validação de métodos bioanalíticos curso de farmacologia clínica universidade mogi das cruzes...
TRANSCRIPT
![Page 1: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/1.jpg)
Validação de Métodos Bioanalíticos
Curso de Farmacologia Clínica
Universidade Mogi das Cruzes
Abril 2004
![Page 2: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/2.jpg)
Nas últimas décadas, houve um aumento de
métodos bioanalíticos aplicados à cromatografia
para a determinação qualitativa e quantitativa de
fármacos, produtos acabados, matérias primas e
amostras biológicas, em todas as fases do desen-
volvimento do fármaco desde a pesquisa até a rea-
lização de estudos de bioequivalência.
![Page 3: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/3.jpg)
Assim, devido este aumento e a globalização
da economia, a adoção de um sistema de qualida-
de reconhecido universalmente aceito, é requisito
fundamental.
![Page 4: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/4.jpg)
Portanto, o entendimento do que constituí
uma validação de métodos cromatográficos, possi-
bilita a garantia de um nível satisfatório de qualida-
de na validação metodológica (Massart et al., 1998;
Swartz & Krull, 1998).
![Page 5: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/5.jpg)
Desde o final dos anos 80, a importância da
validação de métodos bioanalíticos e suas influên-
cias na avaliação e interpretação dos resultados,
transformou-se em alvo de amplas discussões pre-
sentes em diversas Conferências tanto nos EUA
quanto na Europa e consequentemente fornecer
adequadas diretrizes em relação aos parâmetros
exigidos na validação analítica (Shan et al., 1991 e
1992; Dadgar, 1995; Cartwright et al., 1991 e Arnoux
& Morrison, 1992) .
![Page 6: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/6.jpg)
A correta avaliação dos Estudos Biofarma-
cêuticos só pode ser alcançada se a exatidão dos
dados analíticos forem obtidos (Pachla et al.,1986).
Além disso, essa exatidão depende de crité-
rios fundamentais empregados, não só em relação
à adequada interpretação desses resultados, como
também na aplicação da confiabilidade e na totali-
dade do desempenho do método bioanalitico.
![Page 7: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/7.jpg)
Assim, podemos destacar os principais critérios
fundamentais empregados na validação de métodos
bioanalíticos:
![Page 8: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/8.jpg)
Avaliação da droga e estabilidade do analito .
Seletividade/Especificidade.
Linearidade e modelo de calibração.
Precisão e Exatidão.
Sensibilidade, Limite de Quantificação e Detecção
Recuperação
* Pachla et al., 1986; Buick et al., 1990; MacDouglas e Crummett, 1980; Taylor, 1983;
Brooks e Weinfeld,1985; Dadgar e Smith, 1986; Inman et al., 1987 e Shan et al., 1987.
![Page 9: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/9.jpg)
Modernos métodos bioanalíticos são funda-
mentados em relação a uma variedade de técnicas
físicoquímicas e biológicas á saber:
![Page 10: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/10.jpg)
• Métodos Químicos: Cromatografia (CG, HPLC) e
uma variedade de processos utilizando métodos
de espectrometria de massa (MS) tais como MS-
MS e combinações de técnicas tais como CG-
MS,LC-MS.
• Métodos Biológicos: baseados em procedimen-
tos de imunoensaios; em particular o Radioimu-
noensaio (RIA), imunoensaio de múltiplas enzi-
mas (EMIT) e ensaio de imunoabsorção de enzi-
mas ligadas (ELISA).
• Métodos microbiológicos
![Page 11: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/11.jpg)
![Page 12: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/12.jpg)
![Page 13: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/13.jpg)
Tais métodos analíticos devem ser cuidado-
samente pré- validados na fase de desenvolvimento
e também validados durante o ensaio analítico, para
garantir que os mesmos sejam satisfatoriamente
realizados e que a confirmação das especificações
pré-determinadas seja encontrada; além disso,
gerar confiabilidade nos resultados obtidos (Buick
et al., 1990; Jackson, J. A; 1994; Shan et al., 1992).
