14_ expressao_e_purificacao_proteinas_recombinantes

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EXPRESSÃO E

PURIFICAÇÃO DE

PROTEÍNAS

RECOMBINANTES

Dra. Débora Colombi

GENÔMICA ↓↓↓↓

compreender a organização molecular do genoma seu conteúdo de informações e respectivos

produtos gênicos

↓↓↓↓ ↓↓↓↓

estrutural funcional↓↓↓↓ ↓↓↓↓

natureza física transcriptoma(proteoma))))

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PROTEOMA

CONJUNTO DE PROTEÍNAS EXPRESSAS

NUM DETERMINADO TECIDO OU ORGANISMO,

NUM DADO MOMENTO, NUMA DADA CONDIÇÃO

PROTEÍNAS

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Dogma Central da Biologia MolecularDogma Central da Biologia Molecular

DNA

RNA

Proteína

Replicação:OrigemForquilhaTelômeros

Reparo e Recombinação

Transcrição:PromotorEnhancers

Processamento:capcauda de poliAremoção de íntrons

Tradução:código genéticoiniciação e terminaçãoribossomo

Processamento:enovelamentopontes S-Sglicosilação

PROTEÍNAS

As proteínas são biopolímeros compostos

por resíduos de aminoácidos ligados entre

si por ligações peptídicas

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AMINOÁCIDO

TOTAL = 20 Aminoácidos

5

Ligação Peptídica

6

ESTRUTURA

Estrutura Primária

A estrutura primária é caracterizada pela

sequência de aminoácidos e ligações peptídicas

da molécula; é o nível estrutural mais simples.

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PRIMÁRIA1 M V A A G K S D L S L P K T F A C S A F

1 ATGGTGGCGGCTGGTAAATCCGACCTTTCCTTGCCCAAAACTTTCGCCTGCAGTGCCTTC

21 A A C V G E V C T I P L D T A K V R L Q

61 GCTGCTTGCGTCGGCGAGGTATGCACAATTCCATTGGACACTGCTAAAGTTAGGCTTCAG

41 L Q K S A L A G D V T L P K Y R G L L G

121 CTCCAAAAGTCTGCTCTTGCTGGTGATGTTACTCTGCCTAAATATCGAGGATTGTTGGGA

61 T V G T I A R E E G L R S L W K G V V P

181 ACTGTTGGTACCATAGCAAGGGAAGAAGGGTTACGTTCACTATGGAAAGGTGTTGTACCT

81 G L H R Q C L F G G L R I G M Y E P V K

241 GGATTGCATCGTCAATGCCTATTTGGAGGTCTTAGGATTGGAATGTATGAGCCGGTGAAA

101 N L Y V G K D F V G D V P L S K K I L A

301 AACTTGTATGTTGGAAAAGACTTTGTAGGTGATGTTCCATTGAGCAAGAAAATTCTTGCT

121 G L T T G A L G I M V A N P T D L V K V

361 GGTTTGACAACAGGTGCACTGGGTATCATGGTAGCAAATCCCACTGATCTTGTGAAAGTT

141 R L Q A E G K L A A G A P R R Y S G A L

421 AGGCTTCAGGCGGAAGGAAAATTAGCTGCAGGTGCGCCAAGACGGTACTCTGGAGCGCTG

First (5')Second

Third (3') U C A G

U

PhePheLeuLeu

SerSerSerSer

TyrTyrTer*Ter*

CysCysTer*Trp

U

C

AG

C

LeuLeuLeuLeu

ProProProPro

HisHisGlnGln

ArgArgArgArg

U

C

AG

A

IleIleIlefMet

ThrThrThrThr

AsnAsnLysLys

SerSerArgArg

U

CA

G

G

ValValValVal**

AlaAlaAlaAla

AspAspGluGlu

GlyGlyGlyGly

U

C

A

G

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Amino acid 3 letter abbreviations

