advances in techniques of testing mycobacterial

7/27/2019 Advances in Techniques of Testing Mycobacterial

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B u l l . O r g . m o n d . S a n t e 1 9 6 9 , 4 1 , 2 1 - 4 3B u l l . W l d H l t h O r g .

A d v a n c e s i n T e c h n i q u e s o f T e s t i n g M y c o b a c t e r i a lD r u g S e n s i t i v i t y , a n d t h e U s e o f S e n s i t i v i t y T e s t si n T u b e r c u l o s i s C o n t r o l P r o g r a m m e s

G . CANETTI,1 WALLACE FOX,2 A . KHOMENK O,3 H . T . MAHLER,'N . K . M E N O N , 5 D . A . M I T C H I S O N , ' N . RIST 1 & N . A . W M E L E V 7I n a p a p e r a r i s i n g o u t o f a n i n f o r m a l i n t e r n a t i o n a l c o n s u l t a t i o n o f s p e c i a l i s t s i n t h eb a c t e r i o l o g y o f t u b e r c u l o s i s h e l d i n 1 9 6 1 , a n a t t e m p t w a s m a d e t o f o r m u l a t e c r i t e r i a , a n ds p e c i f y t e c h n i c a l p r o c e d u r e s , f o r r e l i a b l e t e s t s o f s e n s i t i v i t y ( t h e a b s o l u t e - c o n c e n t r a t i o nm e t h o d , t h e r e s i s t a n c e - r a t i o m e t h o d a n d t h e p r o p o r t i o n m e t h o d ) t o t h e 3 m a i n a n t i t u b e r c u -l o s i s d r u g s ( i s o n i a z i d , s t r e p t o m y c i n a n d p - a m i n o s a l i c y l i c a c i d ) . S e v e n y e a r s l a t e r , a f u r t h e r

c o n s u l t a t i o n w a s h e l d t o r e v i e w t h e l a t e s t d e v e l o p m e n t s i n t h e f i e l d a n d t o s u g g e s t h o ws e n s i t i v i t y t e s t s m i g h t b e p u t t o p r a c t i c a l u s e i n t u b e r c u l o s i s c o n t r o l p r o g r a m m e s . T h ep a r t i c i p a n t s r e a c h e d a g r e e m e n t o n h o w t o d e f i n e d r u g s e n s i t i v i t y a n d r e s i s t a n c e , a n d s t r e s s e dt h e i m p o r t a n c e o f u s i n g a d i s c r i m i n a t i o n a p p r o a c h t o t h e c a l i b r a t i o n o f s e n s i t i v i t y t e s t s .T h e i r v i e w s a r e c o n t a i n e d i n t h e p r e s e n t p a p e r , w h i c h a l s o i n c l u d e s d e s c r i p t i o n s o f t h es e n s i t i v i t y t e s t s u s e d b y t h e M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l o f G r e a t B r i t a i n f o r f i r s t - a n d s e c o n d -l i n e d r u g s ( m i n i m a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n a n d r e s i s t a n c e - r a t i o m e t h o d s ) , t h e t w o m a i nv a r i a n t s o f t h e p r o p o r t i o n m e t h o d d e v e l o p e d b y t h e I n s t i t u t P a s t e u r , P a r i s , a n d a m e t h o d f o rc a l i b r a t i n g s e n s i t i v i t y t e s t s .I . I N T R O D U C T I O N 8

A s t h e o u t c o m e o f a n i n t e r n a t i o n a l c o n s u l t a t i o n o fp e c i a l i s t s i n t h e b a c t e r i o l o g y o f t u b e r c u l o s i s , a r -a n g e d b y WHO i n 1 9 6 1 , C a n e t t i e t a l . ( 1 9 6 3 ) d e -c r i b e d c r i t e r i a a n d t e c h n i q u e s f o r r e l i a b l e t e s t s o fm y c o b a c t e r i a l r e s i s t a n c e t o t u b e r c u l o s t a t i c d r u g s .S i n c e t h e n , c o n s i d e r a b l e e x p e r i e n c e h a s b e e na i n e d i n t h e u s e o f t h e t e s t s d e s c r i b e d a n d newd r u g s h a v e b e e n i n t r o d u c e d . T h e t e c h n i c a l p r o b l e m si n v o l v e d i n s t a n d a r d i z i n g s u c h m e t h o d s a r e nowm u c h b e t t e r u n d e r s t o o d . T h e p a p e r b y C a n e t t i e t a l .

( 1 9 6 3 ) h a d s a i d l i t t l e a b o u t how s e n s i t i v i t y t e s t sm i g h t b e p u t t o p r a c t i c a l u s e i n t h e c o n t r o l o ft u b e r c u l o s i s . T h e p r e s e n t a r t i c l e r e v i e w s t h e p r o -g r e s s t h a t h a s b e e n made i n m e t h o d s o f s e n s i t i v i t yt e s t i n g a n d t h e i r c a l i b r a t i o n . F u r t h e r , t h e w a y s i nw h i c h t h e r e s u l t s o f s e n s i t i v i t y t e s t s ma y i n f l u e n c et h e c h o i c e o f r e gi m e n s o f c h e m o t h e r a p y f o r i n d i v i d -u a l p a t i e n t s , a n d t h e i r u s e t o e s t i m a t e t h e p r e v a l e n c eo f d r u g - r e s i s t a n t s t r a i n s i n t h e c o m m u n i t y , a r e e v a -l u a t e d . A n a t t e m p t i s made a l s o t o f o r m u l a t e t h e

1 C h e f d e S e r v i c e , I n s t i t u t P a s t e u r , 2 5 r u e d u D o c t e u rR o u x , P a r i s 1 5 e , F r a n c e .' D i r e c t o r , M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l' s T u b e r c u l o s i s a n dC h e s t D i s e a s e s R e s e a r c h U n i t , B r o m p t o n H o s p i t a l , F u l h a mR o a d , L o n d o n , S . W . 3 , E n g l a n d .3 F o r m e r l y M e d i c a l O f f i c e r , T u b e r c u lo s i s , D i v i s i o n o fC o m m u n i c a b l e D i s e a s e s , W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n ,G e n e v a , S w i t z e r l a n d ; p r e s e n t a d d r e s s : P r o f e s s o r a n d Head o fT u b e r c u l o s i s D e p a r t m e n t , P o s t g r a d u a t e M e d i c a l I n s t i t u t e ,K h a r k o v , USSR.

' C h i e f M e d i c a l O f f i c e r , T u b e r c u l o s i s , D i v i s i o n o f Com-m u n i c a b l e D i s e a s e s , W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n , G e n e v a ,S w i t z e r l a n d .

b D i r e c t o r , T u b e r c u l o s i s C h e m o t h e r a p y C e n t r e , M a d r a s ,I n d i a .' H o n o r a r y D i r e c t o r , M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l ' s U n i tf o r R e s e a r c h o n Drug S e n s i t i v i t y i n T u b e r c u l o s i s , R o y a lP o s t - g r a d u a t e M e d i c a l S c h o o l , D u c a n e R o a d , L o n d o n , W . 1 2 ,E n g l a n d .7 D i r e c t o r , C e n t r a l R e s e a r c h I n s t i t u t e o f T u b e r c u l o s i s ,M o s c o w - 1 2 8 , USSR.8 P r e p a r e d b y t h e p a r t i c i p a n t s i n a n i n f o r m a l c o n s u l t a t i o no n t h e d r u g - r e s i s t a n c e p r o b l e m i n t u b e r c u l o s i s , h e l d i nG e n e v a , S w i t z e r l a n d , f r o m 2 3 t o 2 6 A p r i l 1 9 6 8 : Dr G .C a n e t t i , Dr W a l l a c e F o x , Dr A . Khomenko, Dr H . T . M a h l e r ,Dr N . K . Menon, P r o f e s s o r D . A . M i t c h i s o n , Dr N . R i s ta n d P r o f e s s o r N . A . S m e l e v .

3 5 3 -21-


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G . C A N E T T I AND O TH ER Sr o l e o f s e n s i t i v i t y t e s t s i n t u b e r c u l o s i s c o n t r o l p r o -g r a m m e s a t w i d e l y v a r y i n g s t a g e s o f d e v e l o p m e n t .

DE FI N I T I O N O F DRUG RES IS TANCEDrug r e s i s t a n c e m a y b e d e f i n e d i n b a c t e r i o l o g i c a l

t e r m s o r i n t h e l i g h t o f t h e p r o b a b l e r e s p o n s e o f t h ep a t i e n t t o c h e m o t h e r a p y w i t h t h e d r u g c o n c e r n e d .As i t i s d i f f i c u l t t o e s t a b l i s h a p r e c i s e c l i n i c a l d e f i n i -t i o n o f r e s i s t a n c e , a d e f i n i t i o n i n p u r e l y b a c t e r i o l o g i -c a l t e r m s h a s b e e n a d o p t e d f o r t h e p u r p o s e s o f t h i sp a p e r . T h e f o l l o w i n g s t a t e m e n t ( M i t c h i s o n , 1 9 6 2 ) i sc o n s i d e r e d t o b e a d e q u a t e :

" R e s i s t a n c e i s d e f i n e d a s a d e c r e a s e i n s e n s i t i v i t y o fs u f f i c i e n t d e g r e e t o b e r e a s o n a b l y c e r t a i n t h a t t h e s t r a i nc o n c e r n e d i s d i f f e r e n t f r o m a s a m p l e o f w i l d s t r a i n s o fhuman t y p e t h a t h a v e n e v e r c o m e i n t o c o n t a c t w i t h t h ed r u g . "S u c h a d e f i n i t i o n a s s u m e s t h a t t h e v a r i a t i o n i ns e n s i t i v i t y o f s e n s i t i v e s t r a i n s t o a n y o n e o f t h ea n t i b a c t e r i a l d r u g s i s s m a l l . ( I t d o e s n o t a p p l y t ot h i o a c e t a z o n e , s i n c e n a t u r a l r e s i s t a n c e t o t h i s d r u go c c u r s i n a h i g h p r o p o r t i o n o f s t r a i n s o b t a i n e d f r o mc e r t a i n r e g i o n s o f t h e w o r l d ( T h o m a s e t a l . , 1 9 6 1 ;R i s t , 1 9 6 8 ; M i t c h i s o n & A l l e n , t o b e p u b l i s h e d ) . )F o r m o s t o f t h e a n t i t u b e r c u l o s i s d r u g s , t h e r e i se v i d e n c e t h a t a d i m i n i s h e d c l i n i c a l r e s p o n s e m ayo c c u r w h e n r e s i s t a n c e i n t h e a b o v e - m e n t i o n e d b a c -t e r i o l o g i c a l s e n s e i s d e m o n s t r a t e d i n t h e l a b o r a t o r y .

AV A ILABLE METHOD S O F T E S T I N GF O R DRUG SENSITIVITY

T h r e e w i d e l y u s e d m e t h o d s f o r t e s t i n g s e n s i t i v i t yt o i s o n i a z i d , s t r e p t o m y c i n a n d p a r a - a m i n o s a l i c y l i ca c i d ( P A S ) o n L o w e n s t e i n - J e n s e n m e d i u m - n a m e l y ,t h e a b s o l u t e - c o n c e n t r a t i o n m e t h o d , t h e r e s i s t a n c e -r a t i o m e t h o d a n d t h e p r o p o r t i o n m e t h o d - w e r e d e -s c r i b e d b y C a n e t t i e t a l . ( 1 9 6 3 ) . P a r t I I o f t h ep r e s e n t p a p e r d e s c r i b e s t h e m i n i m a l i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n m e t h o d a n d t h e r e s i s t a n c e - r a t i om e t h o d ; P a r t I I I , a s i m p l i f i e d v a r i a n t a n d a s t a n d a r dv a r i a n t o f t h e p r o p o r t i o n m e t h o d ; a n d P a r t I V , am e t h o d o f c a l i b r a t i n g s e n s i t i v i t y t e s t s .T h e r e a r e , o f c o u r s e , o t h e r m e t h o d s , i n c l u d i n gt e s t s w i t h a g a r - b a s e d s e m i - s y n t h e t i c m e d i a a n dl i q u i d m e d i a , a s w e l l a s v e r t i c a l d i f f u s i o n m e t h o d s .T h e r e r e m a i n s a n e e d f o r m or e r a p i d a n d s i m p l eb u t a c c u r a t e t e c h n i q u e s o f s e n s i t i v i t y t e s t i n g . D i r e c tt e s t s p r o v i d e r e s u l t s more r a p i d l y t h a n i n d i r e c t t e s t s ,w h i c h a r e u s e d i n m o s t l a b o r a t o r i e s . I t i s t h e r e f o r ee n c o u r a g i n g t h a t p r o g r e s s w i t h d i r e c t t e s t s i s b e i n g

made i n t w o d i r e c t i o n s . F i r s t , s i m p l i f i e d d i r e c t t e s t s ,w h i c h a r e a l r e a d y a v a i l a b l e w i t h c e r t a i n m e t h o d s( s e e P a r t I I I ) , a r e b e i n g f u r t h e r d e v e l o p e d , e s p e c i a l l yf o r i s o n i a z i d a n d s t r e p t o m y c i n . S e c o n d l y , t h e s l i d e -c u l t u r e m e t h o d , w h i c h y i e l d s r e s u l t s i n 7 d a y s , i sb e i n g s t a n d a r d i z e d i n t e r m s o f e s t a b l i s h e d i n d i r e c tt e s t s .

