amboj00054-0025the x-ray crystal structure of the catalytic domain of human neutrophil collagenase...

7/27/2019 Amboj00054-0025The X-ray crystal structure of the catalytic domain of human neutrophil collagenase inhibited by

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The EMBO J o u r n a l v o l . 1 3 n o . 6 p p . 1 2 6 3 - 1 2 6 9 , 1994

T h e X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e c a t a l y t i c d o m a i n o fhuman n e u t r o p h i l c o l l a g e n a s e i n h i b i t e d b y a s u b s t r a t ea n a l o g u e r e v e a l s t h e e s s e n t i a l s f o r c a t a l y s i s a n ds p e c i f i c i t yW o l f r a m B o d e 1 , P e t e r R e i n e m e r 1 ,R o b e r t H u b e r , Thomas K l e i n e 2 ,S u s a n n e S c h n i e r e r 2 a n d H a r a l d T s c h e s c h e 2M a x - P l a n c k - I n s t i t u t f u r B i o c h e m i e , A b t e i l u n g f u r S t r u k t u r f o r s c h u n g ,D - 8 2 1 5 2 M a r t i n s r i e d , a n d 2 U n i v e r s i t i t B i e l e f e l d , F a k u l t i i t f u r C h e m i eu n d B i o c h e m i e , D - 3 3 6 1 5 B i e l e f e l d , G e r m a n y' C o r r e s p o n d i n g a u t h o rC o m m u n i c a t e d b y R . H u b e rM a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s a r e a f a m i l y o f z i n c e n d o -p e p t i d a s e s i n v o l v e d i n t i s s u e r e m o d e l l i n g . T h e y h a v e b e e ni m p l i c a t e d i n v a r i o u s d i s e a s e p r o c e s s e s i n c l u d i n g t u m o u ri n v a s i o n a n d j o i n t d e s t r u c t i o n . T he s e e n z y m e s c o n s i s t o fs e v e r a l d o m a i n s , w h i c h a r e r e s p o n s i b l e f o r l a t e n c y ,c a t a l y s i s a n d s u b s t r a t e r e c o g n i t i o n . Human n e u t r o p h i lc o l l a g e n a s e ( P M N L - C L , MMP-8) r e p r e s e n t s o n e o f t h et w o ' i n t e r s t i t i a l ' c o l l a g e n a s e s t h a t c l e a v e t r i p l e h e l i c a lc o l l a g e n s t y p e s I , H a n d I I I . I t s 1 6 3 r e s i d u e c a t a l y t i cd o m a i n ( M e t 8 O t o G l y 2 4 2 ) h a s b e e n e x p r e s s e d i nE s c h e r i c h i a c o l i a n d c r y s t a l l i z e d a s a n o n - c o v a l e n tc o m p l e x w i t h t h e i n h i b i t o r P r o - L e u - G l y - h y d r o x y l a m i n e .T h e 2 . 0 A c r y s t a l s t r u c t u r e r e v e a l s a s p h e r i c a l m o l e c u l ew i t h a s h a l l o w a c t i v e - s i t e c l e f t s e p a r a t i n g a s m a l l e rC - t e r m i n a l s u b do m a in f r o m a b i g g e r N - t e r m i n a l d o m a i n ,c o m p o s e d o f a f i v e - s t r a n d e d $ - s h e e t , t w o a - h e l i c e s , a n db r i d g i n g l o o p s . T h e i n h i b i t o r m i m i c s t h e u n p r i m e d( P 1 - P 3 ) r e s i d u e s o f a s u b s t r a t e ; p r i m e d ( P 1 ' - P 3 ' )p e p t i d e s u b s t r a t e r e s i d u e s s h o u l d b i n d i n a n e x t e n d e dc o n f o r m a t i o n , w i t h t h e b u l k y P 1 ' s i d e - c h a i n f i t t i n g i n t ot h e d e e p h y d r o p h o b i c S i ' s u b s i t e . M o d e l l i n g e x p e r i m e n t sw i t h c o l l a g e n s h o w t h a t t h e s c i s s i l e s t r a n d o f t r i p l e - h e l i c a lc o l l a g e n m u s t b e f r e e d t o f i t t h e s u b s i t e s . T h e c a t a l y t i cz i n c i o n i s s i t u a t e d a t t h e b o t t o m o f t h e a c t i v e - s i t e c l e f ta n d i s p e n t a - c o o r d i n a t e d b y t h r e e h i s t i d i n e s a n d b y b o t hh y d r o x a m i c a c i d o x y g e n s o f t h e i n h i b i t o r . I n a d d i t i o n t ot h e c a t a l y t i c z i n c , t h e c a t a l y t i c d o m a i n h a r b o u r s a s e c o n d ,n o n - e x c h a n g e a b l e z i n c i o n a n d t w o c a l c i u m i o n s , w h i c ha r e p a c k e d a g a i n s t t h e t o p o f t h e $ - s h e e t a n d p r e s u m a b l yf u n c t i o n t o s t a b i l i z e t h e c a t a l y t i c d o m a i n . T h e p o l y p e p t i d ef o l d i n g a n d i n p a r t i c u l a r t h e z i n c e n v i r o n m e n t o f t h ec o l l a g e n a s e c a t a l y t i c d o m a i n b e a r a c l o s e r e s e m b l a n c e t ot h e a s t a c i n s a n d t h e s n a k e venom m e t a l l o p r o t e i n a s e s .K e y w o r d s : c o l l a g e n a s e s / c o l l a g e n d i g e s t i o n / m a t r i x m e t a l l o -p r o t e i n a s e s / X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e / z i n c e n d o p e p t i d a s e s

I n t r o d u c t i o nM a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s , t i s s u e c o l l a g e n a s e s , EC3 . 4 . 2 4 . 7 ) a r e a f a m i l y o f z i n c - a n d c a l c i u m - d e p e n d e n te n d o p e p t i d a s e s r e s p o n s i b l e f o r d e g r a d a t i o n o f e x t r a c e l l u l a rm a t r i x c o m p o n e n t s s u c h a s i n t e r s t i t i a l a n d b a s e m e n tm e m b r a n e c o l l a g e n s , f i b r o n e c t i n a n d l a m i n i n . T h e y h a v e

b e e n i m p l i c a t e d i n t i s s u e r e m o d e l l i n g p r o c e s s e s a s s o c i a t e dw i t h m a m m a l i a n g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t , o v u l a t i o n a n dw o u n d h e a l i n g , b u t c a n a l s o p l a y a d e l e t e r i o u s r o l e i n v a r i o u sd i s e a s e p r o c e s s e s s u c h a s r h e u m a t o i d j o i n t d e s t r u c t i o n i nr h eu m a t o i d a n d o s t e o a r t h r i t i s , t u m o u r i n v a s i o n a n d p e r i o d -o n t i t i s ( f o r r e c e n t r e v i e w s s e e W o e s s n e r , 1 9 9 1 ; M a t r i s i a n ,1 9 9 2 ; M u r p h y a n d D o c h e r t y , 1 9 9 2 ; B i r k e d a l - H a n s e n e t a l . ,1 9 9 3 ) . A t l e a s t n i n e d i f f e r e n t ( y e t h i g h l y h o m o l o g o u s ) MMPt y p e s h a v e b ee n c h a r a c t e r i z e d , i n c l u d i n g i n t e r s t i t i a l ( F I B -C L , MMP-1) a n d n e u t r o p h i l c o l l a g e n a s e ( P M N L - C L ,M M P - 8 ) , t w o g e l a t i n a s e s [ t h e 7 2 k D a ( M M P - 2 ) a n d t h e9 2 k D a ( M M P - 9 ) g e l a t i n a s e s ] , t h e s t r o m e l y s i n s [ S L - 1( M M P - 3 ) , S L - 2 ( M M P - 1 0 ) a n d m a t r i l y s i n ( p u m p , M M P - 7 ) ]a n d o t h e r s ( S L - 3 (MMP-1 1 ) , m e t a l l o e l a s t a s e ] . T h e s ep r o t e i n a s e s a r e s e c r e t e d a s i n a c t i v e m u l t i d o m a i n - p r o -e n z y m e s , w i t h t h e a c t i v e - s i t e z i n c b l o c k e d b y a n u n p a i r e dc y s t e i n e ( S p r i n g m a n e t a l . , 1 9 9 0 ) w i t h i n a s t r o n g l y c o n s e r v e dPRCGVPD s e q u e n c e m o t i f o f t h e - 8 0 r e s i d u e p r o p e p t i d ew h i c h i s r e m o v e d i n a s t e p w i s e p r o c e s s u p o n a c t i v a t i o n( K n a u p e r e t a l . , 1 9 9 0 ; N a g a s e e t a l . , 1 9 9 0 ) . F o l l o w i n g t h i sp r o p e p t i d e i s t h e z i n c a n d c a l c i u m b i n d i n g c a t a l y t i c d o m a i no f - 1 7 0 r e s i d u e s , c o n t a i n i n g t h e c o n s e r v e d HEXX-HXXGXXH z i n c s i g n a t u r e ( B o d e e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h i s i sf o l l o w e d i n t u r n b y a h e m o p e x i n - l i k e d o m a i n o f - 2 1 0r e s i d u e s , w h i c h i s i m p o r t a n t f o r t h e u n i q u e a b i l i t y o f F I B -a n d PMNL-CL t o c l e a v e t r i p l e - h e l i c a l c o l l a g e n ( H a s t y e t a l . ,1 9 8 7 ; M u r p h y e t a l . , 1 9 9 2 ; K n a u p e r e t a l . , 1 9 9 3 a ; S a n c h e z -L o p e z e t a l . , 1 9 9 3 ; S c h n i e r e r e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e g e l a t i n a s e sp o s s e s s a n a d d i t i o n a l f i b r o n e c t i n - l i k e d o m a i n w h i c h i si n s e r t e d i n t h e c a t a l y t i c d o m a i n , a n d MMP-9 s h o w s a u n i q u ee x t e n d e d h i n g e r e g i o n b e t w e e n t h e c a t a l y t i c a n d t h eh e m o p e x i n - l i k e d o m a i n .T h e i n t e r s t i t i a l c o l l a g e n a s e s , F I B - C L a n d PMNL-CL, a r et h e m o s t s p e c i f i c o f t h e s e MMPs, e x h i b i t i n g a u n i q u e t r i p l eh e l i c a s e a c t i v i t y . E a c h o f t h e t h r e e p o l y p e p t i d e c h a i n s o f t h en a t i v e h e l i c a l c o l l a g e n s o f t y p e s I , I I a n d H I i s c l e a v e d a ta s i n g l e p e p t i d e b o n d , g i v i n g r i s e t o f r a g m e n t s t h r e e q u a r t e r sa n d o n e q u a r t e r o f t h e n a t i v e c h a i n l e n g t h . T h e n e u t r o p h i lc o l l a g e n a s e ( P N M L - C L , M M P - 8 ) i s s y n t h e s i z e d d u r i n g t h ee a r l y p h a s e s o f c e l l u l a r d i f f e r e n t i a t i o n a n d i s s t o r e d a s ah i g h l y g l y c o s y l a t e d p r o t e i n i n t h e s p e c i f i c g r a n u l e s o fn e u t r o p h i l s w h i c h c a n b e s e c r e t e d a s a n i n a c t i v e p r e c u r s o ra f t e r i n i t i a t i o n b y i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s ( M u r p h y e t a l . ,1 9 7 7 ; H a s t y e t a l . , 1 9 8 6 ; K n a u p e r e t a l . , 1 9 9 0 ) . U p o na c t i v a t i o n c l e a v a g e o f t h e p r o e n z y m e , a c t i v e PMNL-CLs p e c i e s w i t h N - t e r m i n a l r e s i d u e s P h e 7 9 , M e t 8 O o r L e u 8 1h a v e b e e n o b s e r v e d ( f o r s e q u e n c e n u m b e r i n g s e e F i g u r e 1 ) ,w h i c h d i f f e r s i g n i f i c a n t l y i n a c t i v i t y ( G r a n t e t a l . , 1 9 8 7 ;K n a u p e r e t a l . , 1 9 9 0 ; M a l l y a e t a l . , 1 9 9 0 ; S u z u k i e t a l . ,1 9 9 0 ; B l a s e r e t a l . , 1 9 9 1 ; K n a u p e r e t a l . , 1 9 9 3 b ) .H e r e we p r e s e n t t h e X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e n o n -c o v a l e n t c o m p l e x f o r m e d b e t w e e n t h e c a t a l y t i c d o m a i n( M e t 8 0 - G l y 2 4 2 ) o f h u m a n P M N L - c o l l a g e n a s e a n d t h ei n h i b i t o r P r o - L e u - G l y - h y d r o x y l a m i n e ( N H O H ) , w h i c h

