adln perpustakaan universitas airlanggarepository.unair.ac.id/25597/13/13. bab 2.pdf ·...
TRANSCRIPT
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Penelitian ini bertujuan untuk mensisntesis kolagen yang berasal dari
tendon sapi untuk dijadikan komposit kolagen – hidroksiapatit sebgai bahan bone
filler. Dalam bab ini penulis akan membahas tentang tinjauan pustaka, dengan
penekanan pembahasan pada tinjauan teori tentang tulang, protein kolagen, sapi,
kolagen tendon sapi, keramik hidroksiapatit, komposit kolagen – hidroksiapatit,
serta karakteristik komposit kolagen - hidroksiapatit.
2.1 Tulang
2.1.1 Struktur mikroskopis tulang
Secara garis besar tulang dikenal ada dua tipe yaitu tulang korteks
(kompak atau cortical) dan tulang trabekular (berongga = spongy = cancelous).
Bagian luar kedua tulang tersebut merupakan tulang padat yang disebut korteks
tulang dan bagian dalamnya adalah tulang trabekular yang tersusun seperti bunga
karang (Riis, 1996). Tulang korteks merupakan bagian terbesar (80%) penyusun
kerangka,mempunyai fungsi mekanik, modulus elastisitas yang tinggi dan mampu
menahantekanan mekanik berupa beban tekukan dan puntiran yang berat. Tulang
korteks terdiri dari lapisan padat kolagen yang mengalami mineralisasi, tersusun
konsentris sejajar dengan permukaan tulang (Riis, 1996).
Tulang spongiosa atau cancellous atau trabekular mempunyai elastisitas
yang lebih kecil dari tulang korteks, mengalami proses reabsorpsi lebih
cepat dibandingkan dengan tulang korteks. Tulang spongiosa terdapat pada daerah
metafisis dan epifisis tulang panjang serta pada bagian dalam tulang pendek
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
(Buckwalter, 1995). Secara makroskopis tulang dibedakan menjadi tulang
dan tulang berlapis lamellar
yang paling awal pada
kolagen berbentuk ireguler.
berlapis lamellar yang
Struktur tulang normal
Menurut sudut pandang
dari komponen organik
adalah protein dengan
hidroksiapatit adalah
sebuah keramik. Struktur k
angstrom, tertanam di
Secara makroskopis tulang dibedakan menjadi tulang
lamellar (tulang sekunder) . Tulang woven adalah bentuk tulang
yang paling awal pada embrio dan selama pertumbuhannya terdiri dari j
ireguler. Setelah dewasa tulang woven diganti
yang terdiri dari tulang korteks dan trabekular ( Rachman,
normal ditunjukkan pada Gambar 2.1.
Gambar 2.1. Struktur tulang dewasa normal
(Rachman, 2006)
sudut pandang struktural, tulang pada dasarnya adalah
organik dan anorganik yaitu, kolagen dan hidroksiapatit
dengan kekuatan tarik yang tinggi dan sifat viskoelastik
adalah senyawa kalsium fosfat dengan sifat yang mirip dengan
Struktur kristal hidroksiapatit, berbentuk jarum
di sisi serat panjang kolagen. Serat kolagen kemudian
7
Secara makroskopis tulang dibedakan menjadi tulang woven
adalah bentuk tulang
embrio dan selama pertumbuhannya terdiri dari jaringan
diganti oleh tulang
Rachman, 2006).
normal
pada dasarnya adalah gabungan
hidroksiapatit. Kolagen
viskoelastik, sedangkan
sifat yang mirip dengan
jarum dengan ukuran
kemudian disusun
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
8
dalam lembaran sebagai struktur paralel, yang pada gilirannya berlapis dalam
lingkaran konsentris dengan orientasi serat kolagen bervariasi antara lapisan.
Dimensi lapisan konsentris komposit, atau lamella ini berbeda untuk setiap jenis
tulang (Grimm, Michele J, 2004).
2.1.2 Matriks tulang
Berdasarkan beratnya, matriks tulang yang merupakan substansi
interseluler terdiri dari ± 70% garam anorganik dan 30% matriks organik. Matriks
anorganik merupakan bahan mineral yang sebagian besar terdiri dari kalsium dan
fosfat dalam bentuk kristal-kristal hydroxyapatite. Kristal –kristal tersebut
tersusun sepanjang serabut kolagen. Mineral – mineral lain yang terkandung
dalam tulang yaitu magnesium (Mg), fluoride (F) dan klor (Cl), natrium (Na) dan
kalium (K) yang ditunjukkan pada Tabel 2.1 (Kalfas dalam Dewi, 2009).
Kehadiran mineral tersebut menjadikan kalsium fosfat dalam tulang mempunyai
sifat yang kompleks, seperti dapat hadir dalam berbagai fase dan adanya
kemurnian (Dewi, 2009). Kekerasan tulang tergantung dari kadar bahan anorganik
dalam matriks, sedangkan dalam kekuatannya tergantung dari bahan-bahan
organik khususnya serabut kolagen (Rachman, 2006).
Sebesar 95% komponen organik dibentuk dari kolagen, sisanya terdiri
dari substansi dasar proteoglikan dan molekul non kolagen yang terlibat dalam
pengaturan mineralisasi tulang. Kolagen yang dimiliki oleh tulang adalah kurang
lebih setengah dari total kolagen tubuh, strukturnya pun sama dengan kolagen
pada jaringan pengikat lainnya. Hampir seluruhnya adalah fiber kolagen tipe I.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
9
Ruang pada struktur tiga dimensinya yang disebut sebagai hole zones, yang
merupakan tempat mineral tulang (Grimm, Michele J, 2004) .
