P. dimotphospora suspension treatment, occurrences were only 0.9% for site A and zero
for site B. This fungus was not recovered in any other treatment.
Natural tùngal composition varied with sites, periods, and treatments. Detailed results for
frequencies and occurrences of individual fun@ for the dominant species of each site and
penod are shown in Tables 2.2, 2.3, 2.4 and 2.5. After one month exposure, the aerial cut
d a c e of most of the logs took on a black-blue coioration mainly due to the presence of
blue stain fungi like Pesotm sp. (wnidial state of Cemtocystis sp.), Homonema sp.,
CIadosporium spp., and a few other Dematiaceous fùngi. Logs treated with the pre-
colonized grain inoculum, presented a surface stauied with a yellow colour exuded from the
grains. This coloration was present d o m to 1.0 cm. We also noticed that parts of the log
surface treated with control rye grain treatment becarne pi& This colour was associated
with the presence of Fusarium sp. We did mt observe the formation of hi t ing bodies over
the two-month period.
Table 2.1. Frequencies (F) and occurrences (O) of Phlebiopsis gigantea in red pine
logs over the two sampling periods.
1 month 2 months
Treatrnen ts Site A Site B Site A Site B
Control 80 5.9 1 O0 24.8 80 5.4 100 30.1
pg 1 O0 69.8 100 70.0 1 O0 38.4 100 60.3
Pd 80 3.2 1 O0 13.6 80 6.4 100 19.6
P d / R 20 0.4 O O O O 20 O. 8
R Y ~ 20 O .4 80 6.8 20 0.4 100 10.8
Note: Pg, P. gigantea; Pd, P. dimorphospora suspension; Pd/R, P. dimorphospora pre-colonized rye grains; Rye, rye grain controL
Table 2.2. Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant h g i in red pine logs on site A after one month.
Treatmeat
Control P. gigantea Pd Pd/ R R Y ~
F O F O F O F O F O
Zygomycetes
Mortierella kabellina Mortierelfa parospora Mortierella vinacea Mucor hiemalis var hiemalis Total Zygomycetes
Ascomycetes
Hyalorhiocladie fla sp. Nectrr'a sp. Pesotum sp. Tympanis sp. 1 Tympanis sp ,2 Unlaiown A l Total Ascomycetes
Basidiomycetes a
Udcnown B9 U h o w n 820 Unknown B24 Unknown B22 Total Basldlomycetes
Deu teromycetes
Altemaria alternata CIadosponirm cladosporoides Epicoccum nigmm Fusunùm spp. Honnonema sp. Penicilliirm spp. RhimcludieIIa atrovirem Trichodema spp Total Deuteromycetes
Total Unidentifid
60 1.7 40 1.0
- 20 0.4 80 3.0
- 80 10.8 20 0.5 40 1.8 100 9.7 20 0.8 100 23.6
60 3.1 40 0-9 80 3.7 - *
100 14.9
- - 60 1.4 40 0.9 - - 100 6.9 80 4.9 40 0.8 20 0.5 100 173
LOO 53
Total sterüe chips 100 43.2 100 26.5 100 58.8 100 37.7 100 49.4 Note: Results are exprcssed as percentage. Pd, P. dimorphospora suspension; PdR, P. dimorphospora pte- colonized rye grains; Rye, rye grain control.
8 For P. gigantea values see Table 2.1.
Table 23. Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant f'ungi in red pine log on site B after one month.
Mortierelfa &abelfina Mortiereh parospora Mortierella vinucea Mucor hiemalis var hiemalis Total Zygomycetes
Ascomycetes
Hyalorhiocladiella sp. Nectria sp. Pesotum sp Tympanis sp. 1 Tympanis sp.2 Unknown A 1 Total Ascomycetes
Basidiomycetes * Unknown B9 Unknown B20 Unknown B24 Unknown B22 Total Basidiomycetes
Deuteromycetes
Alfernario altemaru Cladosporium clcrdosporoides Epicoccum nigrum Fusarium spp. Hormonema sp. Penicillium s pp. RhinocladieZZa atro virens Trichodema spp. Total Deuteromycetes
Total Unidentified
40 1,4 20 0,s - - 40 0,7 80 2,6
100 5,3 80 1,8 100 16,8 LOO 4,4 IO0 8, l - - 100 36,4
40 2,4 20 0,4 40 2,5 60 1,s 100 30,7
20 0,3 * - - - -
80 3,8 100 5,7 - - 20 0,4 100 12,s
80 3.6
60 1,8 -
40 L,1 80 6,9 100 9,8
- 20 1,o 100 12,4 - -
40 0,9 - 100 14,7
- 40 1,4 20 0,7 30 2,4 100 6,9
20 0,s - - - - 20 I,5 100 4,4 LOO 12,3 20 0,3 60 1,7 100 29J
100 11.8
Totai sterile chips 100 49.1 LOO 203 100 50.9 100 52.9 100 45.3 Note: Results are expressed as percentage. Pd, P. dimorphospora suspension; Pd& P. dimorphospora prc- colonized rye grains; Rye, rye grain control.
a For P. gigantea values see Table 2.1.
Table 2.4. Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant fiingi in r d pine logs on site A after two months.
Zy gomycetes
Mortierella irube~hluz Mortierella parospora Mortiere/la vinacea Mucor hiemalk var hiemalis Total Zygomycetes
Ascomycetes
Hyalorhiocfadiella sp. Nectria sp. Pesotum sp Tympanis sp. 1 Tyrnpanis sp.2 Unhown A 1 Total Ascomycetes
Basidiomycetes a
Unknown B9 Unknown B20 Unknown 824 Unknown B22 Total Basidiomycetes
Deuteromycetes
Alternaria alternata Cladosporium cladosporoides Epicoccum nigrum Fusanhm spp. Honnonema sp. PeniciIIium spp. Rhinocladiella atrovirens Trr'chodema spp. Total Deuteromycetes
Total Unidentified
80 60 40 60 100
20 20 60 20 - LOO
- -
80 - 80
- - - - - 100 20 1 00 100
100
Total sterüe chlps 100 65,8 100 524 100 48,8 100 58,I 100 54,s Note: Results are expressed as percentage. Pd, P. dimorphospora suspension; Pd/& P. dimorphospom pre- coionized rye grains; Rye, rye grain control.
For P. gigantea values see Table 2.1.
Table 2.5. Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant fun@ in red pine logs on site B afier two months.
Trea tment
Zygomycetes
Mortierellu isu bellina Mortierella purospora Mortierelfa vinacea Mucor hiemalis var hiemalis Total Zygomycetes
Ascomycetes
Hyalorhiocludiefla sp. Nectria sp. Pesotum sp. Tympanis sp. 1 Tympan& sp.2 Utiknown Al Total Ascomyce tes
Unknown B9 Unknown B20 Unknown B24 Unknown B22 Total Basidiomycetes
Deu terornycetes
Altemariu alfernata CIadosporium cladosporoida Epicoccum nigmm Fwarium spp. Hormonema sp. Penicillium spp. Rhinocladiella afrovirens Trichodema spp. Total Deuteromycetes
Total Unidentifïed
80 1,s -
60 1,9 80 4,9 100 9,4
- 20 0,4 100 14,2
- -
100 18,3
20 1,O 60 1,I 80 1,8 60 1,l 100 8,5
- - 40 1,l 20 0,3 - - - -
LOO 9,l 20 0,3 100 6,9 100 19J
100 1SJ
Totai steriie chips 100 46,8 100 25,s 100 49,4 100 S1,l 100 49,l Note: Remlis are expressed as percentage. Pd, P. dimorphospora suspension; Pd/R P. dimorphospora pre- colonized rye grains; Rye, rye grain control,
8 For P. m n t e a values see Table 2.1.
Despite variations, the results indicated some trends. Overall the most common species
recovered from wood samples were : Penicillium spp., Tnchoderma spp., Mortierellu
isabellina Oudem, Mucor hiemalis Wehmer f. hiemalis, Nectria sp., Tympanis sp. 1, and
Tympanis sp.2 (Tables 2.2, 2.3, 2.4 and 2.5). Trichodema spp. mainiy compnsed three
species, T. hanianum Rifai, T. vîride Pers. Ex. Gray and T. pseudo-konngii Rifai. Another
very common h g u s mostly specific to site B, was Pesotum sp. This fungus was present in
relatively high number (F=100%, 2.4% S O < 33.4%) in al1 treatments except for those
treated with P. gigantea (F=80%, O 5 8.5%) on site B (Tables 2.3, 2.5). We also noticed
that the black yeast fungus Hormonema sp. colonized most of the logs (Fr 80%) after one
month except for the P. gigantea treatment with a relatively high occurrence (O 2 3.8%)
(Tabies 2.2, 2.3). Penetration by fùngi was mostly concentrated at the 0.2 cm level, except
for P. gigantea and a few other fùngi like Pesotum sp, Tympanis sp.1, Nectria sp., A.
alternata, E. nigrum, Penicillium spp. and Trichudenna spp.
As we already mentioned, differences between the natural mycoflora fiom each site were
observable. On site A, only the mould, PeniciIhm spp., occurred in more than 20% of the
chips while more species (Penicillium spp., Pesotum sp., and Trichodenna spp.) were
obtained on site B (Tables 2.2, 2.3). Moreover, we did see more colonization by three
deuteromycetes [Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissl., Epicoccum nigrum Link and
Cladosporium cladosporoides (Fresen.) GA. De Vries] after one month (5% S O 5 15%) in
the controls fiom site A,
Treatment effects on the mycoflora were also noticeable. Besides Iow colonization by
Pesotm sp., logs treated with P. gigantea excluded any other basidiomycetes except for
site B afier a two month exposure. One of the most common species associated with that
treatment after one month was Peniciïliuni spp. (=-O%, 4.3 % S O I 1 3.3%), and after two
months, Trichodema spp. (F280%, 0 2 3.4%) (Tables 2.2, 2.3). However, after one
month, occurrences of Penicillium spp. were the highest in logs treated with Pd/R (O 2
12.3%) and Rye (O 221.1%). We aiso noticed that inoculation with a suspension of
P. dimorphospora seemed to have favoured the presence of Tympanis sp.2 for both sites
and periods (F280%, 2.4 % 2 O 2 9.7%). Rye treatments showed the highest presence of
M. isabellina (F260%, 5.4 % 2 O 2 14.1%). Afier one month, about half of the wood
samples from al1 treatments except the P. gigantea one were not colonized by fungi. mis
treatment allowed for a high colonization, leaving 26.5% and 20.3% for site A and B
respectively of non-colonized wood sarnples (Tables 2.2, 2.3). Sirnilar results were
obtained for site B after No months exposure (Table 2.5). However, site A showed a
higher level of wood sample without fun@, including the P. gigantea treatment (Table 2.4).
The relative occurrence of each taxonomie group is illustrated in Fig. 2.3 and 2.4. Controls
were mainly colonized by basidiomycetes and deuteromycetes both with relative
occurrences over 30%, except for site A, after two months, where the ascomycetes,
basidiomycetes and deuterornycetes groups were almost equally represented. One of the
most important observations on the mycoflora, regarding the treatmenb, was the low level
of total basidiomycetes obtained with PdIR and Rye beatrnents. For both sites and periods,
they were replaced by higher rates of zygomycetes, particularly in logs treated with control
Rye grain. However, we noticed a reduction in the relative occurrence of the zygomycetes
after two months in site B (Fig. 2.4). Another common group stimulateci by the Pd/R
treatment was the deuteromycetes (rO225%). The highest relative occurrences of
ascomycetes were obtained following treatment with the P. dimotphospora suspension.
This was also associated with a low level of zygomycetes and deuteromycetes. In general,
presence of basidiornycetes was higher afier two months except for the controls on site A
and overall P. gigantea treatments.
Figure 2.3. Relative occurrence of each taxonomie group in red pine logs one
month after treatment on site A (a) and B @). C, control; Pg, P. giganteu; Pd ,
P. dimorphospora suspension; Pd/R, P. dimorphospora pre-colonized rye grains;
Rye, rye grain control.
Figure 2.4. Relative occurrence of each taxonomie group in red pine logs two
months after treatment on site A (a) and B (b). C, control; Pg, P. gigantea; Pd,
P. dimorphospora suspension; PdR, P. dimorphospora pre-colonized rye grains;
Rye, rye grain control.
2.4 DISCUSSION
Previous greenhouse studies have shown the effectiveness of P. dimophospora as a
biological control agent against G. abietina (Yang et al. 19951>), S. musiva (Yang et al.
1994), 0. ulmi (Bernier et al. 1996) and C. scoparium (Yang et al. 1995a). In these
investigations, results obtained in laboratory expetiments tended to correspond to in vivo
studies. In another in vitro study perfomed on wood discs, P. diniorphospora colonized red
pine tissues, produced antifungal metabolites, and inhibited the growth of H. annosurn
(Chapter 1). In the present work, conducted in a natural environment, P. dimorphospora did
not have the expected eficiency in preventing infection by H. annosum. It was obsened
that the P. dimorphospora fomulated as a liquid suspension was the least effective
treatment causing an increase in colonization of tissues by the pathogen after a two month
exposure. However, P. dimorphospora formulated as pre-colonized rye grains did control
H. annosum. Even if this formulation inhibited the growth of the pathogen, mostly by the
difision of antagonistic metabolites, this treatment had limited penetration potential (no
more than 1 cm into the log). Moreover, it did not offer important coverage of log tissues. It
might be better having P. dimorphospora growing inside the log and producing the
antibiotic substances.
In vitro, P. dimorphospora had demonstrated the ability to colonize red pine tissues for at
least six weeks (Chapter 1). In the present field test, survival of the inoculum might have
been limited by environmental factors such as temperature and wood moistute content.
These factors are known to contribute to the effectiveness of a biological control agent by
influencing its colonization and inhibition capabilities (Butcher 1968; Nelson and Thies
1985; Nelson and Thies 1986; Nicolloti and Varese 1996). In the field, log moisture content
was definitively lower than in the discs used in the in vitro tests that were almost saturated.
Weather conditions at the time of inoculation might not have been optimal for this
antagonist. in north-eastern Canada, to control H. annusum, the biocontrol agent has to be
effective in the fat1 period when the pathogen is actively growing and spodating.
DesRochers (1992) showed reduction in the growth and production of antifungal
metabolites by P. dimorphospora at temperatures under 15°C. The effect of temperature
and moisture content of the wood on the antagonist needs m e r study.
Presence of high incidence of the natural mycoflora at the surface of the log might also
have contributed to the failure of P. dimorphospora to develop. Microbial competition is
one of the factors affecting the spread of most fun@. Labotatory experiments are mostly
conducted in a closed system, excluding interference from other fungi. Abundant sources of
nutrient sugars in different types of agar media, like malt extract agar, generaily allow the
antagonist and pathogen to grow without competition compareci to what occurs in wood
tissues (Morell and Sexton 1990; Nicoloni et al. 1994). This competition phenornenon
might affect their growth rates and interactions. Cornpetition between Neciria fickeliana
Booth, Ascocoryne cylichnium (Tul) Korf, yeast like fungi and bacteria had limited the
spread of Stereum sanguinolentum (Alb. and Schw.: Fr.) Fr. in the stem of a healthy 80-
yearsld P. abies (Hallaksella 1993). Presence of T. hanianum had been shown to
influence interactions between basidiomycetes (Schoeman et al. 1996). Results obtained by
Yang et al. (199%) showed the ability of P. dimorphospora to sunive in soil in a closed
systern (Petri dishes), free of any other organism for six weeks, but it did not survive in
soil, in a greenhouse experirnent aAer one month. It was instead replacecl by a high
concentration of T. harzianum. in our study, P. dimorphospora did not enhance the
presence of Trichuderma spp. in log tissues. However, it did have an influence on the
mycoflora by generally limiting colonization by zygomycetes and deuteromycetes, thus
potentially excluding beneficial organisms.
Low colonization rates on red pine logs are not necessarily surprising as P. dimorpiiospora
was isolated fiom an elm tree (DesRochers, 1992). Better colonization muld be reached
with a formulation that is less susceptible to environmental factors. Fermented barley grain
inoculum of T. Mride proved to be an excellent inoculum to replace the pathogen Phellinus
weirii (Murr.) Gilb in Douglas fir (Pseudostuga menziesii (Mirb.) Franco) stumps (Nelson
and Thies 1985). This corresponds to our finding were P. dimorpliospora pie-inoculated on
rye grains was a better treatment for survival and efficiency of control.
In previous tests conducted in viîro, P. diniorphospora produced a yellow pigment in wood
tissues considered to be antifungal metabolites (DesRochers 1992). in the present study, no
pigmentation was observed in logs treateà with the suspension of P. dimorphospora
probably due to the limited colonization of tissues by the antagonist. High colonization
rates corresponded to strong coloration of red pine wood tissues in vitro (Chapter 1). On the
other hand, pre-colonized grains were impregnated with the yellow pigmentation and, by
difision, the first centimeter of the surface on most of the treated logs was coloured. Rye
grains provided adequate nutritional factors to support the growth of the antagonist and to
allow for production of antifungal metabolites. In vitro tests perfiormed on agar plates
demonstrated the antagonistic effect of the pigment exuded fiom the colonized grains
against H. annosum (data not shown). In addition, it appeared to have been toxic inside
wood tissues to other basidiomycetes like P. gigantea as low levels of this group were
obtained. This partly explains the effectiveness of that treatment and confims at least some
attributes of P. dimorphospora as a biocontrol agent. AntifÙngal metabolites produced by
P. dimorphospora have been shown to be antagonistic on agar to many fungi including
H. annosum, causing hyphal lysis and inhibition of spore germination (Yang et al. 1993).
Application of metabolites instead of the fungi can be considered as an alternative.
Metabolites produced by the h g u s and P. dimoiphospora itself had presented similas
effects in treatrnents of poplar cuttings against S. muriva (Yang et al. 1994). More research
is needed to explore the efficiency and composition of the antifungal compounds for their
utilisation. Tests will be required to explore the effectiveness of the antifùngal metabolites
alone on wood. Presence of the fùngus itself might be necessary. Metabolites produced by
T. virens (GliogardTM, W.R. Grace and Co, Ct) were effective on agar but not on wood
(Highley 1997). This suggests the need for the presence of living mycelium to reach
sufficient concentrations of hngitoxic compounds.
Tests conducted in vitro demonstrated the preventive effect of P. dimorphospora but this
antagonist was less effective when applied only one day before H. annosum compared to a
seven day pre-inoculation (Chapter 1). In the field, the pathogen was applied 30 minutes
after the P. dimorphospora treatment; this can also explain the results. The antagonist did
not have the time to colonize tissues before the pathogen. Rapid colonization by the
biocontrol agent is an important factor for the success of the treatment (Lundborg and
Unestam 1980). This biological control agent bas to be regarded as a preventative
treatment; and this is parily due to the fact that it is a slow growing fungus. Other studies
had shown its potential as preventing agent against O. ulmi (Bernier et ai. 1996) and
S. musiva (Yang et al. 1994), but that it was less effective when applied at the same time as
the pathogen. This indicates a need for a conditioning period before the attack by the
pathogen.
Not surprisingly, the most effective treatment was the one with P. gigantea. In contrast to
P. dimotphospora, this fungus is a fast coloniter and is well adapted to out-compete
H. annosum. The strain used in this field study showed a great potential as far as
colonization capability and biocontrol efficiency are concemed. Field expenments on red
pine stumps also demonstrated the colonization potential of the strain (Chaptre 3,
Dansereau 19%). Success of this basidiomycete in preventing aerial infection of fiesh pine
stumps by H. annomm has been demonstrated in many studies (Greig 1976; Rishbeth 1963;
Sierota 1997; Korhonen et al. 1994; Soutrenon et al. 1998). A drop in the occurence of
P. gigantea observed after two months was partly associated to a rapid downward spread of
the fungus. It was detected down to 5 cm nom the cut surface (data not shown). in
cornparison, naturd colonization by P. gigantea did not go deeper than one centimeter.
Only a few other species were isolated fiom these levels and at very low rates. This
confïrms the advantage of artificial inoculation evm if the fungus is naturally present.
Massive introduction of the biocontrol agent allowed for a faster and more uniform
colonization than the lower naturd infeçtion which needed a longer period to get
established. This type of inoculum can more easily exclude cornpetitors. In our field test,
P. gigantea limited the colonization of tissues by other fiinpi. Similar conclusions have
been drawn by Meredith (1959) and Rishbeth (1963) with P. gigantea on pine shimps.
