activaciÓn y producciÓn de superficies …€¦ · para la realización del estudio activación y...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA

“ACTIVACIÓN Y PRODUCCIÓN DE SUPERFICIES

SILANIZADAS PARA PEINADO MOLECULAR DE ADN”

Autor: Ana Joseth Rivera Quinteros

[email protected]

Informe Final de Investigación para optar por el Título Profesional de:

QUÍMICO

Tutor: Dr. Pablo Bonilla

[email protected]

QUITO, ABRIL 2016

mailto:[email protected]

ii

Rivera Quinteros, Ana Joseth. Activación y

producción de superficies silanizadas

para peinado molecular de ADN. Trabajo

de investigación para optar por el título de

Químico. Carrera de Química. Quito: UCE.

92 pág.

iii

DEDICATORIA

Al concluir este trabajo de investigación, mis metas alcanzadas y mis valores adquiridos a

lo largo de mi vida van dedicados a Dios y a mis padres Patricio Rivera y Gladis

Quinteros, quiénes me dieron la vida y han sido el pilar fundamental en mi formación,

amigos incondicionales que han sabido estar en cada momento para guiarme por el camino

del bien.

iv

AGRADECIMINETO

Es muy grato expresar mis agradecimientos a la Facultad de Ciencias Químicas de la

Universidad Central del Ecuador, la cual me brindó conocimientos en el transcurso de

estos años, mediante profesores, compañeros y amigos.

Un agradecimiento especial a mi tutor Dr. Pablo Bonilla y a mi co-tutora Dra. Ana Poveda,

quién mediante su amistad y conocimiento han sido los guía para culminar este proyecto

como buenos resultados. De igual manera al Dr. Ramiro Acosta y Dr. Klever Parreño que

con su paciencia y experiencia han aportado un granito de arena para el logro de éste

trabajo de investigación.

A mis padres y mi hermana Magali, quienes forman parte de mi vida y que nunca se han

alejado de ella, que siempre han estado ahí para apoyarme en los buenos momentos y

empujarme en los más difíciles para seguir en adelante. A mi sobrino Venhamin que es la

luz y la alegría que me brinda desde el momento que nació. A mi Israel López que desde

hace 4 años ha sido mi apoyo incondicional robándome una sonrisa cada día, mi amigo y

mi compañero inseparable.

A mis grandes amigos Yese, Katherine, María José, Laura, Giss, Angi, Daniela Jaramillo,

Daniela Maldonado, Diego, Francisco, Alejo y Klever. Personas amigables que gracias a la

universidad los he encontrado, ustedes que me han brindado sus conocimientos para

ayudarme a aprender y a culminar ésta carrera. Alegrías, tristezas y locuras que hemos

compartimos formando momentos inolvidables.

vi

AUTORÍA INTELECTUAL

APROVACIÓN DEL TUTOR

vii

INFORME DEL TRIBUNAL CALIFICADOR DE LA TESIS

viii

LUGAR DONDE SE REALIZARÁ LA INVESTIGACIÓN

Para la realización del estudio Activación y producción de superficies silanizadas para

peinado molecular de ADN, se procederá a trabajar en los siguientes laboratorios:

El tratamiento de limpieza y producción para la silanización de las superficies se realizará

en el Laboratorio de la unidad de DNA Replication & Genome Instability del Centro

Internacional de Zoonosis de la Universidad Central del Ecuador.

Para la caracterización de hidrofobicidad se realizará en el Laboratorio de Coloides de la

Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.

ix

ÍNDICE DE CONTENIDO

DEDICATORIA ................................................................................................................... iii

AGRADECIMINETO .......................................................................................................... iv

AUTORÍA INTELECTUAL ................................................................................................ vi

APROVACIÓN DEL TUTOR ............................................................................................. vi

INFORME DEL TRIBUNAL CALIFICADOR DE LA TESIS ......................................... vii

LUGAR DONDE SE REALIZARÁ LA INVESTIGACIÓN ............................................ viii

RESUMEN .......................................................................................................................... 17

ABTSTRAC ........................................................................................................................ 18

1. CAPÍTULO I .............................................................................................................. 19

1.1. Planteamiento del problema. ................................................................................. 19

1.2. Formulación del problema .................................................................................... 20

1.3. Hipótesis de trabajo .............................................................................................. 20

1.4. Objetivos ............................................................................................................... 20

GENERAL: ........................................................................................................... 20

ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 21

1.5. Importancia y justificación ................................................................................... 21

2. CAPITULO II ............................................................................................................. 22

2.1. Antecedentes. ........................................................................................................ 22

2.2. MARCO TEÓRICO. ............................................................................................ 23

2.2.1. Peinado molecular ......................................................................................... 23

2.2.2. Limpieza para silanización. ........................................................................... 25

2.2.2.1. Limpieza con soluciones ácidas. ............................................................ 26

2.2.2.2. Limpieza con plasma cleaner. ................................................................ 27

2.2.2.3. Método de limpieza UV/Ozono. ............................................................ 28

2.2.3. Funcionalización de la superficie silanizada. ................................................ 29

2.2.4. Métodos de silanización ................................................................................ 30

x

2.2.5. Superficies hidrofóbicas ................................................................................ 33

2.2.6. Determinación de la hidrofobicidad .............................................................. 33

2.2.7. Medición de ángulo de contacto .................................................................... 36

2.2.8. Método estático de la gota en reposo............................................................. 38

2.3. Marco legal ........................................................................................................... 39

2.3.1. Norma INEN 2266 transporte, almacenamiento y manejo de productos

químicos peligrosos. ..................................................................................................... 39

3. CAPÍTULO III ........................................................................................................... 42

3.1. Tipo de la investigación ........................................................................................ 42

3.2. POBLACIÓN Y MUESTRA. ............................................................................... 42

3.2.1. Población ....................................................................................................... 42

3.2.2. Muestra .......................................................................................................... 42

3.3. Diseño experimental. ............................................................................................ 42

3.3.1. Tratamientos y repeticiones ........................................................................... 44

3.3.2. Caracterización de las variables. .................................................................. 45

3.4. Diseño estadístico. ................................................................................................ 45

3.4.1. Descripción del diseño experimental estadístico ........................................... 45

3.4.2. Análisis de Varianza de DCA. ....................................................................... 47

3.4.3. Pruebas de rangos múltiples en DCA ............................................................ 48

3.5. MATERIALES Y MÉTODO. .............................................................................. 49

3.5.1. Materiales ...................................................................................................... 49

3.5.2. Método ........................................................................................................... 51

4. CAPITULO IV ........................................................................................................... 60

4.1. Resultados ............................................................................................................. 60

4.2. Resultados de pruebas previas. ............................................................................. 60

4.2.1. Resultados de primer ensayo con 5 tiempos diferentes de exposición del (7-

octen-1-il) trimetoxisilano ............................................................................................ 60

4.2.2. Resultados del segundo ensayo. .................................................................... 68

xi

4.3. Resultados de la experimentación. ........................................................................ 71

5. CAPITULO V ............................................................................................................. 80

5.1. Conclusiones. ........................................................................................................ 80

5.2. Recomendaciones. ................................................................................................ 81

6. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 83

7. ANEXOS ..................................................................................................................... 86

7.1. Anexo 1. Metodología de limpieza (pre-silanización) .......................................... 86

7.2. Anexo 2. Metodología de Silanización de cubreobjetos ...................................... 87

7.3. Anexo 3. Metodología post-silanización .............................................................. 88

7.4. Anexo 4. Imágenes de gotas formadas en superficies tratadas a 6h de exposición

de (7-octen-1-il) trimetoxisilano. ..................................................................................... 89





7.7. Anexo 7. Tabla de distribución de T de Student (Díaz & Fernández, 2007) ..................... 92

xii

ÍNDICE DE FIGURAS.

