agenda mikroteknik 2009

Biologi UPI ---- MIKROTEKNIKAgenda Mikroteknik (teori : Praktikum = 20% : 80%)Senin, 8.40 – Selesai Lab STH & STBDadang M (08122 384 925) & Kusdianti (08121 460 655)mg ke

Materi

Alat dan Bahan Jumlah

1 Pendahuluan

2 Preparasi reagen

- Alkohol 95%- Formalin 45 %- As cuka glasial - As pikrat- Hematoksilin- Gliserin PA- Alkohol absolut- Kalium alum (tawas)- Aquades- Sabun- Beker glass- Hotplate stirer- Corong- Gelas ukur- Botol-botol

20 lt5 lt1 lt500 gr50 gr1 lt5 lt50 gr20 lt1 kg5 macam X313 macam X 33 macam x 315 X 3

3 In toto hewan & tumb

Objek glasCover glassEntelanAlbuminPipetAlk bertingkat 50 – 96Alkohol absolutXilolPewarna HEHot plate

3 dus3 pak500 cc200 gr20 buah@ 2 lt5 lt2 lt1 lt1

4 In toto

idem idem

5 Preparasi hewan

Tikus/mencitAlat bedahRinger

23 set2 lt

6 Fiksasi, dehidrasi

BoiunsBotol filmAlkohol bertingkat 50 – 96Alkohol absolut

1 lt40@ 1 lt1 lt

7 Clearing, infiltasi, embeding

Alkohol absolutXilolBotol filmParafin mp 45 oC dan 50 oCParafin oven

1 lt1 lt40@ 500 gr

8 Penyayatan, nempel

Mikrotom, kwasBaki pitaObjek glassHot plate

2 set63 dus2

9 Pewarnaan, tutup

Staining jarPewarna HEXilolAlkohol menurun !00 – 60Mikroskop/CCTVMinyak cengkehAlk meningkat 60 – 100

301 lt2 lt4 lt11 lt4 lt

10 UTS -11 Prepa

rasi tumbuhan

Batang, akar dan daun (monokot dan dikot)Alat bedah

23 set2 lt

12 Fiksasi, dehidrasi

FAA56AspiratorBotol filmAlkohol bertingkat 50 – 96Alkohol absolut

1 lt

40@ 1 lt1 lt

13 Clearing, infiltasi,

Alkohol absolutXilolBotol filmParafin mp 45 oC dan

1 lt1 lt40@ 500 gr

embeding

50 oCParafin oven

14 Penyayatan, nempel

Mikrotom, kwasBaki pitaObjek glassHot plate

2 set63 dus2

15 Pewarnaan, tutup

Staining jarPewarna HEXilolAlkohol menurun !00 – 60Mikroskop/CCTVMinyak cengkehAlkohol meningkat 60 – 100

301 lt2 lt4 lt11 lt4 lt

16 Fotografi in toto, hew, tumb

Film negatif asa 400Camera digital, kompouter

2 roll

IN TOTO Microorganisme hewan1. objek diisolasi dan di kultur murni (paramaecium, euglena,

amuba, protozoa, alga, cyclop, daphnia, miona, plasmodium, planaria, fasciola, redia, sercaria), sperma (sapi, domba, orang, mencit), darah (mamalia, aves, amfibia, ikan, reftil)

2. objek dan cover glass di bersih-keringkan, replikasi 5X untuk tiap objek

3. objek glass diberi sedikit olesan albumin/HAUPS & keringkan

4. objek (protozoa dll) ditetes pada albumin kering diatas objek glass, kontrol di mikroskop

5. sebelum air menguap, fiksasi dengan alkohol bertingkat tiap jenjang ditetes satu menit (alkohol 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%)