) O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s 1 263


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W.Bode e t a l .

m i m i c s b i n d i n g o f t h e N - t e r m i n a l p a r t o f p e p t i d e s u b s t r a t e st o t h e n o n - p r i m e d e n z y m e s u b s i t e s ( u s i n g t h e n o m e n c l a t u r eo f S c h e c h t e r a n d B e r g e r , 1 9 6 7 ) . M o d e l l i n g e x p e r i m e n t s s u g -g e s t t h a t t r i p l e - h e l i c a l c o l l a g e n w i l l n o t f i t a s a w h o l e t o t h ea c t i v e - s i t e r e g i o n o f c o l l a g e n a s e s b u t t h a t s i n g l e s t r a n d s m u s tb e f r e e d a r o u n d t h e i r s c i s s i l e p e p t i d e b o n d f r o m t h e t r i p l eh e l i x i n o r d e r t o b e b o u n d a n d c l e a v e d .R e s u l t s a n d d i s c u s s i o nO v e r a l l s t r u c t u r eT h e c a t a l y t i c d o m a i n o f h u m a n P M N L - c o l l a g e n a s e c o n t a i n -i n g 1 6 3 r e s i d u e s f r o m M e t 8 O t o G l y 2 4 2 ( u s i n g p r o e n z y m es e q u e n c e n u m b e r i n g , F i g u r e 1 ) h a s b e e n c l o n e d , a n d t h ee n z y m e h a s b e e n e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o l i a n d p u r i f i e dt o h o m o g e n e i t y ( S c h n i e r e r e t a l . , 1 9 9 3 ) . I t h a s b e e nc o - c r y s t a l l i z e d w i t h t h e s u b s t r a t e a n a l o g u e P r o - L e u - G l y -NHOH, a n i n h i b i t o r d e s c r i b e d f o r u s e i n a f f i n i t y c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ( M o o r e a n d S p i l b u r g , 1 9 8 6 ) . T h e X - r a yc r y s t a l s t r u c t u r e o f t h i s n o n - c o v a l e n t c o m p l e x h a s b e e ns o l v e d b y m u l t i p l e i s o m o r p h o u s r e p l a c e m e n t a t 3 . 0 Ar e s o l u t i o n a n d s u b s e q u e n t l y r e f i n e d a t 2 . 0 A r e s o l u t i o n ( s e eT a b l e s I - I I I ) . T h e s t r u c t u r e s h o w n i n F i g u r e 2 b e a r s s o m es i m i l a r i t y t o c r a y f i s h a s t a c i n ( B o d e e t a l . , 1 9 9 2 ; G o m i s - R u i t he t a l . , 1 9 9 3 a ) a n d s n a k e venom a d a m a l y s i n ( G o m i s - R i i t he t a l . , 1 9 9 3 b ) . I t r e v e a l s t h a t t h e PMNL-CL c a t a l y t i c d o m a i ni s a s p h e r i c a l m o l e c u l e n o t c h e d a t t h e p e r i p h e r y t o g i v e ar e l a t i v e l y f l a t a c t i v e - s i t e c l e f t , s e p a r a t i n g t h e s m a l l ' l o w e r 's u b d o m a i n f r o m t h e ' u p p e r ' m a i n b o d y ( F i g u r e 2 a ) . I n t h i sN - t e r m i n a l M e t 8 O - f o r m e l e c t r o n d e n s i t y i s o b s e r v e d o n l yf r o m t h e 7 t h r e s i d u e ( P r o 8 6 ) o n w a r d s . T h e f i r s t t h r e eq u a r t e r s o f t h e p e p t i d e c h a i n ( u p t o G l y 2 0 4 ) f o r m t h er e g u l a r l y f o l d e d ' u p p e r ' d o m a i n . T h i s d o m a i n c o n s i s t s7 9 9 0 1 0 0

I - - - - p 1 . I

m a i n l y o f a c e n t r a l , h i g h l y t w i s t e d f i v e - s t r a n d e d ( - p l e a t e ds h e e t , f l a n k e d b y a n S - s h a p e d ' d o u b l e - l o o p ' a n d t w o o t h e rb r i d g i n g l o o p s o n i t s c o n v e x s i d e , a n d b y t w o l o n g h e l i c e so n i t s c o n c a v e s i d e ( c A , c t B i n F i g u r e 1 ) . T h e s h e e t s h i e l d sa l a r g e c o r e b u i l t a l m o s t e x c l u s i v e l y f r o m h y d r o p h o b i cr e s i d u e s . T h e ' l o w e r ' s u b d o m a i n , c o m p r i s i n g t h e l a s t 3 8r e s i d u e s , i s o r g a n i z e d i n m u l t i p l e t u r n s , e n d i n g i n a l o n gC - t e r m i n a l c e - h e l i x a t t h e s u r f a c e o f t h e m o l e c u l e ( F i g u r e 2 b ) .T h e ' c a t a l y t i c ' z i n c i o n ( Z n 9 9 9 ) i s s i t u a t e d a t t h e b o t t o mo f t h e a c t i v e - s i t e c l e f t . I t i s p e n t a - c o o r d i n a t e d b y t h e t h r e ei m i d a z o l e N E 2 a t o m s o f H i s 1 9 7 ( 2 . 0 A ) , H i s 2 0 1 ( 2 . 2 A ) a n dH i s 2 O 7 ( 1 . 9 A ) o f t h e HEXXHXXGXXH z i n c b i n d i n gc o n s e n s u s m o t i f , a n d b y t h e c a r b o n y l ( 2 . 0 A ) a n d t h eh y d r o x y l o x y g e n ( 2 . 2 A ) o f t h e i n h i b i t o r ' s h y d r o x a m i c a c i dm o i e t y ( F i g u r e 3 ) . B e s i d e s t h e s e t w o o x y g e n - z i n c c o n t a c t s ,t h e h y d r o x a m a t e g r o u p i s s i t u a t e d w i t h i t s o x y g e n a n dn i t r o g e n c l o s e t o G l u 1 9 8 0 e 1 a n d f o r m s a h y d r o g e n b o n dv i a i t s n i t r o g e n t o t h e c a r b o n y l g r o u p o f A l a l 6 l o f t h ee x t e n d e d e d g e s t r a n d A l a l 6 1 - P h e l 6 4 ( ( 3 4 i n F i g u r e 1 ) o f t h ef - s h e e t . T h e a c t i v e - s i t e h e l i x c o n t a i n i n g H i s 1 9 7 , G l u 1 9 8 a n dH i s 2 0 1 e x t e n d s t o G l y 2 0 4 , w h e r e t h e p o l y p e p t i d e c h a i n t u r n s

s h a r p l y a w a y f r o m t h e h e l i x a x i s t o w a r d s H i s 2 O 7 , t h e t h i r dz i n c l i g a n d . T h e r e f o l l o w s a w i d e r i g h t - h a n d e d l o o p ,s t a b i l i z e d b y a h y d r o g e n b o n d b e t w e e n S e r 2 O 8 N a n dM e t 2 1 5 0 a n d a 1 , 4 - t i g h t t u r n A l a 2 1 3 - L e u 2 I 4 - M e t 2 I 5 -T y r 2 1 6 k n o w n a s t h e ' M e t - t u r n ' ( B o d e e t a l . , 1 9 9 3 ;G o m i s - R i i t h e t a l . , 1 9 9 3 b ) . T h e s i d e c h a i n o f M e t 2 1 5p r o v i d e s a h y d r o p h o b i c b a s e m e n t t o t h e t h r e e z i n c l i g a n d i n gh i s t i d i n e r e s i d u e s , a c h a r a c t e r i s t i c e l e m e n t f o r t h e ' m e t z i n -c i n s ' ( B o d e e t a l . , 1 9 9 3 ) .T h e p e p t i d e c h a i n t h e n p r o c e e d s t o t h e m o l e c u l a r s u r f a c ea t P r o 2 1 7 , w h e r e t h e c h a i n i s k i n k e d , f o r m i n g t h e o u t e r w a l lo f t h e p u t a t i v e S I ' p o c k e t ( F i g u r e 3 ) . T h e f o l l o w i n gC - t e r m i n a l h e l i x , s i t u a t e d a t t h e b o t t o m o f t h e m o l e c u l e1 1 0 1 2 0 1 2 81 - , P 2- - - - - - - - - - - - - - a A - - - - - - - - - - - - - - I

