1 1 benoit grelier hela kouada laureline mahe fanny marticke projet créatinine régulation de la...
Post on 03-Apr-2015
109 Views
Preview:
TRANSCRIPT
11
Benoit GRELIERHela KOUADALaureline MAHEFanny MARTICKE
Projet créatinineProjet créatinine
Régulation de la fonction rénale
22
PLANPLAN
I- Le projet
II- Démarche expérimentale : les réactions
III- Etalonnage électrochimique
I- Le projet
II- Démarche expérimentale : les réactions
III- Etalonnage électrochimique
33
I-Le projetI-Le projet
44
produit de dégradation du phosphate de créatine dans le muscle.
Le sangLa sueur
La saliveLes urines
REINREIN
1) Le projet
La créatinineLa créatinine
55
Le dosage sanguinLe dosage sanguin
Taux normal = 65 – 120 µmol/L ± 20 % (homme) 50 – 100 µmol/L ± 20 % (femme)
Insuffisance = 600 – 700 µmol/L ± 20 %Prises de sang régulière
A jeun / sans effort physique
1) Le projet
Le dosageLe dosage
66
Insuffisance rénaleInsuffisance rénale
Inconvénient du dosage
Inconvénient du dosage
Sanguin
Invasive
Source d’infection / douleur
3 millions de personnes
60 % de séniors
25 % de diabétiques
Nécessite du personnel médical
I- Le projet
ActuellementActuellement
77
I- Le projet
• Utilisation simple
• Fiable à ± 10 %
• Miniaturisation
•Dosage par Électrochimie•Sueur ? •Salive ?
•Dosage par Électrochimie•Sueur ? •Salive ?
•Utilisation simple•Utilisation simple
•Fiable à ± 10 %•Fiable à ± 10 %
•Méthode non invasive•Méthode non invasive
• Miniaturisation• Miniaturisation
Notre butNotre but
88
Rencontre avec le P. JAOUIRencontre avec le P. JAOUI
Expériences au CIMEExpériences au CIME
Achat des réactifsAchat des réactifs
Définir plus précisément les objectifs/ les contraintes du projet
Etablir le cahier des charges
Se rendre compte de la réalité du projet
1) Le projet
Recherches…Recherches…Recherches préliminairesRecherches préliminaires
Rencontre avec le P. ZAOUIRencontre avec le P. ZAOUI
Expériences au CIMEExpériences au CIME
SaliveSalive
Déroulement…Déroulement…
99
II-LES REACTIONSII-LES REACTIONS
1010
Objectif : savoir si les réactions qui mènent à H202 fonctionnent
?3 réactions
II- Les réactions
Est-ce que ca marche?Est-ce que ca marche?
1111
II- Les réactions
De la créatinine à H 2O2De la créatinine à H 2O2
créatinine + H2Ocréatinine + H2O créatine (1)
créatine + H2Ocréatine + H2O
créatininase
sarcosine (2)
sarcosine + H2Osarcosine + H2O H2O2 (3) sarcosine oxidase
créatinase
12
•peroxydase•H2O2 + 2* TMB TMBox+ (bleu) peroxydase•H2O2(en excès)+ 2* TMB TMBox++ (rouge)
•Il faudra obtenir du TMBox+ bleu car il varie linéairement en fonction de la H2O2 et donc de la sarcosine=> Avoir une quantité raisonable de H2O2 de l’ordre du µmol•La péroxydase doit être aussi en faibles quantité 1µL
•peroxydase•H2O2 + 2* TMB TMBox+ (bleu) peroxydase•H2O2(en excès)+ 2* TMB TMBox++ (rouge)
•Il faudra obtenir du TMBox+ bleu car il varie linéairement en fonction de la H2O2 et donc de la sarcosine=> Avoir une quantité raisonable de H2O2 de l’ordre du µmol•La péroxydase doit être aussi en faibles quantité 1µL
II- Les réactions
Détection du HDétection du H22OO22Détection du HDétection du H22OO22
13
La troisième réactionLa troisième réactionLa troisième réactionLa troisième réactionII- Les réactions
•7 puits7 puits•Différentes quantités de sarcosine oxydase Différentes quantités de sarcosine oxydase la meilleure obtenue pour 1/ 2 µLla meilleure obtenue pour 1/ 2 µL vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif …vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif … A priori tout marche bien, mais …A priori tout marche bien, mais …
•7 puits7 puits•Différentes quantités de sarcosine oxydase Différentes quantités de sarcosine oxydase la meilleure obtenue pour 1/ 2 µLla meilleure obtenue pour 1/ 2 µL vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif …vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif … A priori tout marche bien, mais …A priori tout marche bien, mais …
14
Mais…Mais…Mais…Mais…II- Les réactions
•Les résultats sont très aléatoires: en variant les Les résultats sont très aléatoires: en variant les concentrations de sarcosine ou de sarcosine concentrations de sarcosine ou de sarcosine oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne trop…??trop…??
•On n’arrive pas à contrôler la réaction On n’arrive pas à contrôler la réaction génant pour la détectiongénant pour la détection
•Les résultats sont très aléatoires: en variant les Les résultats sont très aléatoires: en variant les concentrations de sarcosine ou de sarcosine concentrations de sarcosine ou de sarcosine oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne trop…??trop…??