6. warnai dengan Eosin 1% dlm alkohol 95%, selama satu menit

7. diferensiasi dalam alkohol 95% dalam mikroskop sampai ideal

8. lanjutkan dehidrasi satu menit pada alkohol absolut9. lanjutkan dengan xilol:alkohol absolut = 1:1 selama satu

menit10.xilol murni satu menit11.tutup dengan entelan & cover glass

IN TOTO Microorganisme Tumbuhan1. objek diisolasi dan di kultur murni (euglena, spyrogyra,

ulothrix, dll)2. objek dan cover glass di bersih-keringkan, replikasi 5X

untuk tiap objek3. objek glass diberi sedikit olesan albumin/HAUPS &

keringkan4. objek (macam alga) ditetes pada albumin kering ditas objek

glass, kontrol di mikroskop5. fiksasasi dengan FAA 1-24 jam: (alkohol 70% 90 cc,

formalin 4% 10 cc & asam cuka glasial 2CC)6. cuci dengan alkohol 50% satu menit7. warnai dengan anilin blue 30 menit (anilin blue WS 0,4 g &

aquades 100 cc)8. objek disimpan dalam gliserin 10% sampai pekat

(hangatkan) & kontrol di mikroskop9. tutup dengan objek glass, kelebihan gliserinya di isap

dengan kertas & pinggir cover glass tutup dengan kutek bening

/tt/file_convert/55cf9bbe550346d033a73a0b/document.doc 1

PREPARASI HISTOLOGI A. PENGAMBILAN JARINGAN1. hewan dimatikan dengan cara dislokasi servix atau dibius

dengan aether/khloroform, 2. dengan menggunakan alat bedah, jaringan/organ yang

akan digunakan dikeluarkan 3. direndam dalam salin (NaCl 0,96%)untuk dibersihkan

dari darah dan jaringan lain yang mengotorinya4. masih dalam salin objek dipotong-potong sesuai arah yang

diinginkan (TS, LS, CS) dengan ukuran lebih kurang 1cc

B. FIKSASIObjek Direndam dalam larutan fiksatif selama 24 jam atau lebih, BOUINS (asam pikrat jenuh 75% + formalin pekat 20% + asam cuka glasial 5%) atau dalam FORMALIN 5%

- - - - - - - - - - BISA DISIMPAN

C. DEHIDRASI (bisa dirumah)Masing-masing potongan organ direndam dalam alkohol dengan konsentrasi meningkat dengan masing-masing lama waktu minimal 2 jam. Mulai dari alkohol 60 % --- 70 % bias lama --- 80% --- 96% --- 100%Pada alkohol 100 %

D. PENJERNIHAN/CLEARING (di lab sth)Perendaman dalam xilol bertingkat sampai objek menjadi jernihAlkoho 100% : xilol = 1:1 maksimal 10 menitXilol murni maksimal 15 menit

E. INFILTRASI (di oven paraffin lab SH)Memasukan objek/preparat ke parafin cair bersih bertingkat pada suhu 58 oC dengan waktu minimalParaffin-xilol =1:1 = 30 menitParafin I 48 oC (1 jam) --- parafin II 56 oC (1 jam) ----

F. PENANAMAN/EMBEDING (di oven Parafin, SH)Objek yang telah diinfiltrasi ditanam kedalam parafin cair pada balok kertas. Letak objek disesuaikan dengan orientasi pemotongan nanti (TS,CS,LS) yang diatur dengan sonde panas dan diberi label/keterangan objek. Selanjutnya dibiarkan sampai membeku lalu disimpan pada block holder.- - - - - - - - - - - BISA DISIMPAN

G. PENYAYATAN (di lab. Mikrotek, SH)1. Sebagian parafin yangdigunakan dibuang dengan

cara di sayat untuk mendapatkan bentuk yang trapesium

2. Block holder dipasang pada microtom putar3. Pisau microtom dipasangsecara tepat dengan sudut

tertentu. Hati-hati sangat tajam4. Penyayatan dimulai dengan ketebalan 15 mikron dan

selanjutnya menurun sampai 10 mikron. Tujuannya untuk membuang sebagian parafin dan untuk mendapatkan bagian objek yang lengkap, serta untuk mengetahui pada ketebalan berapa mikron pita sayatan terbentuk baik.

5. Pita hasil sayatan disimpat pada baki triplek beralas kertas

6. Parafin dan sayatan yang menempel pada pisau atau pada mikrotom harus dibersihkan dengan kwas/kapas yang ber xilol - - - - - BISA DISIMPAN

7.H. PENEMPELAN (Di Lab Mikrotek, SH)

1. Sedikit albumin cair diulaskan merata ditas kaca objek yang telah dibersih keringkan

2. Objek glass ditetesi dengan aquades secara merata, selanjutnya ditempatkan pada jot plate/papan pemanas 45 oC.

3. Sejumlah pita hasil sayatan mikrotom, dengan peletakan tertentu (seri atau tunggal) ditempatkan diatas air objek glass tadi, sampai mengembang maksimal dan diatur posisinya dengan menggunakan sonde

4. Sisa aquades pada objek glass dibuang dengan menggunakan koertas isap/buram hingga kering.

5. Tidak boleh ada gelembung udara yang terjebak diatara objek glass dan pita , karena akan mengganggu pada proses berikutnya.

