autoantitestek kimutathatóságának határai, jelenlétük ......

Post on 06-Feb-2018

221 Views

Category:

Documents

0 Downloads

Preview:

Click to see full reader

TRANSCRIPT

Autoantitestekkimutathatóságának határai, jelenlétük zavaró hatása az

immunanalitikai módszerekre

Dr. Toldy Erzsébet Ph.D.Szombathely, Vas Megye és Szombathely Markusovszky

Kórháza, Szombathely, PTE Diagnosztikai és Menedzsment Intézet, Pécs

MOLSZE Vándorgyűlés Bük, 2005.

Autoimmunitás

• Fiziológiás immunműködés szerves részeként

- mint biológiai jelenség az élő működés lényegi része

• Kóros immunműködés gyanánt- a szervezet homeosztazisát súlyosan veszélyeztető

jelenség (európai népesség 1-3%-át érinti)

Fiziológiás autoimmunitás:immunologiai homunculus

Magasabb rendű szervezet annak érdekében, hogy ne indulhasson el saját antigénjével szemben autoimmunreakció fenntart egy csekély mértékű autoimmunitást.- CD5+ B sejtek

- kicsiny affinitású proliferatív IgM típusúautoantitest termelődés

Egészség vége? Betegség kezdete?

Az egyensúly fenntartását biztosító tényezők:

• immuntolerancia: védelem a saját antigénstruktúrával szemben

• anti-idiotípus hálózat

fiziológiás autoimmunitás

pathologiás autoimmunitás

Anti-idiótípus reguláció

Anti idiótípus- antitest

Antigéndeterminánsok

Antitest

Anti-anti-idiótípus- antitest

Patológiás következmény

AUTOIMMUN BETEGSÉG

Fiziológiás védelem

Antigének:„saját ?” és „nem saját?”

Antisomatogén = ellenanyagtermelést kiváltó(Detre László, 1960, NY)

• Autoantigén „saját”: a szervezetet saját felépítő struktúrái, melyek felismerésére a T és B sejtek specifikus receptorokkal rendelkeznek, s immunválaszt (autoantitestet) fejlesztenek ki velük szemben.

• Heterophyl antigén „Nem saját”: az emlős szervezet számos építőeleme homológiát mutat az evolució távoli fajait és egyedeit felépítő molekuláris elemekkel.- autoimmun kórképek kialakulásának egyik oka lehet az autoantigén struktúra megváltozása külső antigén hatására.

• Keresztrokonságok miatt valójában heteroimmunitás →autoimmunitás

Ig típus Termelődés Szérumszint

TermTerméészetesszetes IgM CD5+ B1 sejt ng/mlalacsony affinitás

PatolPatolóógigiááss IgG, IgA, IgM B2 sejt mg/mlmagas affinitás

Az autoimmunitás ellenanyagai

Autoantitest meghatározások korlátai

Az eredmények meglehetősen módszerfüggők, ok:

legkülönfélébb: - analitikai és klinikai szenzitivitás,

- analitikai és klinikai specificitás,

- referencia érték,

- ál pozitív értékek eltérő %-ban

• alkalmazott antigén, anti human-Ig-antitest

• alkalmazott méréstechnika

Specifikus antitesteket meghatározó módszerek

• Immunfluoreszcencia

• Counter immunelektroforézis

• Radiális immundiffúzió

• Agglutináció

• Immunoblot

• Immuno-assay (ELISA, ECLIA, CLIA, RIA, RRA)

Szisztémás autoimmun markerek: ANA -IF

0 10 20 30 40 50 60 70 80

<60 éves egészséges felnőtt populációban

>60 éves egészséges felnőtt populációban

graviditas

SLE-és betegek egészséges rokonai körében

anaemia perniciosa

Psoriasis vulgaris

Virus hepatitisek

Alkohol indukálta cirrhosis

autoimmun thyreoiditis

Rheumatoid artritis (RA)

Myastenia Gravis

Primér biliáris cirrhosis

Autoimmun haemolitikus anaemia

Mononukleosis

Immun trombocytophenia

leukémia

Szervspecifikus autoimmun markerek: pajzsmirigy antitestekantitestek

TPO-antitestek• TPO izoformák: eltérően expressálódnakTPO1 (105 KD) – domináns formaTPO2 (100 KD) –GB-ban kisebb• Antigenitás: két epitópC2-fragmens (85 aminosav)- főbb epitópC21-fragmens (99 aminosav)- Hashimotoban: 52-60%TPO epitopok találhatók a Tg –molekulában is.• TPO antitestek: Gátolják az enzimet, aktiválják a komplementrendszert,

direkt cytotoxikusak.

TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. Al (UK): 2003-as tanulmány 13 assay

klinikai értékelés: 178 klinikailag ismert eset

0

20

40

60

80

100

Szenzitivitás Specificitás Leletazonosság

minimum

maximum

% 8094 91

100 100100

1,5

39,6

min.1,3

max.33,4

01020304050

Intra-assay Inter-assay

CV

%

TPO-antitestek meghatározása: Analitikai összevetése:mérések közötti eltérések

Mérések száma: 13 x 10

Célérték : 1000 U/ml

Célérték: 500 U/ml

Célérték: 250 U/ml

100

300

500

700

900

1100

1300

1500

1700

1. 2. 3. referens preparátum (U/ml)

TPO

Ab

U/m

l

TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. al: 2003-as tanulmány 13 ELISA

Pontosság vizsgálata

13 módszerből 8-nak inkorrekt a kalibrációja

1

1 10

11

104 1

2

23

1

3

12

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Lipaemia

zava

r

13 m

ódsze

rben

Haemoli

sis za

var

12 m

ódsze

rben

Hyperp

rotei

naemia

Zavar

3 mód

szerb

enHyp

erbilir

ubinaemia

Zavar

13 m

ódsze

rben

TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. al: 2003-as tanulmány 13 ELISA

Matrix effektus vizsgálata

Viz

sgál

t mi n

ta á

l -poz

it ivi

t ási

gya

kori

sága

Antitest interakciók az

immun-analitikában

Immunglobulinok okozta keresztreakciók feltételei

1.) Az analitre nézve antigénkötő-molekularésszel rendelkező – specifikus- antitestek jelenléte a szérumban.

2.) A zavaró specifikus antitest koncentrációviszonya a módszer méréstartományát elérő, vagy azt meghaladó legyen.

3.) Aspecifikus immunglobulinok kóros mennyiségi arányai.

Interferenciáért felelős antitest típusok

I. Heterophyl antitestek

II. Human anti-animal-antitestek

III. Reuma faktor

IV. Specifikus antitestek az analit ellen

I. Interferenciáért felelős antitestek: Heterophyl antitestek

- immunogenitásuk rosszul definiálható- a beteg anamnézisében az állati fehérjével

történő expozició nem igazolható- multispecifikus: Rf és két v. több faj

immunglobulinjával aktivitást mutat - prevalencia: 0,5-12%

II. Interferenciáért felelős antitestek Specifikus anti-human-animal-

antibodies (HAAAs)- Izotípusuk lehet: IgG, IgM, IgA, IgE - immunogenitásuk jól definiálható- a beteg anamnézisében az állati fehérjével történő

expozició igazolható és az állatfaj azonos a tesztben alkalmazott állati immunglobulinnal

- endogén antitest további besorolását a faj határozza meg: pl. HAMA, HARA

- szérumkoncentrációi: µg/L-g/L is lehet!- évekig perzisztálhatnak a keringésben- előfordulásuk: 1-80% is lehet.

Az egér-antigének ellen keletkezőhumán antitestek előfordulási gyakorisága a keringésben I.

05

101520253035

Egészségesvéradó

N=1008

RA N=54

Sjögren s.N=45

SLE N=54

P.M.Autoimmun

N=70

P.M. cc.N=15

Gya

kori

ság

(%) Tévesen

magas

CK-MB, cTr

Az egér-antigének ellen keletkező humán antitestek előfordulási gyakorisága II:

Iatrogén okok.

Gya

kori

ság

(%)

01020304050607080

Ovarium cc.CA-125-mouse Ab N=32

Egyéb cc.Radiologiai Ab

N=61

IL-6 Ab-el kezeltRenal cell met. Myeloma mult.

N=12

Kricka: Clin. Chem. 1999.

Az IgG struktúrája és a human anti-animal antitestek

Human anti-izotípiás antitest

Állati antitest Human anti-idiotípiás antitest

Human anti-anti idiotípiás antitest

Kricka Clin. Chem. 1999.

Antitest interakciók az immunometrikus módszerekben

Szilárd fázis

Capture Ab (animal)

AntigenAnti-

animal AbAnti-

animal Ab

jelölt Ab (animal)

jelölt Ab (animal)

jelölt Ab (animal)Anti-

animal Ab

Capture Ab (animal)

Capture Ab (animal)

Helyes Tévesen pozitív Tévesen negatív

Interferenciáért felelős antitestek III.Rheumatoid faktor (Rf)

Eredetük: a humán IgG Fc fragmense ellen képződnekIzotípusuk: főként IgM

Előfordulásuk:

a normál populációban (idősebb kor): 5-10%,

autoimmun betegekben gyakrabban.

Rheumatoid arthritis kezdeti stádium (első év): 40-60%

Később (2.-3. Évben) : 80%

Úgy viselkednek, mint a heterophyl antitestek: minden faj immunglobulinjához hozzákötődnek.

- Troponin T és I- CK-totál, CK-MB mass, - T4, T3- CEA, CA-15-3, CA-125, AFP- hCG, FSH, LH- Tg- Prolactin

Interferenciáért felelős antitestek IV. Specifikus antitestek az analit ellen

Módszerek az interakciót okozóantitestek kiszűrésére II.