Figura 2. 1. Representación esquemática de pasos básicos para el peinado molecular del

ADN.. ................................................................................................................................... 24

Figura 2. 2. Funcionamiento de la velocidad del menisco.. ............................................... 25

Figura 2. 3. Equipo de plasma cleaner para eliminar residuos orgánicos. ....................... 27

Figura 2. 4. Trimetoxisilano estructura fundamental de compuestos sintéticos orgánicos

de silicio. .............................................................................................................................. 31

Figura 2. 5. Estructura de compuesto de silano ((7-octen-1-il) trimetoxisilano) utilizado en

el proceso de silanización en fase líquida.. ......................................................................... 31

Figura 2. 6. Estructura y alineación del (7-octen-1-il) trimetoxisilano sobre la superficie

del vidrio.. ............................................................................................................................ 32

Figura 2. 7. Unión de los extremos de las hélices del ADN con los grupos orgánicos de la

superficie silanizada. ........................................................................................................... 33

Figura 2. 8. Imágenes de diferentes ángulos de contacto de una gota de agua sobre una

superficie sólida. .................................................................................................................. 33

Figura 2. 9. Esquema de la representación del ángulo del contacto. ............................... 34

Figura 2. 10. Diferentes Ángulos de contactos A) comportamiento de la gota si la

superficie es hidrofilica y B) comportamiento de la gota si la superficie es hidrofóbica.. . 35

Figura 2. 11. Ángulo de contacto menor a 90°. .................................................................. 35

Figura 2. 12. Ángulo de contacto igual a 90°.. ................................................................... 35

Figura 2. 13. Ángulo de contacto mayor a 90°. .................................................................. 36

Figura 2. 14. Equipo para medición de ángulo de contacto.. ............................................ 37

Figura 2. 15. Equipo de visualización de ángulo de contacto adaptado por un microscopio

y estereoscopio.. .................................................................................................................. 38

Figura 2. 16. Determinación del ángulo de contacto mediante un software. .................... 39

Figura 3. 1. Cámara UV/ozono para eliminar residuos orgánicos, la cual consta de: 1)

caja de vidrio, 2) Tapa, 3) foco de luz UV de 254nm, 4) focos de luz UV de 180nm y 5)

Conducto de entrada. .......................................................................................................... 44

Figura 3. 2. Crear carpeta de archivo de captura. ............................................................. 54

Figura 3. 3. Funcionamiento de estereoscopio modificado ................................................ 54

Figura 3. 4. Mayor definición de gota en el computador ................................................... 55

Figura 3. 5. Forma de capturar la Imagen. ........................................................................ 55

Figura 3. 6. Herramienta Angle Tool en el software IMAGEJ.. ......................................... 56

Figura 3. 7. Selección de OPEN.. ....................................................................................... 57

xiii

Figura 3. 8. Imagen de estudio de IMAGEJ.. ..................................................................... 57

Figura 3. 9 Medición de ángulo de contacto. ..................................................................... 58

Figura 3. 10 Herramienta para obtener valores de ángulo de contacto. ........................... 58

Figura 3. 11.Tabla con valores del ángulo de contacto. .................................................... 59

Figura 4. 1. Comportamiento del ángulo de contacto promedio con respecto a los

diferentes tiempos de exposición en dos experimentaciones diferentes 67

Figura 4. 2. Comportamiento del ángulo de contacto sobre superficies con o sin

tratamiento post-silanización. ............................................................................................. 70

Figura 4. 3. Representación de las medias y de los efectos de los tratamientos en el DCA,

indicando que 𝜏1 = 0,245; 𝜏2 = 1,767; 𝜏3 = −2,012. ................................................... 76

xiv

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 3. 1.Ordenamiento de datos experimentales para el tratamiento estadístico ........... 46

Tabla 3. 2. Tabla de análisis de Varianza ANOVA de DCA ............................................. 47

Tabla 4. 1. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a un

tiempo de exposición de 2 horas y con luz UV de 254nm.

…………………………………………………………………………61


tiempo de exposición de 7 horas y con luz UV de 254nm. ................................................. 62


tiempo de exposición de 12 horas y con luz UV de 254nm. ............................................... 62






tiempo de exposición de 2 horas y con luz UV de 254nm y 180nm. ................................... 64


tiempo de exposición de 7 horas y con luz UV de 254nm y 180nm. ................................... 65


tiempo de exposición de 12 horas y con luz UV de 254nm y 180nm. ................................. 65


tiempo de exposición de 17 horas y con luz UV de 254nm y 180nm. ................................. 66

Tabla 4. 10. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a

un tiempo de exposición de 24 horas y con luz UV de 254nm y 180nm. ............................ 66

Tabla 4. 11. Ángulo de contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados sin

tratamiento pos-silanización. .............................................................................................. 69

Tabla 4. 12. Ángulo de contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados con

tratamiento pos-silanización. .............................................................................................. 69

xv


un tiempo de exposición de 6 horas. Las imágenes captadas correspondientes a estos

valores se observan en el Anexo 4. ...................................................................................... 72







Tabla 4. 16. Ángulo de Contacto de agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados en

tres tratamientos diferentes. ................................................................................................ 74

Tabla 4. 17. ANOVA del DCA de los tiempos de exposición del (7-octen-1-il)

trimetoxisilano para la formación de cubreobjetos silanizados. ........................................ 76

Tabla 4. 18. Aplicación de la prueba LSD para los diferentes tiempos de exposición del (7-

octen-1-il) trimetoxisilano. .................................................................................................. 78

Tabla 4. 19. Valores de ángulos de contacto en los mejores tiempos de exposición del (7-

octen-1-il) trimetoxisilano, cubreobjetos silanizados de Francia y Cubreobjetos sin

tratamiento. ......................................................................................................................... 79

xvi

ÍNDICE DE ECUACIONES

Ecuación 1 ........................................................................................................................... 26

Ecuación 2 ........................................................................................................................... 26

Ecuación 3 ........................................................................................................................... 26

Ecuación 4 ........................................................................................................................... 28

Ecuación 5 ........................................................................................................................... 28

Ecuación 6 ........................................................................................................................... 29

~ 17 ~

RESUMEN

En el presente trabajo de investigación se estandarizó una metodología para la

activación y producción de superficies silanizadas para peinado molecular de ADN. La

metodología fue realizada mediante la activación de grupos OH de superficies de vidrio

(cubreobjetos) al ser eliminada la materia inorgánica con etanol y materia orgánica por

reacciones de oxidación, mediante la creación de una cámara de UV/ozono con dos

longitudes de onda una a 245nm y otra a 180nm. El proceso de silanización se lo realizó

a tiempos de exposición de 6h, 7h y 8h con (7-octen-1-il) trimetoxisilano/ n-heptano

o,oo3M sobre las superficies activadas. Al trascurrir este tiempo de reacción se eliminó

el exceso de reactivos con heptano y cloroformo. Con el método del ángulo de contacto

se determinó si las superficies son hidrofóbicas y aptas para la técnica de peinado

molecular. Debido a los datos obtenidos se puedo determinar que el tiempo de

exposición del reactivo si influye en la formación de superficies hidrofóbicas, siendo los

mejores resultados a tiempo de 7h.

Palabras clave: (7-octen-1-il) trimetoxisilano, silanización, hidrofóbico, ángulo de

contacto.

