bi330 microscopy staining 1.61 - maejo university · 2018-11-19 · 1....

กลองจลทรรศนและการยอมส

ผศ.ดร.ปยะนช เนยมทรพยคณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยแมโจ

� การวดขนาดจลนทรย เน�องจากจลนทรยเปนส�งมชวตขนาดเลกท�ไมสามารถมองเหนไดดวยตาเปลา ดงน "นจงตองอาศยกลองจลทรรศน (microscope) ซ�งจะชวยขยายใหมองเหนรายละเอยดท "งรปรางและลกษณะของเซลล

หนวยใชวดขนาดของจลนทรย เชน ไมครอนหรอไมโครเมตร (micron, micrometer หรอ µm), นาโนเมตร (nanometer, nm) และ(micron, micrometer หรอ µm), นาโนเมตร (nanometer, nm) และแองสตรอม (angstrom, oA)

1 micrometer (µm) = 10-3 millimeter

= 10-6 meter

1 nanometer = 10-9 meter

1 angstrom (oA) = 10-10 meter

� กลองจลทรรศน (Microscope) กลองจลทรรศน แบงออกเปน 2 ประเภท คอ แบบใชแสงธรรมดาและแบบใชแสงอเลกตรอน1. กลองท&ใชแสงธรรมดา (Light microscope)

หรอเรยกวากลองจลทรรศนเลนสประกอบ (compound microscope) เน�องจากมเลนส 2 ชด คอ เลนสวตถ (objective lens) และเลนสตา คอ เลนสวตถ (objective lens) และเลนสตา (ocular lens หรอ eyepieces) ใชแสงธรรมดาเปนแหลงกาเนดแสง ขยายภาพโดยแสงเดนทางจากแหลงกาเนดแสงผานเลนสรวมแสง (condenser lens) ซ�งจะบงคบใหแสงตรงเขาสวตถท�ตองการด ภาพของวตถจะถกขยายอกคร "งหน�งดวยเลนสตา

1. กลองท&ใชแสงธรรมดา (Light microscope) แบงออกเปน

1.1 กลองจลทรรศนแบบไบรทฟลด (bright field microscope)1.2 กลองจลทรรศนแบบดารคฟลด (dark field microscope)1.3 กลองจลทรรศนแบบใชแสงอลตราไวโอเลต (ultraviolet microscope)1.4 กลองจลทรรศนฟลออเรสเซนซ (fluorescence microscope)1.5 กลองจลทรรศนเฟสคอนทรสต (phase-contrast microscope)1.4 กลองจลทรรศนฟลออเรสเซนซ (fluorescence microscope)1.5 กลองจลทรรศนเฟสคอนทรสต (phase-contrast microscope)

1.1 กลองจลทรรศนแบบไบรทฟลด (bright field microscope) เปนกลองจลทรรศนท�ใชกนอยางแพรหลายในหองปฏบตการท �วไป ม

กาลงขยายประมาณ 1,000 เทา ขอจากดของกาลงขยาย (magnification) น"ไมไดข"นอยกบผลคณของกาลงขยายของเลนสตาและเลนสวตถเทาน "น แตยงข"นกบความสามารถของเลนสวตถในการแยกแยะรายละเอยดของภาพ ใหเหนความแตกตางกนได ท�เรยกวารซอลวงเพาเวอร (resolving power)power)

คา resolving power หรอคารโซลชน (resolution) หมายถง คาความสามารถของเลนสในการแยกแยะรายละเอยดของภาพ ทาใหเหนความแตกตางระหวางจดสองจดท�อยภายในโครงสรางได คา resolving power ข"นอยกบความยาวคล�นแสง และคา numerical aperture, N.A.) ของเลนสน "น

คา resolving power = ความยาวคล&นแสง คา resolving power = ความยาวคล&นแสง2 N.A.

ดงน "น ถาความยาวคล�นแสงย�งส "น จะใหรายละเอยดของภาพมากข"น Numerical aperture (N.A.) เปนสมบตของเลนสท�เก�ยวของกบดชนหกเหของตวกลางท�แสงผานไปกอนจะเขาสเลนสวตถ

เลนสวตถท&ใชนHามน (oil immersion objective) เปนเลนสวตถท�มกาลงขยายมากท�สด คอ 100 เทา ซ�งการใชเลนสน"