T HE C A LI BR AT I O N O F T ES TST h e n e c e s s i t y t o s t a n d a r d i z e a n y s e n s i t i v i t y t e s tm e t h o d w a s e m p h a s i z e d b y C a n e t t i e t a l . ( 1 9 6 3 ) , b u t

t h e y g a v e n o d e t a i l s o f t h e w a y s i n w h i c h t h i s m i g h tb e d o n e . O b j e c t i v e m e t h o d s o f c a l i b r a t i o n a r e i m -p o r t a n t f o r s e v e r a l r e a s o n s . F i r s t , t o c l a r i f y how t h ep r e s e n t c r i t e r i a o f r e s i s t a n c e i n t h e m e t h o d s d e -s c r i b e d i n P a r t s I I a n d I I I h a v e b e e n o b t a i n e d .S e c o n d l y , f o r t e c h n i c a l r e a s o n s t h e m o s t e f f i c i e n tc r i t e r i o n o f r e s i s t a n c e m a y b e s l i g h t l y d i f f e r e n t f r o mo n e l a b o r a t o r y t o a n o t h e r . I n p a r t i c u l a r , d r u g a c t i v -i t y m a y v a r y b e c a u s e o f h e a t i n s t a b i l i t y o f s o m ed r u g s d u r i n g i n s p i s s a t i o n o r s t o r a g e ( n o t a b l y e t h i o n -a m i d e a n d c y c l o s e r i n e ) . T h e t y p e o f c o n t a i n e r a n dt h e t y p e o f c l o s u r e f o r s l o p e s c o n t a i n i n g s t r e p t o m y -c i n a l s o a f f e c t t h e r e s u l t ( K r e b s e t a l . , 1 9 6 2 ; I n t e r n a -t i o n a l U n i o n a g a i n s t T u b e r c u l o s i s , 1 9 6 4 ) . T h i r d l y ,o b j e c t i v e m e t h o d s o f c a l i b r a t i o n a l l o w o f c o m p a r i -s o n s b e t w e e n m e t h o d s o f s e n s i t i v i t y t e s t i n g i n w h i c ht h e m e a s u r e s o f s e n s i t i v i t y a r e e x p r e s s e d o n d i f f e r e n ts c a l e s .I n t h e p a s t , a co m m o n a p p r o a c h w a s t o t e s t as a m p l e o f p r e s u m e d l y s e n s i t i v e s t r a i n s . S t r a i n s w e r ec o n s i d e r e d t o b e r e s i s t a n t i f t h e y w e r e s l i g h t l y morer e s i s t a n t t h a n t h e g r e a t m a j o r i t y o f t h e s e n s i t i v es t r a i n s . S u c h a p r o c e d u r e h a s t h e d e f e c t t h a t s t r a i n sc o n s i d e r e d t o h a v e n a t u r a l o r p r i m a r y r e s i s t a n c em u s t b e r e m o v e d f r o m t h e p o p u l a t i o n o f s e n s i t i v es t r a i n s , u s i n g n e c e s s a r i l y a r b i t r a r y c r i t e r i a .A n a l t e r n a t i v e a p p r o a c h i s t o c o n s i d e r t h e r e s u l t so f t h e t r e a t m e n t o f p a t i e n t s who h a v e o r g a n i s m s o fv a r y i n g d e g r e e s o f s e n s i t i v i t y a t t h e s t a r t o f t r e a t -m e n t , a n d t o t r y t o d e t e r m i n e a t w h a t l e v e l o fs e n s i t i v i t y t h e r e i s a c h a n g e i n t h e t h e r a p e u t i c r e -s p o n s e . I n p r a c t i c e , t h e n u m b e r o f p a t i e n t s w i t hi n i t i a l l y r e s i s t a n t s t r a i n s who a r e t r e a t e d w i t h t h ed r u g c o n c e r n e d , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h o n l yo n e o t h e r d r u g , i s t o o s m a l l t o a l l o w p r e c i s e c r i t e r i ao f r e s i s t a n c e t o b e o b t a i n e d .

H o w e v e r , t h e b e s t a v a i l a b l e a p p r o a c h i s t o c o m -p a r e t h e s e n s i t i v i t y o f a s a m p l e o f s t r a i n s f r o mu n t r e a t e d p a t i e n t s ( a p r e d o m i n a n t l y s e n s i t i v e s a m -p l e ) w i t h a s a m p l e o f s t r a i n s f r o m p a t i e n t s who h a v eb e e n t r e a t e d w i t h t h e d r u g f o r a t l e a s t a f e w m o n t h s ,

2 2


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M Y C O B A C T E R I A L DRUG S E NSI T IVI T Y T ESTS: R E C E N T A D V A N C E S AND PRA C T I C A L US E

w i t h o u t s u c c e s s ( a p r e d o m i n a n t l y r e s i s t a n tT h e c r i t e r i o n o f r e s i s t a n c e t h a t d i s c r i m i -b e t w e e n t h e t w o s a m p l e s w i t h t h e g r e a t e s tc a n t h e n b e c h o s e n . T h i s d i s c r i m i n a t i o ni s d e s c r i b e d f u l l y i n P a r t I V ( " T h e c a l i b r a -

o f s e n s i t i v i t y t e s t s " ) . F o r s u c h a c o m p a r i s o n , i ts u n n e c e s s a r y t o h a v e e i t h e r a p u r e p o p u l a t i o n o fs t r a i n s o r a p u r e p o p u l a t i o n o f r e s i s t a n t s t r a i n s :t i s e s s e n t i a l o n l y t h a t t h e r e s h o u l d b e a s u b s t a n t i a li n t h e p r o p o r t i o n o f r e s i s t a n t s t r a i n s w i t h -n e a c h s a m p l e . U n f o r t u n a t e l y , e v e n w i t h t h i s d i s -a p p r o a c h , o w i n g t o t h e e r r o r s i n h e r e n tn a n y m e t h o d o f t e s t i n g , s o m e m i s c l a s s i f i c a t i o n o fn s i t i v e s t r a i n s a s r e s i s t a n t , a n d v i c e v e r s a , t e n d s t oS i n c e i t i s d e s i r a b l e t o a v o i d m i s c l a s s i f i c a t i o nf s e n s i t i v e s t r a i n s a s r e s i s t a n t , b e c a u s e t h i s m ay l e a dh e p h y s i c i a n t o d e p r i v e t h e p a t i e n t o f a v a l u a b l e

i t i s p r e f e r a b l e t o c h o o s e a f i n a l c r i t e r i o n o ft h a t v e r y r a r e l y m i s c l a s s i f i e s a s e n s i t i v ea l t h o u g h i t m ay m o r e o f t e n f a i l t o d e t e c tw i t h b o r d e r l i n e d e g r e e s o f r e s i s t a n c e .A s s o o n a s p o s s i b l e a f t e r s t a r t i n g t o c a r r y o u tt e s t s , i r r e s p e c t i v e o f t h e m e t h o d o f t e s t i n g

a l a b o r a t o r y s h o u l d make p r o v i s i o n f o rh e c a l i b r a t i o n o f t h e s e t e s t s . T h i s w i l l make i tt o e s t a b l i s h w h e t h e r t h e c r i t e r i a o f r e s i s t a n c eo p o s e d b y t h e i n i t i a t o r s o f t h e m e t h o d a r e e n t i r e l yi n t h e l a b o r a t o r y i n q u e s t i o n o r w h e t h e r s o m e

f t h e c r i t e r i a r e q u i r e m o d i f i c a t i o n . F u r t h e r m o r e , i tb e d e s i r a b l e f o r l a r g e l a b o r a t o r i e s t o r e p e a tc a l i b r a t i o n p r o c e d u r e a t i n t e r v a l s , e s p e c i a l l y f o rt h a t a r e d i f f i c u l t t o p e r f o r m . E v e n t h o u g hw o r k w o u l d b e n e c e s s a r y , i t w o u l d b et h a t t h e e f f i c i e n c y o f t h e t e s t s p e r f o r m e d i nl a b o r a t o r y r e m a i n e d h i g h . I t i s d e s i r a b l e t h a to f p r e d o m i n a n t l y r e s i s t a n t c u l t u r e s s h o u l d

e m a i n t a i n e d i n r e f e r e n c e l a b o r a t o r i e s f o r i s s u e t on y l a b o r a t o r y i n w h i c h i t i s d e s i r e d t o c a l i b r a t et e s t s .T h e d i s c r i m i n a t i o n a p p r o a c h s h o u l d b e u s e d a l s on c o m p a r i n g m e t h o d s o f s e n s i t i v i t y t e s t i n g . F o r t h i st h e b e s t c r i t e r i o n f o r e a c h m e t h o d i s c h o s e nn d i t s a b i l i t y t o d i s c r i m i n a t e b e t w e e n p r e d o m i n a n t -y s e n s i t i v e a n d p r e d o m i n a n t l y r e s i s t a n t g r o u p s o fi s e x p r e s s e d a s a p e r c e n t a g e , w h i c h e s t i m a t e sh e e f f i c i e n c y o f e a c h m e t h o d i n t h e d e t e c t i o n o f

COMPARISO N O F METHOD S O F SENSITIVITY T EST I NGA m o ng t h e t e c h n i c a l i s s u e s c o n c e r n i n g s e n s i t i v i t y

t h e s t a n d a r d i z a t i o n o f t h e s i z e o f t h e i n o c u l u m

r e m a i n s o f t h e g r e a t e s t i m p o r t a n c e . F u r t h e r e v i -d e n c e i s a c c u m u l a t i n g t h a t t h e r e i s a l a r g e d i f f e r e n c ef r o m c u l t u r e t o c u l t u r e i n t h e number o f c o l o n i e st h a t g r o w f r o m a s i m i l a r i n o c u l u m s p e c i f i e d b yw e i g h t o r o p a c i t y ( C a n e t t i e t a l . , 1 9 6 3 ; I n t e r n a t i o n a lU n i o n a g a i n s t T u b e r c u l o s i s , 1 9 6 4 ; L e f f o r d & M i t -c h i s o n , 1 9 6 6 ; B a r t m a n n & G a l v e z - B r a n d o n , 1 9 6 8 ) .V a r i a t i o n i n t h e n u m b e r o f c u l t u r a b l e p a r t i c l e s ( f o r -m e r l y known a s t h e " v i a b l e c o u n t " ) c a n b e a t t r i -b u t e d e i t h e r t o d i f f e r e n c e s i n t h e a c t u a l n u m b e r o fo r g a n i s m s i n t h e i n o c u l u m o r t o t h e d e g r e e o fc l u m p i n g o f t h e b a c i l l i . I f t h e f o r m e r i n t e r p r e t a t i o ni s c o r r e c t , t h e p r o p o r t i o n m e t h o d s h o u l d c o m p e n -s a t e f o r v a r i a t i o n i n t h e t o t a l b a c i l l a r y c o n t e n t o f t h ei n o c u l u m . I f t h e l a t t e r , t h i s a d v a n t a g e o f t h e p r o -p o r t i o n m e t h o d i s n o t g a i n e d . O n t h e a v a i l a b l ee v i d e n c e , b o t h t h e s e f a c t o r s c a u s e v a r i a t i o n i n t h en u m b e r o f c u l t u r a b l e p a r t i c l e s , b u t f u r t h e r w o r k i sr e c o m m e n d e d t o e s t a b l i s h w h i c h i s t h e m o r e i m p o r -t a n t , a n d t o w h a t e x t e n t e a c h m o d i f i e s t h e r e s u l t s o ft e s t s .Of g r e a t e r p r a c t i c a l i m p o r t a n c e t h a n t h e s e t h e o -r e t i c a l c o n s i d e r a t i o n s i s t h e e m p i r i c a l c o m p a r i s o n o ft h e r e l a t i v e e f f i c i e n c y o f t h e d i f f e r e n t m e t h o d s i nd i s t i n g u i s h i n g a s a m p l e o f p r e d o m i n a n t l y s e n s i t i v es t r a i n s f r o m a s a m p l e o f p r e d o m i n a n t l y r e s i s t a n ts t r a i n s . L a r g e l y f r o m u n p u b l i s h e d d a t a , u s i n g t h ed i s c r i m i n a t i o n a p p r o a c h o r a v a r i a n t o f i t , t h e f o l -l o w i n g p r o v i s i o n a l c o n c l u s i o n s h a v e b e e n d r a w n .F i r s t - l i n e d r u g s

F o r s t r e p t o m y c i n , t h e r e a p p e a r s t o b e l i t t l e t oc h o o s e b e t w e e n t h e m i n i m a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a -t i o n , r e s i s t a n c e - r a t i o a n d p r o p o r t i o n m e t h o d s , u s i n gt h e d i s c r i m i n a t i o n a p p r o a c h . F o r i s o n i a z i d , a s i m i -l a r c o n c l u s i o n c a n b e d r a w n a b o u t t h e m i n i m a li n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n a n d p r o p o r t i o n m e t h o d s ,b u t t h e r e s i s t a n c e - r a t i o m e t h o d h a s n o t b e e n s t u d -i e d . T h e r e l a t i v e e f f i c i e n c y o f t h e t h r e e m e t h o d s f o rt e s t i n g PA S s e n s i t i v i t y d o e s n o t a p p e a r t o h a v e b e e ni n v e s t i g a t e d . T h e d i s c r i m i n a t i o n a p p r o a c h h a s b e e nf o u n d t o b e u n s a t i s f a c t o r y f o r a n a l y s i n g s e n s i t i v i t yt e s t s t o t h i o a c e t a z o n e i n s t r a i n s f r o m r e g i o n s w h e r en a t u r a l r e s i s t a n c e t o t h i o a c e t a z o n e i s p r e v a l e n t .S e c o n d - l i n e d r u g s

T h e r e s i s t a n c e - r a t i o m e t h o d o f m e a s u r i n g s e n s i t i v -i t y o n L o w e n s t e i n - J e n s e n medium u s i n g s e r i a l 2 - f o l dd r u g d i l u t i o n s a p p e a r s t o b e u n s a t i s f a c t o r y , m a i n l yb e c a u s e t h e c r i t i c a l r a t i o t h a t d i s t i n g u i s h e s s e n s i t i v ea n d r e s i s t a n t s t r a i n s b e s t l i e s b e t w e e n 2 a n d 4 .E v i d e n c e o n c o m p a r i s o n s o f t h e m i n i m a l i n h i b i t o r y

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G . C A N E T T I AND OTHERS

c o n c e n t r a t i o n a n d p r o p o r t i o n m e t h o d s f o r e t h i o n -a m i d e a n d c y c l o s e r i n e i s d i s c r e p a n t . Some w o r k e r sf i n d t h a t t h e m e t h o d s a r e o f s i m i l a r d i s c r i m i n a t i v ee f f i c i e n c y ( L e f f o r d & M i t c h i s o n , 1 9 6 6 ) ; o t h e r s , t h a tt h e p r o p o r t i o n m e t h o d i s t h e m o r e e f f i c i e n t . F o rp y r a z i n a m i d e - s e n s i t i v i t y t e s t s , t h e r e i s a g r e e m e n tt h a t t h e p r o p o r t i o n m e t h o d i s t h e m o r e e f f i c i e n t ,b u t , a g a i n , t h e e x t e n t o f t h e a d v a n t a g e f o u n d d i f f e r sf r o m o n e g r o u p o f w o r k e r s t o a n o t h e r . S i n c e t h e r eh a v e b e e n f e w c o m p a r i s o n s b e t w e e n t e s t s d o n ew i t h t h e m i n i m a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n a n d p r o -p o r t i o n m e t h o d s , a n d n o c o m p a r i s o n s h a v e b e e nm a d e f o r P A S , k a n a m y c i n o r v i o m y c i n , f u r t h e rs t u d i e s a r e n e e d e d .O n l y t e n t a t i v e s u g g e s t i o n s c a n b e m a d e o nm e t h o d s t o b e a d o p t e d f o r t e s t i n g s e n s i t i v i t y t o t w onew d r u g s , e t h a m b u t o l a n d r i f a m p i c i n .