Competition with the pathogen is bound to occur not only on the surface but also deep in
stump tissues. Thus, deep penetration dlows P. giguntea to get fast access to uncolonized
resources giving the fiingus a signifiant competitive advantage. At the same time, rapid
decay prevents the stump from becoming a disease reservoir. In addition, it limits
secondary infection from wounds which can allow H. annoswn to penetrate the newly
exposed tissues of the stump. Fast decay also improves site access for future management
operations.
Non negligible natural coîonization by P. gigantea occuned in most of the treatments,
especially on site B, where a thiming operation was done a few months before Our study.
On this site, basidiocarps of the fungus were cornmonly observed in the surrounding area
on logs left on the ground. This corroborates results obtained from treated stumps in red
pine plantations where natural stump colonization was more important in the previously
thimed site (Roy et al. 1997). In the present study, almost al1 isolates recuperated frorn logs
treated with P. gigantea were somatically compatible with P 104 implying that they were
the sarne (data not shown). This method was show to be as effective as random amplified
polymorphic DNA (RAPD) for discriminating P. gigantea isolates (Roy et al. 1997). This
indicates that the inoculated strain had not been replacecl by indigenous strains. Similarly,
Hallasksella (1 993) observed low replacement of the inoculated strain a h successful
treatment with the basidiomycete S. sanguinolentum. In contrast, P. giguntea isolates
recuperated fiom other treatments were, except for a few cases, different nom P 104 as they
demonstrateci somatic incompatibility with this straùl. More than one indigenous strains
were found in the untreated logs. This study provided evidence for the naturai air-borne
dissemination of P. gigantea in the plantations.
2.43 Rye grain controls
Rye seed controls also reduced the Section by H annosuni after the first month but lost
theu efficiency afler two montbs on site B. Efficiency of this mtment was attn'buted to the
presence of a high number of zygomycetes like M. isabelina and M. hiemalis f hiemulis,
and aiso imperfect fiingi like Penicillium spp. These microfùngi occupied the niche and
prevented the growth of the pathogen. Mucor hiemalis, one of the dominant species in
surface colonization of Norway spruce stumps, has show marked in vitro antagonism
against H. annosum but failed in wood discs (Nicolotti and Varese 1996). Ability of
PeniciIiium sp. to antagonize wood decay organisms has been reported (Ejechi and
Obuekwe 1994). AAer one month on site B, we obsened the disappearance of the rye grain
control inoculum on the surface of the logs from the five blocks. We assumed they were
eaten by birds or small mammals. This resulted in the ineffectiveness of the treatment in
that site afier the two month penod. Reduction of total zygornycetes could have been the
reason why more ascomycetes and basidiomycetes were obswed. Colonization by
naturall y occumng P. gigantea increased but as in the water control treatment , colonization
was not sufficient enough to inhibit H. annosum. Low levels of basidiomycetes following
treatments with rye grain cont~ols as well as pre-colonized ones by P. dimorphospora may
result in a slower decay process and eventually an inefficient treatment. As we mentioned
earlier, rapid decay of sturnps provides advantages for the biological control agent.
2.4.4 Mycodivenity
Extensive colonization by the namal mycoflora was observed. With oniy few exceptions,
qualitative fùngal succession of the logs was similar on both sites. Differences in the
occurrences of species and in the relative importance of the different groups observed
between sites reflect local variations in naturai inoculum potential. Basham (1966a)
observed different heartwood flora in Jack pine (Pinus bankîiana Lamb.) between two
plots only 3.2 km apart. Common natural surface mycoflora found in red pine logs are
similar to those found on stumps of the same species (Chapter 3). Most of them were
reported to be isolated fiom conifen (Butcher 1968; Meredith 1960; Schoeman et al. 1994;
Varese et ai. 1998). Even if lots of bacteria and yeast were present in tissues they were not
identified. These microorganisms are also part of succession in the wood decay process.
Furthermore, we 0th observeci more than one species on the same wood sample. Some
chips containai over four species. This has also been obsmed in Norway spruce afier
green pnining (Metzler 1997). The use of benomyi amended medium allowed for isolation
of basidiomycetes in presence of Trichoderma spp. which oflen obscures the presence of
slower growing fun@ (Butcher 1968; Maloy 1974). Otherwise it would have been
sometimes dificult to isolate them.
In our study, Trichoderma spp. were an important part of the natural mycoflora. It has o f h
been evaluated as a biocontrol agent against h g i with variable results. It has been a
popular choice in agriculture and forestry due to the variety of mechanisms by which it
antagonizes fùngi: production of toxic metabolites, mycoparasitism, fast growth, and
cornpetition for the niche (Bruce et al. 1996; Chet and Inbar 1994). Some stuâies showed
the potential of Trichodenna spp. against H. annosum. Driver and Gims (1969) observed
that the relative increase in natural presence of Trichodema spp. was associateci to a
decrease of infection and colonization by H. annosum in Slash pine (Pinus elliotti var
elliotti Engelm) stumps. Moreover, invasion of spruce stumps by H. annosum was Iimited
by Trichodenna spp. (Kallio and Hallaksela 1979). However, Rishbeth (1963) observed
that these fun@ did not colonize freshly cut stump surfaces of Scots pine (Pinus sylvestris
L.) enough to compete with the pathogen. This seems to be generally true for other
microfùngi including Peniciffium spp. in our field experiment, natural Tnfhodenna spp.
did not seem to have any impact on the colonization by the pathogen.
Another group of fùngi, which are part of the first step of the succession in wood decay, are
the blue stain fun@ (Meredith 1959). This group was encountered in al1 sites and for al1
periods, and was represented mostly by the ascomycete Pesotum sp., and the
deuteromycetes Homonemu sp. and Cfadosporium spp. Presence of these fùngi varid
qualitatively and quantitatively depending on the site. Populations of Pesohm sp. were
more important on site B, and increased with time. Homonema sp., fiequent after one
month, did not grow deeper into the tissues compared to Pesotum sp. This species belongs
to the Ceratocystis group well known for its characteristic staining of the wood and for
being an early colonist (Meredith 1960). ûther ascornycetes present were Nectriu sp.,
Tympanis sp.1 and Tympanis sp.2. Species of Necma have been found in other conif=
wood, Iike Nfickeliana on Noway spruce (Huse 198 1, Metzler 1997). Tynrpanis
hypopodiu N y1 was antagonistic against Fomes pini (Fr.) Lloyd on malt agar and Jack pine
wood sampies (Basham 1966b). In our study, Tymponis sp.2 did not show any activity
against H. annosum since it was present in hi@ levels in logs treated with
P. dimorphospora suspension, the lest effective treatment. Besides the P. grgantea
treatment, basidiomycetes were more comrnon in the ineffective treatments such as water
alone (control) and P. dimorphospora suspension. Similar observations were made by
Kallio and Hallaksela (1 979) on Norway spruce stump treatments. Besides P. gigantea,
three other basidiomycetes were commonly isolated, unknown species B9, B20 and 824.
We were unable to identiw them by mycelial characteristics. They are assumed to be decay
pioneers like P. gigantea. It has been shown that some decay fun@ (basidiomycetes) also
have the ability to be pioneers (primary saprotrophs) occupying canifnifer trees or stumps
(Holmer et al. 1997; Roll-Hansen and Roll-Hansen 1980).
2.5 CONCLUSION
Results of this study combined with those obtaiaed fiom tests conducted on red pine
sturnps (Chapter 3, Dansereau 1996) tend to confirm the potential of P. gigantea as a
preventative control agent against H. annosum in red pine plantations. This biological agent
is well adapted to Québec and northeastem Ontario regions (eastern Canada). It would be
very useful in unthianed plantations not infecteci by H. annosum. The fungus
P. dimorphospora in suspension did not thoroughiy colonize wood nor compete with the
indigenous mycoflora to exert antagonistic actions against H. annosum. This field test
revealed the uselessness of this h g u s for field conditions when applied as a suspension.
Obviously, in vitro assays performed before going out in the field were not appropnate for
determinhg the biocontrol effect. Observations made on the success of P. dimorphosporo
in this investigation confirm the necessity to use bioassays that reproduce similar
conditions to the field situation. It also demonstrates the need to use a formulation that will
keep the antagonist dive in woody tissues by, for example, keephg high humidity on the
sturnp. Even if preîolonized and control rye grain treatments provided excellent protection
afler one month, they started to be less effective afier the two-month period. They showed
more variable results compared to P. gigantea treatment that was stable between sites and
periods. They were more dependent on the natural microflora and environmental
conditions. Development of an adequate formulation that will allow for survival, growth
and metabolite production into tissues by P. dimorphospora could be useful. Conclusions
drawn by this study must be applied with caution to stump treatments. Newly cut surfaces
of red pine stumps exude hi& quantities of resin which modifies wood status like its
moisture content. High resin content of pine stumps (Pinus sylvestris L., Pinus nigra var.
calabrica Schneid.) has been correla ted wi th increased resistance to infection (Meredith
1959).
Al1 treatments have been found to have an influence on the structure of the natural
mycoflora in red pine logs. This corresponds to the findings of Varese et al. (1998)
suggrsting the influence of biological treatments on the naturally occumng mycoflora of
Norway spruce stumps. The method used in this field test is a suitable mode1 for quickly
testing cornpetition effect on the success of a biological agent as qualitative f'ungal
populations present in logs are similar io ones found in stumps (Chapter 3). Evaluation of a
biocontrol agent should include tests to evaluate the impact of the treatment on the natual
rnicroflora of wood tissues or soi1 where it is to be applied. As we o b s e d , succession is a
complex system comprised of many different organisms. A better understanding of the
microflora is one of the first steps for the successful use of microorganisms. Some fun@
found in this study should be evaluated for their potential use as biocontrol agents.
2.6 REFERENCES
Basham, J.T., 1966a: Heart rot of Jack pine in Ontario. 1. The occurrence of
Basidiomycetes and microf'ungi in defective and normal heartwood of living Jack pine.
Can. J. Bot. 44,275-295.
Basham, J.T., 1966b: Heari rot of Jack pine in Ontario. II. Laboratory studies on the
pathogenicity and relationships of the principal heartwood inhabiting fun@ of living jack
pine. Cari. J. Bot. 44,849-860.
Bernier, L.; Yang, D.; Ouellette, G.B.; Dessureault, M., 1996: Assessrnent of Phaeotheca
dimorphospora for biological control of the Dutch elrn disease pathogen, Ophiostoma ulmi
and 0. novo-ulmi. Plant Pathology 45,609-6 17.
Bruce, A.; King, B., 1986: Biological control of decay in creosote treated distribution poles.
II. Control of decay in poles by immunizing commensal fiinpi. Mater. Org. 2 1,165- 1 79.
Bruce, A.; Kundzewicz, A.; Wheatley, R., 1996: infiuence of culture age on the volatile
organic compounds produced by Trichodema aureoviride and associated inhibitory effects
on selected wood decay fungi. Mat. ûrg. 30,79-94.
Butcher, J.A., 1968: The ecology of fùngi infecting untreated sapwood of Pinus radiata.
Can. J, Bot 46, 1577-1589.
Chet, L; inbar, J., 1994: Biological control of fimgal pathogens. Applied. Biochemistry and
Biotechnology 48,3743.
Coates, D.; Rayner, A.D.M., 1985: Fungal population and community development in cut
beech logs. I. Establisment via the aerial cut surface. New Phytol. 10 1, 153-1 7 1.
Cook, R.J.; Baker, K.F., 1983: The nature and practice of biological control of plant
pathogens. APS Press, St. Paul, Minnesota. 539 p.
Dansereau, A., 1996: Colonisation des souches de pin rouge par PMebiopsis gigantea dans
le cadre d'un essai de lutte contre la maladie du rond au Québec. M. Sc. Thesis,
Département des sciences du bois et de la forêt. Université Laval. Québec. Canada. 63p.
DesRochers, P., 1992: Aspects biochimiques et ultrastnichuaux de l'inhibition
d'Ophiostoma ulmi par Phaeotheca dimorphospora sp. nov. Ph. D. Thesis, Département
des sciences forestières. Université Laval. Québec. Canada. 23 1p.
DesRochers, P.; Ouellette, G.B., 1994: Phaeotheca dimorphospora sp.nov.: description et
caratéristiques culturaies. Can. J. Bot. 72,808-8 17.
Driver, CH.; Ginns, J.H. Jr, 1969: Ecology of Slash pine stumps: fimgal colonkation and
infection by Fomes annosus. Forest Science 1 5,2- 10.
Ejechi, B.O.; Obuekwe, C.O., 1994: The effect of mixed cultures of some rnicrofungi and
Basidiomycetes on the decay of three tropical timbers. international Biodeterioration and
Biodegradation 33, 173-185.
Etheridge, D.E., 1972: Antagonistic interactions in wood-inhabithg microorganisms and
biological control of decay. in: Biological control of forest diseases, XV IUFRO meeting,
Gainsville, Florida, 197 1. Ed. by Nordin, VJ. Ottawa: Canadian Forestry Service, pp. 37-
53.
Greig, B.J.W., 1976: Biological control of Fomes annosus by Peniophora gigantea. Eur. J .
For. Path. 6,6507 1.
Hallaksela, A.-M., 1993: Early interactions of Heterobasidion annosum and Stereum
sanguinolentum with non-decay fungi and bacteria following inoculation into stems of
Picea abies. Eur. J. For. Path. 23,416-430.
Highley, T.L., 1997: Control of wood decay by Trichodema (Gliocladium) virens. 1.
Antagonistic properties. Mat. Org. 3 1,79-89.
Holmer, L.; Renvall, P.; S tenlid, J., 1 997: Selective replacement between species of wood-
rotting basidiomycetes, a laboratory study. Mycol. Res. 10 1,7 14-720.
Huse, K.J., 1981: The distribution of fun@ in sound-looking stems of Pices obies in
Nonvay. Eur. J. For. Path. 1 1, 1-6.
Kallio, T.; Hailaksela, A.-M., 1979: Biological control of Heterobasidion onnosum (Fr.)
Bref. (Fomes annsous) in Finland. Eur. J. For. Path. 9,298-308.
Korhonen, K.; Lipponen, K.; Bendz, M.; Johansson, M.; Ryen, L; Venn, K.; Seiskari, P.;
Niemi, M., 1994: Control of H. annosum by stump treaûnent with "Rotstop", a new
commercial formulation of P. gigantea. in: Proc. of the 8" Int. Conf. Root and Butt Rots,
Wik, Sweden and Haikko, Finland, August 9-16, 1993. Ed. by Johansson, M.; Stenlid, J.
Uppsala: Swed. Univ. Agric. Sci. pp. 675685.
Laflamme, G.; Blais, R., 1995: Détection du Heterobosidion annosum au Québec.
Phytoprotection 76,3943.
Lundborg, A.; Unestarn, T., 1980: Antagonism against Fomes annosus. Cornparison
between different methods in vitro and in vivo. Mycopathologia 70, 107- 1 15.
Maloy, O C , 1974: Benomyl-malt agar for the purification of cultures of wood decay
fungi. Plant Disease Reporter 58,902-904.
Meredith, D.S., 1959: The infection of pine stumps by Fomes annosus and other fungi.
Arui. Bot. 33,455476.
Meredith, D.S., 1960: Further observations on fungi inhabiting pine stumps. Ann. Bot. 24,
63-78.
Metzler, B., 1997: Quantitative assessrnent of fimgal colonkation in Norway spruce after
green pnuiing. Eur. J. For. Path. 27, 1 - 1 1.
Morrell, J.J.; Sexton, C.M., 1990: Evaluation of a biological agent for controllhg
Basidiomycete attack of Douglas-fir and Southeni pine. Wood and Fiber Science 22, 10-2 1.
Nelson, E.E.; Thies, W.G., 1985: Colonization of P hellinw werii-infested stumps by
Tnclrodenna viride. 1. Effect of isolate and inoculum base. Eur. I. For. Path. 15,42543 1.
Nelson, E.E. ; T'hies, W .G., 1 986: Colonization of Phellinus werii-infested stumps b y
Trichodema viride. 11. Effect of season of inoculation and stage of wood decay. Eur. J.
For. Path. 16,56960.
Nicolotti, G.; Gangemi, D.; Lanata, F.; Anselmi, N., 1994: Antagonistic activity of wood
decay basidiomycetes against European Amillaria species. In: Proc. of the 8h int. Conf.
Root and Butt Rots, Wik, Sweden and Haikko, Finland, August 9-1 6, 1993. Ed. by
Johansson, M.; Stenlid, J. Uppsala: Swed. Univ. Agric. Sci. pp. 725-735.
Nicolotti, G.; Varese, G.C., 1996: Screening of antagonistic b g i against air-borne
infection by Heterobasidion annosurn on Norway spmce. Forest Ecology and Management
88,249-257.
Rishbeth, J., 1963: Stump protection against Fomes annosus. III. Inoculation with
Peniuphora giganiea. AM. Appl. Bi01 52,63077.
Roll-Hansen, F.; Roll-Hansen, H., 1980: Microorganisms which invades Picea abies in
seasonal stem wounds. 1. General aspects. Hymenomycetes. Eur. J . For. Path. 10,321-339.
Roy, G.; Cormier, M.; Hamelin, R.C.; Dessureault, M., 1997: Cornparison of RAPD
technique and somatic incompatibility tests for the identification of Phlebiopsis gigantea
strains. Can. J. Bot. 75,2097-2104.
SAS Institute Inc., 1989: SAS/STAT user's guide, version 6.4' ed. Vol. 1. SAS hstitute
Inc., Cary, N.C.
Schoeman, M.J.; Webber, J.F.; Dickinson, D.J., 1994: A rapid method for screening
potential biological control agents of wood decay. Eur. I. For. Path. 24, 154- 159.
Schoeman, M.J.; Webber, J.F.; Dickinson, D.J., 1996: The effect of diffisible metabolites
of Trichodermo hmzianum on in vitro interactions between basidiomycete isolates at two
different temperature regimes. Mycol. Res. 100, 1454- 1458.
Sierota, Z.H., 1997: Dry weight loss of wood aftei the inoculation of Scots pine stumps
with Phlebiopsis gigantea. Eur. J. For. Path. 27, 179- 1 85.
Soutrenon, A.; Levy, A.; Legrand, P.; Lung-Escarmant, B.; Guillaumin, J.J.; Delatour, C.,
1998: Cornparison between three stump treatments to control Heterobasidion annosum
(urea, disodium octaborate tetrahydrate, Phlebiopsis gigantea). In: Root and Butt Rots ( 9 ~
International Conference on Root and Butt Rots). Ed. by Delatour, C.; Guillaumin, J.J.;
Lung-Escarmant, B.; Marçais, B. iNRA Edition, Les Colloques n089, 38 1389.
Varese, G.C.; Franco, D.; Buffa, G.; Luppi, A.M.; Nicolotti, G., 1998: Effects of biological
and chernical treatments against Heterobusidion annosum on Picea abies stump mycoflora.
In: Root and Butt Rots (9' International Conference on Root and Butt Rots). Ed. by
Delatour, C.; Guillaumin, I.J.; Lung-Escamant, B.; Marçais, B. MU Edition, Les
Colloques n089, p 448.
Woodward, S.; Stenlid, J.; Karjalainen, R.; Hüttermm, A., 1998 : Heterobmidion
unnosum. Biology, ecology, impact and control. CAB International, Oxon, U.K. 589p.
Yang, D.; Bernier, L.; Dessureault, M., 1994: Biological control of Septoria leaf spot of
poplar by Phaeotheca dimorphospora. Plant Dis. 78,82 1-825.
Yang, D.; Bemier, L.; Dessureault, M., 1995a: Phaeotheca dimophospora ùicreases
Trichoderma harzianum density in soi1 and suppresses red pine darnpingsff caused by
Cylindrocfadium scopariirn. Cm. J . Bot. 73,693-700.
Yang, D.; Laflamme, G.; Bemier, L.; Dessureault, M., 1995b: Phaeotheca dimorphospora
as a potential biocontrol agent for shoot blight caused by Gremmeniella abietina. Cm. J.
Plant Pathol. 17, 7-1 2.
Yang, D.; Plante, F.; Bernier, L.; Piche, Y.; Dessureault, M.; Laflamme, G.; Ouellette,
G.B., 1 993 : Evaluation of a fungal antagonist, Phaeoîheca dimorphospora, for biological
control of tree diseases. Can. J. Bot. 7 1,4260433.