ตองเพ�มความระมดระวงมาก เน�องจากระยะหางระหวางวตถกบเลนสชดกนมาก เวลาใชจงตองหยดน"ามน (immersion oil) บนสไลดและใหเลนสวตถสมผสกบน"ามน เพ�อใหแสงเดนทางผานเปนเสนตรงเขาสเลนสวตถได ถาไมใชน"ามน แสงท�ผานจากแกวสไลดเขาสอากาศ จะหกเหออกไปมากทาใหแสงเขาสเลนสนอย ภาพจงไมชดทาใหแสงเขาสเลนสนอย ภาพจงไมชด

กาลงขยายของกลองจลทรรศน (magnification) กลองสวนใหญท�ใชในหองปฏบตการจลชววทยา ประกอบดวยเลนส

วตถ 4 ขนาด ซ�งมกาลงขยายท�ตางกน คอ - เลนสวตถกาลงขยายต�า (low-power objective lens) = 4x, 10x

- เลนสวตถกาลงขยายสง (high-power objective lens) = 40x- เลนสวตถหวน"ามน (oil immersion objective lens) = 100x- เลนสวตถหวน"ามน (oil immersion objective lens) = 100x

ขณะท�เลนสตามกาลงขยาย 10 เทา ดงน "น กาลงขยายของภาพจากกลองจลทรรศนจงสามารถคานวณไดจาก

กาลงขยายของภาพ = กาลงขยายของเลนสตา x กาลงขยายของเลนสวตถ

1.2 กลองจลทรรศนแบบดารคฟลด (dark field microscope) เปนกลองจลทรรศนท�ทาใหพ"นภาพเปนสดา ในขณะท�วตถท�ตองการด

เกดภาพสวาง โดยอาศย condenser พเศษ (dark field stop) ท�จะตดแสงออกไปไมใหเขากลอง ดงน "นถาพ"นของตวอยางท�จะศกษาเปนสารเน"อเดยวกนและโปรงใส แสงท�ผาน condenser พเศษน"จะเลยออกไปและพ"นภาพจะเปนสดา แตถามวตถอยจะเกดการสะทอนและหกเหแสงใหเขาสเลนส จงเกดภาพสวางข"นในท�มด กลองน"มเลนส จงเกดภาพสวางข"นในท�มด กลองน"ม

ประโยชนใชศกษาจลนทรยท�ไมยอมสและ ศกษาสไลดสดและเทคนคหยดแขวน และใชในการวนจฉย เช"อโรคบางชนด เชน เช"อซฟลส

1.3 กลองจลทรรศนอลตราไวโอเลต (ultraviolet microscope) เปนกลองจลทรรศนท�ใชแสงอลตราไวโอเลต ซ�งจะทาให resolving

power มากกวากลองธรรมดา เพราะแสงอลตราไวโอเลตมคล�นส "นกวา (ประมาณ 180-400 nm) เลนสของกลองชนดน"ทาจากควอตซ ทาใหแสงเขาสกลองไดมาก จงทาใหภาพชดเจน แตเน�องจากแสงอลตราไวโอเลตน"ตาเรามองไมเหน จงตองบนทกภาพไวบนฟลม

1.4 กลองจลทรรศนฟลออเรสเซนซ (fluorescence microscope) เปนกลองท�ใชหลกการท�ใหจลนทรยยอมสฟลออเรสเซนซ ซ�งจะเกด

การเรองแสงและสวางข"นเม�อผานรงสอลตราไวโอเลต จงทาใหจลนทรยชดเจนในฉากท�มด สท�นยมใชยอม เชน ส auramine O ส acridine yellowสฟลออเรสเซนซใชมากในการหาปฏกรยาทางน"าเหลองวทยา

เรยกเทคนคน"วา fluorescent-antibody technique

1.5 กลองจลทรรศนเฟสคอนทรสต (phase contrast microscope) เปนกลองท�ใชศกษาเซลลท�มชวต โดยมหลกการท�ใช phase contrast

objective และ condenser พเศษ (annular stop) ตดเขาไปในกลองจลทรรศนท�ใชแสงธรรมดา โดยการท�แสงผานวตถท�มความหนาแนนตางกน แสงจะหกเหออกไปมากนอยตางกน ทาใหแตละสวนของวตถมความสวางตางกนดวย จงทาใหกลองชนดน"แยกรายละเอยดของลกษณะภายในจลนทรยไดภายในจลนทรยได

2. กลองจลทรรศนอเลกตรอน (electron microscope, EM) เปนกลองท�มความแตกตางจากกลองจลทรรศนธรรมดาหลายขอ

- มกาลงขยายสงมาก - มความยาวคล�นอเลกตรอนส "นมาก คอ 0.05 Ao ดงน "นจงสามารถ แยกแยะรายละเอยดของวตถท�ขนาด 10 Ao ได และขยายภาพไดถง