![Page 14: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/14.jpg)
Para tanto, os mesmos envolvem
procedimen-
tos de determinação e quantificação de moléculas
orgânicas com amplas propriedades físico- quími-
cas, onde cada composto deve ser avaliado de acor-
do com as suas propriedades individuais e também
levando em consideração a complexidade analítica e
as concentrações almejadas (Jackson, J. A 1994).
![Page 15: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/15.jpg)
Seleção e Desenvolvimento
Pode-se considerar que a etapa crítica no Es-
tudo Biofarmacêutico é o desenvolvimento e valida-
ção de ensaios bio-analíticos, que consistem de
experimentos realizados para encontrar condições
necessárias para a quantificação do analito em
questão.
![Page 16: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/16.jpg)
Isto requer conhecimentos das propriedades
físico-químicas da droga para que o processo de
desenvolvimento seja racional e individualizado.
Assim, todos os critérios envolvidos no desen-
volvimento analítico deverão ser registrados em
relatórios de acompanhamento analítico (Snyder,
1988; Jackson, J.A 1994).
![Page 17: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/17.jpg)
Padrões
• Análise de Drogas ou seus Metabólitos é invariávelmete feita através de amostras “contaminadas”, curvas de calibração e amostras de controle de qualidade (QC).
• Padrões de Referência autenticados devem ser utilizados no estudo. Preferivelmente o mesmo composto.
• Caso contrário um sal, base, ácido ou éster do composto pode ser usado.
![Page 18: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/18.jpg)
Escolha da Procedência:
• Padrões certificados (U.S.Pharmacopea)
• Padrões disponíveis comercialmente de fontes de conhecida reputação.
• Padrões com pureza documentada, específicamente sintetízados por laboratórios comerciais.
![Page 19: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/19.jpg)
Deflazacort (DFZ) 21-Hydroxy DFZ (21-OH DFZ)
21-Acetate Dexamethazone (21-Ac DXM, I.S.)
O
HO
H H
H O
NO
OH
O
HO
H H
H O
NO
O
O
O
HO
F H
H
OHO
O
O
![Page 20: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/20.jpg)
A realização de uma pesquisa bibliográfica é
a primeira etapa para a busca do método bioanalíti-
co. Uma vez existindo o método, ele deverá ser tes-
tado quanto a sua reprodutibilidade.
Na inexistênciade um método bioanalítico para
um determinado fármaco, o centro analítico deve
desenvolver um método que responda satisfatória-
mente ao estudo desejado..
![Page 21: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/21.jpg)
Para a aplicação deste fato, consideram-se os
seguintes tipos de validação:
Validação Total
Validação total é de importância no desen-
volvimento e implementação de um método quando
aplicado pela primeira vez ou quando for utilizado
para determinar um novo analito nesta mesma
condição analítica.
![Page 22: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/22.jpg)
Validação Parcial
Validações parciais são modificações do
método já validado. Uma validação parcial pode
compreender desde uma pequena determinação de
precisão/exatidão a até quase uma validação total.
![Page 23: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/23.jpg)
No desenvolvimento de um método é nece-
ssário verificar toda a metodologia de preparação
da amostra, a qual envolve os processos de extra-
ção, separação, purificação, identificação e quanti-
ficação do fármaco na matriz biológica.
Para tanto, podemos dizer que nesta fase,
temos duas etapas distintas á saber:
![Page 24: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/24.jpg)
• Pré-Validação
• Objetivo: Avaliar os parâmetros de desempenho do método.
• Deve ser realizado para cada matriz biológica e cada espécie
química estudada.
• Deve ser realizado com pelo menos 3 lotes da matriz biológica,
onde cada lote é coletado de uma fonte diferente.
![Page 25: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/25.jpg)
• Cada lote deve conter:
– Uma curva de calibração utilizando a matriz pura,
matriz + I.S. e 5 a 8 pontos com a faixa de
aplicação do método.
– Amostras de Controle (n 5) de Qualidade de
Baixa concentração (QCA) Média concentração e
(QCB) Alta concentração (QCC) e Limite de
Detecção (LOQ QC).