~ 18 ~

ABTSTRAC

In the present research work, a method for the activation and production of silanized

surfaces used in DNA combing was standardized. The methodology was performed by

activating OH groups on glass surfaces (coverslips) after eliminating all inorganic and

organic material with ethanol and by oxidation in a UV/ozone chamber with two

wavelengths (245nm and 180nm), respectively. The silanization process was done by

exposing the activated coverslips to (7-octen-1-yl) trimethoxysilane / n-heptane o,

oo3M for 6h, 7h and 8h. After the determined amount of reaction time all excess was

eliminated with heptane and chloroform. With the angle of contact method, we were

able to determine whether the silanized surfaces were apt for DNA combing. Because of

the data we determined that the amount of time that the coverslips are exposed does

have influence on the formation of hydrophobic surfaces, 7h giving the best results.

Key words: (7-octen-1-yl) trimethoxysilane, silanization, hydrophobic, angle of contact

~ 19 ~

1. CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN.

1.1. Planteamiento del problema.

Un reto importante en la investigación biomédica es entender el origen de la

inestabilidad genómica y los mecanismos por los cuales las células eucariotas detectan y

responden al estrés genómico. La inestabilidad genómica juega un papel central en el

desarrollo del cáncer y en otro tipo de enfermedades genéticas entre los cuales destacan

los denominados síndromes de inestabilidad genómica (Conti & Caburet, 2001). Para

poder entender estas alteraciones se han venido realizando varios estudios desde la parte

más central como es el ADN.

“El Centro Internacional de Zoonosis (CIZ) es un centro de excelencia, trans-

disciplinario e interinstitucional, encargado de dar respuesta a los problemas

relacionados con las enfermedades zoonóticas más importantes del país y de la Región

Andina” (CIZ-UCE, 2015). Parte de las investigaciones de este centro van orientadas a

comprender la replicación del ADN y los mecanismos que controlan el mantenimiento

de la estabilidad del genoma, usando la levadura Saccharomyces cerevisiae como

organismo modelo. Actualmente se están realizando esfuerzos para implementar la

técnica del peinado molecular en la unidad de ADN Replication & Genome Instability

(DR&GI) del Centro Internacional de Zoonosis. Esta técnica consiste en colocar fibras

del ADN sobre una placa de vidrio (cubreobjetos) estiradas y alineadas. Para ello es

necesario activar las superficies de vidrio con una solución de silano que hace que la

superficie del vidrio se vuelva hidrofóbica. En paralelo se prepara una solución de

ADN pH 5.6. En estas condiciones los extremos de ADN se encuentran

desnaturalizados, es decir, se rompen los puentes de hidrógeno que unen las bases

nitrogenadas en los pares de bases de los extremos de las fibras, quedando las bases

nitrogenadas en la solución acuosa. Al sumergir la superficie silanizada en la solución

de ADN, las bases nitrogenadas de naturaleza hidrofóbica van a tender a interaccionar

con la superficie silanizada, también de naturaleza hidrofóbica. Cuando se saca el

cubreobjetos a una velocidad lenta y constante, las moléculas del ADN quedan

dispuestas de manera lineal, perpendicular al eje de la fuerza de tracción.

~ 20 ~

Como se ha indicado anteriormente para realizar el peinado del ADN se requieren

cubreobjetos de vidrio silanizados. El problema radica que actualmente ninguna

empresa del País produce este tipo de cubreobjetos y su obtención es cara y limitada.

Alternativamente varios laboratorios a nivel mundial han desarrollado métodos para

poder producir sus propios cubreobjetos de vidrio silanizados. El objetivo de esta tesis

es la estandarización de un método sencillo que permita la producción de cubreobjetos

silanizados para realizar el peinado molecular, en la unidad de DR&GI del Centro

Internacional de Zoonosis a bajos costos. Para determinar que el proceso de silanizado

ha funcionado correctamente, la hidrofobocidad que adquiere la superficie del vidrio

será determinada por el método del ángulo de contacto. Este método consiste en medir

el ángulo de contacto que presenta la gota al colocarse en la superficie silanizada. Si

éste ángulo es 90° se dice que la superficie es hidrofóbica y si el ángulo es menor a 90°

la superficie es hidrofílica (Guard, 2015) (Pérez, 2013).

1.2. Formulación del problema

Para implementar la técnica de peinado molecular de ADN es indispensable

producir cubreobjetos silanizados de bajo costo en el Ecuador, con características de

una alta hidrofobicidad.

1.3. Hipótesis de trabajo

HI: La superficie hidrofóbica en la producción de cubreobjetos silanizados si

depende del tiempo de exposición al reactivo.

Ho: La superficie hidrofóbica de los cubreobjetos silanizados no depende del

tiempo de exposición del reactivo.

1.4. Objetivos

GENERAL:

Producir superficies silanizados con una capa hidrofóbica para la adhesión y

estiramiento de fibras moleculares de ADN, por medio de una limpieza UV/ozono y una

posterior reacción con el (7-octen-1-il) trimetoxisilano/ n-heptano.

~ 21 ~

ESPECÍFICOS

Crear un protocolo de limpieza para eliminar todos los residuos orgánicos e

inorgánicos de la superficie de los cubreobjetos de vidrio, para la posterior

formación de capa hidrofóbica.

Estructurar un método para silanizar la superficie de cubreobjeto de vidrio

determinando cual es el tiempo idóneo de exposición del silano, para la formación

de la mejor capa hidrofóbica y comprobar mediante el valor del ángulo de contacto.

1.5. Importancia y justificación

Una de las funciones de las células es la duplicación de la información genética

contenida en los cromosomas. El ADN está expuesto a una gran variedad de amenazas

que pueden alterar su integridad, por esta razón las células han evolucionado creando

diversos mecanismos para proteger, reparar y replicar el ADN. Cuando estos

mecanismos presentan un fallo se produce una mutación en el ADN que puede conducir

al desarrollo de cáncer y otras enfermedades genéticas. Por ello el estudio de los

procesos de replicación y protección del ADN es de suma importancia (Poveda, por

comunicación personal).

El peinado de ADN, es un proceso que permite la unión de moléculas de ADN

individuales en cubreobjetos de vidrio silanizados, dispuestas de manera lineal. La

característica de los cubreobjetos que permite esta alineación es la hidrofobocidad en la

monocapa creada en la superficial del vidrio por los grupos órgano-silanos que permite

la unión inespecífica de bases nitrogenadas de los extremos desnaturalizados del ADN.

De tal manera que se ha visto una necesidad de producir superficies silanizadas para

proyectos biológicos que se realizaran en el Centro Internacional de Zoonosis

presentando un trabajo multidiciplinario (Schwob, Renty, Coulon, & Gostan, 2009)

~ 22 ~

2. CAPITULO II

MARCO TEÓRICO

2.1. Antecedentes.

Para poder llegar al objetivo de esta investigación se ha tomado en cuenta

publicaciones y trabajos similares que aportan con datos y conocimientos muy

importantes con la producción o formación de cubreobjetos silanizados para la

utilización en el peinado molecular el ADN.

Una de las primeras investigaciones que brindarán aportes científicos para éste

estudio es el trabajo que se realizó en Üse of DNA Combing for Studying DNA

Replication In Vivo in Yeast and Mammalian Cells, 2009ëstudio realizado por el

investigador Etienne Schwob y sus colaboradores, quienes realizaron un peinado de

ADN de levaduras y de células de mamífero usando cubreobjetos silanizados.