F M L T P G N P K W E R T N L T Y R I R N Y T P Q L S E A E V E R A I K D A F E L W S V A S P L I F* * * * **** * * * * * * ** *

1 4 0- - - - - - 3 - - - - - i 1 5 0 160 I - M 4 - - l 170 178I - - p 5 - - - 1TRI S Q GE AD IN IA F Y Q RD H G D NS P F D GP NG ILA HA F Q P G Q GIG G DA H F DA

* *** * * * **** ** ** * ** ***

1 7 9 190 20 0 21 0 220E E T W T N T S A N Y N L F L V A A H E

228

F G H S L G L A S S D P G A L M Y P N Y A F R E T S N Y S

24 0 24 2_ _ _ _ _ _ _ c--------L P Q D D I D G I Q A I Y G

F i g . 1 . P r i m a r y s t r u c t u r e ( g i v e n i n o n e - l e t t e r c o d e ) f o r t h e c a t a l y t i c d omain o f h u m an P M N L - c o l l a g e n a s e ( H a s t y e t a l . , 1 9 9 0 ; S c h n i e r e r et a l . ,1 9 9 3 ) . S e q u e n c e n u m b e r i n g c o r r e s p o n d s t o t h e s h o r t f o r m p r o c o l l a g e n a s e l a c k i n g t h e s i g n a l p e p t i d e a n d t h e h e m o p e x i n - l i k e d o m a i n . R e s i d u e s s t r i c t l yc o n s e r v e d t h r o u g h o u t t h e h u m a n c o l l a g e n a s e s a n d s t r o m e l y s i n s [ f i b r o b l a s t c o l l a g e n a s e ( F I B - C L , M M P - 1 ) , n e u t r o p h i l c o l l a g e n a s e (PMNL-CL,M M P - 8 ) , s t r o m e l y s i n - I ( M M P - 3 ) , - 2 (MMP-10) a n d - 3 ( M M P - 1 1 ) ] ( f o r sequences a n d a l i g n m e n t s e e B i r k e d a l - H a n s e n et a l . , 1 9 9 3 ) are m ark e d witha n a s t e r i s k ( * ) . S e c o n d a r y s t r u c t u r e e le me nt s ( a A , B , C : a - h e l i c e s ; / 3 1 , 2 , 3 , 4 , 5 : , 3 - s t r a n d s ) c a l c u l a t e d w i t h D S S P ( K a b s c h an d S a n d e r , 1 9 8 3 ) areo v e r l a y e d ov er t h e p r i m a r y s t r u c t u r e . R e s i d u e s i n v o l v e d i n b in di n g o f t h e m e t a l i o n s [ ' c a t a l y t i c ' z in c ( Z n 9 9 9 ) : H 1 9 7 ( N E 2 ) , H201 ( N E 2 ) , H207 ( N E 2 )' s t r u c t u r a l ' z i n c ( Z n 9 9 8 ) : H 1 4 7 ( N E 2 ) , D 1 4 9 ( 0 8 2 ) . H162 ( N E 2 ) , H175 ( N 8 1 ) , c a l c i u m s i t e K a 9 9 7 : D154 ( 0 8 2 ) , G155 ( 0 ) , N 1 5 7 ( 0 ) , 1159 ( 0 ) , D177( 0 a i ) , E 1 8 0 ( E 1 ) , c a l c i u m s i t e K a 9 9 6 : D 1 3 7 ( 0 ) , G169 ( 0 ) , G 1 7 1 ( 0 ) , D173 ( 0 8 1 ) ] a re g i v e n i n b o l d .1264

1 2 9-

229


3/7

S t r u c t u r e o f t h e c a t a l y t i c d o m a i n o f h P M N L - c o l l a g e n a s e

( F i g u r e 2 b ) , c o n t a i n s t h e s t r i c t l y c o n s e r v e d r e s i d u e s A s p 2 3 2a n d A s p 2 3 3 . T h e b u r i e d s i d e c h a i n o f t h e l a t t e r r e s i d u e ,w h i c h i s e s s e n t i a l f o r c a t a l y t i c a c t i v i t y ( H i r o s e e t a l . , 1 9 9 3 ) ,f o r m s a h y d r o g e n b o n d t o t h e M e t - t u r n r e s i d u e s L e u 2 1 4 Na n d M e t 2 1 5 N , t h u s s t a b i l i z i n g t h e a c t i v e - s i t e b a s e m e n t .A s p 2 3 2 i s p o s i t i o n e d a t t h e s i d e o f a h y d r o p h o b i c g r o o v ef o r m e d b y t h e C - t e r m i n a l h e l i x r e s i d u e s G l y 2 3 6 , A l a 2 3 8 a n d1 1 e 2 4 0 a n d c l o s e d b y L e u 2 O 5 a n d M e t 2 1 5 . T h i s r e g i o n c o u l ds t a b i l i z e t h e f o u r N - t e r m i n a l r e s i d u e s o f t h e P h e 7 9 ' s u p e r -a c t i v e ' f o r m s ( S u z u k i e t a l . , 1 9 9 0 ; K n a u p e r e t a l . , 1 9 9 3 b ) ,w i t h t h e N - t e r m i n a l ammonium g r o u p m a k i n g a s a l t b r i d g et o t h e c a r b o x y l a t e g r o u p o f A s p 2 3 2 . W e h a v e r e c e n t l y s o l v e dt h e X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e P h e 7 9 f o r m , a n d h a v es h o w n t h i s t o b e t h e c a s e ( R e i n e m e r e t a l . , 1 9 9 4 ) .I n a d d i t i o n t o t h e ' c a t a l y t i c ' z i n c i o n , t h e c a t a l y t i c d o m a i no f h u m a n PMNL-CL h a r b o u r s a n o t h e r , h e r e a f t e r r e f e r r e dt o a s ' s t r u c t u r a l ' z i n c i o n ( Z n 9 9 8 ) , a n d t w o c a l c i u m i o n s( K a 9 9 6 , K a 9 9 7 ; s e e F i g u r e s 2 a n d 4 ) . T h e s e c o n d z i n c( Z n 9 9 8 ) a n d o n e o f t h e t w o c a l c i u m i o n s ( K a 9 9 7 ) a r es a n d w i c h e d b e t w e e n t h e s u r f a c e S -s ha pe d d o u b l e l o o pa

A r g l 4 5 - L e u l 6 O ( w h i c h c o n n e c t s s t r a n d s 1 3 3 a n d 1 4 a n db r i d g e s t h e s p a t i a l l y i n t e r v e n i n g s t r a n d 1 3 5 ) a n d t h e s u r f a c eo f t h e 1 3 - s h e e t ( F i g u r e 4 ) . T h e N - t e r m i n a l l o o p i s f o r m e db y a h y d r o g e n b o n d b e t w e e n P h e l 5 3 N a n d A r g 1 4 5 0 . T h e' s t r u c t u r a l ' z i n c i s c o o r d i n a t e d i n a n a l m o s t t e t r a h e d r a lm a n n e r b y H i s 1 4 7 N , 2 ( 2 . 0 A ) a n d A s p 1 4 9 0 5 2 ( 2 . 0 A ) o ft h i s l o o p a n d H i s 1 6 2 N , 2 ( 1 . 9 A ) a n d H i s l 7 5 N b 1 ( 2 . 0 A ) o ft h e o p p o s i n g 1 3 - s h e e t . A l l f o u r r e s i d u e s a p p e a r t o b e s t r i c t l yc o n s e r v e d i n a l l MMPs ( e x c e p t i n S L - 3 , w h e r e H i s 1 4 7 i sr e p l a c e d b y a n a s p a r t a t e ) . W e h a v e b e e n u n a b l e t o r e m o v eo r e x c h a n g e t h i s z i n c i n o u r c r y s t a l s , s u g g e s t i n g a n e x t r e m e l yt i g h t b i n d i n g o f t h i s z i n c s i t e , w h i c h i s i n a g r e e m e n t w i t he x c h a n g e d a t a i n s o l u t i o n ( S a l o w e e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h eC - t e r m i n a l p a r t o f t h i s l o o p e n c i r c l e s o n e o f t h e c a l c i u m i o n s( K a 9 9 7 ) a n d p a c k s i t a g a i n s t t h e s i d e c h a i n s o f A s p 1 7 7 a n dG l u 1 8 0 , w h i c h p r o t r u d e f r o m t h e C - t e r m i n a l e n d o f s t r a n d1 5 ( s e e F i g u r e 4 ) . T h e c a r b o x y l a t e g r o u p s o f t h e s e s t r i c t l yc o n s e r v e d a c i d i c r e s i d u e s , t o g e t h e r w i t h t h e t h r e e l o o pc a r b o n y l s a n d t h e A s p 1 5 4 c a r b o x y l a t e , c o o r d i n a t e t h i sc a l c i u m i n a n e a r l y o c t a h e d r a l m a n n e r ; G l y 1 5 5 0 , A s n 1 5 7 0 ,

F i g . 2 . S t r u c t u r e o f t h e c a t a l y t i c d o m a i n o f h u m a n n e u t r o p h i l c o l l a g e n a s e ( a ) d i s p l a y e d t o g e t h e r w i t h a C o n n o l l y d o t s u r f a c e [ u s i n g t h e p r o g r a mMAIN ( T u r k , 1 9 9 2 ) ] a n d ( b ) s h o w n a s a r i b b o n m o d e l [ u s i n g t h e p r o g r a m RIBBON ( P r i e s t l e , 1 9 8 8 ; m o d i f i e d b y A . K a r s h i k o f f ) ] . An u p p e r( N - t e r m i n a l ) a n d a l o w e r ( C - t e r m i n a l ) d o m a i n a r e s e p a r a t e d b y a m o d e r a t e l y d e e p a c t i v e - s i t e c l e f t , a c c o m m o d a t i n g t h e c a t a l y t i c z t n c i o n [ d i s p l a y e d a sa m a g e n t a - d o t t e d s p h e r e o f r a d i u s 1 A ( a ) o r a r e d s p h e r e ( b ) ] n e a r a v e r y d e e p S I ' p o c k e t ( t o t h e r i g h t o f t h e c a t a l y t i c z i n c ) . T h e u p p e r d o m a i nh a r b o u r s t h e s t r u c t u r a l z i n c i o n ( d i s p l a y e d i n t h e s a m e c o l o u r s ) a n d t w o c a l c i u m i o n s [ d i s p l a y e d a s y e l l o w d o t s p h e r e s ( a ) o r r e d s p h e r e s ( b ) ] .