![Page 26: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/26.jpg)
Nesta fase consiste na realização de alguns
ensaios preliminares visando à determinação dos
seguintes parâmetros:
Exatidão, precisão e recuperação;
Linearidade e limites de quantificação;
Seletividade.
![Page 27: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/27.jpg)
• Validação do Método
É a fase propriamente dita do
desenvolvimen-
to e estabelecimento da metodologia com o objeti-
vo de definir o ensaio bioanalítico.
Neste caso, a padronização de um método
bio-analítico típico inclui a determinação dos se-
guintes parâmetros fundamentais á saber:
![Page 28: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/28.jpg)
Especificidade e Seletividade;
Linearidade;
Precisão e Exatidão;
Sensibilidade, Limite de quantificação e
detecção;
Recuperação;
Estabilidade ;
![Page 29: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/29.jpg)
Protocolo do Ensaio Bioanalítico
Uma vez que o método bioanalítico foi desen-
volvido e totalmente validado, um manual de proce-
dimentos operacionais padronizados (POPs) para o
mesmo deve ser documentado.
Portanto, todas as análises do método em
questão devem ser submetidas conforme procedi-
mentos do respectivo POP.
![Page 30: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/30.jpg)
Alterações podem afetar significativamente
resultados finais como por exemplo, a substituição
por um outro tipo de coluna, uma mudança signifi-
cativa no comprimento de onda durante as análises
e ou mudança no procedimento de extração, requer,
no mínimo, revalidação parcial do método analítico.
![Page 31: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/31.jpg)
As amostras biológicas dos voluntários a
serem investigadas são processadas preferencial-
mente em duplicata e totalmente “randomizadas” e
podem estar compreendidas em:
• Uma única lista
• Em série de listas analíticas
![Page 32: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/32.jpg)
Importante que a análise de amostra bioló-
gica de um voluntário esteja compreendida em uma
única corrida analítica com a finalidadede minimizar
efeitos da variabilidade do inter-ensaio (Dighe e
Adams, 1991).
![Page 33: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/33.jpg)
Uma Lista analítica é constituída por * :
– Amostras analíticas em duplicata a ser
determinadas.
– Uma curva de calibração em duplicata utilizando
a matriz pura, matriz + I.S. e 5 a 8 pontos
correspondendo faixa de aplicação do método.
* Shan et al., 1992; Jackson, J.A 1994
![Page 34: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/34.jpg)
– Amostras de Controle (n 5) de Qualidade de
Baixa concentração (QCA) Média concentração e
(QCB) Alta concentração (QCC) dispostos em
intervalos para monitorar o desempenho
analítico.
![Page 35: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/35.jpg)
Parâmetros da Validação Bioanalítica
![Page 36: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/36.jpg)
Especificidade - Seletividade
A especificidade de um método é definida
quando o mesmo produz uma única resposta analí-
tica para um único analito.
![Page 37: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/37.jpg)
Já a seletividade é definida como a
habilidade
de uma técnica analítica em distinguir e quantificar,
ou não, uma droga em relação a outras resposta de
diferentes componentes presentes nos fluidos bio-
lógicos.
![Page 38: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/38.jpg)
Assim, uma vez que as técnicas
cromatográ-
ficas produzam respostas que possam ser distin-
guidas das demais resultantes dos diferentes inter-
ferentes presentes na matriz biológica; o termo se-
letivo é usualmente aplicado como parâmetro, na
validação dos métodos bioanalíticos (Karnes et al.,
1991; Dadgar e Brunett, 1995).
![Page 39: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/39.jpg)
Diversos interferentes podem surgir
durante
o desenvolvimento de um método analítico, á saber:
• Endógenos: compreende um amplo número de
compostos orgânicos de alto e baixo peso
molecular (hormônios, lipídeos, proteínas, etc.),
metabólitos de fármacos, precursores, produtos
de degradação do analito, co-administração de
fármacos e vitaminas.
![Page 40: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/40.jpg)
• Exógenos: impurezas presentes nos reagentes
empregados no processamento das amostras
analíticas, componentes utilizados na manufatura
dos recipientes de acondicionamento e ou uma
incompleta lavagem dos mesmos (Buick et al.,
1990; Dadgar et al., 1995).