Realizaron un procedimiento de limpieza y activación de las superficies de vidrio con

una cámara UV/ozono, seguida de un procedimiento de adhesión de 7-

octenyltrichlorosilane. Obtuvieron una superficie hidrofóbica con buenas características

del peinado molecular de estos ADN, que han sido comprobada con microscopia,

concluyendo que la limpieza con UV/ozono es un buen método para la formación de

cubreobjetos silanizados (Schwob, Renty, Coulon, & Gostan, 2009)

En el documento: Än optimized easy method for preparing silanized surfaces for

FISH and replication mapping on combed DNA fibers¨ realizado por la investigadora

Hélène Labit (2008) y sus colaboradores, describen un método para la formación de

cubreobjetos silanizados en fase líquida utilizando una combinación nueva de silano /

disolvente que es 0,1% (7-octen-1 il) trimetoxisilano en n-heptano. Obtuvieron

cubreobjetos con las características necesarias para el peinado molecular del ADN. Este

nuevo método consiste en limpiar el vidrio con agua y cloroformo, seguido de un ataque

al vidrio con una solución ácida de peróxido de hidrógeno y ácido sulfúrico. Esta

~ 23 ~

solución ayuda a que el cubreobjetos quede totalmente activado con grupos –OH

expuestos que permiten la adhesión del (7-octen-1 il) trimetoxisilano (Labit, 2008).

En el documento: ¨Molecular Combing¨ investigado por Chiara Conti, (2001) y su

colaboradores, produjeron cubreobjetos silanizados mediante una limpieza con una

cámara de UV/ozono activando el vidrio para realizar una quimisorción con 7 –

Octenyltrichlorosilane, formándose la monocapa hidrofóbica. Se obtuvo buenos

resultados de peinado molecular y se comprobó que la limpieza con UV/ozono tuvo una

mejor reacción al colocar el oxígeno medicinal (Conti & Caburet, 2001).

2.2. MARCO TEÓRICO.

Por muchas razones, el ADN ha sido el centro de atención en estudios de genómica

y biomédica. La alineación de ADN en superficies sólidas permite determinar

diferentes aspectos de la replicación. Desde esta perspectiva, las estrategias que nos

permiten inmovilizar y enderezar ADN sobre un sustrato sólido serían de gran valor

(Nazari & Gurevich, 2013). En este trabajo nos centramos en elaborar superficies

silanizadas que presenten una capa totalmente hidrofóbicas para utilizarlas en el ADN

combing.

2.2.1. Peinado molecular

¨Esta técnica fue introducida por primera vez por Bensimon y Cols en 1994, que

también acuñó el nombre de peinado molecular¨ (Bensimon, 1994).

Peinado suele ser definido como un procedimiento en que a ciertas condiciones de

pH y fuerza iónica, las moléculas de ADN están unidos en uno o ambos extremos a la

superficie hidrofóbica y posteriormente alineados por la fuerza de atracción aplicada en

la interfase aire / agua. A pH 5,6 las moléculas de ADN se desnaturalizan o “abren” sus

extremos, quedando expuestas las bases nitrogenadas que forman el núcleo hidrofóbico

de la doble hélice del ADN, para interaccionar con la superficie del vidrio por medio de

~ 24 ~

interacciones de atracción. Una vez que se produzca ésta atracción, se mueve con una

brazo mecánico o menisco la interfase líquido-aire a lo largo del sustrato (cubreobjeto

silanizado) provocando el estiramiento de las moléculas del ADN con uno o los dos

extremos pegados a la superficie, como se puede observar en la figura 2.1. El proceso de

peinado molecular se rige por las fuerzas de tensión superficial existentes en la interfase

aire-agua. Este mecanismo tiene por ventajas el estiramiento de ADN sin la necesidad

de modificar los extremos (Nazari & Gurevich, 2013).

Figura 2. 1. Representación esquemática de pasos básicos para el peinado

molecular del ADN. A) Solución del ADN colocada sobre la superficie silanizada, B)

Se muestra la dirección a donde será estirado el ADN, C) Se comienza a desplazar la

gota de solución, que produce el estiramiento de las fibras de ADN D) Existe la

presencia de fuerzas de adhesión y la fuerza de estiramiento ejercida por el menisco, E)

ADN casi totalmente estirado y F) Se muestra claramente como el ADN queda peinado

en la superficie hidrofóbica. Por Nazari y Gurevich, 2013.

La velocidad del menisco es un movimiento que puede afectar a la calidad de

peinado. Esto podría ser controlado usando diferentes tamaños de un papel de filtro o un

~ 25 ~

aparato accionado por motor (figura 2.2). “Generalmente, la velocidad del menisco en el

rango de 300-500 micras / s es aceptable, pero los estudios sugieren que podría ser

también tan alto como 5 mm / s cuando se utiliza un papel de filtro con un tamaño de

poro de 11 micras a absorber la solución de ADN” (Nazari & Gurevich, 2013).

Figura 2. 2. Funcionamiento de la velocidad del menisco. Por Nazari y Gurevich,

2013.

Cuando el cubre-objetos se saca con una velocidad lenta y constante (v = 300

22micras s-1), el menisco del retroceso extiende las moléculas de ADN ancladas en el

cubreobjetos mediante una fuerza constante y perpendicular sobre ellos. Este rápido

proceso resulta en fibras de ADN reversiblemente fijadas (Labit, 2008).

2.2.2. Limpieza para silanización.

Para que un proceso de silanización se pueda dar correctamente, se debe tomar en

cuenta que la superficie del cubreobjeto debe estar completamente limpia y activada, es

decir, se debe eliminar todo tipo de residuos orgánicos e inorgánicos, para dejar

expuestos los grupos –OH de la estructura molecular del vidrio. De esta manera la

superficie queda activada para posteriores reacciones químicas. Existen varios métodos

de limpieza que eliminan la materia orgánica no deseada entre ellos tenemos: soluciones

~ 26 ~

ácidas, ataque de plasma de descarga de barrera energética y exposición a radiación

UV/ozono.

2.2.2.1. Limpieza con soluciones ácidas.

Uno de los métodos para una extensa limpieza de superficies de vidrio es la

presencia de ácidos fuertes como es la solución piraña que es una mezcla de ácido

sulfúrico 70% (99% p / v) y peróxido de hidrógeno 30% (35% p/ v) (Labit, 2008).

La eficacia de la solución piraña es la eliminación de residuos orgánicos debido a

dos procesos distintos. El primero y más rápido es la eliminación de hidrógeno y

oxígeno como unidades de agua porque la hidratación de ácido sulfúrico concentrado es

termodinámicamente favorable, con una ΔH de -880 kJ / mol, produciendo una ácido

llamado Caro, (ecuación1).

H2SO4 + H2O2 → H2SO5+ H2O (1)

El segundo proceso y más interesante es la eliminación de materia orgánica. La

transformación de deshidratación energéticamente favorable del peróxido de hidrógeno

forma iones hidronio, iones de bisulfato, y, transitoriamente oxígeno atómico,

provocando la eliminación de materia orgánica como CO2 y carbono elemental

(ecuación 2-3) (Biohacking, 2011).

( 2)

( 3)

La limpieza con soluciones ácidas es considerada una solución muy agresiva por

sus reacciones espontáneas e incluso explosivas. El trabajo con estas sustancias debe

realizarse dentro de una campana de ventilación y con todo el equipo adecuado.

~ 27 ~

2.2.2.2. Limpieza con plasma cleaner.

La limpieza con plasma implica la eliminación de impurezas y contaminantes de

las superficies mediante el uso de un plasma de descarga de barrera energética o

dieléctrica (DBD). El plasma es creado a partir de especies gaseosas como: argón,

oxígeno y mezclas como: aire e hidrógeno / nitrógeno. Elimina contaminantes

orgánicos por reacción química con los radicales de oxígeno altamente reactivos y la

ablación por iones de oxígeno energéticos. Existen varios equipos en el mercado que

realizan esta limpieza usando diferentes gases (figura 2.3) (Sung & Seung, 2014)

Figura 2. 3. Equipo de plasma cleaner para eliminar residuos orgánicos. Por Sung &

Seung 2014.