Heterophyl ill. Rf és AAAT jelenlétekor

1.) Gyárilag az assay pufferhez blokkoló ágenst- borjú v. murin immunglobulin,- nem specifikus egér antitest (MAK33)- Biotinizált egyszárú antitest használata Warren D.J. et al. CEA Clin.Chem. 2005.

2.) A minta előkezelése az immuno-assay előtt:- kezelés PEG, alkohol, ammónium szulfát oldattal- Protein A kromatográfia, ultrafiltráció, - Gél diffúziós kromatográfia- Detergens szulfhydril ágens- Minták hőkezelése- Minták hígítása szériában (non linear response) - Alternatív módszer, - Recovery –teszt, vagy az antitestet közvetlenül mérő módszer. Pl. TgAb

Tg + Tg-visszanyerés (recoveryrecovery) mérése

Alacsony Tg Alacsony Tg visszanyervisszanyeréés s nem jnem jáár mindig r mindig egyegyüütt TgAb pozitivittt TgAb pozitivitáássalssal, ,

100% 100% nemnem zzáárjarja kiki az Abaz Ab pozitivitpozitivitáástst!!

Jelenlegi konszenzus:nincs értelme visszanyerési %-t

meghatározni!Szenzitív TgAb módszerrel a TgAb-t kell

mérni!

Kell-e szűrni antitest interferenciákra a laboratóriumban?

IGEN, ha.

• a populáció jelentős %-át érinti: pl macroprolactinaemia,• Az eredmény a döntéshozatalban meghatározó: pl. Tg• Az anamnesis megköveteli

Laboratóriumé a felelősség!

• 10 Rf-pozitív donor mintáját 74 analitre 66 laborban vizsgáltak

• 3445 eredményből 8,7 %-a volt tévesen pozitív.• 21 % -a közülük durván félrevezető téves pozitív lelet

volt. • A blokkoló reagenssel történő kezelés után 4,2%-ra

csökkentek a téves leletek.

Kell-e szűrni RF interferenciákra a laboratóriumnak ?

Marks V. et al. Clin. Chem. 2002.

Random hibával számolni kell és a klinikusokkal tudatni kell az interferenciák jelentőségét.

Kell-e szűrni ritka antitest interferenciákra a laboratóriumban?

Emerson J.F. et al. California, Clin Chem. 2003.

Következtetésük:- A minták előszűrése nem szükséges- A blokkoló reagens alkalmazásával csak 21% volt a

hiba korrigálható, míg hígítással csak ~3%.- Ismertté kell tenni az anamnesist

Vizsgált szérum: 160 Mért paraméterek: TSH, PSA, hCG, Cortisol

0,8-7 %-ban változott meg a lelet klinikai interpretációja

~3%

• Mivel ezek a vizsgálatok milliókra rúgnak a UKban, így a kellemetlen következmények ezreketérintenek. Ezért a korai kiszűrése lenne indokolt ezeknek az interakcióknak.

Kell-e szűrni ritka antitest interferenciákra a laboratóriumban?

(Ismail A. A, et al. Clin. Chem. 2002. )

Vizsgált szérum: 5310 28 esetben félrevezető FSH, LH, TSH vizsgálati eredmény született antitest interferencia miatt.

0,53 %

Törekvés a tökéletességreLuciant L. Leope: “Striving for Perfection” Clin. Chem. 48. 11. 2002

Harvard School of Public Health, Boston

Megelőzhető műtét~1 millió/év

~3,30%

A diagnosztikában és kezelésben elkövetett komplikációk száma

USA lakóssága: 247 millió

Vizsgált betegek száma: >30 millió/év>12 %

Megelőzhető halálok~71ezer/év

~0,24%

Labor

?

Laboratóriumi tesztek megbízhatósága

1000 tesztből 5 inkorrekt

0,5 %

Dícséretre méltó: a munka sajátjából adódik

Ugyanakkor kicsi hibák pusztítóak lehetnek!

A gyakorlat: a klinikai szakemberek jobban hisznek a teszteknek, mint a saját

itélőképességüknek!

Egészséges szkepticizmus hiánya!

Az antitest interakciók kiküszöbölése:

LEHETETLEN, DE….

…..együtt kell élni vele a következőképpen:

• Több módszert kell elérhetővé tenni

• Team munkában: - tudatosítani kell a klinikusokban az immunanalitikai módszerek korlátait,- klinikai összefüggéseket ismertté kell tenni a labor felé.

Ideális laboratóriumi szakember

• büszke a módszere magas szintű minőségére,

• de állandóan gondolkodik és tovább lát, tudatában annak, hogy óhatatlanul követ el hibát időről időre,

• egészséges szkepticizmussal fogadja az eredményeket

• készen áll a klinikai képbe nem illő hiba tisztázására.

top related