F o r e t h a m b u t o l , t h e i n v i t r o d i f f e r e n c e b e t w e e ns e n s i t i v e a n d r e s i s t a n t s t r a i n s i s v e r y s m a l l , a n d t h er e s i s t a n c e - r a t i o m e t h o d w i l l p r o b a b l y p r o v e t o b eu n s a t i s f a c t o r y . T h e m i n i m a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a -t i o n a n d p r o p o r t i o n m e t h o d s m i g h t b e e q u i v a l e n t ,b u t t h e r e s h o u ld b e o n l y n a r r o w i n t e r v a l s b e t w e e nt h e d r u g c o n c e n t r a t i o n s t o b e t e s t e d . E v e n s o , t h e r ei s e v i d e n c e t h a t i n v i t r o r e s i s t a n c e t o e t h a m b u t o l i so f t e n d i f f i c u l t t o d e t e c t i n c a s e s o f a p p a r e n t c l i n i c a lr e s i s t a n c e . O n t h e o t h e r h a n d , f o r r i f a m p i c i n , t h e i nv i t r o d i f f e r e n c e b e t w e e n s e n s i t i v e a n d r e s i s t a n ts t r a i n s i s c o n s i d e r a b l e , a n d i t i s l i k e l y t h a t t h e r e s i s -t a n c e - r a t i o m e t h o d w i l l b e a s e f f i c i e n t a s t h e t w oo t h e r m e t h o d s .

PR OG N O S T I C SIGNIFICANCE O F DRUG RESISTANCEP r i n m a r y d r u g r e s i s t a n c eO n t h e b a s i s o f t h e a v a i l a b l e e v i d e n c e c o n c e r n i n gt h e i n f l u e n c e o f p r i m a r y i s o n i a z i d r e s i s t a n c e o n t h e

r e s p o n s e o f p a t i e n t s t o t r e a t m e n t w i t h t h i s d r u gg i v e n a l o n e , i t m a y b e c o n c l u d e d t h a t t h e r e s p o n s e i so f t e n i m p a i r e d b y p r i m a r y r e s i s t a n c e . N e v e r t h e l e s s ,a s u b s t a n t i a l p r o p o r t i o n o f p a t i e n t s w i t h p r i m a r yr e s i s t a n c e s h o w a b a c t e r i o l o g i c a l r e s p o n s e , a n d somep a t i e n t s a c h i e v e s p u t u m c o n v e r s i o n . F o r o t h e rd r u g s , i n a d e q u a t e e v i d e n c e i s a v a i l a b l e t o s a y w h e t h -e r , i n t h e p r e s e n c e o f p r i m a r y r e s i s t a n c e , a m e a s u r eo f r e s p o n s e c a n b e e x p e c t e d w i t h t r e a t m e n t w i t h t h ed r u g c o n c e r n e d , w h e n g i v e n a l o n e . A t t h e o t h e re x t r e m e , t h e r e i s e v i d e n c e t h a t t h e p r e s e n c e o f r e s i s -t a n c e t o a s i n g l e d r u g h a s l i t t l e o r no e f f e c t o n t h eo u t c o m e o f t r e a t m e n t w i t h t h e t h r e e d r u g s : i s o n i a z i d ,s t r e p t o m y c i n a n d PAS ( I n t e r n a t i o n a l U n i o n A g a i n s tT u b e r c u l o s i s , 1 9 6 4 ) . F u r t h e r m o r e , e v e n i n t h e p r e s -

e n c e o f p r i m a r y r e s i s t a n c e t o 2 f i r s t - l i n e d r u g s , ab a c t e r i o l o g i c a l r e s p o n s e i s n o t i n f r e q u e n t l y o b t a i n e dw i t h t h e 3 d r u g s .A c q u i r e d d r u g r e s i s t a n c eWhen d r u g r e s i s t a n c e h a s e m e r g e d d u r i n g t h ec o u r s e o f c h e m o t h e r a p y , n o f u r t h e r r e s p o n s e i s t o b e

e x p e c t e d f r o m t h e d r u g c o n c e r n e d , p r o v i d e d t h a t t h es p u t u m i s c o n s i s t e n t l y p o s i t i v e . T h i s i s t r u e e v e n f o ri s o n i a z i d , a n d i n a l l p r o b a b i l i t y n o f u r t h e r b e n e f i t i st o b e o b t a i n e d w i t h l o n g - t e r m t r e a t m e n t w i t h t h ed r u g . S i n c e t h e p r e s e n c e o f p e r s i s t e n t s p u t u m p o s i -t i v i t y i m p l i e s t h e g r o w t h o f o r g a n i s m s w i t h i n t h el e s i o n s , s u c h s t r a i n s a r e n o t o n l y b a c t e r i o l o g i c a l l yr e s i s t a n t b u t a l s o c l i n i c a l l y r e s i s t a n t . T h e d e g r e e o fl a b o r a t o r y r e s i s t a n c e i s i m m a t e r i a l . I n c i d e n t a l l y , t h er e s u l t s o f a r e c e n t i n v e s t i g a t i o n i n d i c a t e t h a t t h ea d d i t i o n o f i s o n i a z i d t o r e - t r e a t m e n t r e g i m e n s i np a t i e n t s w h o s e o r g a n i s m s h a d p r e v i o u s l y a c q u i r e di s o n i a z i d r e s i s t a n c e d i d n o t i m p r o v e t h e r e s u l t .T r a n s i t i o n a l r e s i s t a n c e

O c c a s i o n a l l y r e s i s t a n c e t o o n e o r m o r e d r u g s o f ar e g i m e n m a y e m e r g e i n t h e c o u r s e o f s u c c e s s f u lc h e m o t h e r a p y . T h e r e s i s t a n t c u l t u r e , u s u a l l y c o m -p o s e d o f o n l y 1 o r 2 c o l o n i e s a n d s e l d o m o f moret h a n 5 c o l o n i e s , i s m o s t f r e q u e n t l y o b t a i n e d i m m e -d i a t e l y b e f o r e s p u t u m c o n v e r s i o n , b u t m a y a l s o b eo b t a i n e d d u r i n g t h e n e x t f e w m o n t h s . T h i s f i n d i n g i sd u e t o t h e i s o l a t i o n o f r e s i s t a n t , p e r s i s t e n t o r g a n -i s m s , i . e . , r e s i s t a n t o r g a n i s m s t h a t a r e n o t m u l t i p l y -i n g i n t h e l e s i o n s b u t h a v e n e v e r t h e l e s s s u r v i v e d( C a n e t t i , 1 9 6 5 ) . T r a n s i t i o n a l r e s i s t a n c e i s i n s h a r pc o n t r a s t t o a c q u i r e d r e s i s t a n c e i n t h a t s i g n i f i c a n tm u l t i p l i c a t i o n o f r e s i s t a n t o r g a n i s m s d o e s n o t o c c u ri n t h e f o r m e r a n d t h e r e i s n o j u s t i f i c a t i o n f o r ac h a n g e o f t r e a t m e n t .I t i s s t r o n g l y e m p h a s i z e d t h a t t h e p e r f o r m a n c e o fs e n s i t i v i t y t e s t s d u r i n g c h e m o t h e r a p y i n p a t i e n t sw i t h d e c r e a s i n g b a c i l l a r y p o p u l a t i o n s o n s e r i a l s m e a ra n d c u l t u r e r a r e l y s e r v e s a n y u s e f u l p u r p o s e s i n c e ,u n d e r t h e s e c i r c u m s t a n c e s , t h e o n l y r e s i s t a n t s t r a i n sl i k e l y t o b e e n c o u n t e r e d a r e t r a n s i t i o n a l l y r e s i s t a n ts t r a i n s .

T HE EPIDEMIOLOGY O F DRUG RES IS TANCEI n i t i a l d r u g r e s i s t a n c e

I t i s i m p o r t a n t t o a p p r e c i a t e t h e d i f f e r e n c e b e -t w e e n p r i m a r y a n d i n i t i a l d r u g r e s i s t a n c e . P r i m a r yr e s i s t a n c e i s r e s i s t a n c e f o u n d i n p a t i e n t s w h i c h h a sn o t r e s u l t e d f r o m t r e a t m e n t o f t h o s e p a t i e n t s w i t h

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MYCOBACITERIAL DRUG SENSITIVITY TESTS: R E C E N T ADVANCES AND PR AC T I C AL US E

e d r u g c o n c e r n e d . I t i n c l u d e s b o t h n a t u r a l r e s i s -w h i c h ma y o c c u r i n a s t r a i n t h a t h a s n e v e ri n t o c o n t a c t w i t h t h e d r u g , a n d a c q u i r e d r e s i s -o c c u r r i n g a s a r e s u l t o f e x p o s u r e t o t h e d r u g i np a t i e n t . I n i t i a l r e s i s t a n c e o c c u r s i n p a t i e n t sh o g i v e n o h i s t o r y o f p r e v i o u s c h e m o t h e r a p y . I tp r i m a r y r e s i s t a n c e , a s w e l l a s a c q u i r e d r e s i s -i n p a t i e n t s who h a v e e i t h e r c o n c e a l e d a h i s t o r yp r e v i o u s c h e m o t h e r a p y o r h a v e r e c e i v e d c h e m o -

e x a m p l e , i s o n i a z i d f o r a c o u g h - w i t h -t b e i n g a w a r e o f t h e n a t u r e o f t h e m e d i c a m e n t .

o f t h e p r e v a l e n c e o f d r u g r e s i s t a n c eS i n c e i t i s v e r y d i f f i c u l t t o o b t a i n a r e l i a b l e h i s t o r yp r e v i o u s c h e m o t h e r a p y f r o m p a t i e n t s i n t h e d e v e -c o u n t r i e s , s u r v e y s o f p r i m a r y r e s i s t a n c e i nc o u n t r i e s u s u a l l y c a n n o t b e c a r r i e d o u t . M o s ti n p a t i e n t s d i s c l a i m i n g p r e v i o u s t r e a t m e n ti n p r a c t i c e , s u r v e y s o f i n i t i a l d r u g r e s i s t a n c e .n t h e o t h e r h a n d , i n t h e t e c h n i c a l l y a d v a n c e d

s u r v e y s o f t r u e p r i m a r y d r u g r e s i s t a n c ea n m o r e r e a d i l y b e p e r f o r m e d b e c a u s e t h e p a t i e n t si f t h e y h a v e h a d p r e v i o u s c h e m o t h e r a p y a n dn o r e a s o n f o r w i t h h o l d i n g t h e i n f o r m a t i o n .S u r v e y s o f p r i m a r y r e s i s t a n c e m e a s u r e t h e t e n d e n -y f o r r e s i s t a n t s t r a i n s t o a c c u m u l a t e w i t h i n t h eI n s e v e r a l o f t h e t e c h n i c a l l y a d v a n c e dt h e y h a v e b e e n r e p e a t e d a t i n t e r v a l s o f

I n g e n e r a l t e r m s , t h e r e s u l t s s h o w t h a t t h e r ea s b e e n n o i n c r e a s e i n t h e p r e v a l e n c e o f p r i m a r yd u r i n g t h e p a s t d e c a d e , a n d t h a t r e s i s t a n c eo o n l y o n e d r u g i s much more f r e q u e n t t h a n r e s i s -t o m o r e t h a n o n e d r u g . T h e r e i s i n c r e a s i n gt h a t t h e l e v e l o f p r i m a r y r e s i s t a n c e m ay b en e w w a y o f a s s e s s i n g t h e amount o f b a c i l l a r yi n t h e c o m m u n i t y . T h u s i t may p r o v i d en e w e p i d e m i o l o g i c a l p a r a m e t e r .S u r v e y s o f i n i t i a l d r u g r e s i s t a n c e m e a s u r e t h eo f r e s i s t a n c e i n p a t i e n t s who p r e s e n tf o r t r e a t m e n t . T h e y a c t a s a g u i d e t o t h eo f c h e m o t h e r a p y p r o g r a m m e s a n dt h e q u a l i t y a n d e x t e n t o f c h e m o t h e r a p y p r a c -i n t h e a r e a . T h e a v a i l a b l e d a t a p r o v i d e noe v i d e n c e o f a p r o g r e s s i v e b u i l d - u p o f i n i t i a lr e s i s t a n c e t o a l a r m i n g l e v e l s i n a n y d e v e l o p i n gw h e r e t h e i n i t i a l i n t e r r o g a t i o n o f p a t i e n t st h e h i s t o r y o f p r e v i o u s c h e m o t h e r a p y h a s b e e nc o n d u c t e d . I n d e e d , a s f a r a s t h e t r e n d s c a n

e f o l l o w e d , t h e r e i s some e v i d e n c e t h a t t h e l e v e l say b e c o m e s t a b l e , o r e v e n d e c r e a s e , a s t h e s t a n -o f t h e t u b e r c u l o s i s s e r v i c e a n d o f c h e m o -

p r a c t i c e i m p r o v e .