Beneficios de limpieza con plasma

Elimina el uso de solventes químicos, así como el almacenamiento y

eliminación de residuos de disolvente.

Limpieza de las superficies con una porosidad de microescala o microcanales no

adecuados para la limpieza solvente debido a las limitaciones de tensión

superficial.

~ 28 ~

Promueve la adhesión y mejorar la unión a otras superficies.

Prepara la superficie para su posterior procesamiento como deposición de

película o adsorción de moléculas.

Esteriliza y eliminar los contaminantes microbianos en la superficie.

Se puede tratar una amplia variedad de materiales, así como superficiales

complejas: Obleas, sustratos semiconductores (Si, Ge), portaobjetos de vidrio y

sustratos (Harrick, 2015)

2.2.2.3. Método de limpieza UV/Ozono.

“La limpieza UV / ozono es un método eficaz para eliminar una variedad de

contaminantes de las superficies. Es un proceso en seco fácil de usar que es barato de

instalar y operar” (Vig, 1984).

La capacidad de los rayos ultravioleta (UV) para descomponer las moléculas

orgánicas ha sido conocido durante mucho tiempo, pero es sólo durante la última década

que la limpieza de las superficies de UV/ ozono ha sido explorado. Los rayos UV

generan dos longitudes de onda de interés, 184.9 y 253.7 nm. La longitud de onda de

184,9 nm es importante porque es absorbida por el oxígeno, y por lo tanto conduce a la

generación de ozono. La radiación de 253,7 nm no se absorbe por el oxígeno; por lo

tanto, no contribuye a la generación de ozono. Sin embargo, se absorbe por la mayoría

compuestos orgánicos y también por ozono. Por lo tanto, cuando ambas longitudes de

onda están presentes, el ozono es formado y destruido continuamente. Un producto

intermedio de la formación y procesos de destrucción es el oxígeno atómico, que es un

agente oxidante muy fuerte, capaz de destruir o limpiar las impurezas orgánicas

existentes en la superficie del cubreobjeto (ecuación 4 – 5 y 6). La combinación de

longitudes de luz ultravioleta y ozono producen superficies limpias aproximadamente

200 a 2000 veces más rápido que la luz ultravioleta sola o el ozono solo (Vig, 1984)

(Wright & Cairns, 2005).

Ecuaciones de Formación:

𝑂2 + ℎ𝑣 (184,8 𝑛𝑚) → 𝑂 + 𝑂 ( 4)

𝑂2 + 𝑂 → 𝑂3 ( 5)

~ 29 ~

Ecuaciones de destrucción:

𝑂3 + ℎ𝑣 (253,7𝑛𝑚) → 𝑂2 + 𝑂 (𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑓𝑢𝑒𝑟𝑡𝑒) ( 6)

Los contaminantes inorgánicos tales como el polvo y las sales son eliminado con

etanol, metanol o acetona en un procedimiento previo a la limpieza de UV/Ozono,

debido a que la energía UV produce oxígeno atómico que es eficaz en la ruptura de

enlaces netamente orgánicos como: C-H, C-C, C = C, C-O, y C-N (Vig, 1984) (Schwob,

Renty, Coulon, & Gostan, 2009).

En la actualidad existen varios equipos como por ejemplo Low Cost UVO Cleaner

de la marca Jelight que es muy utilizado para producir rápidamente superficies

atómicamente limpias, en aire o en un sistema de vacío, a temperatura ambiente

(Schwob, Renty, Coulon, & Gostan, 2009). Para nuestra producción de superficies

silanizadas se tratará de construir un equipo similar al anterior, en una caja de vidrio

hermética y con adaptación de dos lámparas UV de diferente longitud de onda.

2.2.3. Funcionalización de la superficie silanizada.

En el procedimiento de silanización, la naturaleza del silano usado define el grado

de hidrofobicidad del sustrato que afecta directamente a la fuerza de la interacción del

ADN. Existen varios compuestos se silanos que presentan en sus estructuras grupos

orgánicos que proveen las características de hidrofobicidad, entre ellos tenemos al 7-

octeniltriclorosilano y al (7-octen-1-il) trimetoxisilano que son compuestos con

características de auto-asociación, es decir, tienen unidades moleculares ordenadas que

se forman por la adsorción espontánea (quimisorción) de un surfactante sobre un

substrato. Estos compuestos al quedar unidos con el sustrato presentan una alineación

de sus grupos orgánicos en la superficie del sustrato (Gómez, 2009). A más de

superficies de vidrio o silicio modificados con silanos existen superficies de polímeros

que dan características hidrofóbicas como: poliestireno, polimetilmetacrilato (PMMA),

polidimetilsiloxano (PDMS) que también presenta una alineación en los grupos

terminales siendo estos hidrofóbicos. El peinado molecular también se ha aplicado a los

experimentos realizados en superficies cargadas que van desde vidrio limpio a las

~ 30 ~

superficies modificadas con recubrimientos positivos, incluyendo grupos amino

terminales tales como polilisina y polihistadina, 3-aminopropiltrimetoxisilano y 3-

aminopropiltrietoxisilano, donde la interacción electrostática de la molécula de ADN

con la superficie juega papel importante de unión (Nazari & Gurevich, 2013).

2.2.4. Métodos de silanización

Existen varios métodos de silanización para las superficies, pero los métodos hasta

ahora más reproducibles para el peinado molecular, ha sido la silanización en fase

gaseosa y líquida. “La desventaja de la silanización en fase gaseosa es que requiere unas

condiciones anhidras en incubadoras especializadas, las cuales son difíciles de utilizar

en los laboratorios de biología comunes” (Labit, 2008). Por esta razón en la actualidad

se han venido probando métodos de silanización en fase líquida mejorada y

reproducible usando una combinación nueva de silano – solvente que es posible adquirir

en casi cualquier laboratorio, formando cubreobjetos silanizados muy similares a los

realizados en forma gaseosa.

Silanización en fase líquida.

Generalmente los compuestos de silano son compuestos análogos de los alcanos,

pero derivados del silicio. El trimetoxisilano es la estructura fundamental de

compuestos sintéticos orgánicos de silicio funcional (figura 2.4). Estos compuestos de

silano están sujetos a varias reacciones junto con polímeros de diferentes terminaciones

de enlaces etilénicos los cuales forman varios compuestos con distintas aplicaciones

como: adhesivos, recubrimientos, polímeros orgánicos de silicio modificados, reactivos

hidrogenación, tratamiento de superficies, entre otros (Guang, 2015).

https://es.wikipedia.org/wiki/Alcano

~ 31 ~

CH3 O SiH

O

CH3

O

CH3

Figura 2. 4. Trimetoxisilano estructura fundamental de compuestos sintéticos

orgánicos de silicio. Por Rivera, 2015

En los procesos de silanización en fase líquida se ha determinado por estudios previos y

por sus propiedades de adhesión (Labit, 2008) que uno de los compuestos que mejor

resultado han dado es el (7-octen-1-il) trimetoxisilano, debido a su estructura de la

posición de sus grupos orgánicos insaturados y sus características de durabilidad,

flexibilidad y adherencia mecánica y química (figura 2.5). Al presentar grupos

orgánicos insaturados muestra una estructura hidrofóbica siendo no polares y por lo

tanto no son capaces de realizar enlaces de puentes de hidrógeno.

CH2Si

OCH3

OCH3

OCH3

Figura 2. 5. Estructura de compuesto de silano ((7-octen-1-il) trimetoxisilano)

utilizado en el proceso de silanización en fase líquida. Por Rivera, 2015.