I. PEWARNAAN dengan HE (Hematoksilin Eosin) (Dilab Mikrotek/SH)1. deparafinisasi dilakukan dengan xilol selama 30

menit dalam coplin jar terhadap objek yang telah ditempel

2. hidrasi pada coplin jar dengan menggunakan konsentrasi alkohol menurun, mulai dari 100% --- 96% --- 80% dan 70% dengan waktu masing-masing 3 menit. Tetapi untuk alkohol 70% bisa disimpan agak lama / istirahat

3. objek diwarnai dengan merendamnya pada pewarna Hematoksilin Erlich dengan lamanya bervariasi tergantung macam jaringannya (misal otot lurik 20 menit, ginjal 4 menit)

4. Dicuci dengan air sampai tampak biru5. diferensiasi warna diperiksa dibawah mikroskop:

a. jika inti belum cukup terwarnai maka dikembalikan kelarutan HE dan mengikuti langkah 3 – 4 - 5

b. jika pewarnaan terlalu tua/gelap maka dikurangi dengan mencelupnya pada larutan 0,3% HNO3 dalam alkohol 70% atau dengan air selama 3-5 menit melalui pemeriksaan dibawah mikroskop

c. kelebihan albumen dan HE pada objek glass dapat dibersihkan dengan lap/tissue

d. jika telah selesai maka dicuci dengan menggunakan aquades/air

6. Dehidrasi dan pewarnaan dengan Eosin pada alkohol dengan konsentrasi meningkat dengan waktu yang relatif sama sekitar 3 menit

7. Alkohol 70% --- 80% --- 96%+Eosin --- 96% --- 100% dan 100% lagi. Masing-masing 3 menit, tetapi umntuk alkohol 96%+Eosin objek sampai terwarna merah dengan pemeriksaan mikroskop

8. Penjernihan dengan dua tahap menggunakan xilol + alkohol 100% selama 3 menitselanjutnya dengan xilol murni selama 3 menit atau sampai terlihat jernih.

J. PENUTUPAN (Di lab mikrotek/SH)Setelah dijernihkan dengan xilol terakhir , secepatnya diangkat dan ditetesi dengan entelan/gom arab secukupnya, tutup dengan kasca penutup yang telah dicelup pada xilol dan cegah jangan sampai ada gelembng udara yang terperangkap Buang entelan yang meluber keluar objek glas dengan tissue/lap berxilol. Keringkan/biarkan kering selama 15 menit

K. SORTING & PREPARAT HISTOLOGI SIAP PAKAI Sorting preparat yang baik dan gagal dengan menggunakan MICROCAMSetelah kering benar berilabelNama objek ----- penampang (TS/CS/LS) ----Hewannya ---pewarnaan ----Nama kelompok dan tahun

L. Mikrofotografi dg EducamMenggunakan Ulead atau Pinacle, setting untuk snapshot/foto atau untuk video, setelah ambil foto langsung di rename nama filenya, jika sudah terkumpul datanya, tinggal di transfer ke CD


PEWARNAAN SPERMA MAMMALIA

Cairan hasil flushing epididimis atau ekstraksi testis sebanyak 2 l + 1000 l PBS dipertahankan pada suhu 37 oC dengan stage water.

Pewarnaan (staining)

Komposisi PBS (phosfat buffer saline)Dalam akuades sebanyak 100 ml pH 7,2Nama Bahan Jumlah (gram)KCL 0,05NaCl 0,8KH2PO4 0,02Na2HPO4. 2H2O 0,115Disterilkan di dalam autoclav dan setelah dingin disimpan di dalam kulkas

PEWARNA DAN PEWARNAANPewarna1. Carmine

Kalium aluminium sulfat 6 gramSerbuk cochineal 6 gramAquadest 100 mlSetelah didihkan selama 0,5 jam, tambahkan

akuades sampai volume mencapai 100 ml. Larutan didinginkan, kemudian disaring. Tambahkan sedikit tymol untuk pengawetan.