CHAPITRE 3
Étude de la mycoflore des souches de pin rouge : colonisation naturelie et colonisation
sui te au traitement avec Phfebiopsis gigantea
Dans cette étude sur la mycflore impliquée au début du processus de dégradation des
souches de pin rouge, seulement sept especes se sont avérées communes : Homonema sp.,
Tympanis sp 1 ., un basidiomycète inconnu B9, P. gigantea, Nectria sp., Trichodema spp. et
Rhinocladiella atrovirens. Des variations locale et saisonnière importantes dans la quantitb
et la variété des especes ont été observées. Les deutéromycètes ont dté retrouvés en plus
grande proportion que les autres groupes taxonomiques lors des phiodes d'échantillonnage
de 2 et 24 mois après la coupe. Les ascomycètes ont été importants dans le site de
Mulgrave. Les basidiomycètes, tout particulièrement l'incomu B9 et P. gzgantea, ont été
très présents lors de I'échantillonnage après une exposition de 12 mois et ce, de maniike
plus importante, pour la période de coupe de septembre. La présence naturelle de
P. gigantea a été remarquable dans la plantation de Bristol où la presque totalité des
souches ont été colonisées. Le traitement des souches avec ce champignon n'a pas changé
qualitativement la mycoflore mais a modifie la fréquence et l'abondance des autres espèces.
L'application artificielle a augmenté et a assuré la présence de P. gigantea partidiérement
dans les tissus en profondeur. Eue a &galement accé1M le processus de dCgradation des
souches qui s'est reflété par l'augmentation de la colonisation par Trichodemu spp. et
R. atrovirens.
3.1 INTRODUCTION
Le champignon Heterobasidion annosum (Fr.) Bref, considéré comme l'un des
champignons pathogènes les plus dévastateurs des plantations résineuses à travers le
monde, a été rapporté pour la première fois en 1955 dans l'Est du Canada, au sud de
l'Ontario (Hord et Quirke 1955; Woodward et al. 1998). Son aire de dispersion a progressé
vers le nord pour atteindre le sud du Québec, où il affecte principalement les plantations de
pin rouge (Pinus resinosa Ait.) (Laflamme et Blais 1995; Whitney 1988). Le nombre de
plantations infectées demeure encore très limité au Québec, justifiant ainsi une approche
préventive de lutte par le traitement des souches ûaîchement coupées, principale porte
d'entrée pour l'infection primaire d'un site (Laflamme et al. 1998; Rishbeth 195 1). Il existe
actuellement une méthode biologique, a la fois efficace et sécuritaire pour l'environnement,
pour lutter contre cette maladie. Il s'agit de I'utilisation du basidiomycète Phlebiopsis
giguntea (Fr. :Fr.) Jül. L'efficacité de cet agent de lutte est démontrée principalement sur
les souches de pin et il est déjà utilisé de façon opérationnelle dans quelques pays
européens pour limiter l'infection des souches de conifëres (Greig 1976; Korhonen et al.
1 994; Sierota 1 997).
En 1993, des travaux de recherche ont été entrepris dans l'Est du Canada, plus
spécifiquement au Québec, pour vérifier l'efficacité de souches indigènes de P. giganteu h
limiter l'introduction de H. annosum dans les plantations de pin rouge. Les rhltats
obtenus jusqu'à présent tendent à démontrer son potentiel comme agent de contrôle
préventif (Dansereau 1996; Chapitre 2). Phlebiopsis gigantea possède une distribution
mondiale mais il se retrouve tout particulièrement dans les forêts rdsineuses de
l'hémisphère Nord (Holdenrieder et Greig 1998; Korhonen et al. 1998). En Angleterre, il
est l'un des champignons les plus communs dans la colonisation primaire des souches de
pins (Pinus syfvestris L., Pinus nigra var calabrica Schneid) qu'il degrade rapidement
(Meredith 1 959; Meredith 1 960; Rishbeth 1963). Puisque I'introduction d'isolats exotiques
d'un agent de lutte biologique dans l'écosystème peut présenter un risque potentiel,
l'utilisation de souches indigènes est plus appropriée. Sous les conditions
environnementales prévaiant dans l'Est du Canada, il existe peu d'information sur
P. gigantea, encore moins sur son écologie sur le pin rouge. Basham (1957) a
ultérieurement fait mention de la présence fréquente de P. gigantea dans les troncs de pin
blanc (Pinus srrobus L.), de pin rouge et de pin gris (Pinus banksiana L.) dans les quelques
années suivant un feu. L'utilisation massive et efficace de cet agent de lutte biologique
requiert donc de nouvelles comaissances concernant son écologie sous nos conditions
environnementales. L'étude de la présence naturelle de P. gigantea se fera par le biais de
l'étude de la mycoflore indigène colonisant les souches de pin rouge fraîchement coupées
en prélevant des copeaux de bois de sections de souche à différents moments.
Un autre facteur a considérer pour l'utilisation efficace d'un agent de lutte biologique est la
présence de la mycoflore indigène colonisant le substrat. Un bon agent de lutte doit être
cornpetitif envers la mycoflore naturelle (Etheridge 1972). La présence de certaines espèces
peut compromettre le succès de la colonisation des tissus du bois (Schoernan et al. 1996;
Roll-Hansen et Roll Hansen 1980a). Mais à l'inverse, l'application artificielle d'un agent
peut engendrer des modifications du processus naturel de dégradation. Peu de travaux ont
démontré l'impact du traitement biologique des souches de conifëres sur la colonisation
naturelle par les micro-organismes (Meredith 1960; Varese et al. 1998). Nous avons
observé que l'application artificielle de P. gigantea réduisait la colonisation des bûches de
pin rouge par les autres espèces sans toutefois modifier la nature de la rnycoflore (Chapitre
2). il est donc intéressant de vérifier l'impact du üaitement P. gigantea sur la diversité des
mycètes dans les souches de pin rouge. De plus, peu de travaux ont fait l'étude descriptive
de la mycoflore indigène associée au processus de dégradation des souches de pin
(Meredith 1959; Meredith 1960). Cette étude amènera des kléments aidant a la
compréhension du phénoméne de succession lors de la dégradation et peut-être a la
découverte de nouveaux agents de lutte efficaces. Cette étude permettra également
d'entrevoir les effets secondaires reliés a l'utilisation massive de P. gtgantea.
Cette étude vise à acquérir des connaissances essentielles à l'utilisation de P. gigantea dans
les plantations de pin rouge de l'Est du Canada. Les objectifs spécifiques poursuivis sont
1) de déterminer la composition des mycètes indigènes impliqués dans la phase initiale de
dégradation des souches de pin rouge; 2) d'observer la présence naturelle de P. gigantea;
3) de déterminer l'impact de l'application artificielle de P. gigantea sur la mycoflore.
3.2.1 Culture du champignon
Une souche de P. gigantea, soit la Plû4, sélectionnée pour son potentiel de production
d'oïdies et son lieu d'origine, est utilisée lors des inoculations. Elle a &té isolée a partir
d'une hctification sur une souche de pin rouge dans une plantation du sud-ouest du
Québec (canton Harrington). La souche est conservée à 4OC sur un milieu gélosé a base
d'extrait de Malt (3%) (MEA) jusqu'au moment de son utilisation.
3.2,2 Sites d'essais
Les essais sont établis dans trois sites expérimentaux localisés dans des plantations de pin
rouge situées dans le sud-ouest du Québec soit la région de l'Outaouais. Les paramètres
principaux qui caractérisent les sites d'essais sont présentés au tableau 3.1.
3.2.3 Traitement des souches
Suite à des travaux d'éclaircie réalisés en 1993 dans chacun des sites d'dtude, des souches
saines sont sélectionnées pour les essais. Les interventions sont effectuées à trois périodes
diffhentes, soit en mai, juillet et septembre. Des périodes différentes de coupe sont testées
afin d'obtenir une idée plus complète sur la diversité des cbampignons et de vérifier la
présence de P. gigantea selon la saison. Afin de permettre la récolte de disques de bois, la
hauteur des souches a été d'environ 25 cm. Dans les 24 heures suivant I'abattage, deux
traitements sont appliqués, témoin (eau) et P. gigantea. L'inoculation du P. gigantea est
réalisée par l'application d'une suspension aqueuse d'oïdies sur la surface fhîchement
coupée des souches. La suspension est préparée en récoltant les oidies sur la surface de
plats de Pétri (MEA, 2%) d'une culture âgée de quatre semaines. La concentration est
ajustée afin d'appliquer 200 oïdies viables/cm2. Le traitement témoin consiste a vaporiser
de i'm sur les souches. Cg traitements se font à l'aide d'un vaporisateur manuel. Le volume
Tableau 3.1. Description des trois sites expérimentaux.
Site Latitude Longitude Zone Âge Densité D.H.S ' écologique (ans) (plantdha) (cm)
-
Bristol 45038'2St1 76O23'37" 2a 35 4450 18
Grenville 45O43'43" 74'42'06" 2a 26 1800 25
Mulgrave 4S044'1 5" 75O20'30" 2a 65 nd 30
- -- - - p. - - - - - - p.
' diamètre moyen a hauteur de souche b ad = non déterminé
total de liquide utilisé est déteminé en fonction du diamètre moyen des souches traitées
(Tableau 3.1). Le volume doit permettre de recouvrir la surface coupée. Le volume est de
30 mL pour les souches des sites Bristol et Grenville, puis 60 mL pour les souches du site
Mulgrave.
3.2.4 Méthode de récolte et évaluation de la colonisation
Pour déterminer la composition de la mycoflore dans les souches, la colonisation par les
champignons est évaluée 2, 12 et 24 mois après la coupe. Un dispositif aléatoire en bloc
complet, comprenant cinq blocs est utilisé dans les trois sites. Les rondelles, environ 10 cm
d'épaisseur, sont découpées des souches à la tronçonneuse et rapportées au laboratoire. De
nouvelles souches sont utilisées à chacune des récoltes. Les rondelles sont conservées a une
température de -20°C dans des sacs de plastique jusqu'au moment de l'examen. À ce
moment, la rondelle est d'abord fendue en deux suivant un diamètre déterminé au hasard a
l'aide d'une hache désinfectée, en partant de la surface inférieure pour éviter les
contaminadons. Par la suite, des copeaux de bois (1,s x 1'5 x 2'0 mm) sont retirés de la
nouvelle surface stérile à l'aide d'un scalpel sous une hotte a flux laminaire. Pour
l'échantillonnage après les périodes d'exposition de 2 et 12 mois, les prélèvements sont
effectués sur une face longitudinale le long du diamètre ii 02, I ,O et 3,O cm de profondeur.
Nous avons ajouté des prélèvements ê 5,Q cm pour les rondelles de 24 mois. A chacun des
niveaux, des copeaux sont pris à 0,2 cm de l'écorce, à 1,O cm, puis approximativement à
tous les deux centimètres jusqu'au centre. Le même scénario se répète sur le rayon opposé.
Le nombre de prélèvements varie en fonction du diamètre de la rondelle. Les prélèvements
sont effechés sans tenir compte du bois d'aubier ou de cœur. Une moyenne de 9, 11 et 14
prélèvements sont faits par niveau dans les plantations de Bristol, Grenville et Mulgrave
respectivement. Au total, nous avons effectué 6505 prélèvements dans 173 souches. Les
morceaux prélevés sont directement mis en culture sur deux milieux : MEA (2%) + 1 ppm
bénomyl (Maloy 1974) et MEA (2%) + 50 ppm pénicilline + 40 ppm chlortétracycline. Les
boîtes de Pétri sont conservées a la température de la pièce et sont observdes régulièrement
sur une pénode de trois semaines. La présence ou l'absence de micro-organismes est
relevée pour chacun des copeaux. Tous les champignons sont séparb, puis mis en culture
pure dans des tubes (MEA, 3%) et conservés à 4OC jusqu'au moment de l'identification.
Deux paramètres sont mesurés pour évaluer la colonisation, soient la fréquence (F) et
l'abondance (A) de chacun des champignons isolés. La fréquence équivaut au pourcentage
de souches dans lesquelles le champignon est isolé. L'abondance représente le pourcentage
d'isolements où le champignon est détecté par rapport au nombre d'isolements totaux
effectués pour tous les niveaux et milieux confondus. Une moyenne de l'abondance est
calculée pour chacun des sites. Nous avons également évalue la pénétration verticale des
principaux champignons à chacune des récoltes afin d'observer le comportement des ces
espèces. Pour ce, nous avons établi la moyenne des fréquences obtenues pour les trois sites
combinés en séparant chacun des niveaux de prélèvements. Finalement, pour une
compréhension globale de la colonisation, nous avons déterminé l'abondance relative (Ar)
de chacun des groupes taxonomiques. Elle correspond au pourcentage de l'abondance totale
d'un groupe sur le total des abondances des groupes pour tous les niveaux et milieux
confondus.
3.3.1 Composition de la mycoflore
Les patrons généraux de la fluctuation dans la présence des principales espèces isolées des
souches traitées ou non avec P. gigantea sont présentés pour les temps d'exposition de
deux mois (Tableaux 3.2 et 3.3), 12 mois (Tableaux 3.4 et 3.5) et 24 mois (Tableau 3.6). La
tiéquence et l'abondance y sont présentées pour chacun des sites, chacune des périodes de
coupe et d'échantillonnage. Globalement, nous remarquons que seules quelques espèces
sont isolées systématiquement au travers des périodes et des sites. il s'agit de
Hormonema sp., P. giganrea, inconnu B9, Tympanis sp. l et Nectria sp. A cette liste
s'ajoutent quelques espèces communes mais plus spécifiques à un site, une période de
coupe ou d'échantillonnage : Peniophora pseudo-pini Weres. & Gibson, Schizophylhm
commune Fr., Rhinocladiella atrovirens Nannf., Trichoderma spp., i n c o ~ u D2 et inconnu
Ms5. Nous constatons la présence accrue de P. gigantea dans les souches traitées avec la
suspension d'ordies en même temps qu'une diminution de certaines especes. L'analyse des
résultats est concentrée sur ces principales espèces fongiques. D'autres espèces, peu
abondantes, sont inclues dans la section sur les groupes taxonomiques.
3.3.1.1 Après deux mois d'exposition
Les prélèvements effectués dans les souches témoins soumises a la colonisation naturelle
révèlent que le deutéromycète Hormonema sp. est le champignon le plus commun
(Tableau 3.2). 11 est isole dans la totalité des souches et dans toutes les situations avec une
abondance variant entre 8,7 et 25,6%. Il est associé à une coloration gris bleu des tissus de
surface. A l'exception de la période de coupe de septembre, il est plus abondant dans les
souches provenant de Grenville et de Mulgrave que de Bristol. Le deuxième champignon, à
la fois fréquent et abondant, tout spécialement pour les périodes de coupe de mai et juillet,
est I'ascomycète Tympanis sp. 1. Ii est beaucoup plus commun dans la plantation de
Mulgrave où nous l'isolons dans la totalité des souches de mai et juillet avec une
abondance de 241 et 19,7% respectivement. Ceci est nettement supérieur aux données
obtenues dans les plantations de Bristol (A7,3%) et de Grenville (AS3,6%). Dans ces deux
plantations, il est globalement plus fréquent (F180%) dans les souches de la coupe de
juillet. Au troisième rang en importance, nous retrouvons un deuxième ascomycète, soit le
Nectria sp. Ii est Fréquent dans les sites de Grenville et de Mulgnwe pour la coupe de mai
(F260%) mais surtout de juillet (F280%). il est presque absent dans les souches de Bnstol.
Nous observons ensuite deux basidiomycètes d'égale importance : P. gigantea et inconnu
B9. Le premier est ûès commun à Bristol, surtout dans les souches de la coupe de mai
(F=100%, A=9,2%). II est moins abondant dans les deux autres sites. L'inconnu B9, quant
à lui, est plus commun dans les souches coupées en mai pour les plantations de Bristol
(F=60%, A=5,3%) et de Mulgrave (F=60%, A=3,6%). Dans la plantation de Grenville, il a
colonisé plus uniformément à chacune des trois périodes de coupe mais c'est dans les
souches coupées en juillet (F=60%, A=5,2%) qu'il est le plus commun.
Nous constatons aussi que certaines espèces sont spécifiques à un site ou à une période de
coupe. À Bristol, nous observons l'importance de P. pseudo-pini pour la coupe de juillet
(F=60%); alors qu'a Mulgrave, S. commune est fréquent dans les souches coupées en mai
(F=80%). De plus, nous remarquons que les Trichoderma spp. colonisent abondamment les
souches de Grenville coupées en juillet (F=80%, A= 10,4%). ils sont peu présents dans les
deux autres sites. Il s'agit majoritairement de Tnchoderma viride Pers. : Fr. et un peu de
Trichodema hanianum Rifai aggr. Globalement, nous observons une diminution de la
colonisation pour la coupe de septembre pour la majorité des espèces. Ce phénomène est
particulièrement observable pour le Nectria sp. (FG0%, MO,5%). Finalement, nous
notons qu'une gmde majorité des prélèvements ne sont pas colonisés, entre 49,6 et 78,9%.
Dans les souches traitées avec P. gigantea, la tendance démontre que Homonema sp. est
toujours l'espèce la plus commune (Tableau 3.3). Dans les souches de la plantation de
Bristol, nous remarquons une augmentation de son abondance par rapport aux thoins pour
les périodes de coupe de mai (A=26,9%) et de juillet (A=24,2%). Dans la plantation de
Grenville, nous dénotons plutôt une baisse. La deuxième espèce dominante est P. giganteu.
Tableau 3.2. Fréquence (F)a et abondance (A) des principales espèces de champignons dans les souches de pin rouge témoins aprés deux mois d'exposition.
Bristol Grenviile Mulgrave
Mai Juillet Septembre Mai Juillet Septembre Mai Juillet Septembre
Zygornycetes
Mortierdlu isobeliina 20 0,7 O 0,0 O 0,O 20 0,7 Mortierella vinacea 20 0,7 O 0,O O 0,O O 0,O
Ascomy cetes
Ceratacystis spp, O 0,O O 0,O O 0,O 40 4,7 Necttiu sp. O 0,0 20 2,2 O 0,O 60 2,O 7)mpancS sp, 1 60 7,3 80 6,2 60 2,l 40 1,O Qmpanis sp.2 O 0,O O 0,O 20 0,7 O 0,O
Bisidiomycetes
Phlebiopsis giguntea 100 9,2 40 3,4 40 2,3 20 0,8 inconnu B9 60 5,3 20 0,8 O 0,0 20 1,O Inconnu B 1 0 O 0,O O 0,O O 0,0 O 0,0 Peniophorapseudo-pini O 0,O 60 3,1 O 0,O O 0,O ScAizophyIum commune O 0,O 20 1,1 O 0,O O 0,O
Deu t tromycetes
Acremoniumlfusidioides 40 2,3 O 0,O O 0,O O 0,0 Honnonema sp, 100 13,5 100 12,3 100 13,2 100 16,2 Penicillium spp. 40 2,4 O 0,0 60 3,9 20 0,s Rhinocladiella atmvirens 20 0.7 O 0,O O 0.0 20 0,8 mehodema spp. O 0,O O 0.0 O 0,O 40 1,9
Isoltments st&rües 100 72,8 100 75,6 100 78,9 100 73,6
Note : Les Ertquences et abondances sont exprimdes en pourcentage. Pour chacun des sites I périodes, n=5 Exccp(ion, n=4
Tableau 3.3. Fréquence (FIa et abondance (A) des principales espèces de champignons dans les souches de pin rouge traitées avec P. gigantea dans les plantations de Bristol et Grenville après deux mois d'exposition.
Bristol Grenville
Mai Juillet Septembre Mai Juillet Septembre
Zygomycetes
Mortierella kabellina Mortierella vinacea
Asco myce t es
Ceratocysris spp. Necfnà sp. M p a n i s sp. 1 TympanW sp.2
Basidiomycetes
Phlebiopsis gigantea Inconnu B9 inconnu B 10 Peniophora pseudo-pini SchizophvItr ni commune
Deu teromyce tes
Acremonium juidioides Honnonema sp. PeniciIIium spp. Rhinocladiella atrovirens Trichodema spp.
Isolements stériles
O O,o O 0,o O 0,o LOO 26,9 LOO 24,s 100 13,l 60 2,3 O 0,0 20 0,8 O 0,O 20 0,8 O 0,O O O,o O 0,o O 0,o
Note : Les tiéquences et abondances sont exprimdes en pourcentage, a Pour chacufl des sites / ptriodes, n=S
nt = non teste
Sa population augmente autant en fréquence qu'en abondance. Il est même très commun
dans les souches de Grenville pour la coupe de juillet (F=80%, A=10,4%) alors qu'il est
complètement absent dans les souches soumises à la colonisation naturelle. Tout comme
dans les souches témoins, nous observons une réduction importante de l'abondance de
P. gigantea pour la coupe du mois de septembre (A11,7%). Cette augmentation de la
présence de P. gigantea a Grenville est associée à une diminution de la présence de
l'inconnu B9, de Nectria sp. et de Tympanis sp. 1, alors que nous constatons une présence
plus appréciable des Trichoderma spp., Penicillium spp. et R. atrovirens. Ce phénomène
n'est pas observé à Bristol. Nous y remarquons plutôt l'augmentation importante de
N e c m sp. surtout dans les souches de la coupe de mai (F=100%), tandis que la population
de l'inconnu B9 et de Tympanis sp. l ne change que très peu. Un autre fait remarquable est
l'absence de tout autre basidiomycete commun. L'impact est très visible a Bristol pour la
coupe de juillet avec l'absence de P. pseudo-pini. Tout comme dans les souches témoins,
une forte proportion de copeaux, entre 48,O et 84,7%, n'est pas colonisée. Cependant, dans
la plantation de Bristol pour les coupes de mai et de juillet, nous observons moins de
morceaux stériles que dans les souches témoins.
