“Preparación de estándares de Diurón y 2,4-D, para el desarrollo de métodos para el análisis de residuos de plaguicidas en la región del Ingenio de Mahuixtlan, Veracruz, México”

Pérez Vásquez Magda Olivia1, López Cruz María del Refugio1, Ramírez Aguilera Juana1, Mendoza López Ma Remédios2, Yerena

Aguilar Clara Elena1, Hernández Baizabal Roberto1, Morales Arteaga Thalia Guadalupe1. 1Fac. de Química Farmacéutica Biológica. 2Unidad de Apoyo en Resolución Analítica Universidad Veracruzana, Xalapa,Ver.

RESUMEN DE INFORME TÉCNICO Introducción: Los plaguicidas son de las familias de productos químicos mas ampliamente empleados por el hombre. Se han usado sobre todo para combatir plagas por su acción sobre las cosechas o vectores de enfermedades trasmisibles. Los plaguicidas pueden clasificarse en función de su empleo (insecticidas, fungicidas, herbicidas, raticidas...) (Ferrer A., 2003). Los herbicidas procedentes de los tratamientos fitosanitarios pueden contaminar el suelo como consecuencia de su forma de aplicación. Las características fisicoquímicas de las materias activas de las formulaciones de los herbicidas, las propiedades de los suelos a los que se aplican y otros factores como el régimen de lluvias, la topología y los vientos dominantes de la zona, condicionan la posible migración de los mismos al medio acuático (Fraile P. et al., 2009). En la región del Ingenio de Mahuixtlan, Veracruz, México se han empleado diversos herbicidas, entre los más usados se encuentra el diurón, el 2,4-D, el glifosato, la ametrina y el paracuat, entre otros. De ellos, al diurón, la agencia de protección Ambiental de Estados Unidos (EPA) lo clasifica como un carcinógeno conocido/probable. Es persistente y contamina las aguas marinas, las aguas subterráneas, los sedimentos y el suelo. En 2005 se inició la revisión de su uso en Europa. El 2,4-D pertenece al grupo de herbicidas clorofenoxi, que ha sido clasificado en el grupo 2B por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer. El grupo 2B incluye sustancias posiblemente carcinogénicas para humanos (Tsipi D. et al., 1998). Los herbicidas fenoxiacéticos son de gran uso y son relativamente tóxicos. La toxicidad parece variar según la especie. Por ejemplo, el valor de DL50 en rata para el 2,4-D es de 639-764 mg/kg, mientras que la LD50 para ratón es de 138 mg/kg. Los perros parecen ser particularmente sensibles al envenenamiento con 2,4-D con la DL50 más baja reportada alrededor de 100 mg/Kg. Los datos de residuos o toxicidad de estos compuestos en animales silvestres son escasos o inexistentes (Charlton A. et al., 2009). El 2,4-D puede permanecer en el ambiente de 1 a 6 meses (Chaikovskaya O. et al., 2009). De ahí, que la Unión Local de Productores de Caña de Azúcar de la zona de abastecimiento del Ingenio de Mahuixtlán, habiendo conocido el uso y manejo de plaguicidas en la región, debido a un proyecto anterior con la Facultad de Q.F.B. ahora este interesada en conocer la posible contaminación de agua y suelo de la región. Lo que supone el desarrollo de métodos analíticos aplicables a dichas muestras, que puedan ser

llevados a cabo con los recursos disponibles. Por lo que, el objetivo del presente trabajo fue llevar cabo la preparación de estándares de Diurón y 2,4-D, a partir de sus formulaciones agroquímicas, para desarrollar métodos de análisis de dichos herbicidas en muestras de la región del Ingenio. Metodología: Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

Para la extracción de 2,4-D se empleó la formulación comercial FITOAMINA 40. La extracción se realizó con la siguiente técnica:

1. Medir 5 ml de la formulación líquida con el 2,4-D y colocarlos en un tubo de ensaye de 13 x 100 cm.

2. Adicionar 0.5 ml aproximadamente de KOH al 5%. 3. Dejar reposar hasta que se observe la formación de cristales. 4. Esperar hasta que los cristales se depositen en el fondo del tubo de ensaye. 5. Retirar con pipeta Pasteur el sobrenadante. 6. Hacer lavados con diclorometano (DCM) hasta quitar el color. 7. Dejar secar. 8. Guardar los cristales blancos en un recipiente de vidrio con tapa. 9. Disolver los cristales en agua destilada y acidificar con ácido clorhídrico

concentrado (con la finalidad de quitar la sal de dietilamina) 10. Poner en baño maría por una hora. 11. Adicionar unas gotas de metanol para la formación de los cristales puros.