1265


4/7

W.Bode e t a l .

F i g . 3 . A d e t a i l e d v i e w o f t h e a c t i v e s i t e c l e f t o f h u m a n P M N L - c o l l a g e n a s e . S h o w n a r e t h e e d g e s t r a n d ( 3 4 ) , t h e z i n c c o o r d i n a t i n g h i s t i d i n e r e s i d u e s( H i s I 9 7 , H i s 2 0 1 ) a n d t h e c a t a l y t i c a l l y i m p o r t a n t g l u t a m a t e r e s i d u e ( G l u 1 9 8 ) , w h i c h a r e p a r t o f t h e a c t i v e - s i t e h e l i x ( a B , b a c k g r o u n d ) , t h e t u r nf o l l o w i n g t h e a c t i v e - s i t e h e l i x c o n t a i n i n g t h e t h i r d z i n c l i g a n d ( H i s 2 O 7 , b o t t o m ) , t h e i n h i b i t o r P r o - L e u - G l y - N H O H ( o r a n g e ) , t h e c a t a l y t i c z i n c i o n( Z n 99 9, m a g en t a s p h e r e ) , o n e o f t h e c a l c i u m i o n s ( K a 9 9 7 , y e l l o w s p h e r e ) a n d a f e w l o c a l i z e d s o l v e n t m o l e c u l e s ( c r o s s e s ) t o g e t h e r w i t h a n o v e r l a y e dC o n n o l l y d o t s u r f a c e . T h e i n h i b i t o r p r o b a b l y m i m i c s t h e u n p r i m e d r e s i d u e s o f a p r o d u c t i v e l y b o u n d p e p t i d e s u b s t r a t e , l y i n g a n t i - p a r a l l e l t o t h e e d g es t r a n d , a n d f o r m i n g i n t e r - m a i n c h a i n h y d r o g e n b o n ds b et w ee n t h e P 2 r e s i d u e L e u I 2 a n d A l a l 6 3 . T h e P 3 r e s i d u e P r o I l s l o t s i n t o a s m a l l c l e f t m a i n l yf o r m e d b y t h e s i d e - c h a i n s o f H i s 1 6 2 a n d P he l6 4 . T h e i n h i b i t o r ' s h y d r o x a m a t e g r o u p i s s i t u a t e d w i t h i t s o x y g e n a n d n i t r o g e n c l o s e t o G l u I 9 8 ,f o r m i n g a h y d r o g e n b o n d t o A l a l 6 l , w h i l e t h e c a r b o n y l a n d t h e h y d r o x y l o x y g e n c o o r d i n a t e t h e z i n c i o n . A v e r y d e e p S 1 ' c l e f t i s v i s i b l e t o t h er i g h t o f t h e z i n c i o n , t o w h i c h a P 1 ' s i d e - c h a i n o f a p r o d u c t i v e l y b o u n d s u b s t r a t e w o u l d e x t e n d .

F i g . 4 . A d e t a i l e d v i e w o f t h e s u r f a c e S - s h a p e d d o u b l e l o o p b e t w e e n A r g l 4 5 a n d H i s 1 6 2 s h o w n w i t h t h e ' s t r u c t u r a l ' z i n c i o n ( Z n 9 9 8 , m a g e n t as p h e r e , t o p ) , a c a l c i u m i o n ( K a 9 9 7 , y e l l o w s p h e r e , r i g h t ) , t h e i n h i b i t o r ( o r a n g e ) a n d a f e w l o c a l i z e d s o l v e n t m o l e c u l e s ( c r o s s e s ) t o g e t h e r w i t h a no v e r l a i d C o n n o l l y d o t s u r f a c e . T h e z i n c i o n i s t e t r a h e d r a l c o o r d i n a t e d b y H i s I 4 7 , A s p l 4 9 , H i s 1 6 2 a n d H i s I 7 5 , w h i l e t h e c a l c i u m i o n i s o c t a h e d r a lc o o r d i n a t e d b y A s p l 5 4 , G l y l 5 5 , A s n l 5 7 , 1 1 e I 5 9 , A s p l 7 7 a n d G lu l 8 O . A l l t h e s e r e s i d u e s w i t h t h e e x c e p t i o n o f H i s 1 4 7 a r e s t r i c t l y c o n s e r v e dt h r o u g h o u t t h e h u m a n c o l l a g e n a s e f a m i l y .I l e 1 5 9 0 , a n d A s p l 7 7 0 6 2 , 2 . 3 , 2 . 2 , 2 . 3 a n d 2 . 2 A a w a y ,r e s p e c t i v e l y , o c c u p y t h e c o r n e r s o f a d i s t o r t e d s q u a r e , w h i l eA s p 1 5 4 0 6 2 ( 2 . 3 A ) a n d G l u 1 8 0 0 E 1 ( 2 . 2 A ) a r e t h e a x i a ll i g a n d s . A g a i n , t h i s l o o p s t r u c t u r e i s r a t h e r c o m p a c ts u g g e s t i n g t h a t t h i s c a l c i u m i o n h e l p s s t a b i l i z e t h e w h o l ed o m a i n , a l s o i n a g r e e m e n t w i t h r e s u l t s o b t a i n e d i n s o l u t i o n .A s e c o n d s i t e , c o r r e s p o n d i n g t o a 6 a p e a k i n a n F 0 - F ce l e c t r o n d e n s i t y o m i t m a p , i s v e r y p r o b a b l y o c c u p i e d b y ac a l c i u m ( K a 9 9 6 ; f o r c o m p a r i s o n K a 9 9 7 g i v e s a 1 0 a p e a ki n a s i m i l a r F o - F c o m i t e l e c t r o n d e n s i t y ) . I t i s f o u n d a tt h e e n d o f t h e g l y c i n e - r i c h o p e n l o o p P h e l 6 4 - G l y 1 7 2 , b e f o r et h e e n t r a n c e t o s h e e t s t r a n d ( 3 5 ( t o t h e l e f t , F i g u r e 2 b ) . K a 9 9 6i s o c t a h e d r a l l y c o o r d i n a t e d , w i t h t h e c a r b o n y l g r o u p s o fG l y 1 6 9 ( 2 . 2 A ) , G l y l 7 l ( 2 . 1 A ) , A s p l 3 7 ( 2 . 2 A , s t r a n d( 3 ) a n d a s o l v e n t m o l e c u l e i n e q u a t o r i a l p o s i t i o n ( 2 . 1 A ) ,

a n d t h e c a r b o x y l a t e g r o u p 0 , I o f t h e s t r i c t l y c o n s e r v e dA s p 1 7 3 ( 2 . 5 A ) a n d a n o t h e r s o l v e n t m o l e c u l e ( 2 . 4 A )p r o v i d i n g t h e a x i a l l i g a n d s .C o m p a r i s o n w i t h t h e s e q u e n c e s o f o t h e r MMPs( B i r k e d a l - H a n s e n e t a l . , 1 9 9 3 ) s h o w s t h a t t h e i r c a t a l y t i cd o m a i n s c a n b e m o d e l l e d o n o u r PMNL-CL m o d e l w i t hr e a s o n a b l e c o n f i d e n c e . A l l m e t a l b i n d i n g a n d c a t a l y t i cr e s i d u e s a n d m o s t i n t e r n a l r e s i d u e s a r e i d e n t i c a l o r a t l e a s th o m o l o g o u s ( s e e F i g u r e 1 ) ; s i d e - c h a i n s l i n i n g t h e ( p r i m e d )s u b s t r a t e b i n d i n g s i t e s e x h i b i t d i f f e r e n c e s t h a t p r o b a b l yc o n f e r i n d i v i d u a l s p e c i f i c i t i e s . T h e t w o g e l a t i n a s e s r e p r e s e n ts p e c i a l c a s e s , i n t h a t t h e y c o n t a i n a 1 8 2 r e s i d u e i n s e r t i o nb e t w e e n T h r i 8 3 a n d L e u l 9 l . T h i s i n s e r t i o n p r o b a b l y s i t sa d j a c e n t t o t h e a c t i v e - s i t e c l e f t ( t o t h e r i g h t , F i g u r e 2 ) , w i t hr e l a t i v e l y f e w i n t e r d o m a i n a l c o n t a c t s w i t h t h e c a t a l y t i c

