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Agência Nacionalde Vigilância Sanitária www.anvisa.gov.br

Visão regulatória no Brasil para métodos bioanalíticos não-

cromatográficos

João Tavares Neto

Coordenação de Bioequivalencia – COBIO

Gerência Geral de Medicamentos - GGMED

Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA

São Paulo 07/06/2010


Sumário

• Métodos Não-Cromatográficos e RE 899/2003

• Recomendações Cristal City 2006

• Draft Guia EMEA 2009 para Validação de Métodos Bioanalíticos

• Implicações práticas para a ANVISA


Métodos Não-Cromatográficos e RE 899/2003

• 2. Considerações gerais

• 2.1. “As informações contidas neste guia aplicam-se a métodos bioanalíticos, tais como cromatografia gasosa (CG), cromatografia líquida ... , utilizados na determinação quantitativa de fármacos e/ou metabólitos em matrizes biológicas, ... Também se aplica a outras técnicas analíticas, tais como métodos microbiológicos e imunológicos, ou para outras matrizes biológicas, embora, nestes casos, pode-se observar um alto grau de variabilidade.


• 2. Considerações gerais

• 2.4. Para os estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência deve-se utilizar padrão interno, sempre que métodos cromatográficos forem utilizados. Deve-se justificar a impossibilidade de sua utilização.


• 3.1. Especificidade

• 3.1.1. ... “Cada amostra branco deve ser testada utilizando o procedimento e as condições cromatográficas propostas”...

• 3.1.2. ... “interferência significativa no tempo de retenção do fármaco, metabólito ou padrão interno” ...

• 3.1.4. ... “deve ser injetado separadamente para determinar os tempos de retenção individuais”.

• 3.1.5. ... “A resposta de picos interferentes no tempo de retenção do fármaco deve ser inferior a 20%”...


• 3.2. Curva de calibração/linearidade

• 3.2.2. Para a determinação da curva de calibração, deve-se analisar amostras extraídas da matriz apropriada, no mínimo 6 (seis) concentrações diferentes. Procedimentos alternativos devem ser justificados, como na obtenção de uma correlação não-linear, em que um maior número de concentrações de padrões serão necessários.


• 3.5. Limite inferior de quantificação (LIQ)

• 3.5.1. Estabelecido por meio da análise de matriz biológica contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível quantificável com precisão e exatidão aceitáveis.

• 3.5.2. e 3.5.3. Razão de 5:1 entre o sinal e o ruído


• “Because of these significant differences between small and macromolecule analytes, different technologies, such as LC-MS for small molecules and LBAs for macromolecules, are often employed to determine drug levels for PK assessments.”

• “As a result of small molecule analysis moving to the LCMS platform, LBAs are now almost exclusively used to measure macromolecules.”

(Viswanathan et al. 2007)

• “Ligand-binding assays or immunoassays are nowadays especially used for macromolecules. In these assays, quantification is based on macromolecular interactions between the macromolecule and antibody.”

(EMEA 2009)


Cristal City (Viswanathan et al. 2007)

VALIDAÇÃO DE LBAS PARA MACROMOLÉCULAS

• Precisão e exatidão com CQs em matrizes equivalentes às previstas no estudo

• Preparação da matriz devido a substancias endógenas

• Avaliação de 5 ou mais concentrações cobrindo a faixa de quantificação do método:

• 1ª – LIQ• 2ª – baixa (3 X LIQ)• 3ª – média (média geométrica)• 4ª – alta (75% LSQ)• 5ª – LSQ




• Para LBAs a variabilidade inter-corridas normalmente contribui mais para a variabilidade geral do que a variabilidade itra-corrida.

• É recomendada ao menos 2 determinações independentes de cada amostra de validação em cada corrida por no mínimo 6 corridas.




• Para aceitação do método a imprecisão e a exatidão inter-corrida devem ser até 20% (25% para LIQ e LSQ)

• É recomendado que a soma da precisão mais a exatidão seja menor que 30% (40% para LIQ e LSQ)

• Todas as corridas devem ser incluídas nos cálculos finais, a não ser em casos de erros óbvios e documentados.



CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO DE CORRIDAS ANALÍTICAS

• 75% dos CCs dentro de 20% de exatidão (25% para LIQ e LSQ)

• CQB, CQM e CQA no mínimo em duplicata (5% do total de amostras desconhecidas)

• Aprovação mínima de 4 em 6 CQs dentro de 20% de exatidão e ao menos 50% de cada concentração


DRAFT EMEA 2009

Especificidade e Seletividade

• Especificidade do anticorpo e seletividade do método são pontos críticos do ensaio.

• Não deve haver reações cruzadas do anticorpo com outros compostos de estrutura semelhante ao analito.