400,000 เทา - การทาใหเกดภาพจะใชสนามแมเหลกไฟฟา และการเตรยมตวอยางเพ�อ - การทาใหเกดภาพจะใชสนามแมเหลกไฟฟา และการเตรยมตวอยางเพ�อ ใชศกษาตองเปนตวอยางท�แหงและเบามาก - ภาพท�ไดจะปรากฏบนฉากเรองแสงหรอถายภาพไว กลองจลทรรศนอเลกตรอนม 2 ชนด คอ 2.1 กลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองผาน (Transmission EM, TEM)

2.2 กลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด (Scanning EM, SEM)

2.1 กลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองผาน (TEM) ใชในการศกษาโครงสรางภายในและรายละเอยดขององคประกอบ

ภายในตวอยาง และยงสามารถใชศกษารปราง ขนาด และลกษณะภายนอกของตวอยางแบบสองมตได

Bacillus subtilis

2.2 กลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด (SEM) ใชในการศกษาลกษณะทางสณฐานและลกษณะพ"นผวของตวอยาง

แตกาลงขยายท�ไดไมสงเทากบ TEM

เปรยบเทยบระบบการเกดภาพของกลองจลทรรศน 3 ชนด

TEM SEM

ขอด - มคา resolution สง ขยายภาพไดถงแสนเทา

- ไมตองตดช"นสวนใหบาง- สามารถมองเหนภาพ 3 มตได

ขอเสย - มความสามารถในการทะลทะลวง จากด ตองใชช"นตวอยางท�บางมาก- ไมสามารถเหนภาพ 3 มตได- ตองผานกระบวนการเตรยม

- กาลงขยายไมสงเทา TEM

- ตองผานกระบวนการเตรยม ตวอยางหลายข "นตอน ทาให ตวอยางเห�ยวยนและเสยรปทรงได

การเตรยมวตถเพ&อศกษาดวยกลองจลทรรศนธรรมดา การเตรยมตวอยางเช"อจลนทรยเพ�อนามาศกษาดวยกลองจลทรรศนท�

ใชแสงธรรมดาอาจทาได 2 วธ คอ - การเตรยมสไลดสดและการทาเทคนคหยดแขวน - การทาใหเซลลแหงตรงอยกบท� และยอมสเพ�อใหเหนความแตกตาง

การเตรยมสไลดสด วธน"จะชวยใหมองเหนจลนทรยในสภาพธรรมชาตจรงๆ โดยท�จลนทรยจะ วธน"จะชวยใหมองเหนจลนทรยในสภาพธรรมชาตจรงๆ โดยท�จลนทรยจะลอยอยในของเหลว โดยหยดของเหลวท�มจลนทรยบนแผนแกวสไลด ปดทบดวยกระจกปดสไลด (cover slip)

การทาเทคนคหยดแขวน (Hanging drop technique)มลกษณะคลายการทาสไลดสด แตใหหยดของเหลวท�มจลนทรยบน

กระจกปดสไลดกอน แลวจงคว�าสไลดหลมท�มหลมตรงกลางลงบนกระจกปดสไลดใหบรเวณหลมอยตรงกลางเหนอหยดของเหลว แลวพลกสไลดใหหงายข"น หยดเช"อจะแขวนอยกบกระจกปดสไลดและอยเหนอหลมของสไลดหลมพอด ขอด

- สามารถศกษาเซลลท�มชวตได- สามารถศกษาเซลลท�มชวตได- สงเกตรปรางและการเรยงตวของเซลล ไดชดเจน- สามารถศกษาพฤตกรรมตางๆ ของเซลล ได เชน การเคล�อนท�- สามารถศกษาถงองคประกอบตางๆ ภาย ในเซลล

การยอมสจลนทรย (Staining)เน�องจากจลนทรยมขนาดเลกมากและมกโปรงแสง จงแยกความ

แตกตางกบของเหลวท�จลนทรยแขวนลอยอยไดนอย ทาใหมองเหนไดยาก ดงน "นการยอมสจะชวยใหเหนรายละเอยดและความแตกตางของจลนทรยแตละชนดไดมากข"น สท�ใชยอมจลนทรยพวกแบคทเรย แบงออกเปน 2 ชนด คอ 1. สท �มคณสมบตเปนกรดหรอมประจลบ (acid dye หรอ ionic dye) 1. สท �มคณสมบตเปนกรดหรอมประจลบ (acid dye หรอ ionic dye) ตวทาใหเกดสมประจเปนลบ จงยอมตดกบสารท�มประจไฟฟาเปนบวก ไดแกสอโอซน (eosin)