Una mono o multicapa de moléculas de silano se adhiere sobre el cubreobjetos de

vidrio exponiendo un grupo vinilo, al ser llevados por un medio de solución de n-

heptano (figura 2.6). La diferencia de tamaño entre el n-heptano disolvente y el reactivo

(7-octen-1-il) trimetoxisilano permite crear una competencia entre las dos moléculas

para alcanzar la superficie. Por lo tanto la formación de la alineación del silano sobre la

superficie sigue una reacción de difusión limitada, es decir, que se expande a lo largo

del espacio activo del vidrio. (Labit, 2008). La perfecta combinación de composición

~ 32 ~

química y arquitectura o topografía de la superficie consigue que al colocar una gota de

agua no moje la superficie sino que sea repelida por ella, demostrando así un

comportamiento hidrofóbico.

Figura 2. 6. Estructura y alineación del (7-octen-1-il) trimetoxisilano sobre la

superficie del vidrio. Por Rivera, 2015.

La alineación del compuesto (7-octen-1-il) trimetoxisilano permite que los grupos

orgánicos queden totalmente expuestos para la producción de una interacción con los

núcleos hidrofóbicos (bases nitrogenádas) de la doble hélice del ADN (figura 2.7).

~ 33 ~

Figura 2. 7. Unión de los extremos de las hélices del ADN con los grupos orgánicos

de la superficie silanizada. Por Rivera, 2015

2.2.5. Superficies hidrofóbicas

El término hidrofóbico se aplica a aquellas sustancias que son repelidas por el agua

o que no se pueden mezclar con ella. Un producto con propiedades super-hidrofóbicas y

oleo fóbicas, cuya tecnología le permite repeler prácticamente cualquier líquido, aceite,

agua, barro e incluso cemento líquido, son repelidos totalmente sin posibilidad de

interactuar. El producto crea una barrera que impide que el líquido penetre o se adhiera

a algún poro de los materiales (Stgo, 2013).

2.2.6. Determinación de la hidrofobicidad

Las mediciones de ángulos de contacto es un método fiable para caracterizar la

interacción entre un líquido y una superficie, y por tanto determinar la hidrofobicidad

(Diaz, 2011). El ángulo de contacto se define como el ángulo que forma la superficie de

un líquido con una superficie sólida (figura 2.8). “Su valor depende principalmente de

la relación existente entre las fuerzas adhesivas que se presentan en la interfase entre el

líquido y el sólido y las fuerzas cohesivas del propio líquido” (Teran, 2013).

Figura 2. 8. Imágenes de diferentes ángulos de contacto de una gota de agua sobre

una superficie sólida. Por Fralis, 2011.

~ 34 ~

El ángulo formado entre la interfaz sólido/líquido y la interfaz líquido/vapor, cuyo

vértice está donde las tres interfases se encuentran, constituye el ángulo de contacto

(figura 2.9).

Figura 2. 9. Esquema de la representación del ángulo del contacto. Por Díaz 2011

Una superficie en la cual la gota forma un ángulo de contacto mayor que 90°, es

una superficie hidrofóbica. Esta condición implica que la mojabilidad, adhesividad y la

energía superficial del sólido son bajas. En cambio, si la superficie es hidrofílica, se

observará un ángulo de contacto menor a 90° y tanto la mojabilidad, adhesividad como

la energía superficial del sólido serán altas (Figura 2.10) (Diaz, 2011).

~ 35 ~

Figura 2. 10. Diferentes Ángulos de contactos A) comportamiento de la gota si la

superficie es hidrofilica y B) comportamiento de la gota si la superficie es

hidrofóbica. Por Díaz 2011.

“Ángulo de contacto menor a 90, predominan las fuerzas de adhesión entre el

líquido y el sólido, superficie liófila.

Figura 2. 11. Ángulo de contacto menor a 90°. Por Attension, 2010.

Ángulo de contacto igual a 90°, Las fuerzas adhesivas y cohesivas están en

equilibrio”.

Figura 2. 12. Ángulo de contacto igual a 90°. Por attensión, 2010.

~ 36 ~

Ángulo de contacto mayor a 90°, predominan las fuerzas de cohesión del

líquido, superficie liófoba (Attension, 2010)

Figura 2. 13. Ángulo de contacto mayor a 90°. Por Attension, 2010.

El resultado de tener superficies con un ángulo de contacto entre gota y superficie

superior a 150⁰ y que repelen totalmente el agua es que se obtienen superficies

autolimpiantes, antihumedad, antiadhesión, anticorrosión, resistentes a las manchas y a

la proliferación de organismos (Cañete & Fernández, 2013).

2.2.7. Medición de ángulo de contacto

En el mercado existen varios equipos para la determinación de la físico-química

superficial de diferentes productos. Estos equipos sobrepasan los 15000 dólares

dependiendo de sus características y de la versatilidad que tienen para realizar

determinaciones de ángulos de contacto (Teran, 2013). Existen varios métodos para la

determinación del ángulo de contacto como son los métodos dinámicos y los métodos

estáticos, como su nombre lo indica la diferencia radica que los unos utilizan gotas en

~ 37 ~

movimiento y los otros gotas en reposo. Para una fácil medición esta investigación está

encaminada a la medición estática.

Los equipos generalemnte consisten en un sitema óptico, una unidad de

dosificación automática y un software que permite medir ángulos de contacto entre

líquidos y sólidos (figura 2.11) (Roncero, 2015)

Figura 2. 14. Equipo para medición de ángulo de contacto. Por Roncero 2015.

En la medición de los ángulos de contacto en este trabajo se utilizó un equipo que

ha sido adaptado por un estereoscopio y un microscopio, el cual nos permite adquirir

una buena definición del contorno de la gota de agua sobre la superficie silanizada

(figura 2.12).

~ 38 ~

Figura 2. 15. Equipo de visualización de ángulo de contacto adaptado por un

microscopio y estereoscopio. Por Rivera, 2016.

2.2.8. Método estático de la gota en reposo

En este método las determinaciones se realizan mediante un goniómetro de ángulo

de contacto utilizando un sistema óptico para capturar el perfil de un líquido puro sobre

un sustrato sólido. El ángulo formado entre la interfase sólido/líquido y la interfase

líquido/vapor es el ángulo de contacto. Un sistema más antiguo utilizaba un sistema

óptico de microscopio con luz de fondo. Los sistemas de nueva generación emplean

cámaras de alta resolución y software actualizado para capturar y analizar los ángulos

de contacto.

Mediante este método el ángulo de contacto puede ser medido utilizando

inspección directa. Es la técnica goniométrica más sencilla de realizar, en la cual se

imprime la imagen del perfil de una gota y la superficie del sustrato y la tangente a la

interfase de la gota en la línea de contacto se dibujan utilizando líneas rectas. El ángulo

de contacto es, entonces, medido directamente utilizando un graduador. Un enfoque

alternativo podría ser el uso de software de imágenes digitales y dibujo para trazar la

superficie y la tangente y así poder determinar el ángulo de contacto (figura 2.13)

(Stacy, 2009) (Solano, 2009).

~ 39 ~

Figura 2. 16. Determinación del ángulo de contacto mediante un software. Por Stacy

2009.

2.3. Marco legal

Los productos químicos en su gran mayoría son considerados como productos

peligrosos para la salud humana y el medio ambiente. En este trabajo a realizarse se

tratará con varios productos químicos los cuales deben ser tratados y manejados

adecuadamente, por ello se debe tener en cuenta ciertas normas las cuales e indican a

continuación.

2.3.1. Norma INEN 2266 transporte, almacenamiento y manejo de productos

químicos peligrosos.

Esta norma establece los requisitos y precauciones que se deben tener en cuenta

para el transporte, almacenamiento y manejo de productos químicos peligrosos.