I n o r d e r t o p r o v i d e a m e a s u r e o f t h e p r o b l e m t h a ta l l n e w l y r e g i s t e r e d p a t i e n t s p r e s e n t f o r t h e t r e a t -m e n t s e r v i c e s , s u r v e y s o f s u c h p a t i e n t s s h o u l d b em a d e . T h e s e s u r v e y s s h o u l d i n c l u d e a l l p a t i e n t sa t t e n d i n g a c l i n i c f o r t h e f i r s t t i m e f o r t r e a t m e n t ,w h e t h e r o r n o t t h e y h a v e r e c e i v e d t r e a t m e n t e l s e -w h e r e ; t h e y w o u l d n o t i n c l u d e p a t i e n t s a l r e a d y o nt h e c l i n i c r e g i s t e r w ho r e t u r n f o r f u r t h e r t r e a t m e n t i nt h e s a m e c l i n i c . S u c h s u r v e y s w i l l b e r e f e r r e d t o a st o t a l s u r v e y s o f n e w l y r e g i s t e r e d p a t i e n t s .T h e p o o l o f c h r o n i c d r u g - r e s i s t a n t i n f e c t i o u s c a s e sA n u m b e r o f d i f f i c u l t i e s a r e i n v o l v e d i n m e a s u r i n gt h e s i z e o f t h e p o o l o f c h r o n i c d r u g - r e s i s t a n t i n f e c -t i o u s c a s e s i n t h e c o m m u n i t y , a m e a s u r e m e n t t h a t p r o -v i d e s a n i m p o r t a n t i n d i c a t i o n o f t h e t o t a l e x t e n t o fd r u g r e s i s t a n c e . A l t h o u g h i t i s p o s s i b l e t o o b t a i ni n f o r m a t i o n o n t h e s i z e a n d c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e

p o o l d u r i n g m a s s r a d i o g r a p h y s u r v e y s o f t h e c o m -m u n i t y , t h e t o t a l n u m b e r o f p a t i e n t s f o u n d t o h a v e ap o s i t i v e c u l t u r e i n s u c h s u r v e y s i s , i n p r a c t i c e , u s u a l -l y s m a l l . F u r t h e r a t t e m p t s s h o u l d b e made t o e v o l v ea c c u r a t e m e t h o d s o f c h a r a c t e r i z i n g t h e p o o l .D r u g - r e s i s t a n c e r e g i s t e r s

I n s o m e c i t i e s , a l l c h r o n i c e x c r e t o r s o f d r u g - r e s i s -t a n t o r g a n i s m s a r e r e c o r d e d i n d r u g - r e s i s t a n c e r e g i s -t e r s . T h e s e r e g i s t e r s a r e a v a l u a b l e way o f f o l l o w i n go n e i m p o r t a n t i n d e x o f t h e s u c c e s s o f t h e r a p y i n t h ec o m m u n i t y .P e r f o r m a n c e o f s u r v e y s

W h e n e v e r p o s s i b l e , a d r u g - r e s i s t a n c e s u r v e ys h o u l d b e c o n d u c t e d w i t h i n a n e n t i r e c o u n t r y o rr e g i o n r a t h e r t h a n i n i n d i v i d u a l c l i n i c s o r h o s p i t a l s ,s o t h a t t h e s u r v e y ma y b e w i d e l y r e p r e s e n t a t i v e .P r e l i m i n a r y d a t a o n t h e n o t i f i c a t i o n o f n e w c a s e s o ft u b e r c u l o s i s s h o u l d b e o b t a i n e d a n d u s e d t o d r a w as t a t i s t i c a l s a m p l e o f t h e c l i n i c s a n d h o s p i t a l s i n t h er e g i o n s , s o t h a t u r b a n a n d r u r a l c o m m u n i t i e s a n dc l i n i c s w i t h g o o d a n d w i t h - p o o r t r e a t m e n t s e r v i c e sa r e f a i r l y r e p r e s e n t e d . I n d e v e l o p i n g c o u n t r i e s , t h es a m p l e s h o u l d i n c l u d e c h i l d r e n u n d e r t h e a g e o f1 5 y e a r s , s i n c e t h e r e i s e v i d e n c e t h a t t h e p a t t e r n o fd r u g s e n s i t i v i t y o f t h e i r o r g a n i s m s m a y g i v e t h e b e s tm e a s u r e o f t h e p r e v a l e n c e o f p r i m a r y r e s i s t a n c e . I ft h e c o m m u n i t y i s m u l t i r a c i a l o r c o n t a i n s l a r g eg r o u p s o f i m m i g r a n t s , i t i s i m p o r t a n t t o r e c o r d t h er a c e o r t h e c o u n t r y o f o r i g i n o f t h e p a t i e n t , s i n c e t h eg r o u p s m ay h a v e d i f f e r e n t p r e v a l e n c e s o f d r u g r e s i s -t a n c e .

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G . C A N E T I I AND O TH ERST h e s e n s i t i v i t y t e s t s f o r a s u r v e y s h o u l d b e p e r -

f o r m e d i n a s i n g l e l a b o r a t o r y c a p a b l e o f d o i n g t e s t so f a h i g h s t a n d a r d o f a c c u r a c y a n d , i n d e e d , i f as u f f i c i e n t s t a n d a r d c a n n o t b e o b t a i n e d t h e s u r v e ys h o u l d n o t b e u n d e r t a k e n . A l l m y c o b a c t e r i a i s o l a t -e d s h o u l d b e i d e n t i f i e d a s M y c o . t u b e r c u l o s i s , M y c o .b o v i s o r some o t h e r m y c o b a c t e r i a l s p e c i e s . I n m a k -i n g a c h o i c e b e t w e e n t h e s e v e r a l a c c u r a t e s e n s i t i v i t yt e s t m e t h o d s a v a i l a b l e , c o m p a r a b i l i t y w i t h p r e v i o u ss u r v e y s i n t h e s a m e r e g i o n i s t h e f i r s t p r i o r i t y , a n dc o m p a r a b i l i t y w i t h s u r v e y s i n o t h e r c o u n t r i e s i s a l s oo f v a l u e . I t i s c l e a r l y d e s i r a b l e t o r e d u c e t o aminimum t h e n u m b e r o f d i f f e r e n t s e n s i t i v i t y t e s t se m p l o y e d , i n o r d e r t o a l l o w a c c u r a t e c o m p a r i s o n sb e t w e e n d i f f e r e n t c o u n t r i e s .

One o r b o t h o f t h e f o l l o w i n g c o n t r o l m e t h o d s a r ea d v i s a b l e . F i r s t , a d e t a i l e d d i s t r i b u t i o n o f t h e s e n s i -t i v i t y o f a s a m p l e o f w i l d s t r a i n s ( o r , l e s s s a t i s f a c t o r i -l y , a s e r i e s o f t e s t s o n t h e s t a n d a r d s t r a i n , H 3 7 R v )s h o u l d b e o b t a i n e d ; t h e d i s t r i b u t i o n c a n t h e n b ec o m p a r e d w i t h s i m i l a r d i s t r i b u t i o n s o b t a i n e d i n a n yo t h e r s u r v e y u s i n g t h e s a m e s e n s i t i v i t y t e s t m e t h o d ,t h u s p r o v i d i n g a c h e c k on t h e c o m p a r a b i l i t y o fd e f i n i t i o n s o f r e s i s t a n c e . S e c o n d l y , a s a m p l e o f p r e -d o m i n a n t l y r e s i s t a n t s t r a i n s , w h i c h i s o f t e n a u t o m a t -i c a l l y o b t a i n e d i n t o t a l s u r v e y s o f n e w l y r e g i s t e r e dp a t i e n t s ( a s d e s c r i b e d on p a g e 2 5 ) , m a y b e t e s t e d .T h e a p p l i c a t i o n o f t h e d i s c r i m i n a t i o n a p p r o a c h w i l lt h e n e n s u r e t h a t o p t i m u m d e f i n i t i o n s o f r e s i s t a n c ea r e u s e d , a n d w i l l f a c i l i t a t e c o m p a r i s o n s w i t h o t h e rs u r v e y s u s i n g t h i s a p p r o a c h . F u r t h e r m o r e , i nr e p o r t i n g t h e r e s u l t s , f u l l t e c h n i c a l d e t a i l s o f t h em e t h o d u s e d , i n c l u d i n g t h e n u m b e r o f c u l t u r a b l ep a r t i c l e s o b t a i n e d o n d r u g - f r e e m e d i u m , s h o u l d b eg i v e n .C o n s i d e r i n g t h e p r e v a l e n c e o f r e s i s t a n c e t o t h ev a r i o u s a n t i t u b e r c u l o s i s d r u g s , m e a s u r e m e n t s o ft h e p r e v a l e n c e o f r e s i s t a n c e t o i s o n i a z i d h a v e t h eg r e a t e s t e p i d e m i o l o g i c a l v a l u e , s i n c e i s o n i a z i d i sw i d e l y u s e d i n t r e a t m e n t t h r o u g h o u t t h e w o r l d , t h et e s t s a r e c o m p a r a t i v e l y e a s y t o p e r f o r m , a n d t h er e s u l t s o b t a i n e d b y d i f f e r e n t m e t h o d s o f t e s t i n g a r el i k e l y t o b e c l o s e l y c o m p a r a b l e . I t i s a l s o o f v a l u e t oe s t i m a t e t h e p r e v a l e n c e o f r e s i s t a n c e t o s t r e p t o m y -c i n , b u t s t r e p t o m y c i n i s m o r e w i d e l y u s e d i n s o m ec o u n t r i e s t h a n i n o t h e r s , t h e t e s t i s m o r e d i f f i c u l t t op e r f o r m r e l i a b l y , a n d i t i s p o s s i b l e t h a t t h e o c c u r -r e n c e o f s t r a i n s w i t h n a t u r a l r e s i s t a n c e t o t h e d r u gm a y o b s c u r e t h e e p i d e m i o l o g i c a l v a l u e o f t h e d a t a .S e n s i t i v i t y t e s t s t o . P A S , t h i o a c e t a z o n e o r t h e s e c o n d -l i n e d r u g s a r e o f l e s s v a l u e . T h e r a t i o b e t w e e n t h en u m b e r o f s t r a i n s r e s i s t a n t t o a s i n g l e d r u g a n d o f

t h o s e r e s i s t a n t t o m o r e t h a n o n e d r u g i s a l s o o fe p i d e m i o l o g i c a l i m p o r t a n c e .T HE ROLE O F SE NSI TIVI T Y T E ST S

IN TUBERCULOSIS CONTROL PROGRAMMEST h e u s e s o f s e n s i t i v i t y t e s t s

S e n s i t i v i t y t e s t s h a v e f o u r m a i n u s e s :F o r s c i e n t i f i c p u r p o s e s : t h e y h a v e c o n t r i b u t e dg r e a t l y t o o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e m e c h a n i s m s o

c h e m o t h e r a p y a n d o f t h e r e a s o n s f o r s u c c e s s a n df a i l u r e .F o r e p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s , w h e t h e r a t o n e p o i n ti n t i m e o r a t t w o d i f f e r e n t p o i n t s i n t i m e i n t h e s a m e

c o u n t r y , o r f o r c o m p a r i s o n s b e t w e e n c o u n t r i e s .F o r p l a n n i n g w i d e - s c a l e t r e a t m e n t , s i n c e , f o r e x a m -p l e , t h e p r o p o r t i o n o f p a t i e n t s w i t h f u l l y s e n s i t i vo r g a n i s m s i n t h e c o m m u n i t y c a n b e e s t i m a t e d .F o r u s e i n t h e i n d i v i d u a l p a t i e n t , i n o r d e r t o d e c i do n r e g i m e n s t h a t m i g h t b e e f f e c t i v e , e s p e c i a l l y i n r et r e a t m e n t .