Kontribusi substansi dasar proteoglikan pada tulang memiliki proporsi
yang jauh lebih kecil dibandingkan pada kartilago, terutama terdiri atas
chondroitin sulphate dan asam hyaluronik. Substansi dasar mengontrol kandungan
air dalam tulang, dan kemungkinan terlibat dalam pengaturan pembentukan fiber
kolagen. Materi organik non kolagen terdiri dari osteokalsin yang terlibat dalam
pengikatan kalsium selama proses mineralisasi, osteonektin yang berfungsi
sebagai jembatan antara kolagen dan komponen mineral, sialoprotein yang kaya
akan asam salisat dan beberapa macam protein lainya (Grimm, Michele J, 2004).
Tabel 2.1. Kandungan Unsur Mineral dalam Tulang
(Aoiki dalam Dewi, 2009)
Unsur Kandungan (% berat)
Ca 34,00 P 15,00
Mg 0,50 Na 0,80 K 0,20 C 1,60 Cl 0,20 F 0,08
Zat sisa 47,62
2.1.3 Sel tulang
Tulang terdiri atas matriks tulang dan 3 jenis sel tulang yaitu, osteosit,
osteoblast yang mensintesis unsur organik matriks dan osteoklas yang merupakan
sel raksasa multinuklear yang terlibat dalam reabsorbsi dan remodeling jaringan
tulang.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
10
Osteoblast memproduksi osteoid atau matriks tulang, berbentuk bulat, oval
atau polihedral, terpisah dari matriks yang telah mengalami mineralisasi.
Osteoblast berfungsi mensintesis dan mensekresi matriks organik tulang,
mengatur perubahan elektrolit cairan ekstraselular pada proses mineralisasi.
Osteoblast mengandung retikulum endoplasmik, membran golgi dan mitokondria.
Osteoblast salingberhubungan melalui gap junction. Osteoblast yang menetap pada
permukaan tulang bentuknya pipih yang dinamakan bone lining cells / resting
osteoblast (Depster, 2001)
Sel osteoklast ditemukan pada permukaan tulang yang mengalami
resorpsi dan kemudian membentuk cekungan yang dikenal sebagai lacuna Howship.
Sitoplasma Osteoklas terisi oleh mitokondria yang berguna untuk menyediakan
energi untuk proses reabsorbsi tulang (Depster, 2001). Osteoblast dan osteoklast
ditunjukkan pada Gambar 2.2.
Gambar 2.2 Sel tulang (B= Bone; ob = osteoblast; oc = osteoklas)
(Depster, 2001)
Osteosit berasal dari osteoblas dimana pada akhir proses mineralisasi akan
tersimpan pada matriks tulang. Osteosit mempunyai satu inti, jumlah organela
bervariasi dan sel ini menjangkau permukaan luar dan dalam tulang, membuat
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
11
tulang menjadi sensitif terhadap tekanan, mengontrol pergerakan ion serta
mineralisasi tulang (Drajad, 2002). Osteosit pada akhir proses mineralisasi
terhimpit oleh ekstraselular matriks (Drajad, 2002). Pada Gambar 2.2 tidak terlihat
adanya osteosit. Letak osteosit ada dibagian bawah osteoblast (Depster, 2001).
2.2 Biomaterial
Biomaterial merupakan semua material sintetik yang digunakan untuk
menggantikan atau memperbaiki fungsi jaringan tubuh yang secara berkelanjutan
atau sekedar bersentuhan dengan cairan tubuh (Cahyanto, 2009 ). Berdasarkan
sumbernya, biomaterial ada 2 macam, yaitu biomaterial alam dan biomaterial
sintetik. Biomaterial alam terdiri dari autograft, allograft dan xenograft. Autograft
merupakan transplantasi jaringan dari satu bagian tubuh ke tubuh yang lain
dalam individu yang sama. Allograft merupakan transplantasi organ atau
jaringan dari satu individu ke individu lain, dalam satu spesies namun berbeda
genotip. Sedangkan xenograft merupakan transplantasi organ atau jaringan dari
spesies yang berbeda. Untuk biomaterial sintetik dapat disintesis dari bahan
logam, polimer, keramik atau komposit. Allograftt memiliki keterbatasan antara
lain kelangkaan donor, betuk anatomi tubuh yang setiap orang dapat berbeda dan
kurangnya tingkat penerimaan organ selama masa penyembuhan. Sedangkan
untuk autograft memiliki kelemahan pada respon kekebalan dan dapat
menghilangkan osteokonduksi (Rodrigues et al, 2002).
Usaha melakukan perbaikan fungsi organ atau jaringan pun semakin
berkembang, sehingga muncul berbagai bahan biomaterial. Biomaterial
merupakan suatu material tak hidup yang digunakan sebagai perangkat medis dan
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
12
mampu berinteraksi dengan sistem biologis (Williams dalam Cahyanto, 2009).
Syarat utama material yang akan digunakan di dalam tubuh adalah biokompatibel,
artinya material yang digunakan mampu bekerja sesuai dengan respon penerima.
Namun, tidak ada material yang biokompatibel menyeluruh. Hal ini disebabkan
material untuk suatu aplikasi bisa saja biokompatibel tetapi tidak untuk aplikasi
lain. Oleh karena itu biokompabilitas dapat berbeda bergantung aplikasinya
(Williams dalam Cahyanto, 2009).
2.3 Protein Kolagen
Kolagen adalah suatu protein struktural yang panjang dan berserat yang
berisi tiga rantai peptida, yang membentuk struktur heliks rangkap tiga oleh ikatan
hidrogen intra-molekuler antara Gly dan Hyp dalam rantai yang berdekatan
(Zeugolis dalam Hua-Jie Wang et al, 2009). Fibril kolagen terdiri dari sub-unit
polipeptida berulang yang disebut tropokolagen yang disusun dalam untaian
paralel dari kepala sampai ekor seperti terlihat pada Gambar 2.3. Tropokolagen
terdiri atas tiga rantai polipeptida yang terpilin erat menjadi tiga untaian atau
lembaran panjang, tiap rantai polipeptida dalam tropokolagen juga merupakan
satu heliks (Lehninger dalam Hajrawati , 2006).