Art. 3.1.22 Producto químico peligroso: Todo producto químico que por sus

características físicoquímicas presentan o pueden presentar riesgo de afección a la salud,

al ambiente o destrucción de bienes, lo cual obliga a controlar su uso y limitar la

~ 40 ~

exposición a él. Producto sólido, líquido o gaseoso que puede ser: explosivo,

inflamable, susceptible de combustión espontánea, oxidante, inestable térmicamente,

tóxico, infeccioso, corrosivo, liberador de gases tóxicos o inflamables, y aquellas que

por algún medio, luego de su eliminación, puedan originar algunas de las características

anteriores.

Art. 6.1.1. Personal: Quienes transporten, almacenen y manejen productos

químicos y materiales peligrosos deben garantizar que todo el personal que esté

vinculado con los productos químicos y materiales peligrosos cuente necesariamente

con los equipos de seguridad adecuados, una instrucción y un entrenamiento

específicos, a fin de asegurar que posean los conocimientos y las habilidades básicas

para minimizar la probabilidad de ocurrencia de accidentes y enfermedades

ocupacionales.

Art. 6.8.1. Identificación del material: Es responsabilidad del fabricante y del

comercializador de productos químicos peligrosos, su identificación y etiquetado de

conformidad con la presente norma. Durante el almacenamiento y manejo general de los

productos químicos peligrosos no se debe mezclar los siguientes productos:

Materiales tóxicos con alimentos o semillas o cultivos agrícolas

comestibles.

Combustibles con oxidantes.

Explosivos con fulminantes o detonadores.

Líquidos inflamables con oxidantes.

Material radioactivo con otro cualquiera.

Art. 6.10.1 Manejo: Será tarea fundamental de todos los involucrados en el

manejo de productos químicos peligrosos el realizar acciones para prevenir accidentes.

Para esto se debe: Identificar y evaluar todos los riesgos, así como las zonas vulnerables

y de mayor fragilidad y determinar un plan de prevención de riesgos, seleccionando

alternativas que lo minimicen y un plan de acción o de actividades para controlarlos.

~ 41 ~

Normas de desechos químicos

Art: 6.11.1.1. Para la aplicación de las tecnologías apropiadas, la empresa debe

establecer su proceso de tratamiento y disposición final, objetiva, alcance, referencia de

normas, responsables, procedimientos, instructivos de trabajo y registro de los mismos

que estarán a disposición de la autoridad competente.

Art: 6.11.1.2 La empresa responsable de los residuos de productos químicos

peligrosos, envases, embalaje y productos caducados, debe establecer el proceso de

tratamiento y eliminación adecuado, considerando el reciclaje como primera alternativa,

basado en las normas vigentes, información técnica de los componentes del residuo a

tratar, caracterización del mismo. La empresa llevará un registro del volumen de los

residuos tratados que estará a disposición de la autoridad competente (INEM, 2000).

~ 42 ~

3. CAPÍTULO III

METODOLOGÍA

3.1. Tipo de la investigación

La presente investigación tiene un enfoque cuantitativo, ya que se desea determinar

de forma experimental la producción de superficies silanizadas, para ello, seguirá el

nivel de tipo experimental y de campo al trabajar en un ambiente controlado

(Hernández, 2006) (Calderon M. , 2013).

3.2. POBLACIÓN Y MUESTRA.

3.2.1. Población

Debido a que la investigación es de tipo experimental y el objetivo es crear una

metodología nueva, no se tiene una población determinada, ya que los resultados

obtenidos es una mínima fracción del infinito número de análisis que se puede realizar.

3.2.2. Muestra

Para el caso de las muestras a escoger, debido a ensayos previos se ha visto que los

mejor tiempos de exposición son tres 6, 7 y 8 horas. Por esta razón se utilizará 21

cubreobjetos, es decir, se tomará 7 muestras o cubreobjetos por cada tiempo de

exposición al (7-octen-1-il) trimetoxisilano.

3.3. Diseño experimental.

Para el desarrollo de la presente investigación, se realizó la metodología que consta

de 2 grandes etapas para cumplir con los objetivos plantados, a continuación se puede

conocer más afondo sobre estas etapas:

~ 43 ~

En la primera etapa consta de la metodología que se siguió para la activación

superficies silanizadas que para nuestro estudio, estas superficies fueron

cubreobjetos de vidrio. La activación de los grupos OH del vidrio se produjo tras

la extructuración de un protocolo de limpieza creando una caja hermética con

componentes adecuados para su construcción, la que permitiera la eliminación

de residuos orgánicos, de una forma sencilla y eficiente.

En la segunda etapa se realizó una metodología para producir superficies

silanizadas de una manera adecuada y óptima, presentando características

hidrofóbicas al ser expuesta a soluciones acuosas las cuales se determinó

mediante la medición del ángulo de contacto.

Estas dos etapas de desarrollo sobre los cubreobjetos se realizaron con la finalidad

de poder crear una metodología para la formación y función del mismo y que puedan

realizarse por cualquier persona que siga los pasos especificados en la metodología

propuesta.

Ya que en la primera etapa se creó el equipo de activación de cubreobjetos, a

continuación se explicara más detalladamente su construcción.

Construcción de Caja UV/Ozono.

Para la presente investigación se necesitaba un equipo que nos brinde una alta

limpieza de materia orgánica sobre las superficies a tratar. En estudios anteriores como

¨Use of DNA Combing for Studying DNA Replication In Vivo in Yeast and

Mammalian Cells”, (Schwob, Renty, Coulon, & Gostan, 2009), trabajan con un

limpiador UV / ozono (Jelight ref 42-220; lámpara UV 28 W / cm a 254 nm) con

ventilador (BLW200-220) y entrada de ozono (OKL200-4). En éste trabajo diseñamos

un equipo que cumpla esta función y que abarate costos. Para su construcción

utilizamos una caja de vidrio de 60cm de largo, 15cm de alto y 10cm de ancho. En la

tapa se adaptó 3 focos de luz ultravioleta: un foco de 45cm, de longitud 254nm y de

~ 44 ~

15w y los otros dos focos de 20cm, de longitud 180nm y 8w. En la parte derecha

inferior se encuentra un conducto de entrada para el oxígeno industrial, (figura 3.1). Con

el equipo construido para su funcionamiento se adaptó una tela de color negro sobre

todo la caja para evitar que las longitudes de onda traspasen el vidrio y puedan afectar a

la salud del analista.

Figura 3. 1. Cámara UV/ozono para eliminar residuos orgánicos, la cual consta de:

1) caja de vidrio, 2) Tapa, 3) foco de luz UV de 254nm, 4) focos de luz UV de 180nm y

5) Conducto de entrada. Rivera 2016.

3.3.1. Tratamientos y repeticiones

¨El número de tratamientos es determinado por el investigador y depende del

problema particular de que se trata. El número de observaciones por tratamiento (n)

debe escogerse con base en la variabilidad que se espera observar en los datos, así como

en la diferencia mínima que el experimentador considera que es importante detectar.

Con este tipo de consideración n=10 cuando las mediciones tienen poca dispersión y

n=30 cuando las mediciones muestran bastante dispersión¨ (Gutiérrez & Vaca, 2008).

1

2

3

4

5

~ 45 ~

Gracias a análisis previos se obtuvo que los mejores tiempos de exposición del (7-

octen-1-il) trimetoxisilano sobre las superficies de vidrio previamente limpias son los

de 7 horas. Por esta razón se escogió trabajar con 3 tiempos de exposición o

tratamientos los cuales se encuentran alrededor de 7 horas como son 6 horas y 8 horas,

determinando de esta manera cual es el tiempo idóneo para producir cubreobjetos

hidrofóbicos, ya que si es menor el tiempo los gastos son menores. Una vez planteado el

número de tratamiento se siguió a determinar el número de repeticiones por cada

tratamiento. Debido a los costos de los materiales para realizar estos cubreobjetos

silanizados se determinó usar 7 repeticiones por cada tratamiento. Las repeticiones

fueron enumeradas del 1 al 21 y su tratamiento se lo realizó escogiendo números a lazar

para trabajar 7 muestras por día, para poder realizar nuestro diseño estadístico.