Después de haber realizado la extracción del 2,4-D, se procedió a su análisis por Cromatografía en Capa Delgada (CCD). La CCD se realizó en una placa de sílica gel con medidas de 2 cm de ancho por 4.5 cm de largo, utilizando para correr la placa un sistema diclorometano:acetona (1:1). Posteriormente se reveló con la solución de ácido cromotrópico en ácido sulfúrico concentrado, después se aplicó calor mediante una parrilla (no se permitió que tocara la parrilla por lo que solo se sujetó con unas pinzas). La mancha reveló púrpura en fondo blanco. El punto de fusión se determinó con el aparato Fisher-Jhons, donde se utilizó un cubreobjetos para colocar algunos cristales de 2,4-D y esperar a que fundieran y anotar las temperaturas entre las que fundió. Para el análisis por espectroscopía uv-vis se disolvieron cristales del 2,4-D en etanol y se leyeron usando etanol como blanco. Las condiciones instrumentales utilizadas fueron: Longitudes de onda de 200-400 nm región Uv-vis con lámparas de deuterio y Tugsteno. Para el análisis del 2,4-D por espectroscopía infrarroja se utilizó el equipo PERKIN ELMER SPECTRUM 100 FT-IR con ATR (Reflectancia Total Atenuada) de diamante. Se montó la muestra en una placa y se hizo presión con el accesorio del ATR. Las condiciones instrumentales utilizadas fueron: Detector: con una región de 4000-400cm-1, una presión de 56 y un número de barridos de 4. Los cristales de 2,4-D se solubilizaron en acetonitrilo grado HPLC, para que posteriormente fueran inyectados en el HPLC con las siguientes condiciones instrumentales: columna C18 250 x 4.6 mm I.D., 5 µm. Marca BuckScientific. Fase móvil: acetonitrilo. Flujo: 1 ml/min. Inyección: 20 µL. Temperatura: 25 °C. Detector: UV a 283 nm.

Para el análisis del 2,4-D por cromatografía de gases acoplada a espectrometría

de masas las condiciones utilizadas fueron: Inyector a 180°C, horno 180°C (3 min) hasta 250°C (5 min) a razón de 10°C/min interfase GC-MSD 280°C, Fuente de ionización 230°C, Filtro de cuadrupolo 150°C. Columna DB-5MS. Carrier Helio a 1 mL/min, Vol. de inyección de 1uL.

Diurón .

Para la extracción de Diurón se utilizaron 5 gramos del polvo de la presentación comercial UNIURON, la cual contiene no menos del 80% de Diurón. La extracción se realizó mediante la siguiente técnica:

1. Pesar 5 gramos del polvo y colocarlos sobre un tubo de ensaye. 2. Adicionar al tubo de ensaye 10mL de acetona. 3. Tapar el tubo con papel parafilm y mezclar por inversión 3 veces. 4. Retirar el papel parafilm y centrifugar el tubo por 5 minutos a 3500rpm. 5. Pasar el sobrenadante (acetona) a un frasco de boca ancha o a un vaso de

precipitados de 100mL y dejar evaporar a temperatura ambiente.

El procedimiento para la purificación del extracto de Diurón (cristales) está basado en la recristalización, la cual consistió en:

1. Disolver en un vaso de precipitados de 100mL una parte del extracto (cristales) de Diurón en 10mL de acetona.

2. Una vez que los cristales estén completamente disueltos, agregar 10mL de agua destilada.

3. Dejar reposar hasta que se observe la formación de cristales. 4. Esperar a que los cristales se depositen en el fondo del vaso de precipitados. 5. Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur. 6. Secar los nuevos cristales formados en estufa a 37°C por 3 días. 7. Guardar los cristales en un recipiente de vidrio con tapa.