•On n’arrive pas à contrôler la réaction On n’arrive pas à contrôler la réaction génant pour la détectiongénant pour la détection
1515
créatine + H2O créatine-amidinohydrolase sarcosine + urée(créatinase)
Solution de créatinase (μL)
Sol
utio
n de
sar
cosi
ne (
μL)
Tableau croisé avec concentration=3 U/mol
Sarcosine : 50 μL à 1,53 U/mol Créatine : 50 μL à 3 U/mol
Sol
utio
n de
sar
cosi
ne (
μL) 0 20 40 60 80 100
0 Contrôle négatif
20 coloration
40 optimum
60 2nde oxydation
80
100
Propriétés de l’enzyme :- Transforme 1μmol de créatine / minute
- Enzyme à diluer à 2,0-3,0 U/mol
II- Les réactionsc
La deuxième réactionLa deuxième réactionLa deuxième réactionLa deuxième réaction
16
La première réactionLa première réactionLa première réactionLa première réactionII- Les réactions
•On prépare la solution de créatinine 1.49g/100mLOn prépare la solution de créatinine 1.49g/100mL•Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl dans les puits en ajoutant le reste des enzymes dans les puits en ajoutant le reste des enzymes conservées au frigo conservées au frigo La réaction ne marche pas La réaction ne marche pas
•On prépare la solution de créatinine 1.49g/100mLOn prépare la solution de créatinine 1.49g/100mL•Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl dans les puits en ajoutant le reste des enzymes dans les puits en ajoutant le reste des enzymes conservées au frigo conservées au frigo La réaction ne marche pas La réaction ne marche pas
17
ConclusionConclusionConclusionConclusionII- Les réactions
•Problème de conservation des enzymes à -20°C et à Problème de conservation des enzymes à -20°C et à 4°C4°C•Incompatibilité des solutions tampon pour les Incompatibilité des solutions tampon pour les différentes enzymes différentes enzymes réactions perturbées (sachant réactions perturbées (sachant que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons différentsdifférents•Changement de pH après la 1ère réaction Changement de pH après la 1ère réaction inhibation des autresinhibation des autres
•Problème de conservation des enzymes à -20°C et à Problème de conservation des enzymes à -20°C et à 4°C4°C•Incompatibilité des solutions tampon pour les Incompatibilité des solutions tampon pour les différentes enzymes différentes enzymes réactions perturbées (sachant réactions perturbées (sachant que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons différentsdifférents•Changement de pH après la 1ère réaction Changement de pH après la 1ère réaction inhibation des autresinhibation des autres
1818
III- Etalonnage électrochimiqueIII- Etalonnage électrochimique
AnodeH2O2-> O2 + 2H+ + 2e-
Cathode2H+ + 2e- -> H2
CEI
- +
WE
EDTA/Tris Hcl +H2O2
REF
VA
Potentiostat
Palier de diffusion
PrincipePrincipePrincipePrincipeIII- Etalonnage
Gamme:50 -> 300 mMGamme:50 -> 300 mM
Le courant détecté est proportionnel à la concentration en H2O2
Le courant détecté est proportionnel à la concentration en H2O2
20
Balayage: 20 mV/s500pts mesurepH=8
WE: Au
CE: ITO
ERAg,AgCl
1ère cellule électrochimique1ère cellule électrochimique1ère cellule électrochimique1ère cellule électrochimique
Pas d’oxydation de H2O2 et ITO non inerte
Pas d’oxydation de H2O2 et ITO non inerte
III- Etalonnage
21
CE: Pt
ERAg,AgClWE: Pt
Balayage: 20mV/spH=8
V=450 mV
FAUX!
Courant capacitif ou autre réaction
2ème cellule électrochimique2ème cellule électrochimique2ème cellule électrochimique2ème cellule électrochimique
•Ampérométrie réalisée au mauvais potentiel• Concentration des ions non constante (tampon dilué!)
=>Réfléchir avant d’agir!!
•Ampérométrie réalisée au mauvais potentiel• Concentration des ions non constante (tampon dilué!)
=>Réfléchir avant d’agir!!
III- Etalonnage
/ Ag,AgCl
22
ERAg,AgCl
V=450 mV
CE: PtCE: Pt
WE: Au
Oxydation de H2O2
650/ Ag,AgCl
Balayage: 20mV/spH=8
• Fuites• Mauvaise connection• Fuites• Mauvaise connection
3ème cellule électrochimique3ème cellule électrochimique3ème cellule électrochimique3ème cellule électrochimique
Problèmes possibles:• Cinétique H+• Capacité tampon
Problèmes possibles:• Cinétique H+• Capacité tampon
III- Etalonnage
23
Conclusion généraleConclusion généraleConclusion généraleConclusion générale
• Réactions 2 & 3 vérifiées => Réaction 1 à vérifier• Echec courbe étalon: Montage, cinétique H+, capacité tampon• Frustration : pas de dosage de la créatinine dans de la salive• Perspectives : Cinétique H+ sur Pt (pH=8) => CE plus grande? Vérifier si on dépasse la capacité tampon
• Expérience de la recherche
• Réactions 2 & 3 vérifiées => Réaction 1 à vérifier• Echec courbe étalon: Montage, cinétique H+, capacité tampon• Frustration : pas de dosage de la créatinine dans de la salive• Perspectives : Cinétique H+ sur Pt (pH=8) => CE plus grande? Vérifier si on dépasse la capacité tampon
• Expérience de la recherche
top related