3.3.1.2 Après 1 2 mois d'exaosition
Une première constatation est l'augmentation globale de la fiéquence et de l'abondance des
différentes espèces de champignon comparativement à deux mois d'exposition (Tableaux
3.4 et 3.5). Le nombre d'espèces avec une abondance supérieure à 3% est également plus
élevé. De plus, les souches autant témoins que traitées sont plus colonisées. Cela se traduit
par un nombre plus faible de copeaux de bois stériles, entre 15,7 et 46'2%. Dans les
souches témoins, le champignon le plus Fréquent et abondant demeure Hormonema sp.
(Tableau 3.4). 11 est présent dans la totalité des souches avec une abondance variant entre
16'1 et 28,8%. Son abondance est supérieure dans la plantation de Bristol. Le deuxième
champignon très commun est l'inconnu B9, il colonise la presque totalitk des souches à
l'exception de celles coupées en juillet. Dans les trois sites, la péiiode de coupe de
septembre favorise l'abondance (&16,9%) de ce champignon. L'ascomycète
Tympanis sp.1 occupe le troisiéme rang en importance. Ii est moins abondant dans les
souches coupées en septembre peu importe le site. Tout comme après deux mois, Mulgrave
est le site où il colonise le plus les souches (F=100%, k10,6%). Deux champignons se
partagent le quatrième rang. Le premier, P. gigantea. est particulihnent û6quent et
abondant dans la plantation de Bristol (F280%, A21 1,0%). Sa présence augmente dans les
souches de Grenville et de Mulgrave comparativement a ce qui a été observé après deux
mois d'exposition. Tout comme pour l'inconnu B9, il est plus abondant dans les souches
coupées en septembre pour tous les sites. Le deuxième à occuper le quahème rang,
l'ascomycète Nectria sp., colonise les souches avec une fréquence supérieure à 80 et 60%
pour la coupe de mai et de juillet respectivement, et ce pour tous les sites. Pour ces
pénodes, son abondance varie entre 5,2 et 22,4%. Il est beaucoup moins fréquent et
abondant dans les souches coupées en septembre (FS4O%, A12,2%).
D'autres champignons, un peu moins communs tout en étant plus spécifiques à certaines
périodes de coupe ou plantations, attirent tout de même l'attention (Tableau 3.4). D'abord,
le P. pseudo-pini demeure assa spécifique à la plantation de Bristol pour la coupe de juillet
(F=80%, A=17,0%). Nous constatons aussi que le Tympanis sp.2 colonise de manière plus
appréciable les souches coupées en mai et septembre. Il est plus commun à Mulgrave. De
plus, nous remarquons encore la forte présence des Trichdenna dans les souches de
Grenville pour la coupe de juillet (F=100%, A=17,9%). Leur fréquence augmente
également à Mulgrave (F240%). Une des différences avec la période d'exposition de deux
mois est la présence appréciable de R. atrovirens qui se retrouve jusque dans 80% des
souches de Grenville coupées au mois de mai. Nous remarquons aussi une augmentation
des champignons classes parmi les Ceratocystis (Pesotum sp., Hialocladiella sp.)
particulièrement dans les sites de Grenville et de Mulgrave. Ils ont été la plupart du temps
associés à des colonnes longitudinales noires. Nous avons également isolé Leptographium
procerum (Kendrick) M . J . Wingfield et Leptographium abietinum (Peck) M.L Wingfield et
un Phornopsis sp. A partir de ces colonnes.
Tableau 3.4. Fréquence (FIa et abondance (A) des principales espèces de champignons dans les souches de pin rouge témoins après 12 mois d'exposition.
Bristol Grenville Mulgrave
M a i Juillet Septembre M a i Juillet Septembre Mai Juillet Septembre
F A F A F A F A F A F A F A F ~ A F A
Zygomycetes
Mortierella isabellina Mortierella vinacea
Ascomy cetes
Ceratocystis spp. Nectria sp. l)mpanis sp. 1 TjwJpanis sp.2
Phlebiopsis gigantea Inconnu B9 Inconnu B 10 Peniophora pseudo-pini &hizophylurn commune
Dtuttromycetes
Acmonium jicsidioides Honnonema sp. Penicillium spp. Rhinoc/adie/la atrovirens Tnchodema spp.
Isolements stérNes
Note : Les fréquences et abondances sont exprimées en pourcentage, Pour chacun des sites / périodes, n=S Exception, n=4
La mycoflore des souches traitées avec P. gigantea présente des ressemblances et des
différences avec celle qui est présente dans les souches témoins (Tableau 3.5). D'abord, le
Hormonema sp. demeure le champignon le plus commun. Il est présent dans toutes les
souches avec une abondance variant entre 13'6 et 36,1%. A Bristol et à Mulgrave, il est
plus abondant dans les souches traitées que dans les souches témoins. La différence
principale observée entre les deux traitements est l'augmentation générale de la fkéquence
et de l'abondance de P. gigantea qui se classe au deuxième rang des champignons les plus
communs. Ce phénomène est très remarquable a Grenville (F=100%, H I , 6 % ) . Tout
comme dans les traitements témoins, il est plus abondant dans les souches coupées en
septembre dans tous les sites. L'inoculation artificielle des souches du mois de mai à
Mulgrave n'entraîne pas une bonne colonisation de P. gigantea (F=4O%, A=2,6%). Elle est
tout de même supérieure a celle observée dans les souches témoins. Dans les autres
périodes et sites, l'abondance de P. gigantea varie entre 13,9 et 32,5%. Au troisième rang,
nous retrouvons le Tympanis sp. 1. Sa présence est essentiellement la même que pour les
souches témoins mais elle a augmenté beaucoup par rapport a une exposition de deux mois.
L'augmentation de P. gigantea est associée à deux baisses marquées (Tableau 3.5). La
première est celle de la présence de l'inconnu B9, particulièrement dans les souches des
sites de Grenville et de Mulgrave pour les coupes de mai et de juillet (&3,3%). Les
résultats sont plus variables dans les souches de Bristol. Nous y dénotons plutôt une
augmentation de sa présence, sauf pour la période de septembre. Néanmoins, il demeure
plus abondant dans les souches coupées en septembre pour tous les sites. La présence et la
diversité des autres basidiomycètes changent peu par rapport a celles des souches témoins.
il faut se rappeler qu'ils étaient absents dans les souches traitées après deux mois
d'exposition. La deuxième baisse constatée avec le traitement des souches est celle de la
présence de Neciria sp., tout spécialement dans la plantation de Grenville (FS60, k3,3%).
Dans les souches de Bristol, la baisse est importante pour la coupe de mai (A=4,7%).
Tableau 3.5. Fréquence (F). et abondance (A) des principales espèces de champignons dans les souches de pin rouge traitées avec P. gigontea après 12 mois d'exposition.
Bristol Grenville hlulgrave
Mai Juillet Septembre Mai Juillet Septembre Mai Juillet Septembre
Mortierella isabellina 20 1,s Mortierella vinacea O 0,O
Ceratocystis spp. O 0,O Necina sp. 60 4,7 Qmpanis sp. 1 80 6,9 Mpanis sp.2 40 3,4
Basidiomycetes
Phlebiopsis gigantea 100 13,9 Inconnu B9 60 13,3 Inconnu B 1 O 20 1,O Peniophora pseudo-pini O 0,O Schuophylum commune 20 0,O
Deuteromycetes
Acremonium ficsidioides O 0,O Homonema sp. 100 27,8 Penicillium spp, 20 1,5 Rhinocladiella atmvirens 40 3,2 lkichodewna spp, 20 7,7
Isolements stiriles 100 33,3
Note : LeJ wuences et abondances sont exprimées en pourcentage. ' Pour chacun des sites / périodes, n=5
nt = non testé
Une autre différence remarquable observée dans les souches traitées est l'augmentation de
plusieurs deutéromycètes, soit Acremnium ficsidiodes (Nicot) W . Gams, R. atrovirens et
Trichoderma spp. (Tableau 3.5). Cette augmentation est évidente dans la plantation de
Grenville. Comme dans les souches témoins, les Thkhodenna y sont principalement
représentés par le T. viride et le T. hanianum. A Mulgrave, nous obtenons égaiement du
Trichoderma pseudo-kongii Rifai. Dans les souches de Mulgrave, nous dénotons la
présence importante du Tympanis sp.2 pour la coupe de septembre (F=100%, A=9,0%). Il
était complètement absent des souches après deux mois d'exposition. Une autre
caractéristique qui est observée est la diminution de la présence des Ceratocystis spp. dans
les souches de Grenville et de Mulgrave alors que dans les souches de Bristol, ils
apparaissent. Finalement, il est clair qu'il y a moins de morceaux de bois colonisés dans les
souches coupées au mois de septembre que dans celles des deux autres périodes de coupe.
Ce phénomène n'est pas remarqué dans les souches témoins. De plus, il y a toujours moins
de copeaux stériles a Bristol comparativement aux deux autres sites.
3.3.1.3 Après 24 mois d'exposition
Les résultats obtenus dans les sites de Bristol et de Grenville proviennent des isolements
effectués dans les souches de la coupe du mois de mai jusqu'au niveau 5'0 cm de la surface
des rondelles (Tableau 3.6). Dans les souches témoins, Homunemu sp. et Tympanis sp. 1
sont les espèces les plus fréquentes (F=IOO%) et abondantes (A15,4%). Trois champignons
se partagent le troisième rang. Le premier, l'inconnu B9, est isolé dans les trois sites avec
une frequence d'au moins 80% et une abondance supérieure à 9%. Le second, P. gigantea,
est plus Fréquent et abondant dans les souches de la plantation de Grenville (F=100%,
A=14,0%) que dans celles de Bristol (F=60%, A=4,7%). Le troisième, R. atrovirens,
colonise 80% des souches avec une abondance supérieure a 8%. Plusieurs autres espèces
sont aussi fréquemment isolées: A.jusidioides, PhiaIuphoro lagerbergii, un
deutéromycètes inconnu D2 (surtout à Grenville) et un mycélium stérile inconnu Ms5. Ces
champignons étaient beaucoup moins communs après une exposition de 12 mois. Nous
remarquons également la faible présence de l'ascomycète Nectria sp. dans les souches
témoins. Finalement, l'abondance des prélèvements stériles est beaucoup plus 6levée dans
les souches de Grenville (A=42,6%) que de Bristol (A=28,6%). Une observation semblable
a été faite après 12 mois d'exposition.
Dans les souches traitées avec P. gigantea, la présence de Homonema sp. (FQ80%,
A2 10'7%) et de Tympanis sp. 1 (F280%, A210,6%) demeure supérieure aux autres espèces
(Tableau 3.6). Tout comme dans les souches témoins, la présence de P. gigantea, de
l'inconnu B9 et de R. afrovirens est sensiblement la même. Mais à ces trois espèces,
doivent s'ajouter les Trichoderma spp. Les deux sites étudiés démontrent un comportement
inverse quant à la présence de P. gigantea et de l'inconnu B9 dans les souches traitées.
Dans la plantation de Bristol, leur présence y est plus remarquable que dans les souches
témoins tandis qu'à Grenville nous constations une baisse. Nous n'observons pas
l'apparition de nouvelles espèces de basidiomycètes de manière importante. La
caractéristique la plus évidente qui est observée dans les souches traitées est l'abondance
élevée de plusieurs deutéromycètes, tout particulièrement R arovirens (A2 14,3%) et
Trichodema spp. (A218,2%). Ils sont tous plus abondants dans les souches traitées que
dans les souches témoins. C'est également le cas pour l'inconnu D2 et Ms5. Pour ce qui est
du Neciria sp., il est presque absent. Finalement, nous remarquons que l'abondance des
pr6lèvements stériles est moins élevée dans les souches traitées que dans les souches
témoins.
Tableau 3.6. Fréquence (F). et abondance (A) des principales espèces de champignons dans les souches de pin rouge témoins après 24 mois d'exposition pour la coupe du mois de mai.
Témoin P. gigantea
Bristol Grenville Bristol Grendie
Zygomyce tes
Mortierella isabellina Mortierella vhcea
Ascomycetes
Ceratocystis spp. Nectria sp. Tympanis sp. 1 Qmpank sp.2
Basidiomycetes
Phlebiopsh gigantea Inconnu B9 inconnu B 10 Peniophora pseudo-pini
Deuteromycetes
Acremonium fisidioides Homonemu sp. Penicillium spp. P hialophora lagerbergii RhinocfadiefIa atrovirens Trichodema spp, I n c o ~ u D2
Mycéiium stérile
COMU MU M s ~
Isolements stériles
Note : Les fidquences et abondances sont exprimées en pourcentage. a Pour chacun des sites / périodes, n=5
3.3.2 Pénétration verticale
3.3.2.1 Après 2 mois d'exposition
Après deux mois d'exposition, nous constatons que les champignons sont présents
majoritairement au niveau 0,2 cm à la fois dans les souches témoins et traitées dans tous les
sites confondus (Tableau 3.7). Quelques-uns, Homonemasp., Nechia sp. et
Tympanis sp. 1, colonisent assez fréquemment le niveau 1 ,O cm dans les souches témoins
pour les périodes de mai (F226,7%) et de juillet (F242,9%). Dans les souches traitées, nous
remarquons généralement moins de Hormonema sp. à L,O cm et 3,O cm de la surface que
dans les souches témoins. En plus de ces champignons, nous observons que P. giguntea et
Trichloderma spp., ce dernier pour juillet uniquement, colonisent considérablement le
niveau 1.0 cm des souches traitées. De manière générale, très peu de champignons
colonisent les tissus à 3,O cm de la surface (F120%).
3.3.2.2 Après 1 2 mois d'exposition
Après 12 mois d'exposition, la colonisation par les champignons est assez uniforme sur les
trois niveaux (Tableau 3.8). Les champignons colonisent principalement les niveaux 0,2 cm
et 1,O cm. A la fois dans les souches témoins et traitées, nous remarquons la nette
proportion de Hormonema sp. B 0,2 cm avec une fréquence d'au moins 90%. Le
basidiomycète P. gigantea est aussi fréquent au niveau 0,2 cm que 1 ,O cm. Toutefois, il est
plus fréquent dans les niveaux 1,O et 3,O cm dans les souches traitées par rapport aux
souches témoins. L'inconnu B9 voit sa fréquence diminuée de beaucoup pour les niveaux
1,0 et 3,O cm dans les souches traitées (O%SFS33%) comparativement aux souches témoins
(14%IFS80%). Finalement, les Necnia sp., Tympanis sp.1 et R. atmvirens colonisent plus
abondamment les niveaux 1,O et 3,O cm autant dans les souches tho ins que traitées.
Tableau 3.7. Fréquence (%) des souches de pin rouge colonisées par niveau
pour les principaux champignons aprés 2 mois d'exposition.
Niveau Témoin P. gr'gantea (cm) M J S M a J S
Hormonema sp.
Phleblopsis gîgunrea
Inconnu 89
Nectria sp.
Tympanis sp.1
Rhinuciadieia atmvirens
Tràchoderma spp.
Nombre total de souches
Note : Les résultats repdsentent la combinaison des données des trois sites expérimentaux (Bristol, Grenville, ~ b l ~ r a v e ) dans le cas du traitement tdmoin et des sites de Bristol et Mulgrave pour le traitement P. giganrea, pour les périodes de mai (M), juillet (J) et septembre (S).
a Exception : site de Bristol uniquement
Tableau 3.8. Fréquence (%) des souches de pin rouge colonisées par niveau
pour les principaux champignons après 12 mois d'exposition.
Niveau Témoin P. gigPnteu (cm) M J S M J' S
Horrnonerna sp.
Phlebhpsis gigantea
Inconnu B9
Necma sp.
Tympank sp.1
Rhinocladieila uîrovirens
Triciioderma spp.
Nombre total de souches
Notes : Les résultats représentent la combinaison des donnkes des trois sites expérimentaux (Bristol, Grenville, Mulgrave) pour les @riodes de mai 0, juillet (J) et septembre (S).
a Exception : sites de Bristol et de Grenville uniquement
3.3.2.3 Après 24 mois d'exwsition
Après 24 mois d'exposition, nous constatons que la présence de Hormonema sp. est
pratiquement restreinte au niveau 0'2 cm, alors que la plupart des autres champignons sont
repartis sur les quatre niveaux (Tableau 3.9). Le Hormonema sp. est donc beaucoup moins
isolé dans les tissus en profondeur comparativement à une exposition de 12 mois. Les
P. gigantea et inconnu B9 sont eux aussi plus fréquents à 0,2 cm (F270%). Tout comme
nous l'avons observe après 12 mois, la fréquence de P. gigantea en profondeur (1, 3 et
5 cm) est plus élevée dans les souches traitées que dans les souches témoins. Nous
remarquons le même phénomène pour les Trichodema spp. Ces derniers sont plus
abondants au niveau 0,2 cm dans les souches témoins alors qu'ils sont répartis sur les
quatre niveaux dans les souches traitées. Aux niveaux 3,O et 5,O cm, nous observons
l'importance de la présence de Tympanis sp. l (F~40%) et de R. atrovirens (F>60%). Ils
sont légèrement plus fréquents dans les souches traitées. Par rapport a l'exposition de 12
mois, R. atrovirens et Trichoderma spp. sont beaucoup plus présents dans les tissus en
profondeur. Finalement, le Necnia sp. est plus fréquent au niveau 1 ,O cm dans les souches
témoins que dans les souches traitées où il est presque absent.
3.3.4 Composition des groupes taxonomiques de champignon
Les isolements effectués à l'intérieur du bois ont permis la détection de plusieurs espèces
de champignons et l'observation de leur comportement individuel. Pour amener une vision
globale de la colonisation, les différentes espèces sont regroupées ensemble selon leur
classement taxonomique et les résultats sont analysés en fonction de ces groupements.
Nous avons regroupé un certain nombre d'espèces secondaires sous le groupe mycélium
stérile » sans avoir cherché à pousser leur identification. L'abondance relative (Ar) de
chacun des groupes est présentée pour les périodes d'échantillonnage de 2 mois (Fig. 3.1 et
3.2), 12 mois (Fig. 3.3 et 3.4) et 24 mois (Fig. 3.5). Les résultats permettent d'observer une
variation selon la période d'échantillonnage, le site et la période de coupe.
Tableau 3.9. Fréquence (%) des souches de pin rouge
colonisées par niveau pour les principaux champignons après
24 mois d'exposition pour la période d'éclaircie de mai.
Niveau Témoin P. giguntea (cm)
Hormonema sp. 092 100,O 90,O 190 10,O 30,O 390 0,o 0,o 590 090 0 8
Phlebiopsk gigantea 42 80,O 70,O IBO 50,O 30,O 3,o 20,o 50,o 5 0 10,O 40,O
Inconnu B9
Neciria sp.
TympanCs sp.1
Tnkhoderma spp. 092 50,O 60,O 20,O 60,O
3.0 10,O 30,O %O 20,O 30,O
Nombre total de souches n=fO n=IO
Notes : Les résultats représentent la combinaison des données pour les sites de Bristol et de Grenville.
3.3.4.1 Aprés 2 mois d'exmsition
Le groupe des deutéromycètes est généralement celui qui domine dans les souches témoins
après deux mois d'exposition représentant un minimum de 35% des isolements (Fig. 3.1).
La seule exception vient de la plantation de Mulgrave pour la p6iiode de juillet où les
ascomycètes colonisent plus abondamment les souches (A~48,8%). La proportion
maximale occupée par les deutéromycètes est obtenue pour la période de septembre
(Ar163,5%). Elle s'associe à une diminution des ascomycètes (ArS13,6%). Dans les
souches des sites de Grenville et de Mulgrave, nous retrouvons très peu de basidiomycètes
(Ar112,7%) comparativement aux autres groupes peu importe la période de coupe. A
Bristol, cette proportion (Ar225,8%) est toutefois plus élevée, particulièrement en mai et en
juillet, les classant au deuxième rang. Dans tous les sites, la proportion des zygomycéies est
pratiquement négligeable (Ar<4,7%). Finalement, moins de 20% des isolements n'ont pu
être classés. Plusieurs des espèces composant ce groupe ne sont isolées qu'une seule fois.