1 letter abbreviations

MW,Daltons

Alanine Ala A 89.1

Arginine Arg R 174.2 Asparagine

Asn N 132.1

Aspartic Acid Asp D 133.1

Asparagine or Aspartic Acid

Asx B -

Cysteine Cys C 121.2

Glutamic Acid Glu E 147.1

Glutamine Gln Q 146.1

Glutamine or Glutamic Acid

Glx Z -

Glycine Gly G 75.1

Histidine His H 155.2

Isoleucine Ile I 131.2

Leucine Leu L 131.2

Lysine Lys K 146.2

Methionine Met M 149.2

Phenylalanine Phe F 165.2

Proline Pro P 115.1

Serine Ser S 105.1

Threonine Thr T 119.1

Tryptophan Trp W 204.2

Tyrosine Tyr Y 181.2

Valine Val V 117.1

Estrutura Secundária

A estrutura secundária é caracterizada pelo

estabelecimento de ligações de hidrogênio entre os

átomos dos aminoácidos de uma cadeia protéica.

Ex: α-hélice (mesma cadeia)

e folha-β ou pregueada (outra cadeia).

O grupo radical não participa !

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Os átomos envolvidos na ligação peptídica se-encontram no mesmo plano: w=180o (trans) ou 0o (cis)

Os ângulos f (phi) e y (psi) tem “livre” rotação

Estrutura Terciária

A estrutura terciária é a organização “global” de uma

única cadeia polipeptídica; o principal fator que determina

a estrutura terciária numa proteína globular é o efeito

hidrofóbico, ou seja, as cadeias laterais dos aminoácidos

não polares ficam como que “escondidas” dentro da

estrutura e as cadeias laterais dos resíduos polares ficam

expostos à superfície.

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Estrutura de mioglobina de baleia, uma proteína globular típica

Estrutura Quaternária

A estrutura quaternária é caracterizada pela associação

de duas ou mais cadeias polipeptídicas numa estrutura

com várias subunidades, resultando numa unidade ativa.

Este tipo de estrutura é estabilizada por ligações de

hidrogênio, forças de Van der Walls ou ligações iônicas.

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Estrutura Quaternária de Proteínas

Estrutura Quaternária de Proteínas

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EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS

• 1. BACTÉRIAS (E.coli)

• 2. LEVEDURA (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris)

• 3. CULTURA DE CÉLULAS

• 4. PLANTAS (Tabaco, milho, etc...)

Escolha do Sistema de Expressão

Escolha do Vetor de Expressão

• Características necessárias:• POLYLINKER

• ORIGEM DE REPLICAÇÃO

• GENE DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICO

• PROMOTOR

• SINAL DE INÍCIO DE TRADUÇÃO (ATG)

• SINAL DE TERMINAÇÃO

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Prós e Contras do uso de BactériasVantagens:Facilidade no crescimento e purificaçãoPossibilidade de uso de várias cepas e plasmídeos comerciaisAlta produção (normalmente 500 mg/l de cultura)Comparativamente baratoSistemas de expressão bem conhecidosTecnologia relativamente simples

Prós e Contras do uso de BactériasVantagens:Facilidade no crescimento e purificaçãoPossibilidade de uso de várias cepas e plasmídeos comerciaisAlta produção (normalmente 500 mg/l de cultura)Comparativamente baratoSistemas de expressão bem conhecidosTecnologia relativamente simples

Desvantagens:Não há modificações pós-traducionais (glicosilação,ribosilação, acetilação, co-fatores etc.)Tamanho do cDNA limitadoCodon usage diferente

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Prós e Contras do Uso de Leveduras

• Ex: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris

• Vantagens:

• Algumas modificações pós-tradução• Possui mitocôndria

• Desvantagens:

• Maior custo e mais trabalhoso• Possui proteases• Modificações não desejáveis

Prós e Contras do Uso de Células de Mamíferos

• Vantagens:• Muitas vezes a biologia celular é a mesma da proteína em

questão (localização, função, etc...)• Há sistemas de modificação pós-traducionais• Os sistemas estão cada vez mais eficientes