![Page 41: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/41.jpg)
• Análise da especificidade e seletividade
emprega-sede no mínimo seis fontes de
amostras de matriz biológica branco obtida sob
controladas condições, avaliando-se o horário da
coleta, ingestão de alimentos, e outros fatores
considerados importantes ao método.
• Cada “branco” deve ser avaliado em relação a
interferentes, utilizando-se o método de extração
proposto e as condições analíticas em questão
(HPLC, LC/MS/MS).
![Page 42: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/42.jpg)
• Os resultados são confrontados com os obtidos
de uma solução aquosa do analíto em
concentrações ao Limite de Quantificação (LOQ).
• Qualquer interferência significativa no tempo de
retenção da droga, do metabólitos ou do padrão
interno (I.S.) deve ser rejeitado (Shan et al., 1992;
ISO/DIS 5725-1 - 5725-3, 1994).
![Page 43: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/43.jpg)
• Interferência em mais que 20% em relação a
concentração do LOQ, o método deve ser alterado
para eliminar os interferentes (Causey et al., 1995;
Doing et al., 1990 e Dadgar et al., 1995).
• Nicotina, drogas OTC e seus metabólitos, como
cafeína, aspirina, acetoaminofen e ibuprofeno
devem ser testados.
• Se mais de um analíto é avaliado, cada um deve
ser injetado separadamente.
![Page 44: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/44.jpg)
![Page 45: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/45.jpg)
Blank SampleI.S.
21-OH DFZ
21-OH DFZ (1ng/mL) + I.S. I.S.
21-OH DFZ
![Page 46: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/46.jpg)
Linearidade*
É considerada como a habilidade de se obter
resultados diretamente proporcionais à concentra-
ção do analito na amostra.
*International Conference of Harmonization - ICH, Guideline
for Validation of Analytical Procedure Methodology, 1996;
Comissionof European Communities – Comittee for Proprie-
tary Medicinal Products 111/5626/94 final draft, 1994; Buick et
al., 1990.
![Page 47: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/47.jpg)
A avaliação da curva de calibração, recomen-
rdam o uso:
• 5 a 8 determinações que correspondem ao intervalo
entre o valor superior e inferior da substância em exame,
que atendam aos requisitos de precisão, exatidão e
linearidade.
Pennickx et al., 1996; Shan et al., 1992; Hill et al., 1992; Metha, 1898; Massart et al., 1998 e Hartmann et al., 1998.
![Page 48: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/48.jpg)
Quatro fatores devem ser empregados no
desenvolvimento da curva de calibração:
• Precisão e exatidão menor ou igual a 15% nas
determinações nominais da curva de calibração,
exceto para as concentrações do LOQ.
• Precisão e exatidão menor ou igual a 20% nas
determinações nominais do LOQ.
![Page 49: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/49.jpg)
• Pelo menos quatro das seis concentrações
nominais devem estar de acordo com critérios
acima mencionados, incluindo os pontos do LOQ
e os pontos de calibração de menor concentra-
ção.
• Valor de coeficiente de correlação linear ou igual
ou maior que 0.95.
![Page 50: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/50.jpg)
21-OH DFZ
0 100 200 300 4000
100
200
300
400
500
Concentração Teórica (ng/mL)
Co
nce
ntr
açã
o E
xpe
rim
en
tal
(ng
/mL)
r>0.999
![Page 51: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/51.jpg)
21-Hydroxy DFZ (21-OH DFZ)
O
HO
H H
H O
NO
OH
21-Acetate Dexamethazone (21-Ac DXM, I.S.)
O
HO
F H
H
OHO
O
O
100ng/mL
20ng/mL
100L
Razão: 5
O Padrão Interno (I.S.) tem como finalidade corrigir erros e\ou
perdaspor transferências e pipetagem. Uma vez
quesua concentração é conhecida podemos
corrigir a concentração do analito
desassociando o volume.
![Page 52: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/52.jpg)
![Page 53: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/53.jpg)
Voluntário 08 - 1:30h após administração
I.S.