Dans les souches traitées avec P. gigantea, nous observons essentiellement les mêmes
résultats sauf pour une diminution importante des ascomycètes en juillet dans les
plantations de Bristol (AS1 5'2%) et de Grenville (ArS4,9%) (Fig. 3.2). Cette baisse est
assodée à une augmentation de la proportion des deuteromycètes (Ar255,9%).
L'abondance relative des ascomycètes et des basidiomycètes varie d'un site ou d'une
période à l'autre mais ils sont toujours moins abondants que les deutbromycétes. La
proportion de basidiomycètes en mai a Bristol diminue par rapport aux témoins mais leur
abondance demeure plus importante dans ce site qu'à Grenville. Les zygomycètes, quant a
eux, occupent une proportion un peu plus élevée (1'5%-8,8%) dans les souches traitbes
que celle observée dans les souches témoins. Finalement, pour la coupe de septembre,
beaucoup de champignons sont isolés en très petit nombre et ne peuvent pas être classés
(&37,4%). Cependant, pour la période de juillet, moins de 2% des isolats ne peuvent être
classés.
Figure 3.1. Abondance relative des différentes groupes taxonomiques de champignons
après 2 mois d'exposition dans les souches témoins. (M=rnai, I=juillet, S=sep tembre).
M J S M J S M J S Bristol Grenville Mulgrave
Figure 3.2. Abondance relative des différents groupes taxonomiques de champignons après
2 mois d'exposition dans les souches traitees avec Phlebiopsis gigantea. (M=mai, J=juiiîet,
S=septembre, nmon testé)
hl J S M J S Bristol Grenville
3.3.4.2 Après 12 mois d'exposition
Les prélèvements effectués dans les souches après 12 mois d'exposition révèlent beaucoup
de variation dans l'abondance relative des différents groupes selon les sites (Fig. 3.3 et 3.4).
Malgré tout, l'élément le plus frappant est la forte proportion occupée par les
basidiomycètes pour la coupe de septembre dans les trois sites autant dans les souches
témoins (Ar236,9%) que traitées (A222,5%). Ceci est nettement supérieur aux abondances
relatives obtenues après deux mois d'exposition. De plus, une diminution globde des
deutéromycètes est constatée (25,5%-6,4%). Il y a eu peu de différences entre les
souches témoins et traitées sauf pour une proportion légèrement supérieure de
deutéromycètes dans ces dernières. Dans les souches traitées de Bristol et de Grenville, les
coupes effectuées en mai et en juillet favorisent d'abord la colonisation par les
deutéromycètes, suivie des basidiomycètes et finalement des ascomycètes (Fig. 3.4). Les
résultats obtenus dans les souches de la plantation de Mulgrave pour la coupe du mois de
mai sont différents par le fait que ce sont les ascomycètes qui dominent
(21,3%<A646,3%). Tout comme apres deux mois, la proportion de zygomycètes est
négligeable (A&4,5%). Dans les deux traitements, nous obtenons moins de 15% de
champignons à mycélium stérile.
3.3.4.3 Avres 24 mois d'exposition
Après 24 mois d'exposition, l'abondance relative des deutéromycètes est la plus &levée
(Ar242,0%), autant dans les souches thoins que traitées (Fig. 3.5). Celle des autres
groupes varie beaucoup. De façon générale, les basidiomycètes sont moins abondants
qu'après 12 mois. A Grenville, ils sont plus importants dans les souches témoins
(Ar=25,2%) que traitées (Ar=9,3%), alors que dans la plantation de Bristol, ils sont
comparables. Les ascomycètes sont moins abondants (-6,3%) que les deutéromycétes.
Les zygomycètes sont peu présents avec une abondance légèrement plus élevée dans les
souches traitées (ArX3,9%), comme nous l'avons observé également après une exposition
de deux mois. Pour terminer, les champignons non classés représentent moins de 20% des
isolements.
Figure 3.3. Abondance relative des différents groupes taxonomiques de champignons après
12 mois d'exposition dans les souches témoins. (M=mai. I=juiIIet. S=septembre)
Mycelium stérile
O DeutBromycètes
Basidiomycètes O Ascomycétes 0 Zygomycètes
M J S M J S M J S Bristol Grenville Mulgrave
Figure 3.1. Abondance relative des differents groupes taxonomiques de champignons après
2 mois d'exposition dans les souches traitées avec Phlebiopsis gigantea. (M=mai, J=juillet,
S=septembre. nt=non testé)
Mycél ium stérile O Deutérornycétes
CP Basidiornycétes O Ascomycètes
O Zygomycètes
M J S M J S M J S Bristol Grenville Mulgrave
Figure 3.5. Abondance relative des différents groupes taxonomiques de champignons après
23 mois d'exposition dans les souches coupées au mois de mai selon le traitement.
U Mycélium stérile 0 Deutéromycètes
II) Basidiomycètes
O Ascomycètes
Bristol Grenville Bristol Grenville Témoin P. gigantea
3.5 DISCUSSION
Nous avons observé des variations locales et saisonnières importantes dans la quantité et la
variété des especes qui colonisent les souches de pin rouge. Des variations semblables sont
rapportées dans la littérature et se manifestent autant entre difTérents sites d'étude qu'à
l'intérieur d'un site (Basham 1965; Meredith 1959). La production et la distribution des
spores dans l'air, la compétition entre les champignons dans les tissus du bois fraîchement
exposés, les conditions physico-chimiques des tissus et les conditions météorologiques sont
tous des facteurs à considérer pour expliquer cette variation (Ginns et Driver 1970; Kallio
et Hallaksela 1979; Roll-Hansen et Roll-Hansen 1980b). La quantité limitée de souches
examinées ainsi que la méthode d'isolement utilisée ne permettent pas d'avoir une vision
entièrement représentative de la composition de la communauté fongique indigène
responsable de la dégradation des souches de pin rouge et l'impact de l'introduction
artificielle de P. giganrea. Cette vision correspond plutôt à des clichés figés dans le temps
et l'espace.
Malgré tout, le choix de la méthode d'isolement a été judicieux puisque, a l'exception de
quelques colonnes noires, du bruissement des tissus et d'indices de dégradation, il y avait
peu de zones caractéristiques dans le bois qui auraient pu nous permettre de détecter
différentes especes. De plus, seules des hctifications de P. gigantea et de S. commune ont
été observées sur les souches. La méthode de prélèvement a donc permis d'isoler des
champignons qui seraient passés inaperçus autrement. Chapela et Boddy (1988) ont
démontré que les isolements à partir de copeaux de bois permettent d'étudier la
composition du bois en champignon de manière plus fiable, surtout au début de la
colonisation de branches de hêtre attachées. D'autres travaux ont plutôt démontré
l'avantage de I'observation directe après incubation (Rayner 1 977). Cette technique a
toutefois le désavantage de révéler uniquement les espèces qui sporulent. Dans notre étude,
plusieurs espèces n'ont pas sporulé sur milieu MEA (3%) et méme sur des rondelles de pin
rouge stériles. Cependant, une des principales limites de notre méthode d'isolement est
d'avoir effectué des prélèvements uniquement sur un diamètre. Ainsi, nous avons fort
probablement passé a côté de certains champignons. Cette perte d'information ne semble
pas, par ailleurs, avoir affecté une description qualitative de la colonisation des souches de
pin rouge ni empéché d'entrevoir certaines tendances qui pourraient éventuellement faire
I'objet d'études plus approfondies.
3.5.1 Inventaire de la mycoflore naturelle
Les résultats obtenus dans cette étude confirment la sélectivité des tissus des souches
fiaichement coupées de pin (Rishbeth 1975). Seulement sept espèces se sont avérées
communes d'un site ou d'une période a l'autre : Hormotiema sp., Tvmpanis sp.,
inconnu B9, P. gignntea, Nectria sp., Trichuderma spp. et R. airovirens. Ce qui correspond
assez bien aux principales espèces obtenues dans les bûches de pin rouge (Chapitre 2). Sur
certains points, comme la présence de P. giganrea, de champignons causant le bleuissement
des tissus et de plusieurs espèces de champignons imparfaits, la mycoflore indigène
ressemble à celle obtenue par Meredith (1959, 1960) sur des souches de pin en Angleterre
et sur des souches d'épinette de Norvège (Picea obies L. Karst) en Italie par Varese et al.
(1998). Cette dernière association est principalement dû au fait que les auteurs ont
concentré leur étude sur I'isolement de champignons microscopiques. Une différence
importante entre ces études et la notre est la faible présence de Stereum sanguinolen~ttm
(Alb. & Schw.: Fr.) Fr. dans les souches de pin rouge.
Le deuteromycète Hormonema sp. est le plus commun des champignons isolés dans notre
étude. Le niveau d'inoculum est essentiellement le même dans les trois plantations mais au
départ il a semblé plus lent à coloniser les tissus dans la plantation de Bristol. Ce qui peut
probablement s'expliquer par la forte compétition exercée par P. gigantea. Au cours des
deux années d'observations, Hormonema sp. demeure essentiellement en surface. Roll-
Hansen et Roll-Hansen ( 1980b) ont fait une observation similaire avec Hormonema
dematioides Lagerb. & Melin; celui-ci colonisait principalement la région autour de la
blessure chez l'épinette de Norvège sans pénétrer plus profondément dans les tissus.
Comme le Hormonema sp. est prélevé principalement près de la surface de la découpe, il
est probable que la méthode d'isolement utilisée a entraîné une surévaluation de la
proportion occupée par ce champignon. En effet, il est possible qu'une partie des
champignons isolés trop près de la surface ne soit pas en phase active (Butcher 1968). Cela
expliquerait pourquoi nous avons isolé jusqu'à six espèces différentes sur le même copeau
de bois. Ce phénoméne se présente aussi quelques fois dans les prélèvements effectués à
proximité de l'écorce. À l'intérieur des tissus, rarement plus de deux espèces sont isolées
sur le même copeau. Malgré le fait que Hormonema sp. soit tres commun, au premier abord
il présente peu de potentiel comme agent de lutte biologique puisqu'il ne colonise que les
tissus situés à la surface des souches. Éventuellement H. annosum pourrait coloniser les
tissus en profondeur. C'est ce que laissent envisager des observations faites sur des bûches
de pin rouge (Chapitre 2). Des essais sur des souches devraient toutefois être réalisés pour
te démontrer.
Dans le groupe des basidiomycètes, deux espèces sont tres communes, le P. gigantea et
l'inconnu B9. Après 12 mois, les tissus ont montré des signes de dégradation (écorce se
détachant, coloration brunâtre des tissus) reliés au passage de ces champignons. Ces deux
basidiomycètes ont la capacité de coloniser les tissus profondément. La plus forte
colonisation observée dans les souches coupées en septembre après une exposition de 12
mois est vraisemblablement liée à la présence d'un inoculum naturel aérien très élevé à
cette période de l'année. Nous pouvons expliquer la faible proportion obtenue apres deux
mois d'exposition pour cette période par des conditions défavorables comme une
température moyenne trop basse pour permettre une colonisation suffisante des tissus
(Dansereau 1996). La majorité des champignons présente cette caractéristique. Ce qui
explique aussi le faible taux de copeaux colonisés a cette période. L'inoculum de l'inconnu
B9 est relativement uniforme dans les trois sites, ce qui signifie que ce champignon est très
commun dans notre environnement. L'utilisation de l'inconnu B9 comme agent de lutte
biologique contre H. annosum mérite d'être étudiée car il présente une écologie similaire au
P. gigantea. Le fait qu'il ne hctifie pas pourrait cependant limiter son efficacité a long
terme. Malheureusement nous n'avons pas pu identifier l'inconnu B9 jusqu'a présent. II n'a
hctifié ni sur les souches ni sur les débris environnants, ce qui en aurait facilité
l'identification. 11 semble donc que ce ne soit pas un champignon qui hctifie beaucoup
contrairement au P. gigantea qui, des le quatrième mois, commence à hctifier sur les
souches colonisées (données non présentées). Notre étude démontre qu'un inoculum naturel
de P. gigantea est présent de mai a novembre. 11 faut cependant être prudent avec la
concentration détectée car les plantations utilisées étaient, en plus de notre étude, des sites
d'essai pour comparer la capacité de colonisation de cinq isolats de P. gigantea (Dansereau
1996).
Quatre autres espèces de basidiomycètes, moins communes, démontrent une spécificité
pour un site ou pour une période: P. pseirdo-pini, inconnu B10, S. commune et
S sangtrinuienrim. Ces derniers ainsi que P. gigantea sont des saprophytes primaires de
coniféres qui, en colonisant la surface vierge fraîchement exposée, participent à la première
étape de dégradation des tissus (Basham 1965; Boyce 1966: Frankland 1998; Holmer er al.
1997; Vasiliauskas er al. 1996). Étant donné le comportement similaire observé pour
l'inconnu B9, nous pouvons l'inclure a cette liste de basidiomycètes pionniers. A ces
espèces pionnières vont succéder au cours des années d'autres basidiomycètes plus
performants dans la dégradation des tissus (Holmer et al. 1997; Renvall 1995). La
colonisation par ces nouvelles espèces se fait généralement à partir des racines ou des
parties enterrées à la base de la souche. Dans les souches de pin en dégradation, Meredith
(1960) a observé qu'à partir de la troisième année Hypholoma fascicuh.zre (Huds.) Fr. et
Tricholoma tutilans (Schaeff.) Fr. succèdent aux P. gigantea et S. sangrrinolentum. Nos
résultats tendent à confirmer le remplacement de P. gigantea. Après 24 mois, de nouvelles
espèces de basidiomycètes non identifiées commencent a coloniser les tissus déjà altérés et
nous observons une diminution de la présence de P. gigantea. Cependant, leur très faible
présence ne permet pas d'établir une hypothèse de succession. 11 faut noter qu'aucun isolat
de H. annosum n'a été prélevé dans cette étude même dans la plantation de Mulgrave ou
quelques foyers d'infection étaient connus.
Deux ascomycètes, Tvmpanis sp. 1 et Nectria sp., démontrent une présence importante. Ils
sont particulièrement communs dans les souches de Mulgrave mais également dans celles
de Bristol dans le cas du Tympanis sp.1. Ce dernier possède par ailleurs la capacité de
coloniser rapidement les tissus de pin rouge puisqu'il est déjà assez abondant après
seulement deux mois d'exposition. Étant donné que Tvmpanis sp. 1 et Nectria sp. colonisent
davantage les souches coupées en mai et en juillet, les maxima de présence aérienne de
spores sont probablement atteints a ces périodes. La faible colonisation obtenue lors de la
coupe du mois de septembre s'explique soit par une baisse d'inoculum ou soit par la
compétition trop forte exercée par d'autres champignons. Néanmoins, nous constatons
qu'une troisième espèce, le Tvmpanis sp.2, est présent presque essentiellement dans les
souches des éclaircies de mai et de septembre après 12 mois d'exposition. Il est possible
que d'un point de vue écologique, elle remplace les autres ascomycetes au mois de
septembre par une compétitivité supérieure envers les basidiomycètes, par un niveau
d'inoculum aérien très élevé ou encore par une meilleure adaptation aux conditions
environnementales prévalant à cette période. L'absence ou la présence réduite d'un
champignon a une période ou dans un site donné peut être reliées à la trop forte abondance
d'une autre espèce ou à des conditions environnementales non favorables (Kallio et
Halfaksela 1979; Meredith 1959).
Les Tvmpanis sp. 1 et Nectrici sp. sont de bons colonisateurs des tissus internes des souches
mais ils ne sont pas associés à des tissus dégradés. Les ascomycetes ne sont généralement
pas reconnus comme des dégradeurs de tissus de bois comme il a été démontré avec
Nectria fickliona Booth sur l'épinette de Norvège (Roll-Hansen et Roll-Hansen 1980b;
Vasiliauskas et al. 1996). Dans notre étude, le Tympanis sp.1 est l'un des rares
champignons à avoir colonisé les tissus du bois de cœur situés près du centre. Basham
(1 965) rapporte la colonisation du bois de cœur de pin gris par Tympanis hypopodia Nyl. en
Ontario. Très commun, il y causait principalement une coloration rouge des tissus sans être
associé à des tissus très dégradés. La très forte colonisation par les ascomycètes dans les
souches de Mulgrave s'explique peut-être par le fait que les arbres y sont plus âgés que
dans les deux autres plantations. La proportion occupée par le bois de cœur dans les
souches était généralement plus élevée que dans les autres sites (Dansereau 1996). La
présence de souches en décomposition provenant d'une éclaircie précédente pourrait
également être une hypothèse. Seule une analyse approfondie de ces souches aurait permis
de la valider.
Comme nous l'avons vu, les deutéromycètes très communs après deux et 24 mois, voient
leur présence diminuer après un an d'exposition. La seule exception est pour la période de
coupe de juillet où leur population demeure appréciable. Cela peut s'expliquer par la
présence moins importante des basidiomycètes à ce moment. Nous poumons en conclure
que les deutéromycètes sont moins compétitifs que les basidiomycètes. En plus du
Hormonema sp. qui colonise abondamment la surface, les deutéromycètes sont représentés
par un grand nombre d'autres espèces. Chacune de ces espèces possédant ses
caractéristiques écologiques propres, il n'est donc pas surprenant d'observer des variations
très importantes dans le temps et l'espace. Au début, la majorité des especes (Alternaria
sp., Cladosporiirm sp., Epiccocunl sp., Fusari~rm sp., Plzomopsis sp.) colonisent
essentiellement la surface des tissus de la souche. Peu d'entre elles pénètrent réellement à
l'intérieur. Ce sont, pour la plupart, des ubiquistes colonisateurs de substrats en
décomposition et dont les spores produites en très grande quantité germent rapidement
(Chapela et Boddy 1985). Toutefois, avec la progression du processus de dégradation des
tissus, certaines espèces ( R oirovirens, A. jiisidioides. inconnu D2, Trichoderrna spp.)
deviennent très communes h l'intérieur des tissus de la souche. La plupart de ces
champignons sont incapables de dégrader la lignine et la cellulose. Il est fort probable
qu'ils peuvent coloniser les tissus suite au passage des décomposeurs, P. gigantea et
l'inconnu B9, qui a permis de libérer des sucres facilement assimilables.
11 est reconnu que l'activité des décomposeurs primaires modifie les propriétés physico-
chimiques du bois, permettant la colonisation par de nouvelles espèces (Holmer et al. 1997;
Rayner et Todd 1979). Meredith (1960) a démontré que plusieurs champignons imparfaits
(Gfiocladirim spp, T. viride, Penicilliitrn spp.) ainsi que des zygomycètes (Mzicor spp.)
colonisent les tissus des souches de pin dégradés par P. gigantea et S. sanguinolenium mais
pas les tissus fraîchement exposés. Les Trichodema spp. sont également plus souvent
isolés dans les tissus de sapin Douglas (Pseiidotsliga menziesii (Mirb.) Franco) dégradés
par Phellinus weirii (Murr.) Gilb. que dans les tissus sains (Nelson et Thies 1985). Trois
espèces de Rhinocladiella NannE ont été rapportées par Rayner (1976) comme
colonisatrices des zones d'interaction observées dans les tissus de souches de feuillus. Ce
sont des zones foncées peu dégradées entre des régions beaucoup plus dégradées. Elles sont
le produit d'une réaction antagoniste entre des mycéliums de différents champignons
décomposeurs (Rayner 1977). Dans le cadre de notre étude, nous n'avons pas observé de
telles zones. 11 est probable que cela est relié au fait que la dégradation n'est encore qu'au
stade initiai. Il est intéressant aussi de remarquer que Basham (1965) a isolé R. afrovirens
dans le bois de cœur de pins gris vivants.
Les zygomycètes, le groupe le moins important, n'ont occupé qu'une très faible proportion
des tissus. Ils sont représentés essentiellement par deux espèces, soit M. isabellina Oudem
et M. vinacea Dixon-Stewart. Elles colonisent presque exclusivement les tissus près de la
surface ou de l'écorce. Il est dommage qu'elles colonisent peu les souches puisqu'elles ont
démontré un potentiel a limiter l'infection par le H. annosum dans des bûches (Chapitre 2).
II s'agissait d'un effet indirect relié au traitement des souches avec des grains de seigle.
Nous avons Fréquemment remarqué la présence de M. vinacea sur les hctifications de
P. gigantea lors de la récolte d'une banque d'isolats. Par ailleurs, ces deux espèces de
Moitiei*ella ont Fréquemment été isolées a partir de morceaux de bois d'épinette de
Norvège en même temps qu'un basidiomycète (Holdenrieder 1994; Metzler 1997).