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
13
Gambar 2.3. Susunan molekul tropokolagen dari fibril kolagen
( Lehninger dalam Hajrawati, 2006 )
Kolagen seperti umumnya protein, memiliki struktur yang terdiri dari
karbon, hidrogen, gugus hidroksil (OH), gugus karbonil (C=O), gugus C≡N dan
gugus amina (N-H). Gugus amina (N-H) pada kolagen terdiri dari pita amida A,
amida I, amida II serta amida III (Marsaid, 2010). Gugus tersebut sesuai dengan
struktur kimia kolagen dan struktur rantai polipeptida yang ditunjukkan pada
Gambar 2.4. Molekul kolagen terdiri dari tiga rantai polipeptida yang saling
berulang.
Gambar 2.4. Struktur rantai panjang kolagen ( kiri ) dan struktur rantai
polipeptida ( kanan ) (Martianingsih et al, 2010)
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
14
Protein kolagen terdiri dari polipeptida dan lebih 1000 residu asam amino.
Polipeptida tersebut adalah glisin – prolin dan hidroksiprolin atau Gly–X-Y,
dimana residu glisin tersembunyi pada bagian dalam rantai, sedangkan asam
amino X-Y berada di bagian permukaan rantai tripel polipeptida. Asam amino
glisin, protein prolin dan hidroksiprolin merupakan asam amino utama
kolagen Struktur asam amino glisin dan hidroksiprolin ini yang menyusun
komponen protein kolagen secara berulang dengan beberapa asam amino lainya.
Struktur glisin dan hidroksiproline ditunjukkan pada Gambar 2.5 yang terdiri dari
gugus karboksil dan amida sekunder, dengan bentuk ikatan yang berbeda. Asam
amino aromatik dan sulfur terdapat dalam jumlah yang sedikit (Ward Ward et
al, 1977).
Gambar 2.5 Struktur rantai glisin (kiri), dan struktur rantai hidroksiprolin (kanan )
(Martianingsih et al, 2010)
Penyebaran kolagen pada tubuh mamalia terdapat sekitar 25% sampai 35%
protein kolagen dari seluruh tubuh mamalia ( Di LulloDagger et al dalam Hua-Jie
Wang et al, 2009 ). Lebih dari 90% protein ekstraseluler ada di tendon dan kulit
dan lebih dari 50% kolagen terdapat pada kulit (Piez dalam Friess,1997).
Penyebaran kolagen pada berbagai jaringan mamalia dapat dilihat pada Tabel 2.2.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
15
Tabel 2.2 Penyebaran Kolagen pada Berbagai Jaringan Hewan Mamalia
(Ward et al, 1977)
Menurut Brown et al (1997), kolagen merupakan kelompok protein
struktural yang bersumber dari matriks ekstraseluler. Fibril kolagen merupakan
struktur protein yang penting dalam kulit, tulang, dinding jaringan darah serta
organ bagian dalam. Sesuai dengan struktur alami, secara komersial kolagen
banyak dimanfaatkan dalam dunia kedokteran, pangan dan industri perkulitan.
Rantai peptida kolagen setiap individu sangat panjang dan mengandung kira-
kira 1050 asam amino residu. Kolagen memiliki kekuatan tarik yang besar, dan
merupakan komponen utama dari fasia, tulang rawan, ligamen, tulang tendon, dan
kulit.
Terdapat banyak tipe kolagen penyusun jaringan, antara lain tipe I kolagen
ditemukan terutama pada kulit, tulang dan tendon, tipe II kolagen ditemukan pada
tulang rawan arteri pada tulang sendi, dan tipe III kolagen merupakan unsur utama
dari pembuluh darah (Cahyanto, 2009). Kolagen yang paling dikenal adalah
kolagen tipe I yang banyak terdapat di jaringan tubuh yang lunak seperti kulit dan
Jenis Jaringan Kandungan Kolagen (%)
Kulit 89 Tendon 85 Tulang 24 Aorta 23
Lambung 23 Usus besar 18
Ginjal 5 Otot 2 Hati 2
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
16
tendon, maupun jaringan jaringan tubuh yang keras seperti tulang dan kartilago.
Kolagen tipe 1 terdiri dari tiga rantai polipeptida. Dua rantai polipeptida disebut
tipe1 dan polipeptida yang ketiga disebut tipe2 (Prayitno, 2007).
Protein kolagen memiliki biokompatibilitas sangat baik, imunogenisitas
yang baik, dan bioabsorbabilitas yang tinggi. Sebagai contoh, Thumann et al
(2009) membuktikan bahwa kolagen tidak beracun oleh morfologi, viabilitas dan
analisis diferensiasi. Setelah 24 minggu implantasi subconjunctival, membran
kolagen tidak menunjukkan bukti adanya peradangan atau fibrosis, dan berhasil
diserap dalam 17 minggu. Membran kolagen terdegradasi lambat dalam ruang
subretinal dan juga tidak menimbulkan penolakan atau respon inflamasi
(Thumann et al, 2009). Dalam percobaan Hong et al, 2007, disiapkan 2-D dan
matriks 3-D tipe I kolagen dan menemukan bahwa geometri dan komposisi
matriks mempengaruhi aktivasi kontekstual dari jalur ERK (Extracellular Signal-
Regulated Kinases), yang mengakibatkan efek yang berbeda pada fenotipe sel
(Hong et al, 2007).
2.4 Sapi (Bos sondaicus)
Bangsa (breed) sapi adalah sekumpulan ternak yang memiliki karakteristik
tertentu yang sama. Atas dasar karakteristik tersebut, mereka dapat dibedakan dari
ternak lainnya meskipun masih dalam spesies yang sama. Karakteristik yang
dimiliki dapat diturunkan ke generasi berikutnya.