2. สท �มสมบตเปนเบสหรอมประจบวก (basic dye หรอ cationic dye) ตวท�ทาใหเกดสมประจไฟฟาเปนบวก จงยอมตดกบสารท�มประจ

ไฟฟาเปนลบไดด ไดแกสเมทลนบล (methylene blue)

วธการเตรยมสเมยรเชHอ (smear preparation)

1. Smear preparation

2. Air dry 3. Heat fix 4. Staining

วธการยอมสแบคทเรย มวธการท�สาคญ 2 แบบ คอ1. การยอมสแบบธรรมดา (simple staining)

โดยใชสชนดเดยวยอมเซลลท"งไวระยะหน�ง หลงจากน "นลางออกดวยน"าและซบใหแหง เซลลจะยอมตดสสม�าเสมอกน การยอมแบบน"เพ�อศกษารปรางและขนาดของเซลล ตวอยางสท�ใช เชน crystal violet (A), methyleneblue (B) และ carbol fuchsin (C) เปนตน

2. การยอมมากกวาหน&งส (differential staining)โดยการใชสยอมมากกวาหน�งชนด ทาใหสยอมตดสวนตางๆ ของเซลล

ไมเทากน จงเหนความแตกตางระหวางเซลลหรอองคประกอบของเซลล 2.1 การยอมสแบบแกรม (Gram staining)การยอมสแบบน"มความสาคญท�สด

และใชกนแพรหลาย สามารถใชศกษารปรางลกษณะและการจดเรยงตวของรปรางลกษณะและการจดเรยงตวของเซลล และทาใหจาแนกแบคทเรยออกเปนสองชนดคอ แบคทเรยแกรมบวกและแบคทเรยแกรมลบ

Gram positive bacteria

ขอจากดของการยอมสแบบแกรม- อายของเช"อ ถาแก แบคทเรยแกรมบวกจะ สญเสยความสามารถในการตดส crystal

violet ทาใหตดสแกรมลบแทน- ข"นกบสภาพแวดลอมของแบคทเรย หรอข"นกบวธการเกล�ยเช"อ วธการยอมส

Gram negative bacteria

หรอข"นกบวธการเกล�ยเช"อ วธการยอมส และคณภาพของสท�ใช

2.2 การยอมสแบบทนกรด (Acid-fast staining)แบคทเรยบางชนดมความสามารถท�จะทนตอการลางดวย acid alcohol

เราเรยกแบคทเรยพวกน"วาแบคทเรยทนกรด (acid-fast bacteria)เน�องจากมปรมาณไขมนในเซลลสง เชน mycolic acid ไดแกแบคทเรยกลม Mycobacterium เชน M. tuberculosis สาเหตของวณโรค และ M. leprae สาเหตของโรคเร"อน โรคเร"อน

2.3 การยอมสสปอร(Spore staining)แบคทเรยบางชนด เชน ในจนส Bacillus และ Clostridium จะมการ

สรางสปอรภายในเซลลเรยกวา endospore ซ�งสปอรจะตดสยอมยาก แต เม�อตดแลวกลางออกยากดวย จงตองใชความ รอนชวยเพ�อใหตดสมากข"นและเรวข"น การ ยอมสปอรชวยใหศกษาขนาดรปรางและ ตาแหนงของสปอรได วธยอมนยมใชวธของ Schaeffer และ วธยอมนยมใชวธของ Schaeffer และ

Fulton โดยใชส malachite green ยอมสปอร และยอมเซลลดวยสแดงของ safranin

2.4 การยอมสโครงสรางตางๆ ของเซลลแบคทเรย โครงสรางตางๆ ของเซลลแบคทเรย เชน แฟลกเจลลา แคปซล ผนง

เซลล เมดแกรนลตางๆ ตองใชวธการยอมดวยเทคนคพเศษ จงจะเหนความแตกตางของโครงสรางเหลาน "น

2.5 การยอมสแบบลบ (negative staining)การยอมแบบลบตวเซลลแบคทเรยจะไมตดสยอม แตสจะไปตดแนน

กบแผนสไลดแทน จงมองเหนฉากมด สวนตวเซลลแบคทเรยจะโปรงแสง สท�นยมคอ หมกอนเดย หรอสนโกรซน วธน"มขอดคอ ทาใหขนาดและ

รปรางของแบคทเรยไมเปล�ยนแปลง เน�องจากไมมการใชความรอนซ�งจะทาให ขนาดเลกลงและรปรางบดเบ"ยวจากความ ขนาดเลกลงและรปรางบดเบ"ยวจากความ เปนจรง