En plus de la coloration gris bleu de la surface coupée de la souche, associée en majeure
partie a la colonisation par H m o n e m a sp., nous avons observé des colonnes
complètement noires colonisées par d'autres espèces de champignons de bleuissement qui
comprennent à la fois des ascomycètes et des deutéromycètes (Ceratocystisspp.,
Leptographium spp. et Phomopsis sp.). Ces colonnes étaient plus fréquentes dans les
souches de la plantation de Mulgrave pour l'éclaircie de juillet. Les températures plus
élevées durant cette période pourraient facilement en être une des causes. Roll-Hansen et
Roll-Hansen (1980a) ont montré la relation positive qui existe entre les périodes chaudes et
le transport de spores de Ceratocystis spp. par les insectes.
Comme nous venons de le voir, chacun des sites présente des caractéristiques propres au
niveau de la mycoflore naturelle. Une des caractéristiques de la plantation de Bristol est la
présence naturelle considérable de P. gigantea. Des débris et troncs laissés au sol lors
d'éclaircies antérieures ont favorisé une augmentation importante de I'inoculum naturel
(Boyce 1966; Chapitre 2). Ce champignon était très peu présent dans la plantation de
Mulgrave. Les conditions prévalant dans la plantation de Grenville ont facilité la
colonisation par les deutéromycètes, surtout les Trichoderma spp. Finalement, la plantation
de Mulgrave dont les arbres sont plus àgés que dans les deux autres sites présente une forte
colonisation par les ascomycétes. Le cours de la succession semble donc bien déterminé
dés le début par la quantité et le type d'inoculum présent initialement, ainsi que les
conditions environnementales.
3.5.2 Mycoflore des souches traitées avec P. gigantea
Le traitement des souches ne change pas qualitativement la mycoflore mais modifie la
fréquence et l'abondance des espèces. Des résultats comparables ont été obtenus dans des
essais réalisCs sur des bûches de pin rouge (Chapitre 2). D'autres études portant sur le
traitement des souches de conifères avec des inoculations artificielles de P. gigantea
présentent des conclusions similaires (Kallio et Hallaksella 1979; Meredith 1960). Un des
effets illustrés par notre étude est l'augmentation de la présence de P. gigantea dans les
souches, particulièrement dans les tissus en profondeur. La pénétration rapide des tissus
oftie un avantage compétitif important. L'inoculation artificielle permet d'assurer un
niveau suffisant d'inoculum surtout dans le cas de faible présence naturelle du champignon
comme nous avons pu le constater à Grenville pour l'éclaircie effectuée au mois de juillet.
Les trois périodes d'inoculation permettent d'obtenir une bonne colonisation des souches
par P. gigantea mais la période de septembre semble, au premier abord, plus favorable.
Deux hypothèses pourraient expliquer ce phénomène. L'hypothèse la plus évidente serait
celle d'une augmentation du taux de colonisation reliée a une présence naturelle élevée
pendant cette période. Cependant, sur la base d'observations faites après une exposition de
six mois sur des souches coupées en mai, il est plus juste de considérer une deuxième
hypothèse (données non-présentées). Celle-ci veut que P. gigantea ait déjà envahi les tissus
au-delà du niveau de $0 cm dans les souches traitées au mois de mai et juillet tout en étant
remplacé par d'autres champignons dans les niveaux inférieurs. Cela est relié à une
colonisation plus rapide au cours de la première année. Nous n'avons malheureusement pas
évalué la colonisation à une profondeur supérieure à 5,O cm qui aurait pu confirmer notre
hypothkse. Plusieurs facteurs présents dès la coupe peuvent expliquer le retard dans la
colonisation des souches coupées en septembre. Les températures fraîches à cette période
ralentissent la croissance de P. gigantea limitant ainsi son pouvoir compétitif puisque les
spores de nombreuses espèces s'accumulent en même temps sur les tissus de surface. La
force de cet agent de lutte est son pouvoir compétitif associé à une colonisation rapide des
tissus Fraîchement exposés.
Tout comme nous l'avions observé dans les bûches de pin muge, des tests d'incompatibilité
somatique ont indiqiié que presque tous les isolats provenant des souches traitées de
Grenville et de Mulgrave correspondaient à la souche appliquée (Chapitre 2; Roy el al.
1997). La seule exception observée dans la plantation de Grenville correspond à la période
de coupe de septembre où nous avons déterminé que certains des isolats provenant des
souches traitées ne correspondaient pas a la P 104 (données non-présentées). Pour le site de
Bristol, une bonne partie des isolats provenant des souches traitées ne correspondait pas au
P 104. Cela est sans aucun doute, comme nous l'avons déjà mentionné, la conséquence de la
forte concentration d'inoculum naturel. La grande majorité des isolats provenant des
souches témoins étaient différents de la souche P 104 utilisée dans le traitement.
La présente étude montre également l'impact important du traitement des souches avec
P. gigantea sur la colonisation des tissus par l'inconnu B9. La compétition entre les deux
champignons est très visible après une exposition de 12 mois ou la présence plus
considérable de P. gigantea dans les tissus entraîne une baisse de celle de l'inconnu B9.
Curieusement, l'effet est moins évident dans les souches de la plantation de Bristol ou le
P. gigantea est fortement présent naturellement. Il est probable qu'un équilibre naturel
établi entre les deux champignons en est l'explication ou encore qu'il y règne des
conditions plus favorables à la colonisation par l'inconnu B9. Néanmoins, ce dernier
colonise abondamment les souches traitées une fois la diminution de la présence de
P. gigantea observée après 24 mois. Cette disparition de P. gigantea est un phénomène déjà
expliqué précédemment et il est normal de l'observer au cours du processus de dégradation,
Par ailleurs, certaines espèces, principalement R. atrovirens et Trichuderma spp., sont
devenues beaucoup plus communes dans les souches traitées que dans les souches témoins.
Ce résultat suppose une dégradation plus avancée des souches traitées permettant a ces
champignons de coloniser les tissus plus rapidement. Les résultats obtenus plus rapidement
dans les souches traitées se comparent à ceux obtenus avec le temps dans les souches
témoins. Le traitement des souches amène donc une accélération du processus de
dégradation.
3.6 CONCLUSION
Cette étude a permis d'établir les bases de la compréhension du processus de dégradation
des souches de pin rouge. Il existe une grande diversité de rnycètes impliqués dans la phase
initiale du processus. Cependant, seulement quelques espèces sont retrouvées en forte
proportion. Cette diversité varie beaucoup en fonction des conditions environnementales et
de l'historique des sites d'études. La présence naturelle importante de P. gigantea ainsi que
ses effets sur la colonisation naturelle démontrent que son application artificielle ne nuirait
pas aux étapes subséquentes de dégradation mais accélérerait le processus. Ceci apparaît
comme un net avantage pour une utilisation efficace de P. gigantea. L'inoculation
artificielle des souches est nécessaire pour assurer un minimum d'inoculum. Elle est
particulièrement importante dans les plantations n'ayant subies aucune éclaircie mais
également lors des périodes où le niveau d'inoculum naturel n'est pas assez élevé. Cela
confirme des observations faites sur d'autres espèces de coniferes lors de l'application
artificielle de P. gigantea (Greig 1 976; Rishbeth 1963; Rishbeth 1975). Ces résultats
combinés à ceux du chapitre 2 laissent entrevoir le succès de cet agent de lune biologique
dans les plantations de pin rouge de l'Est du Canada. Il faudrait en confirmer l'efficacité
contre H. annosum par des tests réalisés sur des souches en y appliquant aussi le
champignon pathogène.
Basham, J.T., 1957: The deterioration by fungi of jack, red, and white pine killed by fire in
Ontario. Can. J. Bot. 35, 155-1 72.
Basham, J.T., 1965: Heart rot of Jack pine in Ontario. 1. The occurrence of Basidiomycetes
and microhngi in defective and normal heartwood of living Jack pine. Can. J. Bot. 44,275-
295.
Boyce, J.S. Jr, 1966: Sporulation of Peniopkora giga~tiea with reference to control of
Annosus root rot. Forest science 12,2-7.
Butcher, LA., 1968: The ecology of fungi infecting untreated sapwood of Pinics rudiata.
Cm. J. Bot. 46, 1577- 1589.
Chapela, I.H.; Boddy, L., 1988: Fungal colonization of attached beech branches. II. Spatial
and temporal organization of communities arising tiom latent invaders in bark and
funciional sapwood, under different moisture regimes. New Phytol. 1 10,4747.
Dansereau, A., 1996: Colonisation des souches de pin rouge par Phlebiopsis giganieu dans
le cadre d'un essai de lune contre la maladie du rond au Québec. Mémoire de maîtrise,
Département des sciences du bois et de la forêt. Université Laval, Québec, Canada. 63p.
Etheridge, D.E., 1972: Antagonistic interactions in wood-inhabiting microorganisms and
biological control of decay. In: Biological control of forest diseases, XV IUFRO meeting,
Gainsville, Florida, 1971. Nordin, V.J., éd. Ottawa: Can. For. Serv., pp. 37-53.
Gims, J.H.; Driver, C.H., 1970: The mycobiota of slash pine shimps and its influences on
the occurrence of annosus root rot .In : Interaction of organisms in the process of decay of
fiorest trees. Bulletin no 13, Université Laval, Fonds de recherches forestières de
l'Université Laval, pp. 1 1 - 18.
Frankland, K., 1 998: Fungal succession - unravelling the unpredictable. Mycol. Res. 1 02,
1-15.
Greig, B.J.W., 1976: Biological control of Fomes annosus by Peniophora gigantea. Eur. J.
For. Path. 6,6507 1.
Hoidenrieder, O., 1994: Isolation of decay fun@ fiom increment cores: hstrating
experience from Switzerland. In: Proc. of the 81h int. Conf Root and Bun Rots, Wik,
Sweden and Haikko, Finland, August 9-16, 1993. Sohansson, M.; Stenlid, J., eds. Uppsala:
Swed. Univ. Agric. Sci. pp. 576-58 1.
H oldeMeder, O.; Greig, B.J. W., 1998 : Biological methods of control. In : Heterobasidion
annosum. Biology, ecology, impact and control. Woodward, S.; Stenlid, J.; Karjalainen, R.;
Hüttermann, A., éds. CAB international, Oxon, U.K. pp. 235-258.
Holmer, L.; Renvall, P.; Stenlid, J., 1997: Selective replacement between species of wood-
rotting basidiomycetes, a laboratory sîudy. Mycol. Res. 10 1, 7 14-720.
Hord, H.H.V.; Quirke, D.A., 1955: Province of Ontario: Forest disease survey. In : Annual
Report of the forest insect and disease survey. Dep. Agric., Ottawa, Ontario. pp. 56-69
Kallio, T.; Hallaksela, A.-M., 1979: Biological control of Heterobasidion annosus (Fr.)
Bref. (Fomes annsoris) in Finland. Eur. J. For. Path. 9,298-308.
Korhonen, K.; Kannelsuo, S.; Vainio, E.; Hantula. J., 1998: Population structure of
Phlebiopsis giguntea in Europe. hi: Root and Butt Rots (9th International Conference on
Root and Butt Rots). Delatour, C.; Guillaumin, J.J.; Lung-Escarmant, B.; Marçais, B., éds.
INRA Edition, Les Colloques n089, p. 438.
Korhonen, K.; Lipponen. K.; Bendz, M.; Johansson, M.; Ryen, 1.; Vem, K.; Seiskari. P.;
Niemi, M., 1994: Control of H. anriosirm by stump treatment with "Rotstop", a new
commercial formulation of P. g iga~~fea . 111: Proc. of the 8th Int. Conf. Root and Butt Rots,
Wik. Sweden and Haikko. Finland, August 9-16, 1993. Johansson, M.; Stenlid, J., éds.
Uppsala: Swed. Univ. Asc. Sci. pp. 675-685.
Latlamme, G.; Blais, R., 1995: Détection du Heterobasidion annosum au Québec.
P hytoprotection 76,39-43.
Laflamme, G.; Blais, R.; Bussieres, G., 1998: Eradication trial of annosus root rot in red
pine plantations. In: Root and Butt Rots (9th International Conference on Root and Butt
Rots). Delatour, C.; Guillaumin, J.J.; Lung-Escarmant, B.; Marçais, B., éds. INRA Edition,
Les Colloques n089, pp. 375-380.
Maloy, O.C., 1974: Benomyl-malt agar for the purification of cultures of wood decay
fun@. Plant Disease Reporter 58,902-904.
Meredith, D.S., 1959: The infection of pine sturnps by Fomes annosus and other fungi.
Am. Bot. 23,455-476.
Meredith, D.S., 1960: Further observations on fungi inhabiting pine stumps. Ann. Bot. 24,
63-78.
Metzler, B., 1997: Quantitative assessrnent of Fungal colonization in Nonvay spnice atter
green piuning. Eur. J. For. Path. 27, 1-1 1.
Nelson, E.E.; Thies, W.G., 1985: Colonization of Phelliriirs werii-infested stumps by
Trichuderma viride. 1. effect of isolate and inoculum base. Eur. J. For. Path. 15,425-43 1.
Rayner. A.D.M.. 1976: Dematiaceous hyphornycetes and narrow dark zones in decaying
wood. Trans. Br. Mycol. Soc. 67, 546-549.
Rayner, A.D.M.. 1977: Fungal colonization of hardwood stumps fiom natural sources. 1.
non-basidiomycetes. Trans. Br. Mycol. Soc. 69, 29 1-302.
Rayner, A.D.M.. Todd, N .K., 1 979: Population and cornmunity structure and dynamics of
fungi in decaying wood. Adv. Bot. Res. 7,333-420.
Renvall, P., 1995: Community structure and dynamics of wood-rotting Basidiomycetes on
decomposing conifer trunks in northem Finland. Karstenia 35, 1-5 1.
Rishbeth. J., 1951: Observations on the biology of Fomes annosus, with particular
reference to East Anglian pine plantations. II. Spore production, stump infection, and
saprophytic activity in stumps. Am. Bot. 15, 1-2 1.
Rishbeth, J.. 1963: Stump protection against Fomes annosus. III. Inoculation with
Peniophom giganfeu. Am. Appl. Biol. 52,63-77.
Rishbeth, J., 1975: Stump inoculation: a biological control of Fomes annosris. In: Biology
and control of soil-borne plant pathogens. Bruehl, G.W., éd. APS Press, St. Paul, Minesota.
pp 158-162.
Roll-Hansen, F.; Roll-Hansen, H., l98Oa: Microorganisms which invades Picea abies in
seasonal stem wounds. 1. General aspects. fimenomycetes. Eur. J. For. Path. 10,32 1-339.
Roll-Hansen, F.: Roi l-Hansen, H., 1 98Ob: Microorganisms which invades Picea abies in
seasonal stem wounds. II. Ascomycetes, fùngi impertècti, and bactena. General discussion,
~vmenonzycefes included. Eur. J . For. Path. 10,32 1 -339.
Roy, G.; Cormier, M.; Hamelin, R.C.; Dessureault, M., 1997: Cornpanson of RAPD
technique and somatic incompatibility tests for the identification of Phlebiopsis gigantea
strains. Can. J. Bot. 75,20974104.
Schoeman, M.J.; Webber, J.F.; Dickinson, D.J., 1996: The effect of difisible metabolites
of Triehoderma hatzianum on in vitro interactions between basidiomycete isolates at two
different temperature regimes. Mycol. Res. 100, 1454- 1458.
Sierota, Z.H., 1997: Dry weight loss of wood after the inoculation of Scots pine stumps
with Phlebiopsis gigantea. Eur. J . For. Path. 27, 179-1 85.
Varese, G.C.; Franco, D.; Buffa, G.; Luppi, A.M.; Nicolotti, G., 1998: ERects of biological
and chernical treatments against Heterobasidion annosum on Picea abies stump mycoflora.
In: Root and Butt Rots (9'h International Conference on Root and Butt Rots). Delatour, C.;
Guillaumin, J.J.; Lung-Escamant, B.; Marçais, B., éds. INRA Edition, Les Colloques n089,
p 448.
Vasiliauskas, R.; Stenlid, J.; Johanssson, 1996: Fungi in bark peeling wounds of Picea
abies in central Sweden. Eur. J. For. Path. 26, 285-296.
Whitney, RD., 1988. L'ennemi caché. Transfert de la technologie concernant les
pounidiés. Min. Rich. Nat. Ont. Et Serv. Can. For., Sault Ste. Marie, Ontario. 35 p.
Woodward, S.; Stenlid, J.; Kajalainen, R.; Hjttermann, A., 1998 : Heterobasidion
annosum. Biology, ecology, impact and control. CAB International, Oxon, U.K. 589p.
CHAPITRE 4
Cornparison of RAPD technique and somatic incompatibiiity tests for the
identification of Phiebiopsis gigunteri strains.
L'incompatibilité somatique et l'amplification au hasard d'ADN polymorphe (RAPD) ont
été comparées pour réaliser le suivi de Phlebiopsis gigantea, un champignon utilisé comme
agent de lune biologique pour le contrôle de la maladie du rond causée par Heterobasidion
annosum. Dans l'ensemble, il y a eu concordance des résultats entre les deux méthodes. La
totalité des isolats incompatibles ont présenté des profils d'amplification différents tandis
que les isolats compatibles, à l'exceptions de deux, ont présenté des profils identiques. Les
essais d'incompatibilité et les profils d'amplifications générés par trois amorces dont nous
avons retenus 11 marqueurs ont p m i s de distinguer les trois souches testées sur le terrain
des 60 isolats provenant d'une population récoltée au Québec et en Ontario. Les deux
techniques ont également permis de démontrer clairement la présence des isolats inoculés
un an après le traitement. L'utilisation combinée des deux approches ofie un outil précieux
pour distinguer des isolats de P. gigantea afin de réaliser des études épidémiologiques sur
le devenir de cet organisme dans l'environnement.
4.1 INTRODUCTION
For the past thirty years, Phlebiopsis gigantea (Fr.) JÜl. has been used as a biological
control agent against the pathogenic fungus Heterobasidiun annosum (Fr.) Bref, which
causes a root and butt rot disease of conifers in temperate and boreal forests throughout the
northem hemisphere (Greig 1 976; Hodges 1 969). Heterobasidion annosum was first
reported in eastem Canada in 1955 infecting red pine (Pinus resinosa Ait.) plantations in
southern Ontario (Hord and Quirke 1955). The pathogen was first detected in Québec in
1989 in a thinned red pine plantation in the Outaouais region close to the Ontario border
(Laflamme and Blais 1993). The number of infected sites has since inmeased (Laflamme
and Blais 1995).
The basidiomycete P. gigantea is a very common saprophytic pine decay fimgus. It is a
strong cornpetitor and is one of the few successful biological controls used on a large scale
(Cook et al. 1 996). It is currently applied to conifer stumps afier logging in England (Greig
1976; Rishbeth 1975), Finland (Kurkela and Lipponen 1993), and Poland (Rykowski and
Sierota 1983) to prevent penetration of H annosum through the cut surface. Results from
field trials on red pine stumps have confirrned the potential use of P. gigantea as a
biocontrol agent against H. annosum in eastem Canada (Dansereau 1996).
Phlebiopsis gigantea is easily recognized in pure culture by the presence of oidial chains,
encnisted upright a e d hyphae, and multiple clamp connections (Stalpers 1978). However,
to get more pertinent infomation about its field performance, it is important to develop
techniques allowing the discrimination between introduced strains and naturally occwing
populations. This will allow confirmation of the establishment of introduced strains and the
monitoring of spread within the environment. A classical approach for identifjing different
fungal individuals is the use of somatic incompatibility (SI) testing. This test relies on a
selflnon-self rejection mechanism which is characterized by the formation of a reaction Iine
(barrage zone) between two different fungal straias when contionted on artificial media. SI
is a simple method used to trace the movement, population distribution and dispersal
mechanisms of many wood decay fùngi, and as a tool for identiwg individual dikaryon
genotypes (Adams and Roth 1967; Adaskaveg and Gilbertson 1987; Lewis and Hansen
199 1; Rayner et al. 1984; Wilson 199 1). Heterokqons of P. gigantea exhibit this reaction
under laboratory conditions (Korhonen and Kauppilla 1988).
More recently, the use of molecular markers has been investigated to diffeienciate between
individuals. Cornparison studies between SI systems and different molecular techniques
have been reported for several hngal species (Holmer et al. 1994; Jacobson et al. 1993;
Kohn et al. 1 99 1 ; Meijer et al. L 994; Mueller et al. 1996; Rivo et al. 1995; Rodrigues et al.