Menurut Romans dalam Arbi (2009), bangsa sapi mempunyai klasifikasi
taksonomi sebagai berikut :
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
17
Filum : Chordata Subfilum : Vertebrata Kelas : Mamalia Sub kelas : Theria Infra kelas : Eutheria Ordo : Artiodactyla Sub ordo : Ruminantia Infra ordo : Pecora Famili : Bovidae Genus : Bos (cattle) Grup : Taurinae Spesies : Bos taurus (sapi Eropa), Bos indicus (sapi India/sapi zebu), Bos sondaicus (banteng/sapi Bali).
Gambar 2.6 Sapi bali (Bos sondaicus)
Spesies sapi potong yang paling umum ditemui di Indonesia adalah Bos
saondaicus atau sapi Bali seperti pada Gambar 2.6. Sapi Bali merupakan
keturunan sapi liar yang disebut sapi banteng (Bos bibos atau Bos sondaicus) yang
telah mengalami proses penjinakan (domestikasi) berabad - abad lamanya. Sapi
jenis ini termasuk dalam golongan sapi pedaging dan pekerja. Bentuk tubuhnya
menyerupai banteng, tetapi ukuran tubuh lebih kecil akibat proses domestikasi,
dadanya dalam, dan badanya padat. Warna tubuh ketika masih kecil berwana
sawo matang. Namun setelah dewasawarna bulu akan berubah menjadi cokelat
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
18
kehitaman. Tanduk pada jantan tumbuh keluar kebagian luar kepala, sedangkan
pada betina, tanuk ini tumbuh kebagian dalam kepala. Tinggi sapi dewasa
mencapai 130 cm dan berat rata-rata sapi jantan adalah 450 kg, sedangkan sapi
betina beratnya mencapai 400 kg (Arbi, 2009).
2.5 Kolagen dari Tendon Sapi
Kolagen secara khas dapat dibuat dari kulit dan tendon. Ekstrak kolagen
dari tendon sapi relatif lebih mudah untuk dilakukan dan menghasilkan kolagen
dalam jumlah cukup banyak. Kandungan kolagen pada tendon terdapat sekitar
85% dari berat keseluruhan tendon. Prosedur untuk membuat kolagen adalah
dengan menyertakan asam atau ekstrak enzim ( Kempt et al, 1992 ). Menyertakan
ekstrak enzim sebagai katalis merupakan metode yang lebih baik untuk
menghasilkan kemurnian kolagen yang tinggi. Banyak ditemukan ekstraksi
kolagen dengan menggunakan enzim pepsin sebagai katalis dalam proses
ekstraksi. Namun kereaktifan enzim juga perlu diperhatikan. Enzim dengan
kereaktifan yang berlebih akan membuat kolagen terhidrolisis dan rusak.
Akibatnya kandungan kolagen tidak terlihat sama sekali ( Kempt et al, 1992 ).
Kandungan kolagen pada tendon sapi jenis bos sondaicus, bos indicus dan
bos taurus kurang lebih sama, sekitar 85% dari total berat tendon diseluruh sapi
(Arbi, 2009). Hal ini bisa dikarenakan berat dari ketiga jenis sapi yang umum ada
di Indonesia ini kurang lebih sama, berkisar 400-500 kg untuk sapi dewasa (Arbi,
2009).
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
19
2.6 Keramik Hidroksiapatit
Mineral apatit, baik sintetis ataupun alami, yang paling stabil dan umum
digunakan dalam kedokteran dan kedokteran gigi adalah hidroksiapatit.
Hidroksiapatit merupakan material kisi kristal heksagonal dengan formula kimia
yang ideal, yaitu, Ca10(PO4)6(OH)2. Struktur kristal monosiklik heksagonal
hidroksiapatit ditunjukkan pada Gambar 2. Hidroksiapatit memiliki Ca:P sebesar
1,67. Secara teoritis, hidroksipatit mempunyai densitas 3,156 gr/cm3 (Aoki dalam
Dewi, 2009). Hidroksiapatit adalah salah satu dari sekian banyak biokeramik
yang digunakan untuk rekontruksi jaringan tulang dan gigi. (Rodrigues et al,
2003).
Gambar 2.7 Skema struktur kristal hidroksiapatit : (a) Hexagonal; (b) Monoslinik
(Billote, 2003)
Kehadiran karbonat (CO32-) dalam tubuh dapat mensubtitusi formula
hidroksiapatit dengan menempati dua posisi. Karbonat menggantikan posisi
hidroksil (OH-) disebut apatit karbonat tipe A dan menggantikan posisi fosfat
(PO4)3- disebut apatit karbonat tipe B (Tomazik dalam Dewi, 2009).
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
20
Hidroksiapatit merupakan komponen utama pembentuk tulang.
Hidroksiapatit merupakan jenis material yang sering diaplikasikan dalam bidang
medis diantaranya sebagai material untuk menggantikan mineral jaringan tulang
(Dewi, 2009). Selain itu juga cukup baik dalam menyerap unsur kimia organik
dalam tubuh, bersifat non toksik, cepat membangun ikatan dengan tulang
(bioaktif), memiliki biokompatibilitas dengan jaringan sekitar dan dapat
mendorong pertumbuhan tulang baru dalam strukturnya yang berpori.
Menurut Xie et al dalam Wahl et al, 2006, hidroksiapatit sangat cocok
digunakan sebagai implant atau filler kerena material ini mempunyai sifat adhesi
yang baik dalam jaringan lokal. Selain itu hidroksiapatit telah terbukti
meningkatkan proliferasi dan diferensiasi osteoblast.