• Desvantagens:• Baixa produção• Sistemas caros e trabalhosos• Vetores

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Ex: BACTÉRIAGENE DE RESISTÊNCIA(Ampicilina / Kanamicina)

Origem de replicação(ori)

Promotor(LacZ e T7)

Polylinker(sítios únicos de clonagem)

Escolha do Vetor de Expressão

MCS (multi-cloning site)

• Polylinker – É necessário clonar o fragmento na mesma fase de leitura doplasmídeo

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MCS (multi-cloning site)

Já existe vetores com as 3 fases de leitura

Opções de Proteínas de Fusão

• Maltose binding protein (MBP)

• HIS-Tags (cauda de histidina)

• Glutathione S transferase

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Purificação das Proteínas Expressas

Cromatografia de Afinidade

Purificação das Proteínas Expressas

• HIS-Tags – Coluna de níquel

• Maltose binding protein – Coluna de amilose

• Glutathione S transferase – Coluna de glutationa

Cromatografia de Afinidade

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Vetor pMALNew England Biolabs

Maltose Binding Protein (MBP)

Vetor pMALNew England Biolabs

MBP

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Vetor pMALNew England Biolabs

Maltose Binding Protein (MBP)

pETNovagen

HIS-tag

20

HIS-tag

HIS-tag

21

HIS-tag

HIS-tag

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Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão

• BL21 – perdeu naturalmente a protease lon e foi

codificado para ser deficiente para a protease OmpT

INDUZIDA POR BACTERIÓFAGO LAMBDA

Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão

• BL21 – perdeu naturalmente a protease lon e foi codificado para ser

deficiente para a protease OmpT

INDUZIDA POR BACTERIÓFAGO LAMBDA

• BL21(DE3) – foi modificada para carregar o gene da T7RNA

polimerase sob o controle do promotor LacUV = carrega o lisogene

lambda DE3

INDUZIDA POR IPTG

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BL21(DE3)

Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão

• BL21 – perdeu naturalmente a protease lon e foi codificado para ser

deficiente para a protease OmpT

INDUZIDA POR BACTERIÓFAGO LAMBDA

• BL21(DE3) – foi modificada para carregar o gene da T7RNA

polimerase sob o controle do promotor LacUV = carrega o lisogene

lambda DE3

INDUZIDA POR IPTG

• BL21(SI) – contém o gene da T7RNA polimerase integrado em seu

genoma sob o controle do promotor proU, que é induzida quando a

célula é submetida a uma alta osmoralidade

INDUZIDA POR SAL (NaCl)

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Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão

• SUBTIPOS DA BL21(DE3)

• BL21(DE3) pLysS ou E – produz lisozima T7

• BL21(DE3) Star

• BL21(DE3) Codon-Plus ou Rosette – codon usage

• BL21(DE3) trxB ou gor – para proteínas com

muitas pontes dissulfeto

Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão

• SUBTIPOS DA BL21(DE3)

• BL21(DE3) pLysS ou E – produz lisozima T7

Carrega o plasmídeo pLysS ou pLysE, que expressa constitutivamente pequenos níveis de lisozima T7, que por sua vez inibe os níveis basais da T7 RNA polimerase

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Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão

Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão

• SUBTIPOS DA BL21(DE3)

• BL21(DE3) Star

Contém uma mutação no gene rne, que codifica para a RNAseE, aumentando a estabilidade do mRNA.

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Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão

• SUBTIPOS DA BL21(DE3)

• BL21(DE3) Codon-Plus ou Rosette – codon usage

Possui cópias extras de genes tRNAs, que são raros em E. coli, mas frequentemente usados em outros organismos.

Ex: RIL - organismos ricos em AT Arg (AGA/AGG), Ile (AUA) e Leu (CUA)

RP - organismos ricos em CGArg (AGA/AGG) e Pro (CCC)