Para confirmar que los cristales se encontraban puros, se procedió a realizar una cromatografía en capa fina mediante la siguiente técnica:

1. Tomar una parte de los cristales secos y disolverlos en acetona. 2. Trazar en placas de sílica gel de 4.5cm x 1.5cm una línea base y aplicar sobre

esta, con la ayuda de un capilar, una parte de los cristales disueltos. 3. Realizar la cromatografía usando como fase móvil cloroformo:metanol en una

relación 95:5. 4. Observar las placas en una lámpara UV.

El punto de fusión de los cristales obtenidos después de la recristalización se realizó con el aparato Fisher-Johns de acuerdo a la siguiente técnica:

1. Depositar los cristales de Diurón entre dos cubreobjetos. 2. Colocar los cubreobjetos sobre la platina de aluminio del equipo.

3. Observar la temperatura a la cual comienzan a fundir los cristales y la temperatura a la cual se licuan (Intervalo de punto de fusión).

La lectura de Diurón por espectroscopía uv-vis se realizó utilizando etanol como solvente. El rango de lectura fue de 200 a 400nm. Fue necesario disolver una parte de los cristales puros de Diurón en etanol y colocarlos en celdas de cuarzo para su posterior lectura. El procedimiento que se siguió fue el indicado en la bitácora del equipo Espectrofotómetro de UV-Vis Modelo Lambda 25.

La técnica de pastilla fue utilizada para la caracterización del Diurón por espectrofotometría infrarroja. El procedimiento para fabricar la pastilla fue el siguiente:

1. Pesar 4 mg de los cristales de Diurón y 250mg de KBr seco. 2. Macerar los cristales de Diurón en el mortero de ágata y una vez que estén bien

macerados agregar los 250mg de KBr. 3. Colocar la mezcla de Diurón y KBr sobre el dado y proceder a elaborar la

pastilla a una presión de 6,000 libras por 1 minuto.

Una vez preparada la pastilla se procede a colocarla en la celda y analizarla de acuerdo al procedimiento descrito en la bitácora del equipo Espectrómetro de infrarrojo con transformada de Fourier Modelo Spectrum 2000 Explorer.

Para el análisis por cromatografía líquida de alta resolución, una parte de los cristales de Diurón, obtenidos de la recristalización, fueron disueltos en acetonitrilo grado HPLC el cual fue previamente filtrado usando un matraz kitazato y una bomba de vacío y posteriormente desgasificado por 30 minutos en un baño ultrasónico.

El análisis de los cristales por Cromatografía Líquida de Alta Resolución se realizó bajo las siguientes condiciones: columna C18 250 x 4.6 mm I.D., 5 µm. Marca BuckScientific. Fase móvil: acetonitrilo. Flujo: 1 ml/min. Inyección: 20 µL. Temperatura: 25 °C. Detector: UV a 250 nm. Resultados: 2,4-D Punto de fusión de los cristales del ácido 2,4-diclorofenoxiacético Para la determinación del punto de fusión de compuestos orgánicos que funden a temperaturas de 25 a 300 °C, se emplean aparatos como el Fisher-Jhons, que consta de una platina de aluminio que se calienta eléctricamente y provista de un termómetro que registra las temperaturas. La fusión de los cristales se observa con la ayuda del foco de iluminación y el vidrio de aumento [Shriner et al., 1999].

Los cristales del 2,4-D obtenidos de la recristalización fundieron a una temperatura de 139.8 °C. Valor comparado con el citado en la bibliografía, la cual reporta que el 2,4-D funde a una temperatura de 140 °C [Moffat et al., 2004].