2. Aseto-Karmin (aceto-carmin)Biasanya digunakan untuk mewarnai kromosom kelenjar ludah Drosophila, atau untuk semir serbuk sari.

Cara membuatnya ialah dengan jalan menambahkan carmine secukupnya ke dalam larutan asam cuka 45% hingga jenuh, kemudian dididihkan selama 2 jam.

3. OrceinBiasanya digunakan untuk pewarnaan sitologi, dengan nama orcein untuk mewarnai kromosom pada preparat pejetan.Formulanya adalah sebagai berikut:Akuades 20 s/d 50 mlAsam asetat 30 s/d 70 mlOrcein 1 gramLarutkan 1 gram orcein ke dalam akuades dan asam asetat. Konsentrasi asam asetat tergantung dari bahan yang akan diwarnai. Untuk sitologi tumbuhan umumnya digunakan asam asetat 50%, dan untuk Drosophila dipakai asam asetat 70%.Metode untuk preparat pejetan adalah sebagai berikut:

- Letakkan objek pada setetes larutan zat warna di atas kaca benda

- Biarkan 3 sampai 10 menit- Tutup dengan gelas penutup dan pejet/tekan

hingga sel-sel terpisah dan kromosom dapat dilihat.

4. Alizarin red SMerupakan larutan pewarna asam, natrium alizarin sulfonat.Cara membuatnya: 7,69% dalam akuades, atau 0,15% dalam alkohol. Dipergunakan untuk mewarnai kromatin/kromosom, akan tetapi sekarang juga digunakan untuk mewarnai tulang.

Pewarna sintetis yang lain1. Eosin

Merupakan pewarna asam. Untuk pewarnaan digunakan 39,11% dalam akuades, atau 0,75 % dalam alkohol. Warna ini biasanya digunakan warna kontras dengan warna lain, khususnya untuk jaringan hewan kontras dengan hematoxilin atau celestine blue B. Untuk sediaan irisan dengan metode parafin, pewarnaan eosin memakai larutan 1% dalam alkohol 95%, lama pewarnaan beberapa detik. Untuk sediaan utuh, dimana materinya biasanya lebih besar, dipakai larutan 1% dalam akuades dan lama pewarnaan beberapa jam.

2. Janus Green BMerupakan larutan pewarna basa, seperti halnya

safranin. Larutan yang dipakai ialah 5,18% dalam air, atau 1,12% dalam alkohol. Dipergunakan untuk pewarnaan vital pada fungi, dan untuk flagela protozoa. Untuk pewarnaan vital dipergunakan larutan 0,001 sampai 0,41 gram dalam 100 ml larutan garam fisiologis.

3. Crystal violetMerupakan larutan pewarna basa, mengandung

gugusan triamino-trijahenil metan. Nama lain ialah Gentian violet. Sering digunakan dalam sitologi. Larutan yang dipergunakan ialah: 1,68% dalam akuades, atau 13, 87% dalam alkohol. Setelah pewarnaan, objek segera dicuci dengan alkohol, dehidratasi, jernihkan dengan xilol, kemudian direkat dengan balsam.


0,5 ml suspensi sperma difiksasi dengan 2 ml formalin 2% dalam H2O (selama 10 menit)

Diteteskan ke atas kaca objek dan dibiarkan sampai mengering

Diwarnai dengan eosin 1% dalam H2O (selama 15 menit)

Dibilas dengan akuades kemudian dikeringanginkan untuk selanjutnya diamati di bawah mikroskop (100 kali)

Ditutup dengan kaca penutup untuk preparat permanen

Crystal violet seringkali mewarnai sitoplasma dari ujung-ujung akar. Bila warnanya terlalu kuat/berlebihan, preparat direndam dalam asam asetat 2% dalam akuades selama 30 menit, kemudian dicuci beberapa kali dengan air mengalir.