1995; Sen 1990; Stenlid 1985). The generation of DNA fingerprints using the randornly
amplified polyrnorphic DNA technique (RAPD) is particularly usefil since no prior genetic
knowledge of the target organism is required (Williams et al. 1990). RAPD markers have
been used by many authors to distinguish fungal species, races, pathotypes, and strains
(Garbelotto et al. 1993; Gosselin et al. 1995; Guthrie et al. 1992; Hamelin et al. 1996;
Jungehülsing and Tudzynski 1997; Raina et al. 1997; Smith et ai. 1992).
The objectives of this study were: 1) to distinguish introduced strains of P. gigantea fiom
the nanirally occuring population by SI tests, 2) to identify sets of genetic markers allowing
the discrimination of P. gigantea strains, and 3) to compare SI tests and RAPDs for their
potential use in monitoring the establisment and survival of introduced strains.
4.2 MATERIALS AND METHODS
4.2.1 Fungal strains
Three P. gigantea strains (P037, PO79 and P 104) collected in Québec were tested as
biological control agents in red pine plantations in the spnng of 1993 (Dansereau 1996).
They were compared to P. gigantea strains from three different populations. The first one
was composed of 60 strains randomly choosen fiom a naîural population collected in 1992
in Québec and Ontario. These dikaryotic cultures were obtained by plating clean
basidiocarp tissue fragments on to 2% Difco malt extract agar (MEA) amended with
benomyl (1 mg/L), penicillin-G (50 mg/L) and chlortetracycline (40 mg/L). AAer five days
of incubation under arnbient laboratory conditions (20-25'C), subcultures were made on
fiesh MEA and stored in test tubes at 4OC. The two other populations were collected one
year after the selected strains (P037, PO79 and P 104) had been applied. They comprised 20
and 21 strains isolated from wood chips collected fiom different stumps in two red pine
plantations located in the Grenville and Bristol cantons (Outaouais region, Québec)
respectively.
4.2.2 Somatic incompatibüity testing
Two 5 mm diameter inoculum plugs of each unknown dikaryon culture were cut fiom the
margins of actively growing colonies. The disks were placed 3 cm apart near the center and
to one side of a 9 cm Petri plate containhg MEA (1%). Two plugs fiom the test strains
(either P037, PO79 or P 104) were placed on the opposite side of the plate, 3 cm apart fiom
the first one (Fig. 4.1). Self-crosses (compatibility reaction) served as controls. Each
confrontation was repeated once and replicates of ten randomly chosen pairs were c b e d
out. Plates were incubated for three weeks at room temperature (20-2S°C), and mycelid
interactions were noted. Strains were classified as somatically incompatible if a reaction
line forrned between them (Fig. 4.1). This zone varied 60m very sttong to light. Paired
strains that did not form such a zone and whose mycelia grew ûeeIy together were
designated as compatible.
Figure 4.1. Pairings among strains of P. giguntea der tbtee weeks on 1% malt extract
agar. (A) Somatic compatibility between P367 and PO37 as indicated by intermingling
mycelia. (B) Somatic incompatibility as showed by forniaton of a reaction line between
PO79 and P037. Petri dishes (9 cm diameter) were used.
4.2.3 DNA extraction
Fungal stniins were grown in liquid culture at ambient temperature (20-25°C) in 250-mL
Erlenmeyer flasks containing 50 rnL of glucose media (6% glucose, 2% yeast extract). The
cultures were harvested three weeks afier inoculation. Each culture was filtered, washed
with sterile distilled water and lyophilized. The harvested and dned mycelium was ground
to a fine powder in liquid nitrogen using a mortar and pestle.
DNA was extracted using a modified version of the protocol developed by Zolan and
Pukkila (1986). Five hundred microliters of extraction buffei (700 mM NaCl, 50 m M Tris-
HCI (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1% CTAB, 1% 2-mercaptoethanol) was added to
approximately 50 pL of dry powdered myceliurn and mixed to produce an homogenous
solution which was incubated at 60°C for 30 min, then mixed by vortex for 2 sec. The
mixture was emulsified by adding an qua1 volume of chloroform:isoamyl alcohol (24:1),
vortexing and centrifuging for 5 min at 12000 x g. Nucleic acid was precipitated fiom the
supernatant by adding an equal volume of isopropml (400 (IL). The precipitate was
pelleteci, then resuspended in 350 PL TE (1 0 rnM Tris-HCl (pH 8.0), 1 .O m M EDTA) and
re-extracted with an equal volume of chloroform:isoamyl alcohol (24: 1 ), vortexing and
centrifiiging for 5 min at 12000 x g. Finally DNA was precipitated by adding 150 pL of 7.5
M ammonium acetate followed by 900 pL of cold absolute ethanol and centrifùged. The
resulting pellet was washed with 70% cold ethawl, dried and resuspended in 50 PL of TE.
The concentration of extracted DNA was estirnated by comparing the band intensity of
samples on a 0.8% agarose gel to DNA standard.
4.2.4 DNA amptification
Amplifications were cmied out in volumes of 12.5 pL containing 10 mM Tris-HC1 (pH
8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgC12, LOO pM of each dNTP (Pharmacia), 0.5 units of Taq
DNA polymerase (Boehringer Mannheim Biochernica, Mannheim, Gerrnany),
approximately 10 ng of genomic DNA and 0.2 pM of oügonucleotide primas (10-mer kit
A, C or J, Operon technologies, Alameda, CA). Amplifications were pedormed in a Perkin
Elmer DNA thermal cycler (GeneAmp PCR System 9600) programmed for 45 cycles
following the method of Perron et al. (1995). Each cycle consisted of a denaturation step of
15 s at 94OC, followed by an annealing step of 15 s at 35°C with an extension step of 90 s at
72OC. The extension step of the last 25 reactions was progressively extended at a rate of 5 s
per cycle. The last cycle was completed with a 10 min extension at 72OC. Amplification
products were seperated by electrophoresis on gel containhg 0.5% Synergel and 1%
agarose in TPE buffer. The gels were stained with ethidiurn bromide and photographed
under UV light.
4.2.5 RAPD analysis
We screened 47 primers to identify polymorphic RAPD fragments that permitted
discrimination between the test strains (P037, PO79 and P104). Primers OPC-06 (5'-
GAACGGACTC3'), OPJ-05 (5'-CTCCATGGGG-3') and OPE09 (5'-TGAGCCTCAC-
3') (Operon technologies, Alarneda, CA) generated reproducible polymorphisms and were
retained. RAPD fragments were identifiai by the name of the primer and the size of the
DNA amplification product. Polyrnorphisms were scored as presence or absence of the
amplified fiagxnent. interpretation of banding patterns did not include band intensity. It was
assumeci that comigrating fiagxnents were homologous. Al1 RAPD amplifications were
repeated at least twice. The three test strains were included as positive controls in most
amplifications.
4.3.1 Somatic incompatibility
All pairings between dikaryotic cultures of P. giganteu from the natural population
(Québec/Ontario) sampled prior to inoculation and test strains (P037, PO79 and P104)
showed incompatible reactions characteristic of distinct genotypes (Table 4.1). A
continuum of interaction lines was observed. These varied fiom strong demarcation lines,
characterized by a dense myceliurn (sometimes yellow), to a diffuse zone without mycelia.
Some pairings exhibited a double line reaction. For this study, al1 of the various types of
interaction lines were regarded as dernonstrating incompatibility. Afier one week, most of
the incompatible reactions appeared macroscopically as a clear zone with a line lacking
mycelial growth. AAer three weeks, dense mycelia started to accumulate in the interaction
zone (Fig. 4.1). Al1 self-pairings were somatically compatible, characterized by non-
antago nistic intermingling colonies where the mycelia mixed fkeel y.
In conûast to the natural population studied, 14 strains originating from stumps that had
been inoculated in the Grenville plantation and 8 fiom the Bnstol plantation were
somatically compatible with one of the three test strains suggesting that they were
genetically identical (Table 4.1). Compatible pairings occured between al1 5 strains fiom
inoculated stumps in the Grenville plantation and the original cultures PO37 or P 104, and 4
out of 5 pairings for strains fiorn sturnps inoculated with P079. Strains 6om the Bristol
plantation showed fewer compatibility reactions: 2 out of 5 for P037, 1 out of 3 for PO79
and 5 out of 9 for P104. At both sites, strains from uninoculated (control) sturnps were
incompatible with al1 three test strains.
Table 4.1. Numbei of strains of P. gigantea showing compatible reaction and identical
RAPD fingerprint to the introduced test strains P037, PO79 and P 104.
SI RAPD
Treatment PO37 PO79 Pl04 PO37 PO79 Pl04
Grenville T37
T79
Tl04
Control
Bristol T37
T79
Tl04
Control
Note: Number of suains tested are in parenthesis. RAPD cornparisons were canied out using 9 markers for PO37 and 1 1 markers for PO79 and P 104.
4.3.2 RAPD analysis
Of the 47 primers tested OPC-06, OPJ-05 and OPJ-09 produced clear and reproducible
bands that allowed the three test strains to be distinguished from the 60 strains fkom the
nahiral population (Fig. 4.2). Three amplified DNA fragments for primer OPC-06, 3 for
OPJ-05 and 5 for OPJ-09 were selected as discriminating bands (Tables 4.2, 4.3 and 4.4).
Fragment OPJ-090.65 was monomorphic whilst the remaining 10 were polymorphic. The
primers produced 7 (A-G) distinct RAPD profiles for both OPC-06 and OPJ-05, and 8 (A-
H) for OPJ-09. To ensure that between-strain differences in RAPD profiles wcle not the
result of artefacts such as somatic mutations i n c d during liquid culture or passage in the
field, eight strains were inoculateci on to red pine wood discs under sterile conditions and
reisolated after four weeks. RAPD profiles and results fiom SI tests were identical before
and after passage in wood (data not shown).
While most markers were stable between repetitions, two were amplified in only a portion
of the repetitions. Markers OPJ-51.90 and OP~-090,80 were present in 75% and 80%
respectively of the amplifications for P037, and were considered unstable for that strain.
Thus, OPJ-05 pattern C or G and in the same manner for OPJ-09 pattern A or D were
considered to be equivalent for distinguishing PO37 (Tables 4.3 and 4.4). The other 9
markers were stable for the three strains. Al1 i 1 markers were stable between repetitions
and were used to differentiate PO79 and P 104.
None of the 60 strains obtained from the naturai population pnor to inoculation showed the
same banding pattern as the three test strains (Table 4.5). Combination of the three primers
allowed the 60 strains io be divided into 21 RAPD groups each containing 1 to 12 strains
with the same profile. The hi& number of diff'ent patterns revealed a great degree of
DNA polymorphism within the population. Combination of two profiles, J5-B and J9-F (8
markers), were sufficient to distinguish PO79 fiom al1 other strains, and profles C6-F
combined with J9-H (8 markas) ailowed Pl04 to be distinguished fiom the remaining
strains. Finally, it appeared that either profile I5-C or 1543 (3 markers) were sufficient to
distinguish PO37 fiom the population studied.
The DNA fingerprints obtaind for strains collected h m the Grenville and Bristol control
sturnps did not match any of the three test strains (Table 4.6). Fingerpnnts of PO79 and
P 104 were obtained from al1 strains compatible with them. Most of the strains that were
compatible with PO37 had identical RAPD patterns. However, the two unstable markers
(OPJ-5 1.90 and OPJ-90.go) present in the banding pattern of PO37 were always absent in the
profile of two compatible strains, P387 and P367 respectively (Table 4.6). A consmative
approach taking into account only 9 markers classed P387 and P367 as identical to P037.
Furthemore, only two strains, P409 and P467, that were incompatible with PO37 showed
the combination of markers OPJ-O5 1-48 and OP J-05 1 ~ 0 , represented by J5-C or J5-G
profiles (Table 4.6). These two strains could be separated 60m PO37 on the basis of their
banding patterns using OPC-06 and OPJ-09.
Figure 43. Gel electrophoresis of RAPD profiles of the test strains (PlW, P079, P037)
obtained with primers OPC-O6 (A), OPJ-05 (B), and OPJ-09 (C). The numbers on the left
are length of the bands considered in the analysis. Lanes "M" are 100 Base-Pair Ladder
(Pharmacia Biotech) molecular marker.
Table 4.2. RAPD patterns of P. gigantea for OPC-06 primer. - -- - - -
RAPD pattem Fragment size
A B C D E F G
Note: The presence or absence of a fiagrnent is specified by 1 or O respectively.
Table 4.3. RAPD patterns of P. gigantea for OP$-05 primer.
RAPD pattem Fragment size
Note: The presence or absence of a fragment is specified by 1 or O respectively.
Table 4.4. RAPD patterns of P. gigantea for OPJ-09 primer.
Fragment size RAPD pattern
A B C D E F G H
- -- --
Note: The presence or absence of a hgment is spccincd by 1 or O rcspcctively.
Table 4.5. RAPD profiles of P. gigantea strains used in shimps inoculations and of
strains from the natural population pnor to inoculation.
. -
RAPD profile
Stmin No.
Note: For banding pancms sec Tables 4.2,4.3 and 4.4. To simpliS, the table, "P" was omined fiom in front of each strain number.
"trains u s d in the initial inoculation.
Table 4.6. RAPD profiles and somatic incompatibility interactions with test
strains of P. gigantea strains from the population collected one year after
inoculation.
RAPD profile
Strain No. None PO37 PO79 Pl04
Note: For banding patterns see Tables 4.2,4.3 and 4.4. Strains with n u m b commcricing with 3 or 4 were obtained from stumps in the Grenville and Bristol plantations respectivdy. Strains tcrminating in 0, 5, 6 or 9, or 7 were obtained fiom control (watm), P079, Pl04 or PO37 trcatcd stumps respectively. To simpliQ the table, "P" was omitted fiom in front of each strain n u m k .
'(x) somatic compatibility, (-) somatic incompatibility.
Strajns showing identical pattern to PO79
Strains placed in the s m c group as PO37 when a more conservative approach was used (SCC
text).
* Strains showing identical pattem to P037.
Stntins showing identical paîtern to P 104.
4.4 DISCUSSION
Somatic incompatibility tests were easily carried out and were totally reproducible. A
similar interaction zone has been obsewed between pairing of heterogenic dikaryons of
other wood decay f'ungi (Adaskaveg and Gilbertson 1987). However, reaction lines did not
always display the same intensity of expression as in other basidiomycetes (Meijer et al.
1994). This phenomenon may be due to allelic difference at the vegetative-loci
(Anagnostakis 1982). For the purpose of ihis study, intensity was not taken into
consideration.
The formation of a demarcation line between fungal individuals is considered as supportive
evidence of distinct biologic entities (Rayner and Boddy 1986). Since no strains from the
natural population sampled pnor to inoculation (Québec/Ontario) were compatible with the
test strains P037, PO79 and P 104, it can be assumed that the strains used in our inoculations
represent unique or rare genotypes. In contrast, compatible reactions suggested that many
strains collected h m stumps inoculated in the Grenville and Bristol plantations were
probably identical to the test sûains. The presence of a high level of endemic P. giganfea in
the Bristol plantation following precommercial thinning could explain the lower nurnber of
compatible strains obtained £iom treated stumps compared to the Grenville plantation. Our
results imply that natural colonization occured in treated stumps. Morever, a high number
control stumps naîurdly colonized were obtained in the Bristol plantation compared to the
Grenville plantation where no previous thiMings had been carried out (Dansereau 1996).
These results are supported by observations made by Boyce (1966) in loblolly pine (Pinus
taeda L.) plantations in Georgia (U.S.A.). The author proposed the cutting of scattered
understory pines several months before a reguiar thinning to achieve a natural increase in
P. gigantea inoculum, and thus provide a control against H. annosum.
Although RAPD analysis and SI tests are as& to be based on unrelated genetic Cntetia,
in our study they yielded similar resuits. Incompatible strains had distinct RAPD profiles,
and the majority of compatible strains had identical profiles. The only exceptions were two
strains compatible with P037. These showed different RAPD profiles but only when non-
stable markers were considered. It is possible that these non-stable markers represent PCR
artefacts. Band instability may be caused by factors including poor discrimation by primers
between alternative priming sites of slightly different nucleotides sequences (mismatches),
DNA quality (presence of a contaminant) or concentration, and reaction components or
temperature conditions during amplifications (Tommerup et ai. 1995; Williams et al. 1990).
However, constant absence of the unstable bands in the profile of these two strains could
also imply some differences in their genome. Compatible reaction only indicates that the
strains have identical alleles at the vegetative loci but they may differ at other loci (Hansen
et al. 1993). in contrast, RAPD reflects the presence of polymorphic sequences in the entire
genome and provides more information on genotype relationships between strains
(Mazurier et al. 1992). This was demonstrated in work on the ectomycorrhizal fungus
Suillus granulatus (L. ex Fr.) Kuntze (Jacobson et al. 1993). The authors used RAPD
profiles to show that somatically compatible strains were often not genetically identical.
This situation may result when a population is composai of closely related individuais with
identical SI alleles but different background genotypes. In such cases, the use of SI testing
rnay be invalid when attempting to distinguish between di fferent genotypes. Unstable bands
must be considered carefulty since their interpretation can alter the conclusions drawn.
Additional markers are required to establish if the two strains are really distinct from P037.
This underlines the importance of primer choice and its impact on the value of the analysis.
Cornparison between other molecular techniques and SI tests also demonstrated a
correlation between methods. Mueller et al. (1 996) found complete concordance between SI
and amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis for symbiotic îüngi cultureci
by the fungus-growing ant Cyphomyrmex minutus (Attini: Formicidae). Polymerase chah
reaction analysis for Phellinzu tremulae (Bond.) Bond. & Borisov. (Holmer et al. 1994),
DNA restriction length polymorphisms markers for Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary
(Kohn et al. 1991), proteîn electrophoresis for Inonofus tomentoms (Fr.: Fr.) S . Teng
(Lewis and Hansen 199 l), and isoyme pattern for S u i l h spp. (Sen 1990) and H. annosum
(Stenlid 1985) also correlated with SI tests.
The markers used in the present study were selected to diffaentiate test strains fiom the
natural popuiation. Therefore, they may not necessarily provide an adequate representation
of the genome. Nevertheless, RAPDs demonstrated that the P. gigantea population prior to
inoculation was composeci of a large number of genetically distinct individuals. Similari ty
coefficients were calculated between RAPD groups using Jacquard's coefficient (Rohlf
1987). They revealed a higher similarity between strains P409 and PO37 (83%), than
between P409 and Pl04 (40%) ((results not shown). This was easily observeci by the
presence of P037-specific combination of markers in the RAPD profile of P409. These
results are possibly due to an error in the inoculation process or by mating behveen oidial
spores of the applied strain with P037, indigenous or other test strains. Propagules
contained in the oidial suspension originating fiom one heterokaryotic mycelium could
have been either hetero- or homokaryotic (Korhonen and Kauppila 1988). The latter may
have compatible mating types and therefore the capacity to form heterokaryons identical to
the onginal one. However, mating with member of the indigenous population and formation
of a different heterokaryon may also occur. Analysis of progeny fiom these heterokaryons
would provides answers to questions regarding their origin and be useful in ascertaining the
identity of inoculated P. gigantea used for biocontrol.
This study showed that both RAPDs and SI are useful techniques and that their combination
offers a valuable tool allowing discrimination betwecn different P. giguntea strahs and the
monitoring of the persistence and spread of introduced strains within the environment. This
is important in the research and developmental process prior to commercial use of
biocontrol agents (Cook et al. 1996). SI is a simple, f a reliable, and inexpensive, method
for discriminatîng between P. giguntea strains. It can be used as a rapid screening test to
separate distinct strains. However, it cm not be used to measure relatedness between
individuals and is not as powerful as RAPD for estirnating the degree of genetic variation
within a population. The development of strain-specific DNA markers would provide a
qui& diagnostic assay al10 wing faster identification of P. gigantea strains than SI. Both
methods allowed us to show clearly the presence of inoculated strains one year afier
treatment and the important colonization by naturally occuring isolates. This confirms that
the fungus P. gigantea is an effective and a highly cornpetitive primary colonizer, and may
explain its successful use as a biocontrol agent.
4.5 REFERENCES
Adams, D.H., and Roth, L.F. 1967. Demarcation lines in paired cultures of Fomes
cajanden' as a basis for detecting genetically distinct mycelia. Can. J. Bot. 45: 1583- 1589.
Adaskaveg, J.E., and Gilbertson, R.L. 1987. Vegetative incompatibility between
intraspecific dikaryotic pairings of Ganoderma Iucidum and G. tmgae. Mycologia, 79: 603-
613.