2.7 Komposit Kolagen – Hidroksiapatit
Tulang rangka terutama mengandung kolagen (umumnya tipe I) dan
karbonat yang digantikan dengan hidroksiapatit, yang keduanya merupakan
komponen osteokonduktivitas. Implant yang dibuat dari komponen tersebut
cenderung berperilaku sama dengan sifat asli tulang. Baik kolagen tipe I dan
hidroksiapatit ditemukan untuk meningkatkan diferensiasi osteoblast (Xie et al
dalam Wahl et al, 2006.). Namun, jika keduanya dikombinasikan, dapat
mempercepat osteogenesis. Osteogenesis merupakan proses pembentukan tulang
baru oleh osteoblast. Sebuah komposit matriks ketika tertanam dengan sel
osteoblast yang mirip dengan osteoblast manusia, memperlihatkan sifat
osteokonduktivitas yang lebih baik dibandingkan dengan hidroksiapatit monolitik
(Serre dalam Wahl et al, 2006). Selain itu, kolagen-hidroksiapatit komposit
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
21
terbukti biokompatibel baik pada manusia dan hewan (Serre dalam Wahl et
al,2006). Oleh sebab itu, komposit kolagen – hidroksiapatit memang didesain
sebagai scaffold yang bersifat osteoinduktif dan osteokonduktif (Rodrigues et al,
2002).
Keuntungan biologis komposit kolagen – hidroksiapatit dibandingkan
dengan perancah polimer sintetis adalah dalam hal peningkatan regenerasi tulang.
Perancah merupakan struktur untuk menyangga suatu bahan. Perancah polimer
bisa memakan waktu hingga 2 tahun untuk meningkatkan regenerasi tulang
sementara kolagen – hidroksiapatit memiliki tingkat degradasi yang lebih masuk
akal berkaitan dengan penggunaan klinis dari 2 bulan sampai 1 tahun (Johnson
dalam Wahl et al,2009 ). Selanjutnya, sel osteogenik melekat lebih baik secara in
vitro untuk kolagen permukaan dibandingkan dengan implant polimer lain seperti
Poly-L-Lactide Acid (PLLA) dan Polyglycolic acid (PGA) (El-Amin et al dalam
(Wahl et al,2009).
Percobaan yang dilakukan Rodrigues et al,(2003), variasi komposisi antara
kolagen dan hidroksiapatit yang digunakan adalah 1:1 dan 1:2,6. Komposit
kolagen hidroksiapatit dibuat dalam bentuk scaffold berpori. Pada variasi
komposisi ini, keduanya memiliki sifat osteoinduktif dan osteokonduktif yang
baik. Osteoinduktif adalah proses untuk menstimulasi pertumbuhan atau
perkembangan dari tulang. Osteokonduktif memberikan sebuah matriks fisik atau
scaffolding yang sesuai untuk pembentukan tulang baru.
Rodrigues, et al, 2003 menggunakan human osteoblast untuk uji toksisitas
dan interaksi osteoblast dalam komposit. Tidak ada degenerasi seluler atau
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
22
kematian sel yang diamati dalam tes toksisitas ini. Osteoblast yang dikultur
selama 4 hari terlihat jarang pada permukaan komposit.
Pada hari ke 11 setelah seeding sel, sel menunjukkan tingkat proliferasi
yang tinggi dan menutupi sebagian permukaan komposit (Gambar 2.8). Sel
bermigrasi melalui blok komposit (pori komposit) mencapai permukaan bawah
dan kemudian coverslip (muncul ke permukaan) serta coverslip ke permukaan
komposit. Pada waktu inilah terlihat osteoblast bentuk polygonal melekat pada
permukan partikel hidroksiapatit dan juga serat kolagen (Gambar 2.9).
.
Gambar 2.8 Osteoblast menempel pada permukaan hidroksiapatit pada hari ke-11
(Rodrigues et al, 2003)
Gambar 2.9 Osteoblast menempel kuat pada serat kolagen
(Rodrigues et al, 2003)
Hasil data morfometrik sampel menunjukkan kolagen – hidroksiapatit
yang diberi perlakuan dehidrasi dan diradiasi pada perbandingan 1 : 2.6,
menunjukkan pertumbuhan sel yang terbanyak. Sedangkan kontrol sampel dengan
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
23
perbandingan 1:1 menunjukkan hasil yang lebih rendah. Adanya kolagen
meningkatkan adhesi dan aktivitas osteoblast untuk tumbuh sampai ke permukaan
komposit kolagen – hidroksiapatit. Kolagen meningkatkan adhesi dalam proses
kontak osteoblast inokulasi (osteoblast dimasukkan kedalam sampel) ke
permukaan komposit kolagen – hidroksiapatit melalui RGD (Argynine – Glysine -
Aspartate). RGD inilah yang membuat kolagen melekat kuat pada hidroksiapatit.
(Rodrigue et al, 2003)
2.8 Bone Filler
Bone filler merupakan salah satu bagian dari bone grafting atau
pencangkokan tulang. Bone grafting adalah prosedur pembedahan yang
menempatkan tulang baru atau bahan pengganti ke dalam ruang pada sekitar
daerah fraktur tulang atau dalam lubang di tulang (cacat) untuk membantu dalam
penyembuhan. Syarat utama suatu bahan bisa dijadikan bone filler adalah
biokompatibel dengan jaringan tubuh, tidak toksik (racun) dan mampu
merangsang pertumbuhan sel tulang baru. Penggunaan bone filler pada tulang
trabekular (sponge) dapat dilakukan denga cara menginjeksikan material filler
kedalam rongga tulang (Gambar 2.10). Bone filler banyak digunakan untuk
implant mandibula pada kasus bedah mulut, dan maxillofacial seperti ditunjukkan
pada Gambar 2.11.
Gambar 2.11 menjelaskan, pada step1 gigi yang bermasalah dicabut, dan
terlihat adanya hole pada tulang mandibula pada step 2 yang harus segera diisi
dengan suatu filler. Step 3 menunjukkan adanya suatu filler berbentuk bubuk yang
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
24
diisikan kedalam hole yang kemudian ditutup seperti terlihat pada step 4 dan 5
(Michelle, 2012).