4. GiemsaBahan-bahan yang diperlukan adalah larutan stok giemsa dan pelarutnya (buffer giemsa) yang tersusun atas:a. Larutan KH2PO4 0,07 M

KH2PO4 9,53 gramAkuabides 1000 ml

b. Larutan Na2HPO4.2H2O 0,07 MNa2HPO4.2H2O 12,46 gramAkuabides 1000 ml

c. Larutan buffer fosfat pH 6,8KH2PO4 0,07 M 90 mlNa2HPO4.2H2O 0,07 M 110 mlAkuabides 800 ml

d. Larutan GIEMSA 2,5 %Larutan buffer fosfat pH 6,8 97,5 mlLarutan giemsa stok 2,5 ml

Cara pembuatan larutan stok Giemsa:- Giemsa bubuk 3,8 gram- Gliserol murni 250 ml- Metil alkohol 250 ml

Cara :

1. Masukkan Giemsa bubuk ke dalam cawan porselin2. Tambahkan sedikit demi sedikit gliserol sambil

digerus hingga giemsa larut3. Ambil 150 ml (dari 250 ml) metil alkohol,

campurkan sedikit demi sedikit sambil digerus dengan cepat.

4. Setelah larut, tuangkan larutan giemsa ke dalam botol reagen (tutup kaca)

5. Gunakan sisa metil alkohol untuk membilas cawan, tambahkan ke dalam botol reagen. Dalam 24 jam botol sering dikocok.

6. Larutan giemsa dapat digunakan setelah 48 jam.

5. Larutan induk anilin biruAnilin biru 0,5 gramOrange G 2 gramAkuades 100 mlAsam asetat glacial 8 ml

CARA MEMBUAT PREPARAT SEMIR/PEJETAN

Berbeda dengan preparat utuh, dimana hewan-hewan kecil atau tumbuhan kecil keseluruhannya di mount dalam balsam, maka preparat semir ini merupakan preparat yang disemirkan di atas gelas objek sehingga merupakan lapisan yang tipis atau seperti filem. Objek yang disemirkan berupa cairan atau objek lunak yang mengandung air seperti darah, ludah, feses, kultur bakteri, kelenjar ludah dan lain-lainnya.

Pembuatan preparat pejetan ialah untuk memperoleh preparat cukup tipis guna pemeriksaan di bawah mikroskop, sedang sel-sel tersebut terpisah antara yang satu dengan yang lain tanpa kehilangan bentu-

bentuknya, dengan jalan menekan atau memejet suatu organ dari hewan atau tumbuhan.

Preparat semir darah dengan pewarnaan GiemsaPreparat ini dapat digunakan untuk mengetahui

bermacam-macam sel darah. Prosedur pembuatannya adalah sebagai berikut:1. Bersihkan jari keempat tangan kiri dengan alkohol

70% dan biarkan sampai kering. Dengan menggunakan blood lancet yang telah dibersihkan dg alkohol 70%, tusukkan pada jari. Darah yg pertama keluar dibersihkan dengan kapas.

2. Teteskan secara langsung, darah yang keluar pada salah satu sisi kaca objek yang bersih dari debu dan lemak. Dengan menggunakan kaca objek lain buatkan semir darah ke arah sisi lain. (dijelaskan saat pembuatan)

3. Biarkan semir darah sampai kering.4. Rendam semir tersebut ke dalam metil alkohol

absolut selama 5 – 10 menit, kemudian keringkan.5. Rendam semir darah ke dalam larutan buffer zat

warna giemsa selama 20 menit.6. Cuci dengan air kran yang mengalir.7. Periksa di bawah mikroskop, kalau warnanya kurang

baik, rendam lagi dan biarkan sampai 10-20 menit, kemudian bilas dan kering-anginkan.

Preparat pejetan ujung akar bawangPreparat ini dapat digunakan untuk mengetahui

atau demonstrasi tahap-tahap atau fase mitosis pada sel-sel ujung akar. Prosedur pembuatannya adalah sebagai berikut:1. Ujung akar bawang yang baru tumbuh dipotong

beberapa milimeter, kemudian disimpan di dalam larutan fiksatif (alkohol absolut : asam asetat glasial = 3 : 1) selama 24 jam

2. Pindahkan ke dalam alkohol 70% (dapat disimpan dalam waktu yang cukup lama).

3. Letakkan ujung akar yang telah difiksasi ke atas gelas objek yang bersih dan ditetesi dengan HCl 1 N, biarkan selama 3 –4 menit.