T oo much s t r e s s h a s b e e n l a i d o n t h e l a s t o f t h e su s e s , c o m p a r e d w i t h t h e o t h e r t h r e e .T h e w i d e s c a l e o n w h i c h u n r e l i a b l e s e n s i t i v i t y - t e s tr e s u l t s a r e r e p o r t e d , e v e n i n t h e t e c h n i c a l l y a d v a n c e dc o u n t r i e s , g i v e s c a u s e f o r c o n c e r n . T h e h a r m t h ac o u l d r e s u l t t o t h e i n d i v i d u a l p a t i e n t f r o m c l i n i c aa c t i o n t a k e n o n t h e b a s i s o f i n a c c u r a t e r e s u l t s m u s tb e e m p h a s i z e d . A l s o , f o r t h e p u r p o s e s o f e p i d e m i o l -o g y , t h e p l a n n i n g o f w i d e - s c a l e t r e a t m e n t o r r e s e a r c h ,i n a c c u r a t e r e s u l t s a r e o f v e r y l i m i t e d v a l u e .F u r t h e r m o r e , t h e u s e o f w e l l o r g a n i z e d , g o o dr e g i m e n s o f c h e m o t h e r a p y i n c o m m u n i t i e s w i t h l i t t li n i t i a l d r u g r e s i s t a n c e a u t o m a t i c a l l y l i m i t s t h e p o t e n -t i a l v a l u e o f w i d e - s c a l e s e n s i t i v i t y t e s t i n g .S t u d i e s i n some d e v e l o p i n g c o u n t r i e s h a v e d e m o n -s t r a t e d t h e v a l u e o f a c a r e f u l i n t e r r o g a t i o n op a t i e n t s a b o u t t h e i r p r e v i o u s h i s t o r y o f c h e m o t h e r a -p y , i n c l u d i n g , i n p a r t i c u l a r , i t s d u r a t i o n a n d t hd r u g s u s e d , t o i n d i c a t e w h e t h e r p r e - t r e a t m e n t d r ur e s i s t a n c e i s l i k e l y t o b e p r e s e n t . T h i s i n f o r m a t i o n ia v a i l a b l e a t t h e t i m e w h e n d e c i s i o n s h a v e t o b e t a k ec o n c e r n i n g t h e r e g i m e n o f c h e m o t h e r a p y t o b e g i v et o t h e p a t i e n t . F o r t h i s r e a s o n , c a r e f u l i n t e r r o g a t i oi s o f i m p o r t a n c e i n p l a n n i n g t r e a t m e n t , w h e t h e r on o t a s e n s i t i v i t y t e s t i s p e r f o r m e d .S e n s i t i v i t y t e s t i n g i n c o u n t r i e s a t d i f f e r e n t s t a g e s od e v e l o p m e n t

I n t h e d e v e l o p i n g c o u n t r i e s , r e q u i r e m e n t s f o r s e ns i t i v i t y t e s t i n g n e c e s s a r i l y v a r y a c c o r d i n g t o t h e s t a g

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MYC OB A C T E R I A L DRUG SENSITIVITY TESTS: R E C E N T A D V A N C E S AND P R A C T I C A L US E

f t e c h n i c a l progress a n d t h e a v a i l a b i l i t y o f l a b o r a t o -y s e r v i c e s . F o r some c o u n t r i e s w i t h a very s m a l lo p u l a t i o n a n d w i t h l i m i t e d resources t h e r e i s nof o r e s t a b l i s h i n g s e n s i t i v i t y t e s t i n g i n

a s i n g l e l a b o r a t o r y . S u c h c o u n t r i e s m i g h t n e e do o b t a i n l i m i t e d r e f e r e n c e work f o r e p i d e m i o l o g i c a la n d d o s o i n a l a b o r a t o r y a b r o a d , p o s s i b l yt h e h e l p o f a n i n t e r n a t i o n a l agency. I n t h i se f f o r t s a re c u r r e n t l y b e i n g m a d e b yO t o e s t a b l i s h i n t e r - c o u n t r y r e g i o n a l r e f e r e n c eA t t h e n e x t s t a g e o f d e v e l o p m e n t , t h e r e are many

t h a t e i t h e r a l r e a d y h a v e , o r e l s e r e q u i r e , al a b o r a t o r y a b l e t o u n d e r t a k e a s u f f i c i e n t num-

e r o f s e n s i t i v i t y t e s t s t o meet a l l n e e d s f o r t h es t a g e o f d e v e l o p m e n t o f t h e t u b e r c u lo s i sT h e s e n s i t i v i t y t e s t s m i g h t b e u s e d f o r

p u r p o s e s , f o r t h e p l a n n i n g o f w i d e -t r e a t m e n t p r o g r a m m e s o r , i n some i n s t a n c e s ,f o r i n d i v i d u a l p a t i e n t s . I n some c o u n t r i e s , s u c hl a b o r a t o r y m i g h t b e a b l e t o meet l i k e l y r e q u i r e -f o r a number o f years t o c o m e . Once o n e

l a b o r a t o r y i s f u n c t i o n i n g , t h e n e e d t o i n -t h e number o f l a b o r a t o r i e s s h o u l d b e c a r e f u l l ya n d f u l l y j u s t i f i e d , n o t o n l y a c c o r d i n g t oh e r e q u i r e m e n t s o f t h e t u b e r c u l o s i s p r o g r a m m e b u ti n r e l a t i o n t o c o m p e t i n g h e a l t h p r i o r i t i e s .A t t h e o t h e r e x t r e m e , t h e s i t u a t i o n i n many t e c h n i -

a d v a n c e d c o u n t r i e s t o d a y i s u n s a t i s f a c t o r y .t o o o f t e n , t h e r e a r e l a r g e n u m b e r s o f l a b o r a t o -u n d e r t a k i n g s e n s i t i v i t y t e s t s , many u s i n g u n s a t i s -

m e t h o d s o r e l s e d o i n g t e s t s on t o o s m a l l at o m a i n t a i n a n a d e q u a t e c o n t r o l o v e r t h e i rI t i s e n c o u r a g i n g t o n o t e t h a t e f f o r t s a r em a d e i n some c o u n t r i e s t o c e n t r a l i z e s e n s i t i v i t yi n a f e w r e g i o n a l l a b o r a t o r i e s : s u c h c e n t r a l -

w h e r e l a b o r a t o r i e s u s e u n i f o r m m e t h o d s ,s u b s t a n t i a l a d v a n t a g e s .I t i s c l e a r l y d e s i r a b l e t o m a k e o n e l a b o r a t o r y ar e f e r e n c e c e n t r e .

I t s h o u l d b e e m p h a s i z e d t h a t , w h a t e v e r t h e s t a g ef d e v e l o p m e n t o f t h e l a b o r a t o r y s e r v i c e s o f a co un -no l a b o r a t o r y s h o u l d e m b a r k on s e n s i t i v i t y t e s t -n g u n t i l a d e q u a t e s t a f f , e q u i p m e n t , i n t e r e s t a n ds k i l l s a r e a v a i l a b l e t o s u s t a i n a h i g h

o f w o r k .s e n s i t i v i t y t e s t s

I n t e c h n i c a l l y a d v a n c e d c o u n t r i e s w h e r e i t h a s b e e nt h a t t h e l e v e l s o f p r i m a r y r e s i s t a n c e t o

h e f i r s t - l i n e d r u g s a r e l o w a n d w h e r e t h e a v a i l a b l ep e r m i t t h e u s e o f t h e r a p y w i t h t h e t h r e e

f i r s t - l i n e d r u g s i n a l l n e w ly d i a g n o s e d c a s e s , t h e r o l eo f p r e - t r e a t m e n t s e n s i t i v i t y t e s t s i s l i m i t e d . I n s u c hc i r c u m s t a n c e s , t h e r e i s l i t t l e t o b e g a i n e d f r o m p r e -t r e a t m e n t s e n s i t i v i t y t e s t s i n p a t i e n t s i n w h o m t u b e r -c u l o s i s h a s b e e n n e w l y d i a g n o s e d , e v e n w h e n s e n s i -t i v i t y t e s t i n g i s o f t h e h i g h e s t s t a n d a r d . T h i s i sb e c a u s e f a i l u r e o f t h e s t a n d a r d r e g i m e n d u e t o p r e -t r e a t m e n t d r u g r e s i s t a n c e i s l i k e l y t o o c c u r o n l y i nt h e v e r y s m a l l p r o p o r t i o n o f p a t i e n t s w i t h s t r a i n sr e s i s t a n t t o t w o o r t h r e e d r u g s . I f t h e s t a n d a r d s o fs e n s i t i v i t y t e s t i n g a r e l o w e r , t h e n t h e g a i n s m a y b en e g l i g i b l e . I n d e e d , a p o s i t i o n m a y b e r e a c h e d w h e r e ,p a r a d o x i c a l l y , s e n s i t i v i t y t e s t i n g m i g h t e v e n r e s u l ti n a c t u a l harm b y l e a d i n g t o u n n e c e s s a r y c h a n g e so f c h e m o t h e r a p y f r o m e f f e c t i v e a n d a c c e p t a b l er e g i m e n s t o m o r e t o x i c , l e s s a c c e p t a b l e , a n d l e s se f f e c t i v e s e c o n d - l i n e r e g i m e n s .

I n d e v e l o p i n g c o u n t r i e s e x i s t i n g k n o w l e d g e d o e sn o t p r o v i d e a d e q u a t e g u i d a n c e o n t h e b e s t c h e m o -t h e r a p y p o l i c y t o b e a d o p t e d i n t h e l i g h t o f t h ew i d e l y d i f f e r e n t l e v e l s o f i n i t i a l a n d a c q u i r e d d r u gr e s i s t a n c e e n c o u n t e r e d i n t h e c o m m u n i t y . O n e e x -t r e m e c h o i c e o f p o l i c y f o r a n a r e a m i g h t b e t o t r e a ta l l p a t i e n t s w i t h a s t a n d a r d r e g i m e n , t h e r e g i m e n t ob e c h a n g e d o n l y w h e n i t w a s a p p a r e n t t h a t t h ep a t i e n t r e m a i n e d c o n s i s t e n t l y p o s i t i v e b a c t e r i o l o g i -c a l l y . T h e o t h e r e x t r e m e m i g h t b e t o a p p l y s e v e r a ld i f f e r e n t b a s i c r e g i m e n s a c c o r d i n g t o t h e p r e - t r e a t -m e n t p a t t e r n s o f s e n s i t i v i t y a c t u a l l y e n c o u n t e r e d i nt h e o r g a n i s m s o f i n d i v i d u a l p a t i e n t s .

I n a s t u d y t h a t i s n ow i n p r o g r e s s i n a n a r e a w i t h as u b s t a n t i a l l e v e l o f i n i t i a l d r u g r e s i s t a n c e , t h r e e p o l i -c i e s o f c h e m o t h e r a p y , e i t h e r b a s e d o n o r i g n o r i n g t h er e s u l t s o f p r e - t r e a t m e n t s e n s i t i v i t y t e s t s , a r e b e i n gc o m p a r e d . S u c h s t u d i e s c a n y i e l d i n f o r m a t i o n n o to n l y o n t h e r o l e o f s e n s i t i v i t y t e s t i n g , a n d h e n c e t h el a b o r a t o r y s e r v i c e s t h a t a r e r e q u i r e d , b u t a l s o o n t h em o s t a p p r o p r i a t e p o l i c i e s o f c h e m o t h e r a p y t o a p p l yI n t h e p a s t , t h e f a i l u r e o f g o o d r e g i m e n s o f c h e m o -t h e r a p y h a s o f t e n b e e n e x p l a i n e d b y t h e f i n d i n g o f

r e s i s t a n c e i n p r e - t r e a t m e n t t e s t s f o r d r u g s e n s i t i v i t yT h i s h a s o v e r s h a d o w e d w h a t i s o f t e n a more i m p o r -t a n t f a c t o r : t h e f a i l u r e o f t h e p a t i e n t t o c o - o p e r a t ei n t r e a t m e n t , o n l y t o o o f t e n b e c a u s e t h e s u p e r v i s o r ys t a f f d o n o t a d a p t t h e o r g a n i z a t i o n a n d s u p e r v i s i o no f c h e m o t h e r a p y t o t h e n e e d s o f t h e p a t i e n t .S e n s i t i v i t y t e s t i n g d u r i n g t r e a t m e n t

P a t i e n t s w ho a r e c o n s i s t e n t l y c u l t u r e - p o s i t i v e a tt h e e n d o f 6 m o n t h s o r m o r e o f t r e a t m e n t , e s p e c i a l l yw h e n t h e c u l t u r e s y i e l d a b u n d a n t g r o w t h a n d t h e r eh a s b e e n a " f a l l a n d r i s e " p h e n o m e n o n i n t h e

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G . C A N E T r I AND OTHERSb a c t e r i a l c o n t e n t o f t h e s p u t u m , c a n b e r e g a r d e d a sc l e a r - c u t " f a i l u r e s " o f t h e r e g i m e n i n b a c t e r i o l o g i -c a l t e r m s . H o w e v e r , t h e s e p a t i e n t s m ay h a v e d r u g -s e n s i t i v e o r g a n i s m s b e c a u s e t h e y h a v e b e e n i r r e g u l a ri n t a k i n g t h e i r m e d i c a m e n t . F u r t h e r m o r e , p a t i e n t swho h a v e h a d a r e l a p s e a f t e r s t o p p i n g c h e m o t h e r a p yf r e q u e n t l y y i e l d s e n s i t i v e o r g a n i s m s . I n b o t h t h e s ec i r c u m s t a n c e s a r a p i d s e n s i t i v i t y t e s t , f o r e x a m p l e , ad i r e c t t e s t , w h i c h i s a v a i l a b l e w i t h c e r t a i n m e t h o d s ,w o u l d b e o f p a r t i c u l a r v a l u e . F u r t h e r , t h e l i k e l i h o o do f f i n d i n g s e n s i t i v e o r r e s i s t a n t o r g a n i s m s v a r i e sa c c o r d i n g t o t h e s t a n d a r d s o f t r e a t m e n t i n t h e c o m -m u n i t y . I t m a y w e l l b e p o s s i b l e , b y t h e s y s t e m a t i cc o l l e c t i o n o f d a t a i n c a s e s o f t r e a t m e n t f a i l u r e , a sj u s t d e f i n e d , t o f o r m u l a t e p o l i c i e s f o r f u r t h e r t r e a t -m e n t . I f d r u g s e n s i t i v i t y w e r e co m m o n i n t h e c o m -m u n i t y , t r e a t m e n t w i t h t h e f i r s t - l i n e d r u g s w o u l dn o r m a l l y b e r e s u m e d . I f r e s i s t a n c e w e r e c o m m o n ,t r e a t m e n t w i t h s e c o n d - l i n e d r u g c o m b i n a t i o n s , i fa v a i l a b l e , w o u l d b e g i v e n . S u c h a n e p i d e m i o l o g i c a la p p l i c a t i o n o f s e n s i t i v i t y t e s t i n g c o u l d b e o f g r e a t e rg e n e r a l v a l u e t h a n t e s t i n g i n t h e i n d i v i d u a l p a t i e n t .S e n s i t i v i t y t e s t i n g a n d s e c o n d - l i n e r e g i m e n s