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S t r u c t u r e o f t h e c a t a l y t i c d o m a i n o f h P M N L - c o l l a g e n a s ed o m a i n , a s o n l y f e w o f t h e PMNL-CL s u r f a c e r e s i d u e s i nt h i s r e g i o n d i f f e r d r a s t i c a l l y ( P r o 1 5 6 , A s n 1 5 7 i n t h e z i n c -c a l c i u m d o u b l e l o o p , A s n 1 8 8 a n d A s n 1 9 0 a t t h e e n t r a n c et o t h e a c t i v e - s i t e h e l i x ) .I n h i b i t o r b i n d i n gT h e P r o - L e u - G l y - N H O H , w h i c h p r o b a b l y m i m i c s t h eu n p r i m e d r e s i d u e s o f a p r o d u c t i v e l y b o u n d p e p t i d e s u b s t r a t e ,l i e s a n t i - p a r a l l e l t o t h e e d g e s t r a n d i n a s l i g h t l y t w i s t e dm a n n e r , f o r m i n g t w o i n t e r - m a i n c h a i n h y d r o g e n b o n d sb e t w e e n t h e i n h i b i t o r ' s P 2 r e s i d u e L e u l 2 a n d A l a l 6 3 ( F i g u r e3 ) . T h e N - t e r m i n a l p r o l i n e r e s i d u e s l o t s i n t o t h e h y d r o p h o b i cc l e f t p r o v i d e d b y t h e s i d e c h a i n s o f H i s 1 6 2 , P h e 1 6 4 a n dS e r l S l , w h i l e t h e l e u c i n e r e s i d u e n e s t l e s i n t o a s h a l l o wg r o o v e l i n e d b y H i s 2 O 1 , A l a 2 O 6 a n d H i s 2 O 7 , i n a g r e e m e n tw i t h e a r l i e r p r e d i c t i o n s ( O d a k e e t a l . , 1 9 9 1 ) . B o t h p r o l i n ea n d l e u c i n e a r e f r e q u e n t l y f o u n d i n t h e n e i g h b o u r h o o d o fc o l l a g e n a s e c l e a v a g e s i t e s o f c o l l a g e n s , c o n f e r r i n g b e n e f i c i a le f f e c t s t o s u b s t r a t e s a n d i n h i b i t o r s i f p o s i t i o n e d a t P 3 a n dP 2 ( M o o r e a n d S p i l b u r g , 1 9 8 6 ; N e t z e l - A r n e t t e t a l . , 1 9 9 1 ) .T h e p o s i t i o n o f t h e g l y c i n e r e s i d u e , w h i c h r e p r e s e n t s t h e P 1r e s i d u e i n a l l t y p e I , I I a n d I l l c o l l a g e n c l e a v a g e s i t e s ( f o rr e f e r e n c e s s e e W u e t a l . , 1 9 9 0 o r N e t z e l A r n e t t e t a l . , 1 9 9 1 ) ,m i g h t b e s l i g h t l y i n f l u e n c e d b y t h e z i n c l i g a n d i n g o f i t st e r m i n a t i n g h y d r o x a m a t e g r o u p . I n a t r a n s i e n t l y b o u n ds u b s t r a t e , t h e c a r b o n y l g r o u p o f t h e s c i s s i l e p e p t i d e b o n ds h o u l d b e d i r e c t e d t o w a r d s t h e ' c a t a l y t i c ' z i n c ( s i m i l a r t ot h e c a r b o n y l o f t h e h y d r o x a m a t e ) , w h i l s t t h e a m i d o g r o u ps h o u l d p o i n t t o w a r d s t h e A l a l 6 l c a r b o n y l ( a s w i t h t h en i t r o g e n o f t h e h y d r o x a m a t e ) , w i t h a w a t e r m o l e cu l e b o u n dt o G l u 1 9 8 a n d Z n 9 9 9 s q u e e z e d b e t w e e n , t o a t t a c k t h es u b s t r a t e c a r b o n y l g r o u p ( s e e H o l m e s a n d M a t t h e w s , 1 9 8 1 ) .P r e l i m i n a r y m o d e l b u i l d i n g s t u d i e s s h o w t h a t s u b s t r a t er e s i d u e s C - t e r m i n a l t o t h e s c i s s i l e p e p t i d e b o n d c o u l d i n t e r a c tw i t h t h e p r i m e d s u b s i t e s o f t h e e n z y m e i n a s i g h t l y b e n t b u te s s e n t i a l l y e x t e n d e d c o n f o r m a t i o n . A P 1 ' s i d e c h a i n w o u l de x t e n d i n t o t h e d e e p , m a i n l y h y d r o p h o b i c S 1 ' p o c k e t ( t o t h er i g h t o f t h e c a t a l y t i c z i n c i n F i g u r e 3 ) , w h i c h i s s p a c i o u se n o u g h t o a c c o m m o d a t e n o t o n l y P 1 ' i s o l e u c i n e a n d l e u c i n er e s i d u e s ( n o r m a l l y f o u n d i n c o l l a g e n s u b s t r a t e s ) , b u t a l s oa r o m a t i c s i d e - c h a i n s u p t o t h e s i z e o f i n d o l e m o i e t i e s , a so b s e r v e d e x p e r i m e n t a l l y ( N e t z e l - A r n e t t e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h eP 2 ' - P 3 ' r e s i d u e s o f a b o u n d s u b s t r a t e w o u l d h a v e t o p a s st h r o u g h a n o p e n i n g - 5 A w i d e f o r m e d b y t h e c r o s s i n g - o v e rp e p t i d e s e g m e n t s A s n l 5 7 - G l y 1 5 8 ( p a r t o f t h e c a l c i u m l o o p )a n d A s n 2 l 8 - T y r 2 l 9 ( f o r m i n g t h e e d g e o f t h e S 1 ' s i t e ) , w h i c hw o u l d p r o v i d e s e v e r a l a m i d e g r o u p s f o r e x t e n s i v e m a i nc h a i n - m a i n c h a i n i n t e r a c t i o n s ( s e e F i g u r e 3 ) . C h e m i c a lc o m p o u n d s m i m i c k i n g f r a g m e n t s o f s u ch a p r o d u c t i v e l yb o u n d p e p t i d e s u b s t r a t e a n d / o r f i l l i n g o u t t h e S i ' p o c k e tm i g h t r e p r e s e n t p o w e r f u l c o l l a g e n a s e i n h i b i t o r s a n d m a y b ed e s i g n e d i n a r a t i o n a l w a y o n t h e b a s i s o f t h e r e c e p t o rs t r u c t u r e p r e s e n t e d h e r e .I m p l i c a t i o n s f o r t r i p l e h e l i c a l c o l l a g e n b i n d i n gT h e s p e c i f i c ' t r i p l e h e l i c a s e ' a c t i v i t y o f F I B - a n d PMNL-CL r e q u i r e s t h e C - t e r m i n a l ( h e m o p e x i n - l i k e ) s t r u c t u r e s( H a s t y e t a l . , 1 9 8 7 ; M u r p h y e t a l . , 1 9 9 2 ; K n a u p e r e t a l . ,1 9 9 3 a ; S a n c h e z - L o p e z e t a l . , 1 9 9 3 ; S c h n i e r e r e t a l . , 1 9 9 3 ) .H o w e v e r , t h e c a t a l y t i c d o m a i n a l s o c o n t a i n s s o m e c o l l a g e n -r e c o g n i z i n g d e t e r m i n a n t s ( S a n c h e z - L o p e z e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e

r e p e t i t i v e P r o - X - G l y s e g m e n t o f o n e s t r a n d o f a r e g u l a rt r i p l e - h e l i c a l c o l l a g e n - l i k e s t r u c t u r e c o u l d p r o b a b l y n e s t l ea g a i n s t t h e n o n - p r i m e d c o l l a g e n a s e s u b s i t e s i n s u c h a m a n n e rt h a t t h e g l y c y l c a r b o n y l g r o u p w o u l d a p p r o a c h t h e c a t a l y t i cz i n c . I n t h i s c a s e , h o w e v e r , t h e P 1 ' ( p r o l i n e ) s i d e - c h a i nw o u l d n o t f i l l t h e S 1 ' p o c k e t a d e q u a t e l y , a n d t h e 1 5 Ad i a m e t e r c o l l a g e n t r i p l e h e l i x ( Y o n a t h a n d T r a u b , 1 9 6 9 ;F r a s e r e t a l . , 1 9 7 9 ) c o u l d n o t f i t t h r o u g h t h e o p e n i n g a tS 2 ' - S 3 ' . T h u s , t h e p r o p e r f i t o f t h e s c i s s i l e c h a i n t o t h ee n z y m e s u b s i t e s a l m o s t c e r t a i n l y r e q u i r e s a t l e a s t p a r t i a lu n f o l d i n g o f t h e c o l l a g e n t r i p l e h e l i x a r o u n d t h e c l e a v a g e s i t e .M u t a g e n e s i s e x p e r i m e n t s w i t h m u r i n e a 1 ( I ) c o l l a g e n a n de x p r e s s i o n o f m i x e d t r i p l e - h e l i c a l c o l l a g e n m o l e c u l e s s h o wt h a t t h e p r e s e n c e o f h y d r o p h o b i c P 1 ' r e s i d u e s ( s u c h a sl e u c i n e a n d i s o l e u c i n e ) a n d t h e a b s e n c e o f p r o l i n e r e s i d u e si n t h e p r i m e d p o s i t i o n s o f n a t i v e h e l i c a l t y p e I c o l l a g e n a r er e q u i r e d t o m a k e i t s u s c e p t i b l e t o i n t e r s t i t i a l c o l l a g e n a s e s( W u e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e n o n - c l e a v a b l e m u t a n t s d o n o t e x h i b i te n h a n c e d m e l t i n g t e m p e r a t u r e s , i n d i c a t i n g t h a t c l e a v a b i l i t yi s n o t a p r o p e r t y o f t h e i s o l a t e d t r i p l e h e l i x i t s e l f , b u t o f t h ec o l l a g e n - c o l l a g e n a s e c o m p l e x . O b v i o u s l y , t h e r e s i d u e sf l a n k i n g t h e c l e a v a g e s i t e o f t h e s c i s s i l e c o l l a g e n s t r a n d m u s tb e f r e e d f r o m t h e t r i p l e - h e l i c a l s t r u c t u r e b y e n e r g e t i c a l l yf a v o u r a b l e i n t e r a c t i o n s w i t h t h e c o l l a g e n a s e s u b s i t e s . I nc o l l a g e n c o m p l e x e s w i t h f u l l - l e n g t h c o l l a g e n a s e s , t h eh e m o p e x i n - l i k e d o m a i n m i g h t s a n d w i c h t h e b o u n d t r i p l eh e l i x t o t h e e n z y m e , s t r u c t u r a l l y a n d t e m p o r a l l y s t a b i l i z i n gt h e i n i t i a l e n c o u n t e r c o m p l e x t o r e s u l t i n a m o r e e f f i c i e n tc l e a v a g e . T h i s i s n o t a new p h e n o m e n o n i n p r o t e i n a s e s ;e . g . t h e a p p a r e n t l y r i g i d t r y p t i c c l e a v a g e s i t e o f c h y m o -t r y p s i n o g e n m u s t a d a p t c o n s i d e r a b l y t o t h e b i n d i n g s u b s i t e so f t r y p s i n i n o r d e r t o b e c l e a v e d ( W a n g e t a l . , 1 9 8 5 ) .C o m p a r i s o n w i t h o t h e r ' m e t z i n c i n s 'T h e ' u p p e r ' d o m a i n o f t h e c o l l a g e n a s e c a t a l y t i c d o m a i n , w i t hi t s f i v e - s t r a n d e d f l - s h e e t a n d t h e t w o l o n g h e l i c e s , i st o p o l o g i c a l l y s i m i l a r t o t h e c o r r e s p o n d i n g d o m a i n s f i r s to b s e r v e d i n c r a y f i s h a s t a c i n ( B o d e e t a l . , 1 9 9 2 ; G o m i s - R u t he t a l . , 1 9 9 3 a ) a n d now a l s o i n t h e s n a k e v e n o m m e t a l l o -p r o t e i n a s e a d a m a l y s i n I I ( G o m i s - R i i t h e t a l . , 1 9 9 3 ) a n d t h eP s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a l k a l i n e p r o t e a s e ( B a u m a n n e t a l . ,1 9 9 3 ) ; i t s s u b d o m a i n b e a r s a p a r t i c u l a r l y s t r o n g h o m o l o g yt o t h a t o b s e r v e d i n a d a m a l y s i n . M o r e o v e r , t h e a c t i v e - s i t ee n v i r o n m e n t s c o m p o s e d o f t h e ' a c t i v e - s i t e h e l i x ' , t h e f o l l o w -i n g s t r a n d a n d t h e M e t - t u r n e x h i b i t v i r t u a l l y i d e n t i c a lc o n f o r m a t i o n s . A s t r u c t u r a l c o m p a r i s o n ( u s i n g OVRLAP,R o s s m a n n a n d A r g o s , 1 9 7 5 ) r e v e a l s t h a t -116 a n d 1 1 3 o ft h e 1 5 7 o r d e r e d r e s i d u e s i n t h e c a t a l y t i c d o m a i n o f h u m a nPMNL-CL c a n b e c o n s i d e r e d a s t o p o l o g i c a l l y e q u i v a l e n t t oa s t a c i n a n d a d a m a l y s i n , r e s p e c t i v e l y , h a v i n g r . m . s . d e v i a -t i o n s o f 2 . 2 a n d 2 . 9 A f o r t h e i r a - c a r b o n a t o m s . Of t h e s ee q u i v a l e n t r e s i d u e s , h o w e v e r , o n l y 1 6 ( 1 5 ) a r e i d e n t i c a l , s i x( 1 0 ) o f w h i c h a r e l o c a t e d i n t h e z i n c b i n d i n g r e g i o n a l o n e .T h e s u b s t r a t e b i n d i n g s i t e h a s m u c h m o r e i n common w i t ha d a m a l y s i n , i n a g r e e m e n t w i t h t h e ' c o l l a g e n o l y t i c ' p r o p e r t i e so f t h i s m e t a l l o p r o t e i n a s e ; h o w e v e r , t h e o v e r a l l s c a f f o l d a n dt h e mode o f i n t e r a c t i o n o f t h e N - t e r m i n u s a r e morer e m i n i s c e n t o f a s t a c i n . T h u s , t h e c o l l a g e n a s e c a t a l y t i c d o m a i ne x h i b i t s m a n y c h a r a c t e r i s t i c s t r u c t u r a l e l e m e n t s i n c o m m o nw i t h t h e a s t a c i n s , t h e a d a m a l y s i n s a n d t h e s e r r a l y s i n s , w i t hw h i c h t h e y s h o u l d b e g r o u p e d i n t o a c o m m o n s u p e r f a m i l y ,t h e m e t z i n c i n s ( B o d e e t a l . , 1 9 9 3 ) .