Gambar 2.10 Bone filler pada tulang trabekular (sponge)
(www.n-forcefixation.com)
Gambar 2.11 Bone filler pada kasus bedah mulut
(Michelle, 2012)
Selain itu bone filler dapat diaplikasikan untuk regenerasi cartilage tissue
(Yasuda et al, 2010). Dalam perawatan jaringan tulang rawan yang rusak,
masalah utama yang dihadapi para ahli adalah kesulitan untuk meregenerasi
tulang rawan secara alami tanpa melalui drug delivery. Sebagai contoh, metode
microfracture yang banyak menghasilkan microholes di tulang subchondral
membentuk fibrocartilage, tapi tidak ada tulang rawan hialin artikular sebagai
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
25
penanda pertumbuhan tulang normal. Akibatnya, jaringan tulang rawan yang
rusak biasanya diobati dengan pencangkokan suatu jaringan tulang rawan lain
yang diperoleh dari tubuh pasien itu sendiri (Yasuda et al, 2010). Masalah yang
tibul dari pencangkokan tulang rawan lain dalam satu tubuh pasien adalah
kerusakan pada jaringan tulang rawan yang ditinggalkan dan jumlah tulang rawan
yang belum tentu mencukupi untuk pencangkokan. Oleh karena itu penambahan
bone fiiler pada kasus ini diperlukan untuk mengatasi masalah tersebut (Yasuda et
al, 2010).
2.9 Komposit Kolagen – Hidroksiapatit sebagai Bone Filler
Material bone filler seperti komposit kolagen – hidroksiapatit umumnya
digunakan pada tulang yang tidak terlalu panjang dan luas permukaanya. Sangat
jarang kasus kerusakan pada long bone yang menggunakan bone filler sebagai
tindakan penyembuhan. Misalnya saja, bila terdapat tumor pada long bone, tulang
yang sudah direseksi dari tumor biasanya ditambal dengan menggunakan tulang
dari bagian tubuh pasien lain ( autograft ) (Dubruille et al, 2000). Hal ini
dilakukan untuk menghindari infeksi yang dapat terjadi dan diharapkan bisa
menumbuhkan tulang baru. Namun autograft ini menimbulkan defek pada tulang
yang ditinggalkan. Bila tidak memungkinkan melakukan autograft, maka tindakan
alternatif pilihan adalah menggunakan donor tulang dari tubuh orang lain
(allograft) Kelemahan dari allograft ini adalah tulang yang menjadi donor tidak
bisa berkembang, karena sel sel tulangnya sudah mati (Dubruille et al, 2000).
Alternatif terakhir adalah menggunakan bahan pengganti tulang (bone subtitute)
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
26
atau bone repair. Namun untuk long bone, biasanya digunakan material dalam
bentuk scaffold atau bone cemens bukan filler (Dubruille et al, 2000).
Buser et al (1998) melakukan filling kolagen pada tulang mandibula babi
yang telah diberi defek sebelumnya. Hasil menunjukkan bahwa dalam 4 minggu
tidak terlihat adanya kolagen yang tersisa dan terjadi perbaikan jaringan tulang
ini membuktikan bahwa kolagen mempunyai biokompatibilitas yang tinggi. Buser
et al (1998), juga melakukan filling pada tulang mandibula babi menggunakan
mineral hidroksiapatit. Hasil yang diperoleh menunjukkan pada 4 minggu awal
penyembuhan terlihat laju pertumbuhan sel yang sangat rendah dibandingkan
kolagen. Baru terlihat pertumbuhan yang cukup pesat pada 6 bulan kemudian.
Dari hasil penelitian yang dilakukan Buser et al ini, ada kemungkinan bila
kolagen dan hidroksiapatit jikan dikompositkan akan memiliki sifat yang baik
yaitu cepat meregenerasi jaringan tulang dan memberikan sifat mekanik yang
tidak terlalu rendah (Buser et al, 1998).
2.10 FTIR ( Fourier Transform Infra Red)
Fourier Transform Infra Red atau FTIR adalah spektroskopi yang
mendasarkan fungsinya prinsip molekul yang dapat menyerap cahaya infra merah.
Hanya molekul monoatomik (He, Ne, Ar, dan sebagainya) dan diatomik
homopolar (H2, N2, O2, dan sebagainya) yang tidak dapat menyerap cahaya infra
merah (Perez et al, 2000). Pada dasarnya Spektrofotometer FTIR adalah sama
dengan Spektrofotometer IR dispersi, yang membedakannya adalah
pengembangan pada sistim optiknya sebelum berkas sinar infra merah melewati
sampel. Pada spektofotometer FTIR, seluruh sumber infra merah ditembakkan
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
pada sampel dan hasil spektrum yang berupa domain waktu diolah secara
komputerisasi. Pengamatan langsung spektrum domain waktu yang dihasilkan
akan sulit untuk dibaca dan disimpulkan.
domain frekuensi den
mudah dalam menganalisis dan menyimpul
Diagram alat
Spektrofotometer FTIR dilengkapi dengan cermin yang bergerak tegak lurus dan
cermin yang diam. Dengan demikian radiasi infra merah akan menimbulkan
perbedaan jarak yang ditempuh m
yang diam (Djawarni
gambar 2.13. Prinsip kerja FTIR adalah
tegak lurus dengan cermin diam ketika dikenai sumber radiasi in
terpantul menuju sampel. Spektrum yang diterima sam
detektor. Detektor mendeteksi sinyal sebagai
diubah melalui perangkat komputerisasi
domain agar hasil pengukuran bisa terbaca.
pada sampel dan hasil spektrum yang berupa domain waktu diolah secara
Pengamatan langsung spektrum domain waktu yang dihasilkan
akan sulit untuk dibaca dan disimpulkan. Spektrum domain waktu diubah kedalam
domain frekuensi dengan memanfaatkan sistem komputer fourier transform
mudah dalam menganalisis dan menyimpulkan data.