Es importante observar el intervalo del punto de fusión de un compuesto desconocido, porque es una de las principales propiedades que indican que el compuesto está puro. La gran mayoría de compuestos orgánicos puros funden dentro de un intervalo de 0.5 °C o funden con descomposición dentro de un pequeño intervalo de temperatura de aproximadamente 1 °C [Shriner et al., 1999]

El intervalo del punto de fusión de los cristales de 2,4-D analizados fue de 0.2 °C, lo que indica que los cristales están puros. (Fig. 1 y Fig.2)

Fig. 1. Cristales del 2,4-D fundiéndose Fig. 2. Equipo Fisher-Jhons Análisis instrumental del ácido 2,4-diclorofenoxiacético por espectrofotometría de uv-vis En la figura 3 se observa el espectro obtenido de la lectura del 2,4-D disuelto en etanol. Utilizando como blanco etanol. Las bandas de absorción se obtuvieron a 283.93 y 291.10. Fig. 3. Espectro Uv-Vis del 2,4-D obtenido En la figura 4 se ilustran las bandas de absorción de referencia a 284 y 292 nm.

234.7 240 250 260 270 280 290 300.0

0.01

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

2.6

2.8

3.07

nm

A

283.93,0.94048291.10,0.83240

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Fig. 4. Espectro Uv-vis de referencia. Las diferencias en las longitudes de onda entre las bandas de absorción del 2,4-D obtenido y las de referencia son mínimas, por lo que se logró la identificación de 2,4-D en los cristales obtenidos por espectrofotometría Uv. Análisis instrumental del ácido 2,4-diclorofenoxiacético por espectrometría de infrarrojo El espectro infrarrojo obtenido de los cristales de 2,4-D se muestra en la figura 5 y el de referencia en la figura 6.

Figura. 5. Espectro de IR del 2,4-D obtenido de los cristales extraídos de la formulación comercial.

Fig. 6. Espectro de IR de referencia del 2,4-D. Se hizo la comparación de los picos del espectro de IR de los cristales de 2,4-D con los de referencia, del análisis de los resultados se concluye que se logró identificar el 2,4-D en el extracto realizado a partir de la formulación agroquímica. Análisis instrumental del ácido 2,4-diclorofenoxiacético por cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC). En la caracterización del 2,4-D por cromatografía de líquidos de alta resolución se disolvieron cristales en acetonitrilo grado HPLC. Después se inyectaron 20 µL de la muestra. La Figura 7 muestra el cromatograma obtenido, donde a parece el 2,4-D en 3.11 minutos.

Fig. 7. Cromatograma de la muestra de 2,4-D

Se obtuvo un pico definido, por lo que las condiciones cromatográficas fueron adecuadas. La ausencia de picos interferentes indica que los cristales estaban puros

Las condiciones descritas por otros autores (De Amarante-Junior et al., 2003; Boivin A. et al., 2005; Fraile P. et al., 2005) sirvieron como base para obtener las condiciones en las que se inyectó el 2,4-D.

El análisis del 2,4-D por HPLC se realizó con un detector uv, ya que la estructura de 2,4-D presenta grupos cromóforos. La longitud de onda empleada fue 283 nm ya que se obtuvo el espectro del 2,4-D en acetonitrilo y se obtuvo el máximo de la banda de absorción en 283 ± 1 nm. Dicha longitud se usa por ser una de las principales absorciones de 2,4-D en uv [De Amarante-Junior et al., 2003] ya que los ácido clorofenoxi presentan máximos de absorción en la región de 230 y 280 nm con una relación 9:1 en el coeficiente de extinción molecular entre estas dos longitudes de onda [Vera-Ávila L. E. et al., 1997]. Por lo que, el HPLC es un método idóneo para la determinación del 2,4-D en diversas muestras, ya que es mas simple y rápido, comparado con la determinación por cromatografía de gases [De Amarante-Junior et al., 2003]. La columna empleada en nuestro estudio fue la C18, misma que ha sido utilizada por otros autores para el análisis de 2,4-D en suelo [Boivin A. et al., 2005]. Es la más utilizada en el estudio de herbicidas porque tiene la selectividad, el balance perfecto para la retención de compuestos polares y no polares y afín a compuestos hidrofóbicos, esto se debe a que la columna es de fase inversa y tiene el más amplio rango de aplicaciones. El relleno de esta columna por lo regular contiene sílice tratada para reducir el nivel de intercambio de iones y mejorar la forma del pico. La forma molecular