1 2 6 7


6/7

W.Bode e t a l .

T a b l e I . S t a t i s t i c s o f d a t a c o l l e c t i o nD e r i v a t i v e N a t i v e a A p o b A p o + Z n b A p o + H g b( = n a t i v e )N o . o f m e a s u r e m e n t s 4 7 9 2 0 3 0 3 9 2 3 2 3 0 6 3 0 5 3 7N o . o f o b s e r v a t i o n s 4 5 4 3 9 2 9 3 3 6 3 0 1 5 4 2 8 6 2 5N o . o f u n i q u e r e f l e c t i o n s 9 7 4 0 5 6 5 2 5 9 3 5 5 5 1 5C o m p l e t e n e s s o f d a t a ( % )

o o - 2 . 0 3 Aa/o- 3 . 0 0 A b 8 6 . 3 9 4 . 8 9 3 . 7 9 3 . 92 . 0 7 - 2 . 0 3 A a , 3 . 0 5 3 . o o A b 5 7 . 8 8 8 . 8 9 0 . 0 8 8 . 8R M e r g e C 0 . 1 1 3 0 . 0 9 4 0 . 1 2 8 0 . 1 3 7R s y m d 0 . 0 5 0 0 . 0 4 6 0 . 0 6 0 0 . 0 5 0a H i g h r e s o l u t i o n n a t i v e d a t a s e t , c o l l e c t e d o n MAR i m a g e p l a t e s c a n n e r .b D e r i v a t i v e d a t a s e t s , c o l l e c t e d o n FAST t e l e v i s i o n a r e a d e t e c t o r ; A p o w a s p r e p a r e d b y s o a k i n g o f a n a t i v e c r y s t a l i n 2 0 mM o - p h e n a n t h r o l i n f o r1 d a y ; A p o + Hg w a s p r e p a r e d b y s o a k i n g o f a n a t i v e c r y s t a l i n 2 0 mM o - p h e n a n t h r o l i n f o r 1 d a y a n d s u b s e q u e n t t r a n s f e r t o 5 mM H g ( O O C C H 3 ) 2f o r 2 h ; A p o + Z n = n a t i v e w a s u s e d a s a ' d e r i v a t i v e ' i n t h e i n i t i a l s t a g e s w i t h A p o a s t h e ' n a t i v e ' i n o r d e r t o i m p r o v e p h a s i n g .c R M e r g e = E h E i [ I ( J h , l ) - < I ( h ) > I ] / h E i I ( h , A ) , w h e r e I ( h , i ) i s t h e i n t e n s i t y v a l u e o f t h e i - t h m e a s u r e m e n t o f h a n d < I ( h ) > i s t h e c o r r e s p o n d i n gm e a n v a l u e o f h f o r a l l i m e a s u r e m e n t s o f h : t h e s u m m a t i o n i s o v e r a l l m e a s u r e m e n t s .d R S y m = E ( | I F - < I F > | ) I E I F , w h e r e I F i s t h e a v e r a g e d v a l u e o f p o i n t g r o u p r e l a t e d r e f l e c t i o n s a n d i s t h e a v e r a g e d v a l u e o f a B i j v o e t p a i r .T a b l e I I . S t a t i s t i c s o f p h a s i n g

N o . o f O c c . a A t o m i c B i s o c P h a s i n g Mean f i g u r es i t e s c o o r d i n a t e s ( A ) ( A 2 ) p o w e r d o f m e r i t e( a ) A p o a s n a t i v e

A p o + Hg 1 5 9 . 7 6 2 3 . 3 , 1 2 . 1 , 1 8 . 5 1 9 . 7 1 . 9 3 0 . 7 0A p o + Z n 1 3 7 . 3 3 2 3 . 4 , 1 2 . 1 , 1 8 . 6 1 6 . 0 1 . 1 8( b ) A p o + Zn a s n a t i v eA p o + Hg 1 3 6 . 8 7 2 2 . 7 , 1 1 . 8 , 1 8 . 7 1 4 . 6 1 . 4 8 0 . 5 9A p o 1 - 3 0 . 8 7 2 4 . 3 , 1 2 . 5 , 1 7 . 4 1 5 . 8 0 . 9 0

a S i t e o c c u p a n c y f a c t o r i n r e l a t i v e u n i t s o n n a t i v e s c a l e ; s c a l e f a c t o r s d e r i v e d b y W i l s o n p l o t ( W i l s o n , 1 9 4 2 ) : k = 1 0 . 1 9 5 f o r A p o a n d k = 1 1 . 4 5 0f o r A p o + Z n = n a t i v e , r e s p e c t i v e l y .b R e a l c o o r d i n a t e s X , Y , Z .c I s o t r o p i c t e m p e r a t u r e f a c t o r s .d F H / r e s i d u a l : r . m . s . m e a n h e a v y a t o m c o n t r i b u t i o n / r . m . s . r e s i d u a l , d e f i n e d a s [ ( F p H c - F P H ) 2 1 n ] " 2 w i t h t h e sum o v e r a l l r e f l e c t i o n s , w h e r e F P H C i st h e c a l c u l a t e d s t r u c t u r e f a c t o r o f t h e h e a v y a t o m d e r i v a t i v e a n d F P H i s t h e s t r u c t u r e f a c t o r a m p l i t u d e o f t h e h e a v y atom d e r i v a t i v e .e 2 5 . 0 - 3 . 0 A r e s o l u t i o n .M a t e r i a l s a n d m e t h o d sP u r i f i c a t i o n and c r y s t a l l i z a t i o n o f M e t 8 O - G l y 2 4 2 c a t a l y t i cd o m a i n o f h u m a n PMNL-CLT h e M e t 8 O - G l y 2 4 2 c a t a l y t i c d o m a i n o f human PMNL-CL w a s e x p r e s s e di n E . c o l i a n d p u r i f i e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( S c h n i e r e r et a l . , 1 9 9 3 ) . B r i e f l y ,t h e r e c o m b i n a n t enzyme w a s r e n a t u r e d b y d i a l y s i n g t h e i n c l u s i o n b o d i e s ,s o l u b i l i z e d i n 6 M u r e a , 1 0 0 mM ( 3 - m e r c a p t o e t h a n o l , a g a i n s t a b u f f e rc o n t a i n i n g 1 0 0 mM N a C l , 5 mM C a C l 2 , 0 . 5 mM Z n C 1 2 a n d 2 0 mMT r i s - H C l , pH 7 . 5 . T h e r e n a t u r e d enzyme wa s s u b s e q u e n t l y p u r i f i e d t oa p p a r e n t h o m o g e n e i t y a s j u d g e d b y S D S - P A G E b y h y d r o x a m a t e a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y . C r y s t a l l i z a t i o n s were p e r f o r m e d a t 2 2 C . H a n g i n g d r o p l e t swere m a d e b y m i x i n g 1 . 5 A l p r o t e i n s o l u t i o n ( - 1 2 m g / m i p r o t e i n i n 5 mMC a C l 2 , 1 0 0 mM N a C l , 3 mM MES-NaOH, 0 . 0 2 % N a N 3 , pH 6 . 0 ) , 2 F li n h i b i t o r s o l u t i o n ( 5 0 mM P r o - L e u - G l y - N H O H ( M o o r e a n d S p i l b u r g , 1 9 8 6 )i n 0 . 2 M MES-NaOH, 0 . 0 2 % N a N 3 , pH 6 . 0 ) a n d 6 F l P EG s o l u t i o n[ 1 0 % ( m / v ) P EG 6 0 0 0 , 0 . 2 M MES-NaOH, 0 . 0 2 % N a N 3 , pH 6 . 0 ] .PMNL-CL c a t a l y t i c d o m a i n was c r y s t a l l i z e d b y vapour d i f f u s i o n a g a i n s t1 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r , 0 . 0 2 % N a N 3 , pH 6 . 0 . S m a l l c r y s t a l s o f- 0 . 5 x 0 . 0 6 x 0 . 0 3 mmwere o b t a i n e d w i t h i n 3 d a y s . T h e y were h a r v e s t e di n 20 % ( m / v ) P EG 6 0 0 0 , 5 0 0 mM N a C l , 1 0 0 mM C a C l 2 , 0 . 2 MMES-NaOH, 0 . 0 2 % N a N 3 , pH 6 . 0 . T h e c r y s t a l s d i f f r a c t t o a t l e a s t 2 . 0A r e s o l u t i o n , a r e o r t ho r ho m bi c a n d b e l o n g t o space group P 2 1 2 1 2 1 w i t hl a t t i c e c o n s t a n t s a =3 3 . 0 9 , b =6 9 . 3 7 , c =7 2 . 4 8 A , a = ye =9 0 , w i t h t h e a s y m m e t r i c u n i t c o n t a i n i n g a m o n o m e r .S t r u c t u r e a n a l y s i sA l o w r e s o l u t i o n n a t i v e d a t a s e t a n d d e r i v a t i v e d a t a s e t s w e r e c o l l e c t e d ona c o m p u t e r - c o n t r o l l e d CAD-4 d i f f r a c t o m e t e r e q u i p p e d w i t h a FAST areat e l e v i s i o n d e t e c t o r ( E n r a f - N o n i u s , D e l f t ) m o u n t e d o n a R i g a k u r o t a t i n g a n o d eg e n e r a t o r o p e r a t e d a t 5 . 4 kW ( A =C U K a , =1 . 5 4 1 8 A ) . X - r a y i n t e n s i t i e s