4. Teteskan 1 tetes aceto-carmine, ujung akar akan menjadi lunak.

5. Potonglah bagian ujung akar sepanjang 2 – 3 milimeter (zona proliferasi), sisanya dibuang. Cacahlah bagian ujung ini dengan skalpel atau pisau yang karatan/berkarat, untuk mempercepat reaksi warna.

6. Tutuplah dengan gelas penutup, kemudian diisap dengan kertas hisap untuk menarik kelebihan zat warna.

7. Kemudian pejetlah gelas penutup dengan ibu jari atau dengan menggelindingkan pencil di atas gelas penutup.

8. Jika warnanya pucat, dapat dikuatkan dengan jalan memanaskannya di atas mulut labu Erlenmeyer yang berisi air mendidih.

9. Jika ingin dibuat preparat permanen, preparat dicuci dengan akuades, dehidratasi dengan alkohol, dijernihkan dengan xilol, dan di mount dalam kanada balsam.


Preparat pejetan Kelenjar Ludah Drosophila sp.

Preparat ini diperlukan untuk mengetahui kromosom dalam kelenjar saliva Drosophila. Zat warna yang dipakai untuk pewarnaan ialah La Cour’s Acetic Orcein. Sedang larutan lain yang diperlukan dalam pembuatan preparat ini ialah larutan Ringer dengan formula sebagai berikut:- Natrium Klorida (NaCl) 0,65 gram- Kalium Klorida (KCl) 0,025 gram- Kalsium Klorida (Ca Cl2)0,03 gram- Akuades 100 mlKelenjar saliva yang dipakai ialah kelenjar saliva dari instar ke-3, yaitu larva yang berukuran besar dan gerakannya pelan.Adapun prosedur pembuatan preparat pejetan adaaalah sebagai berikut:1. Letakkan beberapa larva di atas kaca objek.2. Kemudian letakkan kaca objek ini di atas meja

mikroskop binokuler dengan latar belakang gelap.3. Teteskan Ringer pada sisi sebelah kanan larva.4. Tekan/pegang badan larva hati-hati dengan jarum

pada sisi kiri dengan tangan kiri, dan kemudian masukkan jarum ke dalam mulut larva dengan tangan kanan. Dengan hati-hati tariklah jarum dalam mulut untuk mengeluarkan kelenjar saliva ke arah Ringer. Sekarang kelenjar saliva nampak sebagai dua usus transparan sebelah menyebelah esofagus.

5. Dengan dua jarum sisihkan bagian-bagian mulut.6. Angkat kelenjar saliva dan letakkan di atas gelas

objek yang telah ditetesi dengan zat warna asam orcein. Biarkan selama 5 menit sambil menggerak-gerakkan gelas objek.

7. Tutup dengan gelas penutup, tekan / pejet gelas penutup dengan ibu jari kebelakang dan kemuka secara perlahan-lahan dan hati-hati.

8. Tutup dengan kertas hisap, kemudian pejet lagi hingga sediaan cukup tipis. Kalau perlu boleh diulang berkali-kali.

9. Periksa di bawah mikroskop.10. Kalau cukup baik, preparat dapat dibuat permanen.

Lepaskan gelas penutup, kemudian lakukan dehidratasi, penjernihan, dan akhirnya mount dengan kanada balsam.

MIKRO-MAKRO FOTOGRAFI DIGITALDadang M Bio UPI

Alat & Bahan1. EDUCAM-5 satu set lengkap atau camera

capture digital yg lain 2. mikroskop cahaya yg sudah dimodif jadi

mikroskop listrik3. computer multimedia, dengan hardware video

capture (Pinnacle, Tv tuner dll) dan software video editing (Pinnacle, Ulead, Adobe premier)

Langkah kerja:1. Educam di set untuk mikroskop atau videi

presenter & kabel RCA dihubungkan ke Video In di Komputer

2. program ulead di panggil, seting sumber gambar dari composit/RCA dan resolusi PAL

atau AUTO jangan NTSC krn gambar akan putih hitam

3. kalau objek sudah terlihat ideal, ambil gambar & nama filenya langsung di rename dg kode/nama yg telah disiapkan

4. setelah semua objek terambil, maka transfer semua data ke CD atau Flashdisk atau disket