del 2,4-D y su metabolito 2,4-DB son bastante hidrofóbicos y tienden a adsorberse sobre los filtros o las paredes internas. La fase móvil utilizada por diversos autores [Boivin A. et al., 2005; De Amarante-Junior et al., 2003; Fraile P. et al., 2005; Vera-Ávila L. E. et al., 1997] consistió en una mezcla de disolventes lo cual se debe a que el objetivo en dichos estudios fue el análisis del 2,4-D simultáneamente con otros herbicidas o contaminantes orgánicos. En nuestro caso debido a que no hubo necesidad de resolver el 2,4-D de otros picos el uso de acetonitrilo fue adecuado. El flujo empleado de 1 ml/min fue igual o similar al reportado por otros autores lo que se debe a que la columna utilizada fue semejante a la usada en otros estudios. Varios métodos basados en cromatografía de líquidos determinan simultáneamente el herbicida 2,4-D y su principal producto de degradación el 2,4-DCF en muestras de agua, sin embargo solo dos métodos para el análisis simultáneo en muestras de suelo: uno empleando compuestos radiomarcados y otro que consiste en una simple extracción seguida del análisis cromatográfico con detección UV [De Amarante-Junior et al., 2003]. Análisis instrumental del ácido 2,4-diclorofenoxiacético por cromatografía de gases acoplado a detector de masas La Figura 8 nos muestra el espectro obtenido de los cristales extraídos de la formulación líquida del 2,4-D y la figura 9 el de referencia.

Fig. 8. Espectro obtenido de los cristales extraídos de la formulación líquida del 2,4-D

Fig. 9 Espectro de referencia del 2,4-D La espectrometría de masas es de mayor aplicación, en el sentido que está técnica es capaz de proporcionar información acerca de la composición elemental de las muestras, de la estructura de las moléculas inorgánicas, orgánicas y biológicas; de la composición cualitativa y cuantitativa de mezclas complejas; de la estructura y composición de superficies sólidas; y de las relaciones isotópicas de átomos en la muestra. El espectro de masas proporciona datos que son útiles para la identificación de compuestos como su peso molecular y su fórmula molecular. En cada espectro el pico más alto es denominado pico base, al cual se le asigna un valor de 100 de forma arbitraria. Los espectros de masas más modernos están programados para reconocer el pico base y ajustar el resto de los picos respecto a él. El pico base del espectro del ácido 2,4-diclorofenoxiacético en la referencia se muestra en 199 y el pico base de la muestra se encuentra en 199.

La comparación del espectro obtenido con el de referencia permite concluir que

la sustancia analizada es 2,4-D, debido a la correspondencia entre la masa/carga de los iones fragmento del espectro de la muestra y del espectro de la referencia del 2,4-D,

DIURON

Extracción

Después de dejar evaporar el solvente utilizado para la extracción de Diurón (acetona), se formaron dos tipos de cristales, unos de color blanco depositados en el fondo del vaso de precipitados y otros de color amarillo adheridos a las paredes del vaso. Ambos tipos de cristales se guardaron para su posterior análisis.

Purificación del extracto de Diurón.

Con la finalidad de saber si el extracto obtenido se encontraba puro, los cristales de color blanco y amarillo fueron resuspendidos por separado en acetona y se analizaron por cromatografía en capa delgada empleando placas de sílica gel como fase estacionaria y cloroformo:metanol 95:5 como fase móvil.

Debido a que se observaron en ambas placas, con la ayuda de una lámpara UV, varias manchas, fue necesario implementar un procedimiento para la purificación del extracto (tanto para los cristales de color blanco como para los de color amarillo) basado en la recristalización.

Durante el proceso de recristalización, al momento de ir agregando el agua destilada a ambos tipos de cristales disueltos en acetona, se iban formando los nuevos cristales en el fondo del vaso de precipitados. Estos cristales eran transparentes y tenían forma de pequeñas agujas. Después de los 3 días de secado, la acetona y el agua ya se habían evaporado por completo.

A los cristales obtenidos en la recristalización se les analizó por cromatografía en capa delgada, usando las mismas condiciones empleadas para los primeros cristales (placas de sílica gel como fase estacionaria y cloroformo:metanol 95:5 como fase móvil). El resultado obtenido se ilustra en la figura 10.