Diagram alat FTIR ditujukan pada Gambar 2.12.
Spektrofotometer FTIR dilengkapi dengan cermin yang bergerak tegak lurus dan
cermin yang diam. Dengan demikian radiasi infra merah akan menimbulkan
perbedaan jarak yang ditempuh menuju cermin yang bergerak dan jarak cermin
(Djawarni et al, 2002). Sedangkan prinsip kerja FTIR ditunjukan pada
gambar 2.13. Prinsip kerja FTIR adalah perbedaan jarak cermin yang bergerak
tegak lurus dengan cermin diam ketika dikenai sumber radiasi in
terpantul menuju sampel. Spektrum yang diterima sampel ditangkap oleh suatu
mendeteksi sinyal sebagai time domain. Kemudian s
diubah melalui perangkat komputerisasi fourrier transform menjadi
agar hasil pengukuran bisa terbaca.
Gambar 2.12 Diagram alat FTIR
27
pada sampel dan hasil spektrum yang berupa domain waktu diolah secara
Pengamatan langsung spektrum domain waktu yang dihasilkan
omain waktu diubah kedalam
fourier transform agar
. Sistem optik
Spektrofotometer FTIR dilengkapi dengan cermin yang bergerak tegak lurus dan
cermin yang diam. Dengan demikian radiasi infra merah akan menimbulkan
dan jarak cermin
. Sedangkan prinsip kerja FTIR ditunjukan pada
perbedaan jarak cermin yang bergerak
tegak lurus dengan cermin diam ketika dikenai sumber radiasi infra merah akan
pel ditangkap oleh suatu
Kemudian sinyal
menjadi frequency
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
Spektrum inframerah terletak pada daerah dengan panjang gelombang 0,78
sampai 1000 µm atau bilangan gelombang dari 12800 sampai 1
2011). FTIR termasuk ke dalam kategori radiasi inframerah pertengahan (bilangan
gelombang 4000-200 cm
daerah grup frequency
(Gambar 2.14). Sebagai contoh, pada daearah
serapan dari C=O streching
vibrasi molekul secara keseluruhan.
karakteristik dari suatu molekul secara keseluruhan. Atar molekul yang berbeda,
dihasilkan spektrum yang berbeda pula di wilayah
print digunakan untuk tujuan identifikasi suatu molekul.
yang berbeda strukturnya akan mempunyai bentuk serapan inframerah atau
spektrum inframerah yang sama (Koutsopoulus dalam Lestari
Gambar 2.13. Prinsip kerja FTIR
pektrum inframerah terletak pada daerah dengan panjang gelombang 0,78
µm atau bilangan gelombang dari 12800 sampai 10
FTIR termasuk ke dalam kategori radiasi inframerah pertengahan (bilangan
200 cm-1). Daerah antara 4000 – 1300 cm-1
grup frequency. Daerah 1300 – 200 cm-1 merupakan daerah
ebagai contoh, pada daearah 900 – 1300 cm-1 terdeteksi adanya
streching. Frekuensi di wilayah finger print dipengaruhi oleh
vibrasi molekul secara keseluruhan. Serapan pada daerah finger print
karakteristik dari suatu molekul secara keseluruhan. Atar molekul yang berbeda,
dihasilkan spektrum yang berbeda pula di wilayah finger print ini. Wilayah
digunakan untuk tujuan identifikasi suatu molekul. Tidak ada dua molekul
berbeda strukturnya akan mempunyai bentuk serapan inframerah atau
spektrum inframerah yang sama (Koutsopoulus dalam Lestari, 2009).
28
pektrum inframerah terletak pada daerah dengan panjang gelombang 0,78
0 cm-1 (Suyatno,
FTIR termasuk ke dalam kategori radiasi inframerah pertengahan (bilangan
1 disebut sebagai
merupakan daerah finger print
terdeteksi adanya
dipengaruhi oleh
finger print merupakan
karakteristik dari suatu molekul secara keseluruhan. Atar molekul yang berbeda,
ini. Wilayah finger
idak ada dua molekul
berbeda strukturnya akan mempunyai bentuk serapan inframerah atau
2009).
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
Gambar 2.14 Frekuensi dari beberapa grup vibrasi pada
2.10.1 Spektrum FTIR
Spektrum FTIR kolagen menunjukkan adanya vibrasi gugus hidroksil
(OH), gugus karbonil (C=O),
terletak di daerah serapan sekitar
di daerah serapan 1900
daerah 2400 – 2100 cm
yaitu amida A, amida I, amida II dan amida III. Amida A terdeteksi pada daerah
serapan sekitar 3300 cm
berasosiasi dengan OH dari hidroksiprolin (
terlihat di daerah serapan 1597
ikatan C=O streching
pada daerah 1480 – 1575 cm
– 1301 cm-1.
Gambar 2.14 Frekuensi dari beberapa grup vibrasi pada grup frequency
dan finger print region.
2.10.1 Spektrum FTIR kolagen
Spektrum FTIR kolagen menunjukkan adanya vibrasi gugus hidroksil
gugus karbonil (C=O), dan gugus amina (N-H) (Marsaid, 2010).