T a b l e I I I . C u r r e n t r e f i n e m e n t p a r a m e t e r sR e s o l u t i o n r a n g e 8 . 0 - 2 . 0 3N o . o f u n i q u e r e f l e c t i o n s 9 6 0 0P r o t e i n a t o m s ( e x c l u d i n g H ) 1 2 6 6S o l v e n t a t o m s ( e x c l u d i n g H ) 1 1 1R - f a c t o r a 0 . 1 8 2R . m . s . d e v i a t i o n s f r o m t a r g e t v a l u e s

b o n d s ( A ) 0 . 0 1 2a n g l e s ( 0 ) 1 . 8a R = ( E I F 0 - F c j ) I F 0 .w e r e e v a l u a t e d w i t h t h e MADNES s y s t e m ( M e s s e r s c h m i d t a n d P f l u g r a t h ,1 9 8 7 ) a n d s c a l e d , c o r r e c t e d f o r a b s o r p t i o n e f f e c t s a n d a v e r a g e d( M e s s e r s c h m i d t e t a l . , 1 9 9 0 ) .X - r a y m e a s u r e m e n t s f o r t h e h i g h r e s o l u t i o n n a t i v e d a t a s e t w e r e d o n eo n a MAR i m a g e p l a t e a r e a d e t e c t o r (MAR R e s e a r c h , H a m b u r g ) a l s om o u n t e d o n a R i g a k u r o t a t i n g a n o d e X - r a y g e n e r a t o r o p e r a t e d a t 5 . 4 k W .X - r a y i n t e n s i t i e s w e r e e v a l u a t e d w i t h t h e MOSFLM p r o g r a m p a c k a g e( L e s l i e , 1 9 9 1 ) . A l l X - r a y d a t a w e r e l o a d e d t o t h e PROTEIN p r o g r a mp a c k a g e ( S t e i g e m a n n , 1 9 9 1 ) ; d a t a c o l l e c t i o n s t a t i s t i c s a r e g i v e n i n T a b l e I .H e a v y a t o m d e r i v a t i v e s w e r e p r e p a r e d b y s o a k i n g u n d e r t h e c o n d i t i o n sg i v e n i n T a b l e I a n d w e r e a n a l y s e d b y d i f f e r e n c e P a t t e r s o n m e t h o d s u s i n gP R O T E I N . H e a v y a t o m s i t e s ( s e e T a b l e I I ) a n d t h e p h a s e s w e r e r e f i n e du s i n g MIRPH ( J . R e m i n g t o n ) a s i m p l e m e n t e d i n P R O T E I N . A f i r s t 3 AMIR F o u r i e r m a p c a l c u l a t e d f o r t h e n a t i v e e n z y m e ( i . e . b a s e d o n p h a s es e t b i n T a b l e I I ) w a s v e r y n o i s y b u t s ho w ed s o m e s e c o n d a r y s t r u c t u r ee l e m e n t s . A s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d e l e c t r o n d e n s i t y map w a s o b t a i n e d b yt r e a t i n g t h e z i n c - a p o e n z y m e ( ' A p o ' i n T a b l e I ) a s t h e n a t i v e a n d t h e

1 2 6 8


7/7

S t r u c t u r e o f t h e c a t a l y t i c d o m a i n o f h P M N L - c o l l a g e n a s ez i n c - h o l o e n z y m e ( ' A p o + Z n ' i n T a b l e I , t h e r e a l n a t i v e e n z y m e ) a s a' h e a v y - a t o m ' d e r i v a t i v e ( i . e . a F o u r i e r c a l c u l a t e d f o r t h e a p o e n z y m e b a s e do n a p h a s e s e t a i n T a b l e I I ) . An a p o c a t a l y t i c d o m a i n s t a r t i n g m o d e l o fh u m a n PMNL-CL ( i . e . l a c k i n g t h e ' c a t a l y t i c ' z i n c i o n Z n 9 9 9 ) w a s b u i l tu s i n g t h e i n t e r a c t i v e g r a p h i c s p r o g r a m FRODO ( J o n e s , 1 9 7 8 ) i m p l e m e n t e do n a n E S V - 3 0 g r a p h i c s w o r k s t a t i o n ( E v a n s a n d S u t h e r l a n d ) . T h e m o d e lw a s s u b s e q u e n t l y c o m p l e t e d a n d r e f i n e d i n 1 0 r o u n d s u s i n g X-PLOR( B r u n g e r e t a l . , 1 9 8 9 ) . A f t e r e a c h r o u n d a p h a s e - c o m b i n e d F o u r i e r mapw a s c a l c u l a t e d u s i n g p h a s e s e t a ( i n T a b l e I I ) a n d ' A p o ' ( i n T a b l e I ) a sn a t i v e c o m p o u n d ( u p t o r o u n d 5 ) o r u s i n g p h a s e s e t b ( i n T a b l e I I ) a n d' A p o + Z n ' ( i n T a b l e I ) a s t h e n a t i v e c o m p o u n d , r e s p e c t i v e l y . S t a r t i n gw i t h r o u n d 9 t h e h i g h r e s o l u t i o n n a t i v e d a t a s e t w a s u s e d t o g e t h e r w i t h p u r em o d e l p h a s e s . T h e c u r r e n t m o d e l , o n w h i c h i n t e r p r e t a t i o n i s b a s e d , h a sa c r y s t a l l o g r a p h i c R - f a c t o r o f 1 8 . 2 % i n c l u d i n g a l l d a t a ( a p p l y i n g n os y s t e m a t i c a - c u t - o f f ) f r o m 8 . 0 t o 2 . 0 3 A r e s o l u t i o n a n d c o m p r i s e s r e s i d u e s8 6 - 2 4 2 a n d I l l o r d e r e d s o l v e n t m o l e c u l e s ; t h e c u r r e n t r e f i n e m e n tp a r a m e t e r s a r e g i v e n T a b l e I I I . A f t e r c o m p l e t i o n o f r e f i n e m e n t t h ec o o r d i n a t e s w i l l b e s u b m i t t e d t o t h e P DB d a t a b a s e .

A c k n o w l e d g e m e n t sW e t h a n k P . W i d a w k a a n d I . M a y r - K r o n e r f o r e x c e l l e n t h e l p i n c l o n i n g h u m a nPMNL-CL c a t a l y t i c d o m a i n cDNA a n d c r y s t a l l i z a t i o n , r e s p e c t i v e l y . W ea r e g r a t e f u l t o D r M . T . S t u b b s a n d D r F . - X . G o m i s - R u t h f o r h e l p f u ld i s c u s s i o n s . T h e f i n a n c i a l s u p p o r t o f t h e S F B 2 0 7 o f t h e U n i v e r s i t a t M i i n c h e na n d o f t h e F o n d s d e r C h e m i s c h e n I n d u s t r i e t o W . B . , o f t h e BAYER AG( P F - F / B i o t e c h n o l o g y , M o n h e i m , G e r m a n y ) t o P . R . a n d o f t h e SFB 2 2 3o f t h e U n i v e r s i t a t B i e l e f e l d a n d o f t h e F o n d s d e r C h e m i s c h e n I n d u s t r i e t oH . T . i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d .

R e f e r e n c e sB a u m a n n , U . , W u , S . , F l a h e r t y , K . M . a n d M a c K a y , D . B . ( 1 9 9 3 ) EMBO J . ,1 2 , 3 3 5 7 - 3 3 6 4 .B i r k e d a l - H a n s e n , H . , M o o r e , W . G . I . , B o d d e n , M . K . , W i n d s o r , L . J . , B i r k e d a l -

H a n s e n , B . , D e C a r l o , A . a n d E n g l e r , J . A . ( 1 9 9 3 ) C n i t . R e v . O r a l B i o l .M e d . , 4 , 1 9 7 - 2 5 0 .B l a s e r , J . , K n a u p e r , V . , O s t h u e s , A . , R e i n k e , H . a n d T s c h e s c h e , H . ( 1 9 9 1 )E u r . J . B i o c h e m . , 2 0 2 , 1 2 2 3 - 1 2 3 0 .B o d e , W . , G o m i s - R u t h , F . - X . , H u b e r , R . , Z w i l l i n g , R . a n d S t o c k e r , W . ( 1 9 9 2 )N a t u r e , 3 5 8 , 1 6 4 - 1 6 7 .B o d e , W . , G o m i s - R u t h , F . - X . a n d S t o c k e r , W . ( 1 9 9 3 ) FEBS L e t t . , 3 3 1 ,1 3 4 - 1 4 0 .B r i i n g e r , A . T . , K a r p l u s , M . a n d P e t s k o , G . A . ( 1 9 8 9 ) A c t a C r y s t a l l o g r . S e c t .