Figura 10. Cromatografía en capa fina de los cristales obtenidos en la recristalización.

En la cromatografía en capa fina de estos cristales solo se encontró una mancha, lo que indica la pureza del compuesto extraído.

Punto de Fusión

El punto de fusión de los cristales obtenidos de la recristalización se determinó utilizando un equipo Fisher-Johns. Después de colocar los cubreobjetos que contenían los cristales en el equipo, se observó que éstos fundieron a 157.5-158°C, valor que fue comparado con el citado en la bibliografía, la cual reporta que los cristales de Diurón se funden en un rango de 158-159°C (Moffat et al., 2004) lo que indica que efectivamente, el compuesto extraído es Diurón.

El intervalo del punto de fusión de los cristales de Diurón analizados fue de 0.5°C, lo que indica que los cristales están puros.

Espectrofotometría de UV.

Después de hacer la lectura de Diurón utilizando como solvente etanol, se obtuvieron como resultado dos bandas de absorción (Figura 11), la primera a una longitud de onda de 250.34nm y la segunda a 287.84nm.

Figura 11. Espectro UV de los cristales obtenidos a partir de la formulación UNIURON.

Comparando estos resultados con el espectro de referencia (Figura 12), notamos que las bandas obtenidas se encuentran muy cerca de los valores reportados: la primera banda está reportada a 250nm y la banda obtenida experimentalmente se observó a 250.34nm (diferencia de 0.34nm), la segunda banda está reportado que aparece a 287nm mientras que la banda obtenida se observó a 287.84nm (diferencia de 0.84nm).

287.84,0.031372

200.0 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400.0

0.00

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.30

nm

A

Figura 12. Espectro UV de referencia de Diurón. λ de las bandas de absorción 250 y 287nm (Moffat et al., 2004).

Las bandas obtenidas en el espectro UV se deben a la presencia de grupos cromóforos (Bosch, 1990) en la molécula de diurón, los cuales presentan transiciones electrónicas n-σ*, n -π* y π-π*.

Espectrofotómetría de infrarrojo.

Mediante la técnica de pastilla se logró obtener el espectro de IR del Diurón (Figura 13) el cual fue comparado con el espectro de referencia (Figura 14).

Figura 13. Espectro IR de los cristales obtenidos a partir de la formulación UNIURON.

4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400.0

11.9

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

42

44

46

48

50

52

54

56

58

60

62.0

cm-1

%T

3283

2931

1586

1524

1492

1475

1406

1387

1359

1300

1264

1235

1188

1133

1073

10401027

901888

865

813

757

690

670

634

574526

1270

13951460

1517

1530

1655

29362953

3305

Figura 14. Espectro IR de referencia de Diurón (Spectral Database for Organic Compounds SDBS, 2009)

En el espectro obtenido por el análisis infrarrojo podemos observar bandas espectrales a 2953 y 2936 números de onda las cuales corresponden al movimiento de alargamiento de los CH3 presentes en la molécula de Diurón. Se observa una banda en 1460, la cual es característica de las vibraciones de flexión de los grupos C-H. En la región de 1387 vemos la señal correspondiente a la flexión de sombrilla del CH3.

Las señales de 1586 y 1517 corresponden al estiramiento del anillo aromático. También se observan en el espectro obtenido bandas entre 3000 y 3100 correspondientes a los dobles enlaces del anillo aromático. En la región de 2000 a 1700 se observan las bandas de sobretono del anillo, mientras que las de 865, 813 y 757 números de onda corresponden a las bandas fundamentales del anillo aromático.

En la banda de 3283 observamos la señal del estiramiento N-H del grupo amino presente en la molécula de Diurón, mientras que las bandas de 1300 y 1188 corresponden al estiramiento C-N.

Por último, en la región de 1655 observamos la banda del carbonilo de la cetona que forma parte de estructura de Diurón, como podemos notar, esta banda es la más intensa de todo el espectro.

Una comparación más detallada de los picos característicos del Diurón en el espectro IR se describe en la Tabla 1.