21-OH DFZ
![Page 54: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/54.jpg)
Precisão e Exatidão
Exatidão RuimPrecisão Boa
Exatidão BoaPrecisão Boa
Exatidão RuimPrecisão Ruim
Exatidão BoaPrecisão Ruim
![Page 55: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/55.jpg)
Precisão
É definida como grau de concordância entre
os resultados de análises individuais,quando o pro-
cedimento analítico é aplicado em diversas vezes
em uma mesma amostra analítica, em idênticas
condições experimentais.
Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Causon, R. 1997 e
Brittain, 1998.
![Page 56: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/56.jpg)
Além disso, é expressa como a porcentagem
do coeficiente de variação (C.V) ou o desvio padrão
relativo da média geométrica dos valores das repli-
catas de cada determinação nominal :
Precisão =% CV = (dp/média) x 100
dp = nc2- (c)2 : n (n-1)
Onde:
CV = coeficiente de variação
dp = desvio padrão
n = número de dados
c= concentração calculada
![Page 57: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/57.jpg)
* De acordo com a ICH de 1996 a precisão pode ser medida em dois diferentes níveis :
• Repetibilidade (Precisão intra-ensaio): é definida
como a habilidade de repetições de uma
metodologia empregada nas mesmas condições
laboratoriais, da utilização do mesmo corpo de
analistas, dos mesmos equipamentos e dos
mesmos reagentes analíticos em um curto
intervalo de tempo, considerando a realização do
ensaio analítico em um único dia .
* Relatório final da ISO (International Organization for Standardiza- tion, 1990/1991), Swartz e Kull ,1998; Hartmann et al., 1994; Causon, R. 1997; Shan et al., 1992; Buick et al.,1990
![Page 58: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/58.jpg)
• Reprodutibilidade (Precisão inter-ensaio): é definida
como a habilidade de repetições da mesma
metodologia analítica aplicada sob diferentes
condições laboratoriais como, por exemplo,
mudanças de analistas, reagentes e equipamentos
em subsequentes ocasiões que podem
compreender várias semanas ou até meses.
* Shan et al., 1992; USPXX 1990; Brooks, 1985; Hartmann et al, 1994 e Buick et al., 1990.
![Page 59: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/59.jpg)
A avaliação da precisão intra e inter ensaio,
recomendam o uso:
• 5 á 10 determinações em replicata para cada
nível de concentrações nominais pré-
estabelecidas das amostras de controle de
qualidade.
• Emprega-se três níveis de concentração: baixo,
que pode ser o LOQ; médio e alto, que estejam
compreendidos dentro do intervalo de limite
especificado do procedimento analítico.
![Page 60: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/60.jpg)
Exatidão
É definida como o grau de concordância
entre os valores individuais encontrados em rela-
ção aos valores reais ou nominais
* Causon, R. 1997; Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Brittain,
1998 e Mehta, 1989.
![Page 61: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/61.jpg)
Além disso, é expressa como a porcentagem
do erro padrão relativo da média geométrica dos
valores das replicatas de cada determinação nomi-
nal :
% E.R = (V. exp - V. t) / V. t x 100
Onde,
V. exp: Valores Experimentais
V. t: Valores teóricos
![Page 62: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/62.jpg)
Normalmente os ensaios para a exatidão
poderão se realizados:
• Um único dia “ Exatidão Intra-ensaio”
• Dias diferentes “Exatidão Inter-ensaio”
• Emprega-se três níveis de concentração: baixo, que pode ser o LOQ; médio e alto, que estejam compreendidos dentro do intervalo de limite especificado do procedimento analítico.
• 5 á 10 determinações em replicata para cada nível de concentrações nominais pré-estabelecidas das amostras de controle de qualidade.
* Buick et al., 1990 e Shan et al,. 1992 e 2000.
![Page 63: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/63.jpg)
Sensibilidade, Limite de Detecção (LOD), Limitede Quantificação (LOQ)
A metodologia analítica é dito sensível quan-
do pequenas mudanças nos padrões de calibração
podem gerar grandes variações na resposta do ins-
trumento analítico. Portanto, ela está relacionada
com inclinação (“slope”) da curva de calibração.