F o r p a t i e n t s w h o s e t r e a t m e n t w i t h t h e f i r s t - l i n ed r u g s h a s f a i l e d , t r e a t m e n t w i t h a s e c o n d - l i n er e g i m e n c a n b e s a f e l y i n i t i a t e d w i t h o u t u n d e r t a k i n gs e n s i t i v i t y t e s t s t o t h e s e c o n d - l i n e d r u g s t o b e i n t r o -d u c e d . T h e i n d i c a t i o n s f o r c h a n g i n g a s e c o n d - l i n er e g i m e n m i g h t b e t h e o c c u r r e n c e o f t o x i c i t y , o r t h ef i n d i n g t h a t t h e p a t i e n t ' s o r g a n i s m s w e r e s t i l l s e n s i -t i v e t o m o r e e f f e c t i v e a n d a c c e p t a b l e f i r s t - l i n e d r u g s ,o r e v i d e n c e t h a t t h e s e c o n d - l i n e r e g i m e n h a d i t s e l ff a i l e d . I f a f u r t h e r c o u r s e o f s e c o n d - l i n e d r u g s i sr e q u i r e d a n d i t i s u n c e r t a i n w h e t h e r r e s i s t a n c e m i g h th a v e b e e n a c q u i r e d t o o n e o r more o f t h e m , s e n s i t i v -i t y t e s t s a r e l i k e l y t o b e o f v a l u e .T h e r e a r e a l s o p r o b l e m s o f c r o s s - r e s i s t a n c e . F o re x a m p l e , h i gh d e g r e e s o f i n v i t r o e t h i o n a m i d e r e s i s -t a n c e h a v e b e e n e n c o u n t e r e d i n t w o s i t u a t i o n s i np a t i e n t s who h a v e n e v e r b e e n t r e a t e d w i t h t h e d r u g .One i s u n s u c c e s s f u l t r e a t m e n t w i t h t h i o a c e t a z o n ea l o n e , o r w i t h i s o n i a z i d p l u s t h i o a c e t a z o n e w h i c hh a s r e s u l t e d i n r e s i s t a n c e t o t h i o a c e t a z o n e ; t h e o t h e ri s i n t h e p r e s e n c e o f v e r y l o w d e g r e e s o f p r i m a r yi s o n i a z i d r e s i s t a n c e ( C a n e t t i e t a l . , 1 9 6 7 ) .S m e a r s , c u l t u r e s a n d s e n s i t i v i t y t e s t s i n c o n t r o l p r o -g r a m m e s

F r o m t h e p o i n t o f v i e w o f t h e i r v a l u e i n a t u b e r c u -l o s i s c o n t r o l p r o g r a m m e , s m e a r s , c u l t u r e s a n d s e n s i -t i v i t y t e s t s m a y b e r a n k e d i n t h e f o l l o w i n g o r d e r o fp r i o r i t y :

( a ) s m e a r s ;( b ) c u l t u r e s , f o r d i a g n o s t i c p u r p o s e s i n p a t i e n t sw ho a r e b a c t e r i o l o g i c a l l y n e g a t i v e o n s p u t u m s m e a re x a m i n a t i o n ;( c ) s e n s i t i v i t y t e s t s f o r e p i d e m i o l o g i c a l p u r p o s e s ;( d ) s e n s i t i v i t y t e s t s f o r i n d i v i d u a l p a t i e n t s .T h e m i n i m u m a i m o f a b a c t e r i o l o g i c a l s e r v i c e i n a

d e v e lo pi n g c o u n t r y s h o u l d b e t o p e r f o r m e n o u g hs m e a r e x a m i n a t i o n s t o p e r m i t a n a c c u r a t e d i a g n o s i so n s m e a r a n d a l s o t o a s s e s s t h e p r o g r e s s o f t h e r a p ya t i n t e r v a l s , t h e m i n i m u m f r e q u e n c y b e i n g a t t h e e n do f 6 a n d 1 2 m o n t h s o f t h e r a p y . I f p o s s i b l e , 2 s m e a r ss h o u l d b e p e r f o r m e d a t e a c h a s s e s s m e n t , b e c a u s ei m p o r t a n t c o n c l u s i o n s , f o r e x a m p l e , t h a t a p a t i e n th a s f a i l e d t o r e s p o n d a d e q u a t e l y t o a r e g i m e n o fc h e m o t h e r a p y , s h o u l d n o t b e r e a c h e d o n t h e b a s i s o fa s i n g l e p o s i t i v e r e s u l t o n s m e a r e x a m i n a t i o n . T h e" f a l l a n d r i s e " p h e n o m e n o n i n t h e b a c t e r i a l c o n t e n to f t h e s p u t u m , r e f e r r e d t o a b o v e , i s v e r y i n f o r m a t i v e .T h e r e f o r e , w h e n t h e r e s u l t s o f s m e a r e x a m i n a t i o n sa r e r e a d , t h e g r a d e o f p o s i t i v i t y s h o u l d b e r e c o r d e d .T h e a i m i n a d e v e l o p i n g c o u n t r y i s t o h a v e a s m e a rs e r v i c e o n a l a r g e e n o u g h s c a l e t o g r a d e t h e b a c t e r i a lc o n t e n t o f t h e s p u t u m s m e a r s m o n t h l y i n t h e f i r s tf e w m o n t h s o f t r e a t m e n t , a n d a t 6 a n d 1 2 m o n t h s .F l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y o f f e r s t h e s u b s t a n t i a l a d -v a n t a g e s o f a l l o w i n g more s p e c i m e n s t o b e e x a m i n e da n d t h e p o s s i b i l i t y o f i n s t i t u t i n g a d e q u a t e s u p e r v i -s i o n o f t h e r e a d i n g o f t h e s m e a r s . H o w e v e r , i t s u s eo f t e n e n t a i l s s o m e d e g r e e o f c e n t r a l i z a t i o n o f t h ee x a m i n a t i o n o f s p u t u m s p e c i m e n s , a n d o p e r a t i o n a lr e s e a r c h i s n e e d e d t o s e e t o w h a t e x t e n t t h e g a i n sm i g h t b e o u t w e i g h e d b y t h e d i s a d v a n t a g e s o f d e l a yi n r e p o r t i n g r e s u l t s a n d t h e p o s s i b l e l o s s o f i n t e r e s ti n t h e o u t l y i n g s e r v i c e s .W h e n , w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f t h e s e r v i c e , i tb e c o m e s p o s s i b l e t o u n d e r t a k e c u l t u r e s , t h e i r m o s ti m p o r t a n t u s e i s f o r d i a g n o s t i c p u r p o s e s , i n o r d e r t oe n s u r e a s f a r a s p o s s i b l e t h a t a l l p a t i e n t s b r o u g h tu n d e r t r e a t m e n t a r e , i n f a c t , s u f f e r i n g f r o m t h ed i s e a s e . T h i s r e c o m m e n d a t i o n t a k e s i n t o a c c o u n tn o t o n l y t h e i m p o r t a n c e o f c o n c e n t r a t i n g t h er e s o u r c e s o f t h e t h e r a p e u t i c s e r v i c e s o n p a t i e n t sa c t u a l l y s u f f e r i n g f r o m t h e d i s e a s e b u t a l s o t h e p r i o r -i t y o f b r i n g i n g a l l i n f e c t i o u s c a s e s u n d e r t r e a t m e n t .S e n s i t i v i t y t e s t s f o r e p i d e m i o l o g i c a l p u r p o s e s ( d i s -c u s s e d e a r l i e r ) h a v e a s o m e w h a t l o w e r p r i o r i t y ; s oh a v e s e n s i t i v i t y t e s t s f o r t h e i n d i v i d u a l p a t i e n t . Asd i s c u s s e d a b o v e , t h e p r i o r i t y i n t h e i n d i v i d u a l p a t i e n ti s t o t e s t c u l t u r e s f r o m t h o s e who h a v e " f a i l e d "d u r i n g o r a f t e r t r e a t m e n t w i t h f i r s t - l i n e d r u g s .

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MY C O B A C T E R I A L DRUG S E N SI T I VI T Y T E ST S : R E C E N T A D V A N C E S AND P R A C T I C AL US E 2 9

I I . SENSITIVITY T E S T S U S E D BY THE ME DI C A L R E SE A R C H C O U N C I L O FGREAT BRITAIN F O R F I R S T - AND S E C O ND -L I N E DRUGS 1

MEDIUM

S e n s i t i v i t y t e s t s a r e d o n e on L o w e n s t e i n - J e n s e nw i t h o u t p o t a t o s t a r c h ( J e n s e n , 1 9 5 5 ) . T h ea r e a d d e d b e f o r e i n s p i s s a t i o n , i n t h en o t e d b e l o w . T h e m ed ium i si n a b o u t 5 - m l a m o u n t s i n 1 - f l o z ( 2 8 - m l )b o t t l e s a n d i s i n s p i s s a t e d o n c e f o r

0 m i n u t e s a t 8 5 C .

TESTS F O R I S O N I A Z I D , S TR EP T OM Y C I N AND PA S

T h e s e n s i t i v i t y t e s t s a r e s e t u p w i t h a n i n o c u l u m ,t o b e l o w a s t h e s t a n d a r d i n o c u l u m ,f r o m t h e g r o w t h o n p r i m a r y d i a g n o s t i cmedium s l o p e s . T e s t s a r e s e t u p

o t l a t e r t h a n 2 w e e k s a f t e r t h e s l o p e s b e c o m e( u s u a l l y w i t h i n 3 d a y s ) , a n d o l d e r g r o w t h sr e s u b c u l t u r e d i f n e c e s s a r y t o e n s u r e t h a t t h ei s c o m p o s e d o f y o u n g v i a b l e o r g a n i s m s .W i t h a 2 2 SWG 2 ( w i r e d i a m e t e r 0 . 7 m m )l o o p , a r e p r e s e n t a t i v e s w e e p f r o m t h e

i s t a k e n o n t h e l o o p , w i t h a v o l u m e , j u d g e dy e y e , o f 2 m m 3 ( a p p r o x i m a t e l y 2 m g m o i s t w e i g h tf b a c i l l i ) . T h e g r o w t h t a k e n o n t h e l o o p i s t h e ni n t o 0 . 4 m l o f s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e ri n 0 . 2 5 - f l o z ( 7 - m I ) s c r e w - c a p p e d b o t t l e sw i t h 6 g l a s s b e a d s 3 mm i n d i a m e t e r .o f t h e s i z e o f t h e i n o c u l u m i sa n d d e p e n d s o n e s t i m a t i n g t h e a m o u n t o fr o w t h o n t h e l o o p a s 2 mm3: i t i s a d v i s a b l e t h a t t h es h o u l d i n i t i a l l y w e i g h a n u m b e r o f s u c ho f g r o w t h t o e n s u r e t h a t t h e r e a r e a c t u a l l ym g o f g r o w t h o n h i s l o o p . A s u s p e n s i o n i sb y s h a k i n g t h e 7 - m l b o t t l e f o r 1 m i n u t e o nm e c h a n i c a l s h a k e r , a n d t h e n , w i t h a 3-mm e x t e r n a l2 7 SWG ( w i r e d i a m e t e r 0 . 4 m m )l o o p , a l o o p f u l o f t h e s u s p e n s i o n i s s p r e a dt h e s u r f a c e o f e a c h s l o p e o f t h e s e n s i t i v i t y t e s t .A s a c o n t r o l , a d r u g - f r e e s l o p e i s s e t u p f o r e a c ht e s t e d . T h e s t a n d a r d s e n s i t i v e s t r a i n , H 3 7 R v ,t e s t e d i n e a c h s e t o f t e s t s a n d a g a i n w i t h i n e a c h s e tt h e b a t c h o f m e d i u m i s c h a n g e d .

I P r e p a r e d b y P r o f e s s o r D . A . M i t c h i s o n .' B r i t i s h S t a n d a r d W i r e G a u g e .