Bahan Preparat mikroteknik sept Replikasi tiap organ= 10

no organ hewan1 Kulit berambut + otot cs Rat/Cavia2 Kulit tak berambut + otot Rat/Cavia3 Lidah papilla cs Rat/Cavia4 Lidah papilla cs Rat/Cavia5 Gigi cs Rat/Cavia6 Tulang cs Rat/Cavia7 Trachea+ esophagus cs Rat/Cavia8 Bronchus+broncheolus cs Rat/Cavia9 Alveolus cs Rat/Cavia10 Rawan telinga cs Rat/Cavia11 Lambung 3 wilayah cs Rat/Cavia12 Colon, usus besar cs Rat/Cavia13 Pancreas Rat/Cavia14 Limpa Rat/Cavia15 Oto jantung ls + cs Rat/Cavia16 Arteri + vena ls+cs Rat/Cavia17 Adrenal Rat/Cavia18 Syaraf, apusan Rat/Cavia19 Otak benar, cs Rat/Cavia20 Otak kecil, cs Rat/Cavia21 Medulla spinalis, cs Rat/Cavia22 Ovarium Rat,marmot,

sapi, domba23 Oviduct24 Uterus Rat/Cavia25 Vagina Rat/Cavia26 Testis Rat,marmot,

sapi, domba27 Epididimis28 Vas deferen Rat/Cavia29 Penis Rat/Cavia30 Kantung urin Rat/Cavia

31 Spirogyra32 Cladophora33 Hydrodiction34 Monilia35 Rhizophus36 Penicillium37 Aspergilus38 Parmelia39 Usnea40 Batang monokotil, Zea mays41 Batang dikotil, Cucurbita42 Akar monokotil, Zea mays43 Akar dikotil, Hibiscus44 Daun piscus45 Daun lilia46


PREPARASI HISTOLOGI, Mikroteknik

A. PENGAMBILAN JARINGAN1. hewan dimatikan dengan cara dislokasi servix atau

dibius dengan aether/khloroform, 2. dengan menggunakan alat bedah, jaringan/organ

yang akan digunakan dikeluarkan 3. direndam dalam salin (NaCl 0,96%)untuk

dibersihkan dari darah dan jaringan lain yang mengotorinya

4. masih dalam salin objek dipotong-potong sesuai arah yang diinginkan (TS, LS, CS) dengan ukuran lebih kurang 1cc

B. FIKSASIObjek Direndam dalam larutan fiksatif selama 24 jam atau lebih, BOUINS (asam pikrat jenuh 75% + formalin pekat 20% + asam cuka glasial 5%) atau dalam FORMALIN 5%

- - - - - - - - - - BISA DISIMPAN

C. DEHIDRASI (bisa dirumah)Masing-masing potongan organ direndam dalam alkohol dengan konsentrasi meningkat dengan masing-masing lama waktu minimal 2 jam. Mulai dari alkohol 60 % --- 70 % --- 80% --- 96% --- 100%Pada alkohol 100 % bisa lama

D. PENJERNIHAN/CLEARING(Bisa dirumah)Perendaman dalam xilol bertingkat sampai objek menjadi jernih Alkoho 100% : xilol = 1:1 maksimal 10 menit Xilol murni maksimal 15 menit

E. INFILTRASI (di oven paraffin lab SH)Memasukan objek/preparat ke parafin cair bersih bertingkat pada suhu 58 oC dengan waktu minimal Parafin I (0,5 jam) --- parafin II (1 jam) ---- parafin III ( 1,5 jam)

F. PENANAMAN/EMBEDING (di oven Parafin, SH)Objek yang telah diinfiltrasi ditanam kedalam parafin cair pada balok kertas. Letak objek disesuaikan dengan orientasi pemotongan nanti (TS,CS,LS) yang diatur dengan sonde panas dan diberi label/keterangan objek. Selanjutnya dibiarkan sampai membeku lalu disimpan pada block holder.

- - - - - - - - - - - BISA DISIMPAN

G. PENYAYATAN (di lab. Mikrotek, SH)1. Sebagian parafin yangdigunakan dibuang dengan

cara di sayat untuk mendapatkan bentuk yang trapesium

2. Block holder dipasang pada microtom putar3. Pisau microtom dipasangsecara tepat dengan sudut

tertentu. Hati-hati sangat tajam4. Penyayatan dimulai dengan ketebalan 15 mikron dan

selanjutnya menurun sampai 10 mikron. Tujuannya untuk membuang sebagian parafin dan untuk mendapatkan bagian objek yang lengkap, serta untuk mengetahui pada ketebalan berapa mikron pita sayatan terbentuk baik.