* IUPAC, 1976;Causon, 1997 e Mehta, 1989
![Page 64: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/64.jpg)
Limite de Detecção representa a mais baixa
concentração do composto de investigação que
pode ser detectada em relação à amostra biológica
branco com certo limite de confiabilidade.
• É estabelecido através de análises de soluções
com concentrações conhecidas e decrescentes do
analito até que o nível detectável seja 2 a 3 vezes
superior ao ruído da linha de base cromatográfica
* Swartz e Krull, 1998; Metha, 1989; Mehta, A.C 1987; Mehta A.C 1989;
Brittain, 1998 e BuicK et al.,1990.
![Page 65: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/65.jpg)
O Limite de Quantificação representa a mais
baixa concentração de um composto de investiga-
ção que atende os requisitos para precisão e exati-
dão do ensaio analítico.
• É estabelecido através da a razão 5:1 entre o sinal
e o ruído da linha de base cromatográfica no
tempo de retenção do analito.
• de 5 a 6 determinações em replicata para cada
nível de concentração pré-estabelecida das
amostras de controle de qualidade do LOQ.
* Swartz e Krull, 1998; Causon, R. 1997 e Buick et al., 1990.
![Page 66: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/66.jpg)
Recuperação
Recuperação de um analíto em um estudo é a
resposta obtida de uma quantidade do analito adi-
cionada e recuperada da matrixbiológica e compa-
rada a resposta obtida do padrão puro.
A recuperação avalia a eficiência da extração
e sua variabilidade. Embora recuperações próximas
de 100% sejam desejáveis, baixas recuperações po-
dem ser utilizadas (50-60%) se forem precisas, exa-
tas e reprodutíveis.
![Page 67: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/67.jpg)
Os experimentos de recuperação devem
ser
realizados comparando-se os resuldatos de amos-
tras extraidas a três concentrações diferentes ( alta,
média e baixa ) com padrões não extraidos que
representam 100%.
![Page 68: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/68.jpg)
Para o estudo da recuperação:
• Emprega-se três níveis de concentração: baixo, que pode ser o LOQ; médio e alto, que estejam compreendidos dentro do intervalo de limite especificado do procedimento analítico.
• 5 á 10 determinações em replicata para cada nível de concentrações nominais pré-estabelecidas das amostras de controle de qualidade.
* Mehta, 1989; Causon, R. 1997 e FDA – Guideline for Industry / Bio-analytical Method Validation final draft ,1998 e 2001
![Page 69: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/69.jpg)
Estabilidade
A Resolução RDC Nº 84 de 19 de março de
2002 e FDA, 1997 , estabelecem que que o estudo
da estabilidade deve ser considerada durante a fase
de desenvolmento analítico.
Neste sentido, os estudos de estabilidade
foram classificados em:
![Page 70: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/70.jpg)
• Curta duração:
– Congelamento e descongelamento: - 70 ou - 20°C
por 3 ciclos; recongelamento de 12- 24hs;
– Condições de Análise: 20 - 25°C, tempo máximo
de análise do lote;
– Condições de Auto Sampler: 25°C; tempo
máximo de análise do lote;
![Page 71: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/71.jpg)
• Média duração:
– temperatura - 20 °C;
– Avaliar no tempo zero, um, dois quatro, oito e
dezesseis dias de armazenamento.
• Longa duração;
– deve compreender no tempo entre a data da primeira coleta das amostras e a data da análise da última amostra
– 03 temperaturas de estocagem,4, - 20 e - 70ºC
![Page 72: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/72.jpg)
• Soluções-padrão;
– Deve ser avaliada à temperatura ambiente por
no mínimo 6 horas.
– Se a solução estoque e padrão interno são
refrigeradas ou congeladas por um período de
quatorze dias,
![Page 73: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/73.jpg)
Considerações
• Preparar três á cinco determinações das concentrações de controle de qualidade (baixa, média, e alta) juntamente com o padrão interno nas amostras biológicas e comparar nas condições determinadas com as mesmas amostras recém preparadas.