terletak di daerah serapan sekitar 3500 – 3000 cm-1. Gugus karbonil C=O terletak
di daerah serapan 1900 – 1650 cm-1. Gugus C≡N pada kolagen terdeteksi di
2100 cm-1. Gugus amina (N-H) pada kolagen terdiri dari 4 jenis
yaitu amida A, amida I, amida II dan amida III. Amida A terdeteksi pada daerah
serapan sekitar 3300 cm-1. Amida A terbentuk dari ikatan NH
berasosiasi dengan OH dari hidroksiprolin (Puspawati et al, 2012
terlihat di daerah serapan 1597 – 1672 cm-1. Serapan amida I terjadi akibat adanya
streching dengan kontribusi dari NH bending. Pita amida II terlihat
1575 cm-1. Pita serapan daerah amida III terdeteksi pada 1229
29
grup frequency
Spektrum FTIR kolagen menunjukkan adanya vibrasi gugus hidroksil
(Marsaid, 2010). Gugus OH
. Gugus karbonil C=O terletak
N pada kolagen terdeteksi di
terdiri dari 4 jenis
yaitu amida A, amida I, amida II dan amida III. Amida A terdeteksi pada daerah
atan NH streching yang
2012). Amida I
Serapan amida I terjadi akibat adanya
Pita amida II terlihat
. Pita serapan daerah amida III terdeteksi pada 1229
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
30
2.10.2 Spektrum FTIR Hiroksiapatit
FTIR memanfaatkan energi vibrasi gugus fungsi penyusun senyawa
hidroksiapatit, yaitu gugus PO43-, gugus CO3
2-, serta gugus OH-. Gugus PO43-
mempunyai empat mode vibrasi yaitu:
1. Vibrasi simetri stretching (υ1) dengan bilangan gelombang sekitar 956 cm-1.
2. Vibrasi simetri bending (υ2) dengan bilangan gelombang sekitar 430 - 460
cm-1.
3. Vibrasi asimetri stretching (υ3) dengan bilangan gelombang sekitar 1040 -
1090 cm-1.
4. Vibrasi asimetri bending (υ4) dengan bilangan gelombang sekitar 575 - 610
cm-1.
Bentuk pita υ3 dan υ4 yang tidak simetri merupakan tanda bahwa senyawa
hidroksiapatit tidak seluruhnya dalam bentuk amorf (tidak kristal). Spektrum
hidroksiapatit dapat diteliti yaitu pada υ4 dalam bentuk belah dengan maksimum
562 cm-1 dan 602 cm-1. Pita absorpsi υ3 mempunyai dua puncak maksimum yaitu
pada bilangan gelombang 1090 cm-1 dan 1030 cm-1. Pita absorpsi υ1 dapat dilihat
pada bilangan gelombang 960 cm-1 (Hidayat dalam Lestari, 2009). Puncak pada
633 cm-1 dan 3570 cm-1menunjukkan vibrasi dari OH. Luas puncak pada 3500 cm-
1 dan puncak pada 1660 cm-1 menunjukkan adanya penyerapan air, sehingga
teridentifikasi sebagai gugus OH (Lestari, 2009). Ikatan karbonat teramati pada
870 dan 1430 cm-1.
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
31
2.11 Toksisitas
Dalam rekayasa biomaterial, material yang digunakan harus memenuhi
syarat yaitu biokompatibel dengan tubuh. Salah satu hal yang perlu dilakukan
adalah pengujian toksisitas material. Pengujian ini bertujuan untuk melihat efek
penggunaan material apabila nantinya ditanamkan dalam tubuh. Uji toksisitas
dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu uji secara in-vitro dan uji secara in- vivo.
Uji secara in-vitro berdasarkan penggunaan komponen sub subselular
(misalnya enzim DNA, RNA), atau sel sel- sel yang diisolasi (kultur sel, sel
darah merah, dan lain sebagainya), potongan jaringan atau seluruh seluruh organ
yang diisolasi.
Sedangkan uji in-vivo merupakan suatu uji toksisitas yang dilakukan
dalam tubuh. Uji ini biasanya memakai hewan coba yang struktur genetiknya
hampir menyerupai manusia. Uji toksisitas yang biasa dilakukan pada hewan uji
bertujuan untuk menggali informasi tentang resiko yang dapat terjadi pada
manusia atau lingkungan, baik karena obat atau bahan kimia.
2.12 Uji Toksisitas dengan Metode MTT Assay
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)
Assay adalah tes laboratorium dan dan Assay colorimetric standard (sebuah Assay
yang mengukur perubahan warna ) untuk mengukur pertumbuhan seluler. Uji ini
juga digunakan untuk menentukan toksisitas dari agen medikal dan material
toksik lainya. ( Harsas, 2008 ).
Jenis sel yang dapat digunakan untuk uji toksisisitas bahan biomaterial
adalah kultur cell line misalnya sel BHK – 21 (Baby Hamster Kidney) yang
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning
32
berasal dari fibroblas ginjal tikus. Jenis sel ini mudah untuk tumbuh dan mudah
dilakukan kultur (pembiakan) ulang.
Prinsip dari pewarnaan MTT adalah dengan pengubahan dari cincin
tetrazolium oleh karena aktifitas dari mitokondria pada sel hidup (sel mati tidak
mengakibatkan perubahan cincin tersebut). Mitokondria sel hidup berperan dalam
menghasilkan dehidrogenase, dan bila tidak aktif karena efek toksik maka tidak
akan terbentuk formazan garam tetrazolium. Jumlah yang terbentuk proporsional
dengan aktivitas enzimatik sel hidup. Produksi formazan dapat dihitung dengan
melarutkan dan mengukur densitas optik ( optical density /OD). Persentase jumlah
sel hidup untuk uji MTT dapat dihitung dengan Persamaan 2.1:
% sel hidup =
OD dapat diartikan sebagai kemampuan suatu material untuk menyerap
suatu cahaya. Nilainya setara dengan banyaknya sel hidup dalam lingkungan yang
dibuat. Makin tinggi nilai OD semakin banyak sel yang hidup. Jumlah sel produk
MTT dapat diukur dengan spektrofotometer Elisa Reader pada panjang
gelombang 540 – 570 nm. Semakin tinggi prosentase densitas optik, menunjukkan
sel yang metabolik aktif dapat mereduksi MTT semakin baik.
OD perlakuan + OD kontrol media
OD kontrol sel + OD kontrol media x 100% (2.1)
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi (Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit Kolagen –Hidroksiapatit
Agnes Krisanti Widyaning