I n c u b a t i o n a n d r e a d i n g o f t e s t sT h e s l o p e s a r e i n c u b a t e d a t 3 7 C . A r e a d i n g m a yb e made a t 2 w e e k s t o g i v e a p r e l i m i n a r y i n d i c a t i o no f t h e p r e s e n c e o f r e s i s t a n t s t r a i n s , b u t t h e d e f i n i t i v e

r e a d i n g i s m a d e a t 4 w e e k s , a n d a r e p o r t t h a t a s t r a i ni s s e n s i t i v e s h o u l d n o t b e g i v e n e a r l i e r . F o r a l l t e s t s ," g r o w t h " i s d 2 f i n e d a s t h e p r e s e n c e o f 2 0 o r m o r ec o l o n i e s . T h e r e s i s t a n c e r a t i o ( R R ) i s t h e m i n i m a lc o n c e n t r a t i o n i n h i b i t i n g g r o w t h ( a s d e f i n e d a b o v e )o f t h e t e s t s t r a i n d i v i d e d b y t h e m i n i m a lc o n c e n t r a t i o n i n h i b i t i n g g r o w t h ( a s d e f i n e d a b o v e )o f t h e s t a n d a r d s e n s i t i v e s t r a i n , H 3 7 R v , i n t h e s a m es e t o f t e s t s .S h o r t t e s t

A f t e r t h e t e s t h a s b e e n i n u s e f o r a p e r i o d , t h er a n g e o f d r u g c o n c e n t r a t i o n s m a y b e s h o r t e n e d w i t hl i t t l e l o s s o f i n f o r m a t i o n . T h e c o n c e n t r a t i o n s t h a tc o u l d b e o m i t t e d i n t e s t s a t t h e R o y a l P o s t g r a d u a t eM e d i c a l S c h o o l , L o n d o n , a r e i n d i c a t e d w i t h a na s t e r i s k b e l o w . H o w e v e r , i t i s p o s s i b l e t h a t s l i g h t l yd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s m i g h t b e n e e d e d i n o t h e rl a b o r a t o r i e s . T h e r a n g e r e q u i r e d f o r t h e t e s t s t r a i n i sd e t e r m i n e d b y t h e v a r i a t i o n i n t h e m i n i m a li n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n ( M I C ) o f H 3 7 R v , a n d b yt h e n e e d t o d e t e r m i n e a r e s i s t a n c e r a t i o o f 2 o r l e s sf o r s e n s i t i v e s t r a i n s a n d a r e s i s t a n c e r a t i o o f 8 o rm o r e f o r r e s i s t a n t s t r a i n s . T h u s , i f H37Rv i si n h i b i t e d b y e i t h e r 8 p g / m l o r 4 , u g / m l o fs t r e p t o m y c i n i n a s e r i e s o f b a t c h e s o f t e s t s , t h e n i tw o u l d b e n e c e s s a r y t o h a v e 8 , u g / m l a s t h e l o w e s ts t r e p t o m y c i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e t e s t s t r a i n r a n g e( t e s t s t r a i n MI C = 8 , t g / m l ; H37Rv MI C = 4, g / m l ;RR= 2 o r l e s s ) a n d 3 2 j u g / m l a s t h e h i g h e s tc o n c e n t r a t i o n ( t e s t s t r a i n g r o w s on 3 2 j u g / m l ; H37RvMI C = 8 j u g / m l ; RR= 8 o r m o r e ) .S t o r a g e

S t o c k s o l u t i o n s o f i s o n i a z i d , s t r e p t o m y c i n a n dPA S a r e u s u a l l y p r e p a r e d a t m o n t h l y i n t e r v a l s a n ds t o r e d a t 4 C . D r u g - c o n t a i n i n g m e d i a a s w e l l a r es t o r e d a t 4 C a n d c a n b e u s e d f o r a t l e a s t 2 m o n t h sa f t e r p r e p a r a t i o n .P r o c e d u r e w i t h d i f f e r e n t d r u g sI s o n i a z i d .

S t o c k s o l u t i o n s a r e p r e p a r e d i n d i s t i l l e d w a t e r a n ds t e r i l i z e d w i t h a m e m b r a n e , c a n d l e o r s i n t e r e d - g l a s s


10/23

G . C A N E T T I AND OTHERS

f i l t e r , o r b y v e r y b r i e f a u t o c l a v i n g ( 5 m i n u t e s a t1 0 l b f / i n 2 ( 0 . 7 k g f / c m 2 ) ) . S e i t z f i l t r a t i o n s h o u l d n o tb e p r a c t i s e d a s i t r e m o v e s some o f t h e i s o n i a z i d .C o n c e n t r a t i o n s i n t e s t m e d i u m .

T e s t s t r a i n : 0 . 2 , 1 , 5 * a n d 5 0 * H t g / m l i s o n i a z i dH37Rv: 0 . 0 2 5 , 0 . 0 5 , 0 . 1 , 0 . 2 a n d 1 s g / m l i s o -n i a z i d* Not n e c e s s a r y i n t h e s h o r t t e s t . H o w e v e r , t h e i n c l u s i o n o f5 0 g u g / m l i s h e l p f u l i n t h e i d e n t i f i c a t i o n o f a t y p i c a l m y c o b a c t e r i a ,s i n c e t u b e r c l e b a c i l l i g r o w i n g on t h i s c o n c e n t r a t i o n a r e c a t a l a s e -n e g a t i v e , w h e r e a s a t y p i c a l m y c o b a c t e r i a a r e o f t e n c a t a l a s e - p o s i t i v e .

D e f i n i t i o n o f r e s i s t a n c e .S e n s i t i v e : n o g r o w t h ( l e s s t h a n 2 0 c o l o n i e s ) o n0 . 2 f i g / m l i s o n i a z i d .R e s i s t a n t : g r o w t h o n 1 c g / m l i s o n i a z i d o r g r o w t ho n 0 . 2 , A g / m l f o l l o w e d b y g r o w t h o n

0 . 2 u g / m l i n a f u r t h e r t e s t d o n e f r o m t h ec o n t r o l s l o p e o r o n a c u l t u r e f r o m t h es a m e p a t i e n t .S t r e p t o m y c i n .S t o c k a q u e o u s s o l u t i o n s a r e p r e p a r e d w i t h a s e p t i cp r e c a u t i o n s f r o m s t e r i l e a m p o u l e s o f s t r e p t o m y c i ns u l f a t e .C o n c e n t r a t i o n s ( b e f o r e i n s p i s s a t i o n ) i n t e s t m e d i u m .

T e s t s t r a i n : 8 , 1 6 , 3 2 , 6 4 * a n d 1 0 2 4 * t g / m l s t r e p t o -m y c i nH 3 7 R v : 2 , 4 , 8 a n d 1 6 * , t g / m l s t r e p t o m y c i n* Not n e c e s s a r y i n s h o r t t e s t .

D e f i n i t i o n o f r e s i s t a n c e .S e n s i t i v e : a r e s i s t a n c e r a t i o o f 2 o r l e s sR e s i s t a n t : a r e s i s t a n c e r a t i o o f 8 o r m o r e o r ar e s i s t a n c e r a t i o o f 4 f o l l o w e d b y ar e s i s t a n c e r a t i o o f 4 o r m o r e i n a f u r t h e rt e s t d o n e f r o m t h e c o n t r o l s l o p e o r o na n o t h e r c u l t u r e f r o m t h e s a m e p a t i e n t .

P A S .S t o c k s o l u t i o n s a r e p r e p a r e d a s f o r i s o n i a z i d o rf r o m s t e r i l e a m p o u l e s o f s o d i u m PA S d i h y d r a t e .C o n c e n t r a t i o n i n t e s t m e d i u m .

T e s t s t r a i n : 1 * , 2 , 4 , 8 a n d 1 6 * , t g / m l s o d i u m PA Sd i h y d r a t eH 3 7 R v : 0 . 2 5 * , 0 . 5 , 1 a n d 2 , u g / m l s o d i u m PA Sd i h y d r a t e* Not n e c e s s a r y i n s h o r t t e s t .

D e f i n i t i o n o f r e s i s t a n c e .A s f o r s t r e p t o m y c i n .

TESTS F O R ETHIONAMIDE, CYCLOSERINE,KANAMYCIN AND VI OM Y C I N

I n o c u l u mT h e s t a n d a r d i n o c u l u m i s p r e p a r e d a n d u s e d i nt h e sa m e w a y a s i n t e s t s f o r i s o n i a z i d , s t r e p t o m y c i na n d P A S .

S t o c k s o l u t i o n s a n d s t o r a g e o f m e d i u mC y c l o s e r i n e a n d e s p e c i a l l y e t h i o n a m i d e a r e b o t hh e a t - l a b i l e . F o r t h e s e two d r u g s , s t o c k s o l u t i o n ss h o u l d b e made u p f r e s h f o r e a c h b a t c h o f m e d i u m .S t e r i l e w a t e r a n d c o n t a i n e r s a r e u s e d b u t t h e f i n a ls o l u t i o n i s n o t s t e r i l i z e d . E t h i o n a m i d e i s made upa n d d i l u t e d i n 0 . 1 N H C I . D r u g - c o n t a i n i n g m ed iums h o u l d b e t r a n s f e r r e d t o a r e f r i g e r a t o r a s s o o n a sp o s s i b l e a f t e r i n s p i s s a t i o n a n d , a t a l l s t a g e s i n t h e

t e s t , i t s h o u l d b e k e p t a t room t e m p e r a t u r e f o r t h eminimum t i m e p o s s i b l e . E t h i o n a m i d e - c o n t a i n i n gmedium s h o u l d b e u s e d w i t h i n 2 w e e k s o fp r e p a r a t i o n , b u t c y c l o s e r i n e - c o n t a i n i n g medium i sm or e s t a b l e . K a n a m y c i n a n d v i o m y c i n a r e b o t hh e a t - s t a b l e .P r e l i m i n a r y t i t r a t i o nA p r e l i m i n a r y t i t r a t i o n o f c u l t u r e f r o m 2 0 - 2 5p a t i e n t s i s d o n e i n s e v e r a l b a t c h e s o f m ed ium

c o n t a i n i n g d r u g c o n c e n t r a t i o n s a b o v e a n d b e l o w t h eu s u a l e n d - p o i n t f o r s e n s i t i v e s t r a i n s . T h u s , f o re t h i o n a m i d e , t h e c o n c e n t r a t i o n s s h o u l d b e 0 , 1 0 , 2 0 ,4 0 a n d 8 0 , u g / m l e t h i o n a m i d e . T h e g e o m e t r i c m e a no f t h e u s u a l 2 0 - c o l o n y m i n i m a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a -t i o n s o b t a i n e d i n t h e s e t i t r a t i o n s i s c a l c u l a t e d . T h em ea n i s t h e n m u l t i p l i e d b y 1 . 0 7 , 1 . 5 a n d 2 . 1 ( a 1 . 4 -f o l d s e r i e s ) , t o g i v e t h e t h r e e d r u g c o n c e n t r a t i o n s t ob e u s e d i n t h e r o u t i n e t e s t . T h u s , i f t h e g e o m e t r i cm ea n m i n i m a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n f o r e t h i o n a -m i d e i s 2 7 , t g / m l , t h e c o n c e n t r a t i o n s w o u l d b e2 8 , t g / m l , 4 0 , t g / m l a n d 5 6 j u g / m l . T h e s e c o n c e n -t r a t i o n s a r e r e f e r r e d t o b e l o w a s t h e l o w e r , t h em i d d l e a n d t h e u p p e r c o n c e n t r a t i o n s , r e s p e c t i v e l y .P r o c e d u r e

T e s t s t r a i n s a r e s e t u p on a c o n t r o l , d r u g - f r e es l o p e a n d o n o n e s l o p e c o n t a i n i n g t h e l o w e r , t h em i d d l e a n d t h e u p p e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h e d r u gc o n c e r n e d . I n e a c h b a t c h o f t e s t s , 2 p r e - t r e a t m e n tc o n t r o l s t r a i n s a r e a l s o i n c l u d e d , s e t u p on s l o p e sc o n t a i n i n g t h e r a n g e o f c o n c e n t r a t i o n s u s e d i n t h ep r e l i m i n a r y t i t r a t i o n . The r e s u l t s w i t h t h e s e c o n t r o ls t r a i n s a r e c o l l e c t e d a t i n t e r v a l s o f 6 m o n t h s t o1 y e a r , a n d t h e g e o m e t r i c m e a n s c a l c u l a t e d a s a

3 0


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MYC OB A C T E R I A L DRUG SENSITIVITY TESTS: R E C E N T ADVANCES AND P R A C T I C A L US E

t h a t t h e l o w e r , m i d d l e a n d u p p e r c o n c e n t r a -ar e s t i l l c o r r e c t . I n a n y b a t c h o f t e s t s , t h eo n t h e s e c o n t r o l s a l s o ser v e a s a c h e c k t h a th e b a t c h o f medium u s e d h a s n o t d e t e r i o r a t e d

i m p o r t a n t f o r e t h i o n a m i d e t e s t s ) .and r e a d i n g o f t e s t s

A l l t e s t s a r e i n c u b a t e d a t 3 7 C a n d r e a d a tw e e k s . As f o r t h e f i r s t - l i n e d r u g s , p r e l i m i n a r y

a t 2 w e e k s may i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f as t r a i n .D e f i n i t i o n o f r e s i s t a n c e .

S e n s i t i v e : no g r o w t h on t h e l o w e r c o n c e n t r a t i o n( e . g . , i n t h e e x a m p l e , 2 8 u g / m l e t h i o n -a m i d e ) .

R e s i s t a n t : g r o w t h on t h e m i d d l e c o n c e n t r a t i o n o rt h e u p p e r c o n c e n t r a t i o n s o r g r o w t h ont h e l o w e r c o n c e n t r a t i o n f o l l o w e d b y as i m i l a r g r o w t h i n a f u r t h e r t e s t d o n e ont h e c o n t r o l s l o p e o r on a n o t h e r c u l t u r ef r o m t h e same p a t i e n t .

T ES T F O R P Y RA ZI N A MI D Ei n c u b a t i o n a n d r e a d i n g o f t e s t s

P y r a z i n a m i d e s e n s i t i v i t y t e s t s a r e s e t up w i t h ad i l u t i o n o f t h e s t a n d a r d i n o c u l u m s u s p e n s i o n .h e medium m us t b e a c i d a n d c o l o n i e s t a k e l o n g e ro g r o w . H e n c e , r e a d i n g s s h o u l d b e made a t 6 w e e k si n o c u l a t i o n .

A c i d m ed iu m i s p r e p a r e d b y a d d i n g N H C l v e r ya n d w i t h c o n t i n u o u s s h a k i n g t o t h eb e f o r e i n s p i s s a t i o n ( a p p r o x i m a t e l y 5 0 m l

HC l i s r e q u i r e d f o r 1 . 0 l i t r e m e d i u m ) u n t i l t h ei s a t p H 4 . 8 5 0 . 0 5 , as m e a s u r e d w i t h ae l e c t r o d e . Once a c i d i f i e d , t h e medium s h o u l de d i s t r i b u t e d w i t h o u t d e l a y i n 7 - m l amounts i n 2 8 -l s c r e w - c a p p e d b o t t l e s a n d i n s p i s s a t e d , a s u s u a l ,o r 5 0 m i n u t e s a t 8 5 C . The m e d i u m may b e s t o r e do r I m o n t h .r o c e d u r eT e s t s t r a i n s a n d s t r a i n H37Rv a r e i n o c u l a t e d on t os l o p e s c o n t a i n i n g 0 , 2 5 , 5 0 a n d 1 0 0 , u g / m l

p y r a z i n a m i d e . The t e s t may b e s i m p l i f i e d b y u s i n go n l y o n e d r u g c o n c e n t r a t i o n ( 1 0 0 , t g / m l p y r a z i n -a m i d e ) b u t a d u p l i c a t e p a i r o f d r u g - f r e e a n d d r u g -c o n t a i n i n g s l o p e s s h o u l d t h e n b e s e t up f r o m e a c hs t r a i n .