• A especificidade é validada utilizando matriz de 10 fontes.

• A presença de anticorpos endógenos deve ser considerada.

• Devido à interferência de compostos endógenos a resposta do branco pode ser maior do que 20% da resposta do LIQ, o que é aceitável desde que não comprometa a exatidão do método.


DRAFT EMEA 2009

Curva de calibração

• É importante que a matriz das amostras e a matriz padrão sejam equivalentes.

• Caso não sejam, deve ser demonstrado que a relação dose- resposta não é afetada pela matriz.

• Quando padrões de calibração “âncora” forem utilizados, seus valores devem ser muito bem documentados.

• A exatidão dos padrões de calibração deve estar dentro de + ou – 20% (25 para LIQ e LSQ).


DRAFT EMEA 2009

Controles de Qualidade

• Ao menos 3 concentrações de CQ devem ser incluídas em cada corrida analítica.

• A precisão e a exatidão inter e intra-corrida deve estar dentro de 20%.

• O erro total deve ser menor do que 30% (40% LIQ e LSQ)

• Os resultados de todas as corridas devem ser incluídos para validação, exceto nos casos em que os erros são óbvios e documentados.


DRAFT EMEA 2009

Considerações gerais sobre a validação

• É recomendado que o tamanho da corrida de validação seja comparável ao das corridas com amostras desconhecidas.

• Deve ser demonstrado que as características do analito não são afetadas pelos métodos de preparação de amostras, aditivos (ex. anticoagulantes) e estabilidade durante todo o processo.

• A avaliação não deve apenas considerar propriedades fiisico-químicas mas também a integridade biológica.

• Cuidado com mudanças no método após a validação! (Diluentes, reagentes, pH, etc.)

• Os resultados de todas as corridas devem ser incluídos para validação, exceto nos casos em que os erros são óbvios e documentados.


DRAFT EMEA 2009

Kits Comerciais

• Kits comerciais podem ter sido desenvolvidos com propósitos diferentes de sua aplicação em estudos de bioequivalência.

• Necessitam ser revalidados.

• Os princípios de validação listados acima se aplicam.


Implicações práticas para a ANVISA

• Considerar as peculiaridades dos métodos não-cromatográficos na revisão da RE 899/2003.

• Para moléculas passíveis de análise por métodos cromatográficos,

é recomendado que estes sejam a primeira escolha.

• Quanto uma análise for possível por métodos cromatográficos, mas a empresa quiser utilizar imunoensaios, os mesmos parâmetros de precisão e exatidão devem ser exigidos, acrescidos dos demais cuidados peculiares à técnica.

• Para drogas cujo ensaio cromatográfico não for indicado, podem ser aceitos 20/25% como parâmetros de precisão e exatidão, acrescidos dos demais cuidados peculiares à técnica.

• Kits comerciais devem ser revalidados para estudos de biodisponibilidade relativa.


Referências

• C. T. Viswanathan, Surendra Bansal , Brian Booth , Anthony J. DeStefano , Mark J. Rose , Jeffrey Sailstad , Vinod P. Shah , Jerome P. Skelly , Patrick G. Swann , and Russell Weiner. Workshop/Conference Report — Quantitative Bioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand Binding Assays. The AAPS Journal. 2007; 9 (1) Article 4

• John W. A. Findlay and Robert F. Dillard. Appropriate Calibration Curve Fitting in Ligand Binding Assays. The AAPS Journal. 2007; 9 (2) Article 29.

• EMEA. GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS. (DRAFT) 2009.

• Resolução - RE nº 899, de 29 de maio de 2003. D.O.U. 02/06/2003

• Ligand Binding Assay Bioanalytical Focus Group (www.aaps.org)


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Comparação entre macromoléculas e moléculas pequenas

Macromoléculas Moléculas Pequenas

Natureza Biopolímeros complexos Orgânicas

Síntese Biosíntese Orgânica

Padrões de referência Heterogêneos e impuros Homogêneos de alta pureza

Solubilidade Hidrofílicas Variável

Avaliação de estabilidade

Complexa (bio-integridade)

Simples

Relação com o organismo

Endógenas ou similares a elementos endógenos

Geralmente xenobióticas, ausentes na

matriz.


Ligand Binding Assay - Definição

• Ligand: Latin ligare = ligar, Ligante

• Bind: Ligar, Prender, Unir

Ensaio de Ligação de Ligante

Imunoensaio*


Imunoensaio - Definição

• Um ensaio utilizado para detectar ou medir a interação macromolecular entre um ligante (analito de interesse) e um anticorpo.


Imunoensaio - Características

(Findlay & Dillard 2007)


Imunoensaio - Características

Não se emprega Padrão Interno

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