5. Pita hasil sayatan disimpat pada baki triplek beralas kertas

6. Parafin dan sayatan yang menempel pada pisau atau pada mikrotom harus dibersihkan dengan kwas/kapas yang ber xilol - -BISA DISIMPAN

H. PENEMPELAN (Di Lab Mikrotek, SH)1. Sedikit albumin cair diulaskan merata ditas kaca

objek yang telah dibersih keringkan

2. Objek glass ditetesi dengan aquades secara merata, selanjutnya ditempatkan pada jot plate/papan pemanas 45 oC.

3. Sejumlah pita hasil sayatan mikrotom, dengan peletakan tertentu (seri atau tunggal) ditempatkan diatas air objek glass tadi, sampai mengembang maksimal dan diatur posisinya dengan menggunakan sonde

4. Sisa aquades pada objek glass dibuang dengan menggunakan koertas isap/buram hingga kering.

5. Tidak boleh ada gelembung udara yang terjebak diatara objek glass dan pita , karena akan mengganggu pada proses berikutnya.

I. PEWARNAAN dengan HE (Hematoksilin Eosin) (Dilab Mikrotek/SH)1. deparafinisasi dilakukan dengan xilol selama 30

menit dalam coplin jar terhadap objek yang telah ditempel

2. hidrasi pada coplin jar denngan menggunakan konsentrasi alkohol menurun, mulai dari 100% --- 96% --- 80% dan 70% dengan waktu masing-masing 3 menit. Tetapi untuk alkohol 70% bisa disimpan agak lama / istirahat

3. objek diwarnai dengan merendamnya pada pewarna Hematoksilin Erlich dengan lamanya bervariasi tergantung macam jaringannya (misal otot lurik 20 menit, ginjal 4 menit)

4. Dicuci dengan air ledenga sampai tampak biru5. diferensiasi warna diperiksa dibawah mikroskop:

a. jika inti belum cukup terwarnai maka dikembalikan kelarutan HE dan mengikuti langkah 3 – 4 – 5

b. jika pewarnaan terlalu tua/gelap maka dikurangi dengan mencelupnya pada larutan 0,3% HNO3 dalam alkohol 70% atau dengan air selama 3-5 menit melalui pemeriksaan dibawah mikroskop

c. kelebihan albumen dan HE pada objek glass dapat dibersihkan dengan lap/tissue

d. jika telah selesai maka dicuci dengan menggunakan aquades/air

6. Dehidrasi dan pewarnaan dengan Eosin pada alkohol dengan konsentrasi meningkat dengan waktu yang relatif sama sekitar 3 menit

7. Alkohol 70% --- 80% --- 96%+Eosin --- 96% --- 100% dan 100% lagi. Masing-masing 3 menit, tetapi umntuk alkohol 96%+Eosin objek sampai terwarna merah dengan pemeriksaan mikroskop

8. Penjernihan dengan dua tahap menggunakan xilol + alkohol 100% selama 3 menitselanjutnya dengan xilol murni selama 3 menit atau sampai jernih.

J. PENUTUPAN (Di lab mikrotek/SH)

Setelah dijernihkan dengan xilol terakhir , secepatnya diangkat dan ditetesi dengan entelan/gom arab secukupnya, tutup dengan kasca penutup yang telah dicelup pada xilol dan cegah jangan sampai ada gelembng udara yang terperangkap Buang entelan yang meluber keluar objek glas dengan tissue/lap berxilol. Keringkan/biarkan kering selama 15 menit

K. SORTING & PREPARAT HISTOLOGI SIAP PAKAI Sorting preparat yang baik dan gagal dengan menggunakan EDUCAM Setelah kering benar berilabelNama objek ----- penampang (TS/CS/LS) ----Hewannya ---pewarnaan ----Nama kelompok dan tahun

L. Mikrofotografi dg Educam


Menggunakan Ulead atau Pinacle, setting untuk snapshot/foto atau untuk video, setelah ambil foto langsung di rename nama filenya, jika sudah terkumpul datanya, tinggal di transfer ke CD


agenda mikroteknik 2009

Documents