aluno : joão paulo lourenço franco cairo orientador: prof. dr. gonçalo a. g. pereira...
Post on 07-Apr-2016
219 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Aluno : João Paulo Lourenço Franco CairoOrientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. PereiraCo-Orientador: Fábio Marcio Squina
Introdução Bioenergia e Bioetanol de 2º geração Hidrolases glicolíticas Biologia de cupim e de Coptotermes gestroi Hidrolases glicolíticas em cupim
Objetivos Plano de trabalho Resultados preliminares Perspectivas
Introdução - Bioenergia e Bioetanol de 2º geração
A problemática dos combustíveis fósseis
Energias Alternativas Renovável Sustentável
Biomassa O que é Biomasa? 60% Biomassa vegetal 90 % Compostos
lignocelulósicos Parede celular Vegetal
Introdução - Bioenergia e Bioetanol de 2º geração
A problemática dos combustíveis fósseis
Energias Alternativas Renovável Sustentável
Biomassa O que é Biomasa? 60% Biomassa vegetal 90 % Compostos
lignocelulósicos Parede celular Vegetal
Bioetanol 1º Geração
Caldo da cana 2 º Geração
Material lignocelulósico
Métodos de obtenção de 2º Geração Hidrólise Física e
Química Hidrólise Enzimática
Introdução - Bioenergia e Bioetanol de 2º geração
O que fazem?
Classificadas em Famílias Cazy GH1 = B-Glicosidases GH 7 e 9 = Endo-
Beta-Glicosidases GH12 = Endo-beta-
Xilanases
Tipos: Domínio Único Multidomínio
Introdução – Hidrolases Glicolíticas
O que fazem?
Classificadas em Famílias Cazy GH1 = B-Glicosidases GH 7 e 9 = Endo-
Beta-Glicosidases GH12 = Endo-beta-
Xilanases
Tipos: Domínio Único Multidomínio
Introdução – Hidrolases Glicolíticas
Biologia de cupim e de Coptotermes gestroi
Insetos sociais
Ordem Isoptera
7 Famílias Cupins superiores Cupins inferiores 2.700 espécies
Origem no cretáceo Barata altamente
especializada
BIORREATOR NATURAL
OVOS
LARVA
PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA
ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA
LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA
OPERÁRIO
OVOS
LARVA
PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA
ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA
LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA
OPERÁRIO
OVOS
LARVA
PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA
ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA
LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA
OPERÁRIOOPERÁRIO
Castas em Coptotermes gestroi
Coptotermes gestroi Espécie exótica Origem asiática Família Rhinotermitideae Xilófagos Cupim praga
EST´s de C. gestroi (2006) 1200 reads 218 contigs 220 singlets 2 sequências para Celulases
Hidrolases glicolíticas em cupim
Enzimas endógenas Endo-Beta-Glicosidase Beta-Glicosidase
Coptotermes formosanus Neotermes koshunensis
Enzimas simbiônticas (metagenômica) Xilanses Carboxi Estereases Pectinases
Quase nenhum dado de Proteoma e carcterização bioquímica
Identificar as hidrolases glicolíticas das frações do extrato cru protéico de Coptotermes gestroi por FPLC e purificá-las. Caracterizar bioquimicamente essas frações
Identificação e sequenciamento protéico por MS/MS das frações do extrato cru e classificação com base no banco de dados de hidrolases glicolíticas (CAZY)
Identificar possíveis alvos de clonagem para posterior expressão heteróloga e suas respectivas espécies produtoras.
Clonagem das celulases endógenas identificadas na biblioteca de ESTs do cupim Coptotermes gestroi, e expressar heterologamente em modelo procarioto e caracterizar bioquimicamente.
Extração de RNA.
Clonagem das celulases identificada a partir do banco de ESTs de Coptotermes gestroi
Expressão heteróloga em modelo procariótico (Escherichia coli)
Purificação e caracterização enzimática
Extração protéica (Diversos pH)
Purificação por FPLC (troca iônica), identificação das frações com atividade e filtração em gel das mesmas
Liofilização das amostras e seqüenciamento e identificação por MS/MS
Apresentação de alvos para posteriores clonagens
Caracterização das frações purificadas ou parcialmente : pH ótimo, Temp ótima, teste de Inibição e co-fator.
Clonagens dos genes de celulases endógenas Endo-Beta-Glicosidase (resultado Flávia)
Beta-Glicosidase 3´UTR (resultado Flávia)
5´ UTR (RACE)
300 pb100 pb
~280à 300 pb
N.koshunensis
N.koshunensis C.gestroi
C.gestroi
endo-b-1,4-glucanase [Coptotermes formosanus]
endo-b-1,4-glucanase [Coptotermes gestroi] 1299 pb
Score = 645 bits (1665), Expect = 0.0 Identities = 349/389 (89%), Positives = 355/389 (91%), Gaps = 8/389 (2%) Frame = +1
Screening do estrato protéico de Coptotermes gestroi para diversos substratos pH 5.5 pH 10.0
Ensaio enzimático das divisões do cupim (corpo, cabeça e total) em tampão SAB 0,1 M e pH 5.5
Ensaio enzimático das divisões do cupim (corpo, cabeça e total) em tampão Glicina 0,1 M e pH 10,6
Screening do estrato protéico de Coptotermes gestroi para diversos substratos pH 5.5 pH 10.0 Redução de atividades de
Liquenana,CMC,Xilana em pH Básico e aumento da atividade contra Pectinas e Arabinanas
FPLC de troca iônica Resource Q (Aniônica) Fosfato Potássio buffer pH 6.2 Atividade das frações (1,5 ml)
Substrato/U FraçõesXilana/ 1,9 18,19,20
Liquenana/ 5,5 11,12CMC/0,9 3, 13
Manana/3,0 21,22
Frações de atividade para manana já foram enviadas para MS/MS
A geração de informação para o desenvolvimento de um coquetel de enzimas, co-fatores e nutrientes que mimetize o trato intestinal do cupim em escala laboratorial e industrial
OBRIGADO!!!
top related