Tabla 1. Comparación entre las señales de referencia y las señales obtenidas.

Espectro IR de referencia

Espectro IR obtenido

Espectro IR de referencia

Espectro IR obtenido

Espectro IR de referencia

Espectro IR obtenido

3306 3305 1407 1406 1028 1027 3285 3283 1396 1395 902 901 2952 2953 1388 1387 889 888 2941 2936 1360 1359 866 865 1655 1655 1301 1300 814 813 1587 1586 1270 1270 757 757 1532 1530 1264 1264 691 690 1524 1524 1236 1235 671 670 1518 1517 1190 1188 635 634 1492 1492 1134 1133 576 574 1477 1475 1073 1073 527 525 1462 1460 1041 1040

En la región de la huella dactilar, comprendida aproximadamente entre 1200 y 700 cm-1, se presentan bandas de absorción que resultan de la combinación de las distintas interacciones que se originan en los compuestos y dependen del esqueleto completo de la molécula. Debido a su complejidad, rara vez es posible una interpretación completa por grupo funcional de los espectros en esta región; por otra parte, esta complejidad es la que conduce a la singularidad y por consiguiente a la utilidad de la región para fines de identificación (Skoog et al., 2001). Como podemos observar en la tabla 1, las bandas de absorción obtenidas en la región de la huella dactilar son muy parecidas a las reportadas en la bibliografía. Así por ejemplo, las diferencias más significativas entre las bandas de referencia y las señales obtenidas son de 2cm-1, lo que nos indica que el espectro obtenido corresponde a Diurón.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución

Después de hacer la inyección de los cristales, se obtuvo un cromatograma con un tiempo de retención de 3.133 minutos, tal como puede observarse en la figura 15.

Figura 15. Cromatograma de Diurón obtenido por Cromatografía Líquida de Alta Resolución.

Como se observa en la figura 15, se obtuvo un pico bien definido por lo que las condiciones cromatográficas utilizadas fueron adecuadas. No obstante, es necesario emplear estándares primarios para determinar el límite de detección de la técnica como lo hicieron Martins et al., (2007) quienes encontraron para el Diurón un límite detección de 0.07µL-1 mediante HPLC acoplada a detector UV.

En el método desarrollado en el presente trabajo el volumen de inyección

utilizado (20µL) y el flujo de fase móvil fue semejante al empleado en otro estudio donde además de lograr la determinación de Diurón y otros plaguicidas se estudió el efecto de la temperatura (40-35°C) y la variación del flujo de fase móvil (0.8-1.5 mL/min) (Baez y Zincker, 1999). No obstante, la temperatura (25°C) y flujo de fase móvil empleados en el método desarrollado se mantuvieron constantes por lo que para estudiar los cambios en el tiempo de retención de Diurón (3.133 minutos) sería necesario hacer modificaciones en los valores de temperatura y flujo de fase móvil utilizados.

A diferencia de otros estudios donde se emplearon como fase móvil mezclas de solventes como metanol-agua, isopropanol-hexano, acetonitrilo-agua, etc. (De Amarante-Junior, 2005, Martínez et al., 1998, Curini et al., 2000), en el método propuesto sólo se uso como fase móvil acetonitrilo, lo que resulta práctico para aquellos equipos que sólo cuentan con una bomba y que no pueden hacer mezclas como el equipo HPLC utilizado en este trabajo.

La longitud de onda utilizada en el detector UV fue de 250nm, valor similar al empleado en otros estudios como el de Sancho y colaboradores (1997) y parecido al usado por Martínez y colaboradores, quienes obtuvieron cromatogramas midiendo la absorbancia a 254nm (1998). Conclusión

En resumen se logró la extracción, purificación e identificación del 2,4-D y del Diurón presente en las formulaciones agroquímicas Fitoamina 40 y Uniurón respectivamente, lo que permitirá su empleo como estándares secundarios para el desarrollo de métodos de análisis aplicables en el monitoreo ambiental en la región del Ingenio de Mahuixtlan, Veracruz, México. Referencias bibliográficas:

1. Baez ME, Zincker J. Parámetros de calidad analítica de un método de determinación multiresiuos de plaguicidas por HPLC-DAD. Bol Soc Chil Quím 1999; 44:357-66.