A , 4 5 , 5 0 - 6 1 .F r a s e r , R . D . B . , M a c R a e , T . P . a n d S u z u k i , E . ( 1 9 7 9 ) J . M o l . B i o l . , 1 2 9 ,4 6 3 - 4 8 1 .G o m i s - R u t h , F . - X . , S t o c k e r , W . , H u b e r , R . , Z w i l l i n g , R . a n d B o d e , W .( 1 9 9 3 a ) J . M o l . B i o l . , 2 2 9 , 9 4 5 - 9 6 8 .G o m i s - R u t h , F . - X . , K r e s s , L . F . a n d B o d e , W . ( 1 9 9 3 b ) EMBO J . , 1 2 ,4 1 5 1 - 4 1 5 7 .G r a n t , G . A . , E i s e n , A . Z . , M a r m e r , B . L . , R o s w i t , W . T . a n d G o l d b e r g , G . I .( 1 9 8 7 ) J . B i o l . C h e m . , 2 6 2 , 5 8 8 6 - 5 8 8 9 .H a s t y , K . A . , H i b b s , M . S . , K a n g , A . H . a n d M a i n a r d i , C . L . ( 1 9 8 6 ) J . B i o l .C h e m . , 2 6 1 , 5 6 4 5 - 5 6 5 0 .H a s t y , K . A . , J e f f r e y , J . J . , H i b b s , M . S . a n d W e l g u s , H . G . ( 1 9 8 7 ) J . B i o l .C h e m . , 2 6 2 , 1 0 0 4 8 - 1 0 0 5 2 .H a s t y , K . A . , P o u r m o t a b b e d , T . F . , G o l d b e r g , G . I . , T h o m p s o n , J . P . ,S p i n e l l a , D . G . , S t e v e n s , R . M . a n d M a i n a r d i , C . L . ( 1 9 9 0 ) J . B i o l . C h e m . ,2 6 5 , 1 1 4 2 1 - 1 1 4 2 4 .H i r o s e , T . , P a t t e r s o n , C . , P o u r r m o t a b b e d , T . , M a i n a r d i , C . L . a n d H a s t y , K . A .( 1 9 9 3 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A , 9 0 , 2 5 6 9 - 2 5 7 3 .H o l m e s , M . A . a n d M a t t h e w s , B . W . ( 1 9 8 1 ) B i o c h e m i s t r y , 2 0 , 6 9 1 2 - 6 9 2 0 .J o n e s , T . A . ( 1 9 7 8 ) J . A p p l . C r y s t a l l o g r . , 1 5 , 2 3 - 3 1 .K a b s c h , W . a n d S a n d e r , C . ( 1 9 8 3 ) B i o p o l y m e r s , 2 2 , 2 5 7 7 - 2 6 3 7 .K n a u p e r , V . , K r a m e r , S . , R e i n k e , H . a n d T sc he sc he ,H . ( 1 9 9 0 ) E u r . J .B i o c h e m . , 1 8 9 , 2 9 5 - 3 0 0 .K n a u p e r , V . , O s t h u e s , A . , D e C l e r k , Y . A . , L a n g l e y , K . A . , B l f s e r , J . a n d

T s c h e s c h e , H . ( 1 9 9 3 a ) B i o c h e m . J . , 2 9 1 , 8 4 7 - 8 5 4 .K n a u p e r , V . , W i l h e l m , S . M . , S e p e r a c k , P . K . , D e C l e r v k , Y . A . , L a n g l e y , K . E . ,O s t h u e s , A . a n d T s c h e s c h e , H . ( 1 9 9 3 b ) B i o c h e m . J . , 2 9 5 , 5 8 1 - 5 8 6 .

L e s l i e , A . G . W . ( 1 9 9 1 ) D a r e s b u r y L a b . I n f Q . P r o g . C r y s t a l l o g r . , 2 6( a v a i l a b l e f r o m t h e L i b r a r i a n , SERC L a b o r a t o r y , D a r e s b u r y , W a r r i n g t o n ,WA4 4 A D , U K ) .M a l l y a , S . K . , M o o k h t i a r , K . A . , G a o , Y . , B r e w , K . , D i o s z e g i , M . , B i r k e d a h l -

H a n s e n , H . a n d v a n W a r t , H . E . ( 1 9 9 0 ) B i o c h e m i s t r y , 2 9 , 1 0 6 2 8 - 1 0 6 3 4 .M a t r i s i a n , L . M . ( 1 9 9 2 ) B i o E s s a y s , 1 4 , 4 5 5 - 4 6 3 .M e ss e r sc h mi dt , A . a n d P f l u g r a t h , J . W . ( 1 9 8 7 ) J . A p p l . C r y s t a l l o g r . , 2 0 ,

3 0 6 - 3 1 5 .M e s s er s c h mi d t , A. , S c h n ei d er , M . a n d H u b e r , R . ( 1 9 9 0 ) J . A p p l . C r y s t a l l o g r . ,2 3 , 4 3 6 - 4 3 9 .M o o r e , W . M . a n d S p i l b u r g , C . A . ( 1 9 8 6 ) B i o c h e m i s t r y , 2 5 , 5 1 8 9 - 5 1 9 5 .M u r p h y , G . a n d D o c h e r t y , A . J . P . ( 1 9 9 2 ) A m . J . R e s p . C e l l M o l . B i o l . , 7 ,

1 2 0 - 1 2 5 .M u r p h y , G . , R e y n o l d s , J . J . , B r e t z , U . a n d B a g g i o l i n i , M . ( 1 9 7 7 ) B i o c h e m .

J . , 1 6 2 , 1 9 5 - 1 9 7 .M u r p h y , G . , A l l a n , J . A . , W i l l e n b r o c k , F . , C o c k e t t , M . I . , O ' C on n el , J. P . a n dD o c h e r t y , A . J . P . ( 1 9 9 2 ) J . B i o l . C h e m . , 2 6 7 , 9 6 1 2 - 9 6 1 8 .

N a g a s e , H . , E n g h i l d , J . J . , S u z u k i , K . a n d S a l v e s o n , G . ( 1 9 9 0 ) B i o c h e m i s t r y ,2 9 , 5 7 8 3 - 5 7 8 9 .N e t z e l - A r n e t t , S . , F i e l d s , G . B . , B i r k e d a h l - H a n s e n , H . a n d v a n W a r t , H . E .( 1 9 9 1 ) J . B i o l . C h e m . , 2 6 6 , 6 7 4 7 - 6 7 5 5 .O d a k e , S . , O k a y a m a , T . , O b a t a , M . , M o r i k a w a , T . , H a t t o r i , S . , H o r i , H . a n d

N a g a i , Y . ( 1 9 9 1 ) C h e m . P h a n n . B u l l . , 3 9 , 1 4 8 9 - 1 4 9 4 .P r i e s t l e , J . P . ( 1 9 8 8 ) J . A p p l . C r y s t a l l o g r . , 2 1 , 5 7 2 - 5 7 6 .R e i n e m e r , P . , G r a m s , F . , H u b e r , R . , K l e i n e , T . , S c h n i e r e r , S . , P i p e r , M . ,

T sc he sc he ,H . a n d B o d e , W . ( 1 9 9 3 ) FEBS L e t t . , 3 3 8 , 2 2 7 - 2 3 3 .R o s s m a n n , M . G . a n d A r g o s , P . ( 1 9 7 5 ) J . B i o l . C h e m . , 2 5 0 , 7 5 2 5 - 7 5 3 2 .S a l o w e, S. P . , M a r c y , A . I . , C u c a , G . C . , S m i t h , C . K . , K o p k a , I . E . ,H a g m a n n , W . K . a n d H e rm es , J . D . ( 1 9 9 3 ) B i o c h e m i s t r y , 3 1 , 4 5 3 5 - 4 5 5 0 .S a n c h e z - L o p e z , R . , A l e x a n d e r , C . M . , B e hr e n dt s en , O . , B r e a t ha n c h ,R . a n dW e r b , Z . ( 1 9 9 3 ) J . B i o l . C h e m . , 2 6 8 , 7 2 3 8 - 7 2 4 7 .S c h n i e r e r , S . , K l e i n e , T . , G o t e , T . , H i l l e m a n n , A . , K n a u p e r , V . a n d

T s c h e s c h e , H . ( 1 9 9 3 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 1 9 1 , 3 1 9 - 3 2 6 .S c h e c h t e r , I . a n d B e r g e r , A . ( 1 9 6 7 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 2 7 ,1 5 7 - 1 6 2 .

S t e i g e m a n n , W . ( 1 9 9 1 ) I n M o r a s , D . , P o d j a m y , A . D . a n d T h i e r r y , J . C . ( e d s ) ,F r o m C h e m i s t r y t o B i o l o g y . V o l . 5 , C r y s t a l l o g r a p h i c C o m p u t i n g , O x f o r dU n i v e r s i t y P r e s s , O x f o r d , U K , p p . 1 1 5 - 1 2 5 .S p r i n g m a n , E . B . , A n g l e t o n , E . L . , B i r k ed a h l- H a n s en , H . a n d v a n W a r t , H . E .( 1 9 9 0 ) P r o c . N a t i A c a d . S c i . U S A , 8 7 , 3 6 4 - 3 6 8 .S u z u k i , K . , E n g f i e l d , J . J . , M o r o d o m i , T . , S a l v e s o n , G . a n d N a g a s e , H . ( 1 9 9 0 )B i o c h e m i s t r y , 2 9 , 1 0 2 6 1 - 1 0 2 7 0 .T u r k , D . ( 1 9 9 2 ) P h . D . T h e s i s , T e c h n i s c h e U n i v e r s i t a t M u n c h e n .W a n g , D . , B o d e , W . a n d H u b e r ,R . ( 1 9 8 5 ) J . M o l . B i o l . , 1 8 5 , 5 9 5 - 6 2 4 .W i l s o n , A . J . C . ( 1 9 4 2 ) N a t u r e , 1 5 0 , 1 5 1 - 1 5 2 .W o e s n e r , J . F . ( 1 9 9 1 ) FASEB J . , 5 , 2 1 4 5 - 2 1 5 4 .W u , H . , B y r n e , M . H . , S t a c e y , A . , G o l d r i n g , M . B . , B i r k h e a d , J . R . , J a e n i s c h , R .a n d K r a n e , S . M . ( 1 9 9 0 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A , 8 7 , 5 8 8 8 - 5 8 9 2 .Y o n a t h , A . a n d T r a u b , W . ( 1 9 6 9 ) J . M o l . B i o l . , 4 3 , 4 6 1 - 4 7 7 .R e c e i v e d o n D e c e m b e r 8 , 1 9 9 3 ; r e v i s e d o n D e c e m b e r 2 7 , 1 9 9 3

1 2 6 9

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