Anagnostakis, S.L. 1982. Genetic analysis of Endothia parasitica linkage data for four
single genes and the three vegetative compatibility types. Genetics, 102: 25-28.
Boyce, J.S. 1966. Spomlation by Peniophora gigantea with reference to control of Annosus
root rot. Forest Science, 12: 2-7.
Cook, R.J., Bnickart, W.L., Coulson, J.R., Goettel, M.S., Humber, R.A., Lumsden, R.D.,
Maddox, I.V., McManus, M.L., Moore, L., Meyer, S.F., Quimby, Jr., P.C., Stack, I.P., and
Vaughn, J.L. 1 996. Safety of microorganisms intended for pest and plant disease control: a
fkarnework for scientific evaluation. Biological Control, 7: 333-35 1.
Dansereau, A. 1996. Colonisation des souches de pin rouge par fhlebiopsis gigunteu dans
le cadre d'un essai de lutte contre la maladie du rond au Québec. M.Sc. thesis, Université
Laval, Québec, Canada.
Garbelotto, M., Bruns, T.D., Cobb, F.W., and Otrosina, W.J. 1993. Differentiation of
intersterility groups and geographic provenances among isolates of Heterobasidion
annosum detected by random arnplified polymorphic DNA assays. Can. J. Bot. 7 1: 565-
569.
Gosselin, L., Jobidon, R., and Bernier, L. 1995. Assessrnent of genetic variation within
Chondrostereum purpumm fiom Quebec by random arnplified polyrnorphic DNA
analysis. Mycol. Res. 100: 1 5 1 - 1 58.
Greig, B.J.W. 1976. Biological control of Fomes unnom by Peniophora gigantea. Eur. J.
For. Path. 6: 65-7 1.
Guthrie, P.A.I., Magill, C.W., Frederiksen, R.A., and Odvody, G.N. 1992. Random
arnplified polyrnorphic DNA markers: a system for identifying and differentiating isolates
of Colletotchum graminicola. Phytopathology, 82: 832-835.
Hamelin, R.C., Lecours, N., Hansson, P., Hellgren, M., and Laflamme, G. 1996. Genetic
differentiation within the European race of Gremmeniella abietina. Mycol. Ra. 100: 49-56.
Hansen, E.M., Stenlid, J., and Johannson, M. 1993. Genetic control of somatic
incompatibility in the root-rotting basidiomycete Heterobasidion annosum. Mycol. Res. 97:
1229-1233.
Hodges, C.S. 1969. Modes of infection and spread of Fomes onnosus. Am. Rev. Phytopath.
7: 247-266.
Holmer, L., Nitare, L., and Stenlid, 1. 1994. Population structure and decay pattern of
Phellinus rremulae in Populus tremula as detennined by somatic incompatibility. Can. J.
Bot. 72: 1391-1396.
Hord, H.H.V., and Quirke, D.A. 1955. Province of Ontario: Forest disease survey. In
h m a l report of the forest insect and disease survey. Dep. Agrk., Ottawa, Ontario. pp. 56-
69.
Sacobson, KM., Miller, O.K., and Turner, B.J. 1993. Randomly amplified polymorphic
DNA markers are superior to somatic incompatibility tests for disdminating genotypes in
natural populations of the ectomycorrhizal figus Suillus grcinulatus. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A 90: 9159-9 163.
Jungehülsing, U., and Tudzynski, P. 1997. Anaiysis of genetic diversity in Claviceps
purpurea by RAPD markers. Mycol. Res. 1 O 1 : 1-6.
Kohn, L.M., Stasovski, E., Carbone, I., Royer, J., and Anderson, J.B. 1991. Mycelial
incompatibility and molecuiar markers identify genetic variability in field populations of
Sclemtinia sclerutionrm. Phytopathology, 8 1 : 480-485.
Korhonen, K., and Kauppila, P. 1988. The sexuality of Plilebiopsis gigantea. Karstenia, 27:
23-30.
Kurkela, T., and Lipponen, K. 1993. JuurikZvân torjunta. Metshsuojelutut-kimuksen
Tiedonantoja, 460: 53-60.
Laflamme, G., and Blais, R. 1993. Première mention de Heterobosidion onnosun, au
Québec. Phytoprotection, 74: 17 1.
Laflamme, G., and Blais, R. 1995. Détection du Heterobmidion annosum au Québec.
Phytoprotection, 76: 3 9-43.
Lewis, K.J., and Hansen, E.M. 1991. Vegetative compahiility groups and protein
electrophoresis indicate a role for basidiospores in spread of 1nonotu.s tomenfosus in spnice
forests of British Colombia. Cm. J. Bot. 69: 175601763.
Mazurier, S., Van De Giessen, A., Heuvelman, K., and Wmars, K. 1992. RAPD analysis
of Campylobacter isolates: DNA fingerprinting without the need to purify DNA. Letters in
Applied Microbiology, 14: 260-262.
Meijer, G., Megnegneau, B., and Linders, E.G.A. 1994. Variability for isozyme, vegetative
compatibility and RAPD markers in natural populations of Phomopsis subordinaria.
Mycol. Res. 98: 267-276.
Mueller, U.G., Lipari, S.E., and Milgroom, M.G. 1996. Amplified fiagrnent length
polymorphism (AFLP) fingerprinting of syrnbiotic fun@ cultured by the fwigus-growing ant
Cyphomyrmex minutus. Mol. Ecol. 5: 1 19-1 22.
Perron, M., A.G. Gordon, and Bousquet, J. 1995. Species-specific RAPD fingerprints for
the closely related Picea marionci and P. rubens. Theor. Appl. Genet. 9 1 : 142- 149.
Raina, K., Jackson, N., and Chandlee, S.M. 1997. Detection of genetic variation in
ScIerofinia homoeocarpo isolates using RAPD analysis. Mycol. Res. 10 1 : 585-590.
Rayner, A.D.M, and Boddy, L. 1986. Population structure and the infection biology of
wood-decay fun@ in living trees. Adv. Plant. Pathol. 5: 1 19- 160.
Rayner, A.D.M., Coates, D., Ainsworth, AM., Adams, T.J.H., Williams, E.N.D., and Todd,
N.K. 1984. The biological consequences of the individualistic mycelium. In The ecology
and physiology of the fiingal mycelium. Edited by D.H. Jennings and A.D.M. Rayner.
Cambridge University Press, Cambridge, U.K. pp. 509-540.
Rishbeth, J. 1975. Sturnp inoculation: a biological control of Fumes annosus. In Biology
and control of soilbom pathogens Edired by G. W. Bruehl. Amencan Phytopathological
Society, St. Paul, Minnesota, U.S.A. pp. 158-1 62.
Rizzo, D.M., Blanchette, R.A., and May, G. 1995. Distribution of Amillaria ostoyae genets
in a Pinus resinosa - Pinus banksiana forest. Can. J. Bot. 73: 776-787.
Rodngues, K.F., Petrini, O., and Leuchtmann, A. 1995. Variability among isolates of
Xyiuria cubensis as determined by isozyme analysis and somatic incompatibility tests.
Mycologia, 87: 592-596.
Rohlf, F.J. 1987. NTSYS-pc, numerical taxonomy and multivariate analysis, version 1.3.
Applied Biostatistics hc., Setauket, N.Y., U.S.A.
Rykowski, K., and Sierota, 2. 1983. A biological active preparation for protecting stands
against root rot. Poiish Technical Review 5: 1 5.
Sen, R. 1990. htraspecific variation in two species of Suillus from Scots pine (Pinus
sylvestris L.) forests bas& on somatic incompatibility and isozyme analyses. New Phytol.
114: 607-616.
Smith, M.L., Bruhn, J.N., and Anderson, J.B. 1992. The fungus Amillaria bulbosa is
among the largest and oldest living organisms. Nature, 356: 428-43 1.
Stalpers, J.A. 1978. Identification of wood-inhabiting fungi in pure culture. Studies in
Mycology 16: 1-248.
Stenlid, J. 1985. Population structure of Heterobasidion annosum as determined by somatic
incompatibility, sexual incompatibility, and isoenzyrne patterns. Can. I. Bot. 63: 2268-
2273.
Tommerup, K., Barton, J.E., and O'Brien, P.A. 1995. Reliability of RAPD fingerpnnting
of three basidiomycete fungi, Laccaria, Hydnangium and Rhiroctonia. Mycol Res. 99: 179-
186.
Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafaiski, I.A., and Tingey, S.V. 1990. DNA
polyrnorphisms amplified by arbitrary primers are usefûl as genetic markers. Nucl. Ac. Res.
18: 653 1-6535.
Wilson, A.D. 199 1. Somatic incompatibility in dikaryotic-monokaryotic and dikaryolic
pairings of Echinodontium tinctorium. Can. J. Bot. 69: 27 16-2723.
Zolan, M.E., and PuWola, P.J. 1986. Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus.
Mol. and Cell. Biol. 6: 195-200.
CONCLUSION GÉNÉRALE
Dans cette recherche sur le développement d'un agent de lutte biologique contre
H. annosum, nous avons vérifié le potentiel de deux champignons : P. dimorphospora et
P. gigantea. Ce sont deux espèces bien différentes quant à leur écologie et leur mécanisme
d'action comme agent de lutte biologique. La première agit principalement par antagonisme
et la seconde par competition pour la niche écologique. Malgré l'efficacité de
P. dimorpiiospora démontrée in vitro et in vivo contre plusieurs agents pathogènes d'arbre,
bien peu était connu sur son potentiel d'utilisation contre H. annosuni (Yang et al. 1993).
Notre étude a montré que, sous des conditions contrôlées in vitro, P. dimorphospora inhibe
la croissance du champignon pathogène en colonisant les disques de pin rouge et d'épinette
de Norvège pour une période d'au moins six semaines et en y produisant des substances
antifongiques. Une application préventive de quelques jours assure une meilleure
performance. Ce qui correspond a des observations faites par Bernier et al. (1996) dans des
essais sur son potentiel d'utilisation pour lutter contre 0. ulmi. Comme le succès d'un agent
de lutte biologique repose sur plusieurs critères tel la capacité de coloniser le substrat à
traiter et d'y produire les métabolites inhibiteurs dans le cas d'un antagoniste, il semble que
P. dimorphospora possède les caractéristiques pour être un agent de lutte efficace.
Dans le test réalisé sur le terrain, P. dintorphospora applique sous forme d'une suspension
aqueuse de spores et de mycélium broyé n'a pas inhibé la colonisation par H. annosum de
bûches de pin rouge enterrées. Une mauvaise colonisation des tissus due à des conditions
environnementales défavorables à sa croissance ou à la compétition des micro-organismes
indigènes en sont les raisons principales. 11 a déjà et6 démontré que la cornpetition avec
d'autres espèces peut nuire au succès de la colonisation et, par le fait même, à l'efficacité
d'un agent de lutte biologique (Bruce et King 1986; Etheridge 1972; Merdith 1960;
Nelson et Thies 1985; Schoeman et al. 1996). Cependant, l'application de grains de seigle
pré-colonisés par P. dimorphospora a réduit de manière importante l'infection par
H. annosum après le premier mois d'exposition. Ces résultats s'expliquent surtout par la
production préaiable de substances antifongiques dans les grains qui ont par la suite diffus6
dans les tissus. L'efficacité a diminué au cours du temps faute d'une bonne croissance de
P. dimorphospora à l'intérieur des tissus et d'une production adéquate de métabolites.
L'utilisation d'une formulation appropriée favorisant une meilleure colonisation ainsi que
la production de substances antifongiques à l'intérieur des tissus s'avèrent nécessaire pour
une utilisation éventuelle efficace de ce champignon. Ces résultats laissent entrevoir la
possibilité d'utiliser les composés antifongiques comme moyen de contrôle.
Contrairement au P. dimorphospora, P. gigantea a montré une excellente adaptation aux
conditions envimnnementales qui prévalent dans l'Est du Canada. L'isolat utilisé a colonisé
rapidement les tissus de pin rouge; autant ceux des bûches que ceux des souches. Il a
également complètement inhibé la colonisation des bûches par H. annosum. Dans une autre
étude, quelques isolats de P. gigantea ont aussi démontré leur potentiel a coloniser les
souches (Dansereau 1996). Nous pouvons donc supposer que, suite à une bonne
colonisation des tissus, P. giganteu préviendrait 1 'infection aen e ~ e des souches par le
champignon pathogène. Certains travaux effectués sur des souches de pins ont démontré
cette relation (Greig 1976; Meredith 1960; Rishbeth 1963).
La comparaison de la méthode d'incompatibilité somatique et des marqueurs RAPD, a
indiqué que la première est une méthode moins dispendieuse et plus rapide pour
discriminer les différentes souches de P. gigantea, par le biais de la formation d'une zone
d'interaction caractéristique. Cependant, deux individus ne formant pas cette zone
pourraient tout de même être différents génétiquement. Dans l'éventualité d'une étude plus
approfondie sur la population de P. gigantea, la méthode moléculaire serait toutefois plus
appropriée car elle permettrait d'évaluer les variations génétiques entre les individus. Ces
deux méthodes combinées sont des outils utiles pour effectuer des études sur le devenir des
souches de P. gigantea introduites dans l'environnement. C'est un élément important du
processus de développement commercial d'un agent de lutte biologique (Cook et al. 1996).
Les tests d'incompatibilité somatique ont révélé la forte présence d'inoculum naturel de
P. gigantea autant dans les bûches que dans les souches. Tout comme l'avait observé
Boyce (1966)' la présence de débris au sol issus d'une coupe antérieure augmente la
population naturelle du champignon.
Fait non surprenant, des variations locales et saisonnières importantes dans la quantité et la
variété des especes qui colonisent les souches de pin rouge ont été observées. Certaines
especes se sont avérées très communes: Homonema sp., Tympanrî sp., i n c o ~ u B9,
P. gigantea, Nectrin sp., Tnchoderma spp. et R. ntrovirens. Des observations similaires ont
été faites pour les bûches à la différence que nous y avons isolé également un grand nombre
de zygomycètes (Mortierella spp., M. hiemalis). Les différences entre les deux types de
tissus de pin rouge s'expliquent essentiellement par l'état physiologique et le niveau
d'humidité différents des tissus à coloniser. Les tissus des bûches sont morts alors que
certaines portions des souches demeurent vivantes même après deux ans grâce aux greffes
entre les racines. Les especes isolées ont montré une écologie spécifique autant au niveau
de la colonisation que de la période où elles colonisent. Une des caractéristiques les plus
évidentes correspond à la colonisation abondante par la plupart des basidiomycètes suite à
la coupe effectuée au mois de septembre. Cela correspond sûrement à une forte quantité de
spores aériennes appartenant à ce groupe taxonomique durant cette période. Certaines
caractéristiques des sites ont semblé influencer la colonisation. La plantation de Bristol
s'est distinguée par une population élevée de P. giganteu occasionnée, comme nous l'avons
déjà mentionné, principalement par la présence de débris au sol recouverts de
fhctifications du champignon. Nous avons aussi constate que les conditions prbvdant dans
la plantation de Grenville ont favorise la colonisation par les deutéromycètes, surtout les
Trichoderma spp. Finalement, la plantation de Mulgrave dont les arbres étaient plus âgés a
présente une forte colonisation par les ascomycètes. Le cours de la succession semble donc
fortement influencé par la quantité et le type d'inoculum présent initialement, ainsi que par
les conditions enviromementales. Pour bien comprendre le processus de dégradation, il
serait préférable de réaliser une étude plus approfondie car les résultats obtenus avec la
technique utilisée correspondent plutôt à des clichés figés dans le temps et l'espace.
Les différents traitements appliqués sur les bûches ou les souches ont eu une influence sur
la colonisation des tissus. ils n'ont pas changé la nature de la mycoflore mais ont modifié la
fréquence et l'abondance des différentes espèces. Dans certains cas, cette modification a eu
un impact sur l'efficacité du traitement. Par exemple, l'application de grains de seigle pré-
colonisés par P. dimorphospora a réduit la présence de l'ensemble des basidiomycètes
incluant P. gigantea et l'inconnu B9. Cet impact est principalement associé à la présence
plus importante des deutéromycètes et des zygomycètes. L'inoculation artificielle de
P. gigantea a, bien entendu, augmenté la population de ce dernier mais en même temps a
réduit la présence des autres espèces, particulièrement dans les bûches. L'inoculation
artificielle assure un niveau suffisant de colonisation pour empêcher l'infection par
H. annosum (Greig 1976; Rishbeth 1963). Le traitement des souches avec P. gigantea
serait donc très utile dans les plantations de pin muge particulièrement celles qui ne sont
pas déjà infectées par H. onnosum. De plus, ce traitement a accéléré le processus de
dégradation des souches qui s'est reflété par une augmentation de la présence, entre autre,
de plusieurs deutéromycètes tels Trichoderma spp. et R. atrovirens. Étant donné que
P. gigantea est présent naturellement, son application artificielle ne nuirait pas aux étapes
subséquentes de dégradation des souches de pin rouge mais accélérerait le processus. 11
apparait donc comme le traitement le plus approprié au stade actuel de développement d'un
agent de lutte biologique contre la maladie du rond sur le pin rouge.
Quelques questions sont soulevées suite à ces travaux de recherche réalisés dans le but de
développer un moyen de lutte biologique efficace contre E t annosum. Elles pourraient faire
l'objet d'études plus approfondies :
1) Développer une formulation adéquate pour l'utilisation efficace de P. dimorphospom;
2) Évaluer le potentiel d'utilisation des substances antifongiques comme méthode de lutte;
3) Confirmer l'efficacité de P. giganteu a inhiber l'infection de H. annosum sur les
souches;
4) Développer une formulation pour assurer la colonisation par P. gigantea lors de pendes
moins propices à sa croissance.
Bernier, L.; Yang, D.; Ouellette, G.B.; Dessureault, M., 1996: Assessrnent of Phaeotheca
dimorphospora for biological control of the Dutch elm diseae pathogen, Ophiostoma ulmi
and 0. novo-ulmi. Plant Pathology 45,609-6 1 7.
Bruce, A.; King, B., 1986: Biological control of decay in creosote treated distribution poles.
II. Control of decay in poles by immunizing commensal h g i . Mater. Org. 2 1, 165- 179.
Boyce, I.S., 1966: Sporulation by Peniophora giguntea with reference to conîrol of
Amosus root rot. Forest Science 12,2-7.
Cook, R.J.; Bnickart, W.L.; Coulson, J.R.; Cook, R.J.; Goettel, M.S.; Humber, R.A.;
Lumsden, R.D.; Maddox, J.V.; McManus, M.L.; Moore, L.; Meyer, S.F.; Quimby, Jr., P.C.;
Stack, J.P.; Vaughn, J.L., 1996. Safety of rnicroorganisms intended for Pest and plant
disease control: a framework for scientific evaluation. Biological Control7,333-35 1.
Dansereau, A., 1996: Colonisation des souches de pin rouge par Phlebiopsis gigantea dans
le cadre d'un essai de lutte contre la maladie du rond au Québec. Mémoire de maîtrise.
Département des sciences du bois et de la forêt. Université Laval, Québec, Canada. 63p.
Ethendge, D.E., 1972: Antagonistic interactions in wood-inhabiting rnicroorganisms and
biological control of decay. In: Biological control of forest diseases, XV RTFRO meeting,
Gainsville, Florida, 197 1. Nordin, V.I., éd. Ottawa: Canadian Forestry Service, pp. 37-53.
Greig, B.I. W., 1976: Biological conîrol of Fomes annosus by Peniophora grgantea. Eur. J.
For. Pa&. 6,6507 1.
Meredith, D.S., 1960: Further observations on h g i inhabiting pine stumps. Ann. Bot. 24,
63-78.
Nelson, E.E.; Thies, W.G., 1985: Colonization of Phellinus werii-infested stumps by
Trichoderma viride. 1. Effect of isolate and inoculum base. Eur. J. For. Path. 15,425-43 1.
Rishbeth, J., 1963. Sturnp protection against Fomes annosus. III. Inoculation with
Peniophora gigantea. AM. Appl. Biol. 52,63-77.
Schoeman, M.J.; Webber, J.F.; Dickinson, D.J., 1996: The effect of diffusible metabolites
of Trichoderma harzianum on in vifro interactions between basidiomycete isolates at two
different temperature regimes. Mycol. Res. LOO, 1454- 1458.
Yang, D.; Plante, F.; Bernier, L.; Piché, Y.; Dessureault, M.; Laflamme, G.; Ouellette,
G.B., 1993: Evaluation of a fungal antagonist, Phaeotheca dimorphospora, for biological
control of tree diseases. Can. J. Bot. 7 1,426433.
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