2. Bosch E, Galcerán MT, Prat MD. Modern Optical Methods of Analysis: Analytical

Spectroscopy and related methods, Versión Española: Barcelona España: Reverté; 1990. p. 87-95.

3. Boivin Arnaud, Amellal Samira, Schiavon Michel, Martinus Th. van Genuchten. Enviromental

Pollution 2005; 138: 92 – 99.

4. Chaikovskaya ON, Sokolova IV, Karentnikova EA, Mal´kov VS y Kuz´mina SV. Spectral and GC-MS analisis of phototransformation of herbicides in Water. Russian Journal of Applied Chemistry 2009; 82(3):396-401.

5. Charlton AJA, Stuckey V y Sykes MD. Determination of the phenoxyacid herbicides MCPA, mecoprop y 2,4-D in kidney tissue using liquid chromatography with electrospray tandem mass spectrometry. Bull Envirom Contam Toxicol 2009; 82:711-715.

6. Curini R, Gentili A, Marchese S, Marino A, Perret D. Solid phase extraction followed by high-

performance liquid chromatography-ionspray interface-mass spectrometry for monitoring of herbicides in environmental water. J Chromatogr A 2000; 874:187-98.

7. De Amarante-Junior OP, Mesquita-Brito N, Ribeiro ML. Desarrollo de un método simple para la

determinación de residuos de Diurón por cromatografía líquida en muestras de naranja. Pesticidas 2005; 15:15-20.

8. De Amarante-Junior OP., Rodriguez-dos Santos TC y Silva Nunes G. Breve revisäo de métodos

de determinaçäo de residuos do herbicida ácido 2,4-D. Quim Nova 2003;26(2):223-229.

9. Ferrer A. Intoxicación por plaguicidas. Anales Sis. San Navarra 2003; 26(1):155-170.

10. Fraile P, Izu M, Sáiz I, Castiella J y Pérez de Ciriza JA. Análisis de residuos de herbicidas en aguas procedentes de Navarra mediante LC-MS/MS. An. Sist. Navar. 2009; 32(3): 327-341.

11. Martins EL, Weber OLC, Dores FGC, Spadotto CA. Leaching of seven pesticides currently used

in cotton crop in Mato Grosso State- Brazil. Journal of Environmental Science and Health Part B 2007; 47: 877-82.

12. Martínez K, Linarez C, Gonzáles JL. Método de determinación del contenido de ingrediente

activo de Diurón y Fluometuron en formulados de plaguicidas. Fitosanidad 1998; 2:59-61.

13. Moffat AC, Osselton MD, Widdop B. Clarke's Analysis of Drugs and Poisons. Pharmaceutical Press 2004.

14. Sancho Llopis Juan Vicente. Determinación de residuos de herbicidas polares mediante

cromatografía líquida de alta resolución. Aplicación de técnicas acopladas. Tesis doctoral. Castello, España: Universidad Jaume I de Castelló: Departamento de ciencias experimentales, 1994.

15. Shiriner RL, Fuson RC, Curtin DY. Identificación sistemática de compuestos orgánicos. 3ra ed.

México D.F.: Limusa; 1999. p. 39-46.

16. Skoog, Muller, Nieman. Principios de Análisis Instrumental 5ta ed. España: Mc Graw Hill 2001. p. 439-444.

17. Spectral Database for Organic Compounds SDBS. National Institute of Advanced Industrial

Science and Technology (AIST), Japón 2009.

18. Tsipi D, Hiskia A, Heberer T y Stan HJ. Determination of acidic pesticides in the drinking water of Greece using capillary gas chromatography-mass spectrometry. Water, Air and Soil Pollution 1998; 104:259-268.

19. Vera - Ávila Luz Elena, Meraz – Lira José Luis, Padilla – Cortés Patricia. Metodología en línea

para la determinación de trazas de los herbicidas 2,4 – D y 2,4- DB en agua. Revista Internacional de Contaminación Ambiental 1997; Vol. 13 Núm. 002: 63 – 71.