When i n o c u l a t i n g t h e s l o p e s , c a r e m u s t b e t a k e nn o t t o d i g t h e l o o p i n t o t h e s o f t s u r f a c e o f t h emedium a n d n o t t o i n o c u l a t e t h e m a r g i n s o f t h es l o p e n e a r t h e b o t t l e w a l l s , o r i n t h e w a t e r o fc o n d e n s a t i o n . R e a d i n g s s h o u l d b e made w i t h a l e n s ,t a k i n g i n t o a c c o u n t t h e m o s t m i n u t e c o l o n i e s .D e f i n i t i o n o f r e s i s t a n c e .

S e n s i t i v e : g r o w t h o f l e s s t h a n 1 0 c o l o n i e s o n1 0 0 , u g / m l p y r a z i n a m i d e . ( G r o w t h i su s u a l l y i n h i b i t e d b y 2 5 j u g / m l , b u to c c a s i o n a l s e n s i t i v e s t r a i n s m a y g r o w o ns l o p e s c o n t a i n i n g 2 5 , s g / m l o r e v e n5 0 u g / m l p y r a z i n a m i d e ) .R e s i s t a n t : g r o w t h o f 1 0 c o l o n i e s o r m o r e o n1 0 0 j i g / m l p y r a z i n a m i d e .

I t i s p r o b a b l e t h a t s t r a i n s w i t h a c q u i r e d r e s i s t a n c et o p y r a z i n a m i d e a l w a y s h a v e v e r y h i g h d e g r e e s o fr e s i s t a n c e .Medium a t a p H m o r e a l k a l i n e t h a n 4 . 8 5 i s a l i t t l el e s s e f f i c i e n t i n d i s t i n g u i s h i n g b e t w e e n s e n s i t i v e a n dr e s i s t a n t s t r a i n s . Medium a t p H 4 . 8 5 h a s b e e n f o u n dt o s u p p o r t t h e g r o w t h o f t h e g r e a t m a j o r i t y o f s t r a i n sf r o m B r i t i s h , S o u t h I n d i a n a n d C h i n e s e ( H o n gK o n g ) p a t i e n t s . H o w e v e r , a s l i g h t l y more a l k a l i n ep H medium ( 4 . 9 5 ) w a s n e c e s s a r y t o g e t s a t i s f a c t o r yg r o w t h o f m a n y s t r a i n s f r o m p a t i e n t s f r o m U g a n d a .T h u s , r e g i o n a l v a r i a t i o n i n t h e c h a r a c t e r i s t i c s o fM y c o . t u b e r c u l o s i s r e n d e r s i t n e c e s s a r y t o d e t e r m i n et h e o p t i m u m p H f o r s t r a i n s f r o m d i f f e r e n t a r e a s o ft h e w o r l d .

TESTS F O R T H I O A C E T A Z O N ET e s t s f o r t h i o a c e t a z o n e s e n s i t i v i t y a r e o f l i t t l e

p r o g n o s t i c v a l u e i n a r e a s o f t h e w o r l d w h e r e ap r o p o r t i o n o f w i l d s t r a i n s a r e n a t u r a l l y r e s i s t a n t t ot h e d r u g s i n c e i t i s d i f f i c u l t t o d i s t i n g u i s h b e t w e e ns t r a i n s w i t h n a t u r a l a n d a c q u i r e d r e s i s t a n c e . T h i s i sb e c a u s e t h e r e i s no s t r o n g a s s o c i a t i o n b e t w e e nn a t u r a l t h i o a c e t a z o n e s e n s i t i v i t y o f p r e - t r e a t m e n ts t r a i n s a n d t h e r e s p o n s e o f p a t i e n t s t o t r e a t m e n tw i t h a r e g i m e n o f i s o n i a z i d a n d t h i o a c e t a z o n e( M i t c h i s o n , 1 9 6 8 ) . I n t h e s e a r e a s , i t i s t h e r e f o r eu n p r o f i t a b l e t o d o s e n s i t i v i t y t e s t s t o t h e d r u g .F e w e r s t u d i e s u s i n g t h e M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i ls e n s i t i v i t y t e s t m e t h o d s h a v e b e e n d o n e i n a r e a sw h e r e n a t u r a l r e s i s t a n c e i s r a r e . H o w e v e r , t h ef o l l o w i n g m e t h o d c a n b e u s e d .I n o c u l u m , i n c u b a t i o n a n d r e a d i n g o f t e s t s

S l o p e s a r e i n o c u l a t e d w i t h t h e s t a n d a r d i n o c u l u ma n d r e a d a f t e r 4 w e e k s ' i n c u b a t i o n .

3 1


12/23

32 G . C A N E T T I AND OTHERS

S t o c k s o l u t i o n s a n d s t o r a g e o f m e d i u mA s t o c k s o l u t i o n o f 6 4 0 0 , t g / m l t h i o a c e t a z o n e i sp r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 6 4 m g t h i o a c e t a z o n e i n 1 0 m lt r i e t h y l e n e g l y c o l ( T r i g o l , B r i t i s h D r u g H o u s e s ) , a n dd i l u t i o n s o f t h i s s o l u t i o n a r e a l s o made i n t r i e t h y l e n eg l y c o l . T h e t r i e t h y l e n e g l y c o l s h o u l d b e w a r m e d a t3 7 C t o r e d u c e i t s v i s c o s i t y , a n d f r e s h p i p e t t e ss h o u l d b e u s e d f o r e a c h d i l u t i o n s t e p . T h e s t o c ks o l u t i o n s a r e s e l f - s t e r i l i z i n g , a n d a r e a d d e d t oL 6 w e n s t e i n - J e n s e n m e d i u m t o g i v e a f i n a l c o n c e n t r a -t i o n o f 0 . 5 % t r i e t h y l e n e g l y c o l i n t h e m e d i u m . A l ls t o c k s o l u t i o n s a n d m e d i u m s h o u l d b e s t o r e d i n t h ed a r k , b u t a r e h e a t - s t a b l e .

P r o c e d u r eT e s t s t r a i n s a r e i n o c u l a t e d o n t o s l o p e s c o n t a i n i n g0 , 0 . 5 , 1 , 2 , 4 a n d 8 , g / m l t h i o a c e t a z o n e . S t r a i nH37Rv may a l s o b e i n o c u l a t e d o n t o s l o p e sc o n t a i n i n g 0 . 1 2 , u g l m l a n d 0 . 2 5 , t g / m l , b u t s i n c e t h i s

s t r a i n i s n o t f u l l y s e n s i t i v e t o t h e d r u g , i t s u s e a s ac o n t r o l s t r a i n i s n o t r e c o m m e n d e d .D e f i n i t i o n o f r e s i s t a n c e .

S e n s i t i v e : n o g r o w t h ( o f 2 0 c o l o n i e s o r m o r e ) o n2 y g / m l t h i o a c e t a z o n e .R e s i s t a n t : g r o w t h o n 2 / u g f m l t h i o a c e t a z o n e o rm o r e .

I I I . T HE PR O PO R TI O N METHOD ( T HE S I MPLI F I E D ANDT HE STANDARD VARIANTS) 1

PRINCIPLE O F T HE METHODA l l s t r a i n s o f t u b e r c u l o s i s c o n t a i n s o m e b a c i l l it h a t a r e r e s i s t a n t t o a n t i b a c i l l a r y d r u g s . H o w e v e r , i nr e s i s t a n t s t r a i n s , t h e p r o p o r t i o n o f s u c h b a c i l l i i sc o n s i d e r a b l y h i g h e r t h a n i n s e n s i t i v e s t r a i n s . T h e

p r o p o r t i o n m e t h o d c o n s i s t s i n c a l c u l a t i n g t h ep r o p o r t i o n o f r e s i s t a n t b a c i l l i p r e s e n t i n a s t r a i n .T w o a p p r o p r i a t e b a c i l l a r y d i l u t i o n s , a h i g h a n d al o w o n e , a r e i n o c u l a t e d o n d r u g - c o n t a i n i n g a n dd r u g - f r e e m e d i u m , i n o r d e r t o p r o v i d e n u m e r a b l ec o l o n i e s o n b o t h m e d i a . T h e r a t i o o f t h e n u m b e r o fc o l o n i e s o b t a i n e d o n t h e d r u g - c o n t a i n i n g m e d i u m t ot h e n u m b e r o f c o l o n i e s o b t a i n e d o n t h e d r u g - f r e em e d i u m i n d i c a t e s t h e p r o p o r t i o n o f r e s i s t a n t b a c i l l ip r e s e n t i n t h e s t r a i n . B e l o w a c e r t a i n p r o p o r t i o n ,t h e s t r a i n i s c l a s s i f i e d a s s e n s i t i v e ; a b o v e , a sr e s i s t a n t .T h e r e e x i s t t w o v a r i a n t s o f t h e p r o p o r t i o nm e t h o d : t h e s i m p l i f i e d v a r i a n t a n d t h e s t a n d a r dv a r i a n t . 2 T h e s i m p l i f i e d v a r i a n t i s s u i t a b l e f o rc u r r e n t p r a c t i c e : w i t h t h e c r i t e r i a a d o p t e d , i t s u s eu n d e r a d e q u a t e t e c h n i c a l c o n d i t i o n s c a u s e s a na l m o s t n e g l i g i b l e p r o p o r t i o n o f s e n s i t i v e s t r a i n s t o b em i s c l a s s i f i e d a s r e s i s t a n t a n d a v e r y s m a l l p r o p o r t i o no f r e s i s t a n t s t r a i n s t o b e m i s c l a s s i f i e d a s s e n s i t i v e .T h e s t a n d a r d v a r i a n t , w h i c h r e q u i r e s a w i d e r r a n g eo f d r u g - c o n t a i n i n g m e d i a a n d m o r e w o r k , s h o u l d b eu s e d o n l y i n l a b o r a t o r i e s t h a t a r e h i g h l y s p e c i a l i z e d

I P r e p a r e d b y Dr G . C a n e t t i a n d Dr N . R i s t .2 B o t h v a r i a n t s o f t h e p r o p o r t i o n m e t h o d w e r e w o r k e d

o u t i n c o l l a b o r a t i o n w i t h Dr J . G r o s s e t .

i n s e n s i t i v i t y t e s t i n g ; i t h a s r e l a t i v e l y l i t t l e a d v a n -t a g e o v e r t h e s i m p l i f i e d v a r i a n t , e x c e p t f o r r e s e a r c hp u r p o s e s .

T HE SIMPLIFIED V AR I A N T 3C u l t u r e m e d i u m ; i n c o r p o r a t i o n o f d r u g s i n t o t h em e d i u m ; c o n c e n t r a t i o n s o f d r u g s e m p l o y e d

L 6 w e n s t e i n - J e n s e n medium w i t h o r w i t h o u tp o t a t o s t a r c h i s u s e d f o r a l l t h e r e s i s t a n c e t e s t s . T h es l o p e s u s e d a r e 1 7 mm x 1 7 0 mm a n d c o n t a i n 7 m lo f m e d i u m . T h e d r u g s , d i s s o l v e d i n d i s t i l l e d w a t e r , 4a r e i n c o r p o r a t e d i n t h e medium b e f o r e c o a g u l a t i o n .T h e c o n t r o l m e d i u m w i t h o u t d r u g s i s p r e p a r e d a t t h es a m e t i m e a s t h e d r u g - c o n t a i n i n g m e d i a . A f t e r t h ed r u g h a s b e e n a d d e d t o t h e m e d i u m a n d a f t e rt h e m e d i u m h a s b e e n d i s t r i b u t e d i n t h e s l o p e s , t h em e d i u m i s c o a g u l a t e d a t 8 5 C f o r 5 0 m i n u t e s . T h es l o p e s a r e l e f t a t room t e m p e r a t u r e f o r 2 4 h o u r s w i t hc o t t o n - w o o l p l u g s a n d a r e t h e n c o v e r e d w i t h r u b b e rc a p s a n d s t o r e d a t 4 C . T h e p e r i o d o f v a l i d i t y o f t h em e d i a s t o r e d a t 4 C i s 2 m o n t h s ; f o r m e d i a w i t he t h i o n a m i d e , 1 m o n t h .C o n c e n t r a t i o n s o f d r u g s e m p l o y e d

O n l y o n e c o n c e n t r a t i o n i s e m p l o y e d p e r d r u g .T h e c o n c e n t r a t i o n s a r e :' C a n e t t i e t a l . ( 1 9 6 4 ) .' F o r e t h i o n a m i d e , t h i o a c e t a z o n e a n d r i f a m p i c i n , w h o s es o l u b i l i t y i n w a t e r i s v e r y l o w , 1 % s o l u t i o n s i n p u r e e t h y l e n eg l y c o l a r e f i r s t p r e p a r e d . T h e s u b s e q u e n t d i l u t i o n s a r e m a d e

i n d i s t i l l e d w a t e r .


13/23

M Y C O B A C T E R I A L DRUG SENSITIVITY T E S T S : R E C E N T ADVANCES AND P R A C T I C A L USE 33

I s o n i a z i d 0 . 2 , g / m lS t r e p t o

advances in techniques of testing mycobacterial

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