• Um composto é considerado estável se sua decomposição não ultrapassar 20% da sua concentração inicial ou não ultrapassar o limite estabelecido no protocolo de validação . O prazo de validade é estabelecido com base neste parâmetro
![Page 74: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/74.jpg)
Critérios de Aceitabilidade
• Precisão: Os CV% do inter-day para os QCs é
15%, e 20% para o LOQ QC, avaliados em um
mínimo de 3 lotes.
• Exatidão: A média dos valores do inter-day devem
ser menores que 15% do valor nominal dos
QCs, e não desviar mais que 20% para LOQ QC.
• Sensibilidade: O menor ponto da curva de
calibração aceitável como limite de quantificação
(LOQ) do método é aquele com CV% 20% (inter-
day).
![Page 75: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/75.jpg)
• Especificidade:
– Respostas de picos interferentes no mesmo
tempo de retenção do analíto devem ser menores
que 20% da resposta de um LOQ.
– Respostas de picos interferentes no mesmo
tempo de retenção do padrão interno (I.S.) devem
ser menores que 5% da resposta de um I.S.
utilizado nos estudos.
![Page 76: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/76.jpg)
• Estabilidade: Teste de Longo-Prazo, Curto-Prazo,
Freezer and Thaw, Soluções de Estoque e Auto-
Sampler são propostos no SOP e variam de
estudo para estudo
![Page 77: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/77.jpg)
Guia da Validação
Obtenção do Material Biológico Obtenção do Método Analítico
Referência Bibliográfica
AdequaçãoDesenvolvimento
do Método
Não disponívelDisponível
Pré - Validação
Estabilidade Método Validado
Obtenção do Plasma
Congelamento
Recebimento
Armazenamento
![Page 78: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/78.jpg)
Pré - Validação
Condição Analítica Definida
Seletividade
Recuperação
Limite de Quantificação
Linearidade
Precisão
Exatidão
Parâmetros de Aceitabilidade
Estabilidade
InterferênciaSem Interferência
< 60%> 60%
> 20%< 20%
< 15%
> 15%
> 15%
> 15%< 15% O.K
< 15%
Restrições
![Page 79: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/79.jpg)
Estabilidade
Curta duração
Média duração
Longa duraçãoIniciar o Estudo
Compatível tempo
Compatível tempo
Não compatível tempo
Não compatível tempo
Não compatível tempo
Redefinir tempo de Estudo de Estocagem
![Page 80: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/80.jpg)
Voluntários
Obtenção do Material Biológico
Obtenção do Plasma
Congelamento
Recebimento
Armazenamento Estabilidade
O.K Inicio do Estudo
Aplicação do Método Validado
Corrida do Lote
APROVADO
O.K O.K O.K
Curvas C.QsAmostras
RELATÓRIO
![Page 81: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/81.jpg)
![Page 82: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/82.jpg)
![Page 83: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/83.jpg)
![Page 84: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/84.jpg)
![Page 85: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/85.jpg)
![Page 86: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/86.jpg)
![Page 87: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/87.jpg)
![Page 88: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/88.jpg)
![Page 89: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/89.jpg)
![Page 90: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/90.jpg)
![Page 91: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/91.jpg)
![Page 92: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/92.jpg)
![Page 93: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/93.jpg)
![Page 94: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/94.jpg)
![Page 95: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/95.jpg)
![Page 96: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/96.jpg)
![Page 97: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/97.jpg)
![Page 98: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/98.jpg)
![Page 99: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/99.jpg)
![Page 100: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/100.jpg)
![Page 101: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/101.jpg)
![Page 102: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/102.jpg)
![Page 103: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/103.jpg)
![Page 104: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/104.jpg)
![Page 105: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/105.jpg)
![Page 106: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/106.jpg)
![Page 107: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/107.jpg)
![Page 108: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/108.jpg)
![Page 109: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/109.jpg)
![Page 110: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/110.jpg)
![Page 111: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/111.jpg)
![Page 112: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/112.jpg)
![Page 113: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/113.jpg)
![Page 114: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/114.jpg)
![Page 115: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/115.jpg)
![Page 116: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/116.jpg)
![Page 117: Validação de Métodos Bioanalíticos Curso de Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Abril 2004](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081516/552fc102497959413d8be242/html5/thumbnails/117.jpg)