3.3.2. Caracterización de las variables.

Variable Independiente

Tiempo de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano

Variable Dependiente

Ángulo de Contacto

3.4. Diseño estadístico.

Se deseaba estandarizar un método para producir cubreobjetos silanizados y

determinar la hidrofobocidad mediante el tiempo de exposición frente al (7-octen-1-il)

trimetoxisilano, para ello se realizó un diseño experimental completamente aleatorizado

(DCA), mediante un análisis de varianza de ANOVA.

3.4.1. Descripción del diseño experimental estadístico

Se realizó un análisis de varianza del diseño completamente aleatorio DCA de un

solo factor (una sola variable) con 3 tratamientos diferentes, determinando la existencia

de diferencias significativas con un nivel de confianza del 95% entre las medias de los

tratamientos utilizando como variable el ángulo de contacto, él cual es respuesta a los

~ 46 ~

diferentes tratamientos de la reacción del (7-octen-1-il) trimetoxisilano sobre la

superficie del cubreobjeto.

Para obtener la respuesta a la variable independiente (ángulo de contacto) se

registró los valores calculados por el programa IMAGEJ en las siguientes tablas.

Tabla 3. 1.Ordenamiento de datos experimentales para el tratamiento estadístico

Ángulo de

contacto (°)

Tiempo de exposición del (7-

octen-1-il) trimetoxisilano (h)

6h 7h 8h

1 8 15

2 9 16

3 10 17

4 11 18

5 12 19

6 13 20

7 14 21

Promedio (°) ------- ------- -------

Desviación

estándar (°) ------- ------- -------

Varianza ------- ------- -------

Donde:

1,2,3……. = número de repeticiones, dando como respuesta ángulo de contacto

(°)

6h, 7h y 8h son los tiempos de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano

(tratamiento).

𝐇𝐨 = 𝐓𝟏 = 𝐓𝟐 = 𝐓𝟑

𝐇𝐚 = 𝐓𝟏 ≠ 𝐓𝟐 ≠ 𝐓𝟑

Donde:

~ 47 ~

T1: tiempo de exposición de (7-octen-1-il) trimetoxisilano a 6h



3.4.2. Análisis de Varianza de DCA.

Consiste en analizar los cocientes de las varianzas para probar la hipótesis de

igualdad o desigualdad entre las medias debidas a los tratamientos (Tiempo de

exposición de silano).

En el caso de DCA las fuentes de variación principales son las debidas a los

tratamientos y el error aleatorio.

𝜽 = 𝝁 + 𝑻 + 𝜺

𝜺 = 𝑬𝒓𝒓𝒐𝒓

𝑻 = 𝒕𝒓𝒂𝒕𝒂𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 (𝒕𝒊𝒆𝒎𝒑𝒐 𝒅𝒆 𝒆𝒙𝒑𝒐𝒔𝒊𝒄𝒊ó𝒏)

Con estas fuentes de variación se obtienen los cuadrados de las sumatorias de las

desviaciones, tanto del tratamiento como del error y se construye una tabla de ANOVA

(Clarichemo, 2009).

Tabla 3. 2. Tabla de análisis de Varianza ANOVA de DCA

Fuente de

variabilid

ad

Suma de

cuadrados

Grados

de

libertad

Cuadrados

medios

F

calculado

Valor p

Tiempo

𝑆𝐶𝑇𝑅𝐴𝑇

= ∑ 𝑛𝑖(𝜃𝑖. − 𝜃𝑖..) 2

𝑘

𝑖=1

𝑘 − 1 𝐶𝑀𝑇𝑅𝐴𝑇 =

𝑆𝐶𝑇𝑅𝐴𝑇

𝑘 − 1

𝐶𝑀𝑇𝑅𝐴𝑇

𝐶𝑀𝐸

𝑃(𝐹 > 𝐹0)

Error 𝑆𝐶𝐸 = 𝑆𝐶𝑇 − 𝑆𝐶𝑇𝑅𝐴𝑇 𝑁 − 𝑘 𝐶𝑀𝐸 =

𝑆𝐶𝐸

𝑁 − 𝑘

Total. 𝑆𝐶𝑇 = ∑ ∑ (𝜃𝑖𝑗

𝑛𝑖

𝑗=1

𝑘

𝑖=1

− 𝜃..)2

𝑁 − 1

~ 48 ~

Donde:

𝒏𝒊 = 𝑇𝑎𝑚𝑎ñ𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑖 − é𝑠𝑖𝑚𝑜 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜.

𝜽𝒊𝒋 = 𝐿𝑎 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑖 𝑐𝑜𝑛 𝑙𝑎 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 á𝑛𝑔𝑢𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑐𝑎𝑡𝑜 𝑗.

𝜃𝒊. = 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑒𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑖.

𝜃.. = 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑔𝑙𝑜𝑏𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑡𝑜𝑑𝑎𝑠 𝑙𝑎𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑒𝑠.

𝑘 = 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜.

𝑁 = 𝑆𝑢𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑛𝑖 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑡𝑜𝑑𝑜𝑠 𝑙𝑜𝑠 𝑡𝑖𝑚𝑝𝑜𝑠.

Tiempo = tratamiento

3.4.3. Pruebas de rangos múltiples en DCA

Una vez que se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa, se

debe investigar cuales tratamientos resultaron diferentes, o cuales tratamientos

resultados iguales, lo cual se puede realizar con diferentes métodos, uno de ellos es el

método de diferencia mínima significativa (LSD) (Medardo, 2008).

El problema es probar la igualdad de todos los posibles pares de medias con la

hipótesis:

𝐇𝐨 = 𝝁𝒊 = 𝝁𝒋

𝐇𝐚 = 𝝁𝒊 ≠ 𝝁𝒋

El estadístico de pruebas para cada una de las hipótesis dadas es la correspondiente

diferencia en valor absoluto entre sus medias muéstrales |𝜽�� − 𝜽��|. Se rechaza la

hipótesis nula si ocurre:

|𝜽�� − 𝜽��| > 𝒕𝒂𝟐

.𝑵−𝑲 √𝑪𝑴𝑬 {

𝟏

𝒏𝒊+

𝟏

𝒏𝒋} = 𝑳𝑺𝑫

Donde:

𝒕𝒂

𝟐.𝑵−𝑲 = t Student, se lee en las tablas de distribución con N-k grados de libertad.

𝑪𝑴𝑬 = Es el cuadrado medio del error que se obtiene en la tabla de ANOVA.

𝒏𝒊, 𝒏𝒋 = Son las observaciones para los tratamientos i y j

~ 49 ~

Significativo: Cuando el término de la izquierda es mayor a término de la

derecha.

La cantidad del LSD se la llama diferencia mínima significativa, ya que es la

diferencia mínima que debe existir entre dos medias muéstrales para considerar que los

tratamientos son significativamente diferentes.

3.5. MATERIALES Y MÉTODO.

3.5.1. Materiales

Equipos.

Cámara UV/Ozono: Caja de vidrio con tapa hermética de 60cm de largo, 15cm

de alta y 10cm de ancho, adaptada en la parte superior una lámpara UV de

254nm (1x40w/20w, G15t8/15W, 254nm), y dos lámparas UV de 180nm (110-

130V-60Hz). ELECA130-ELECT SOCKET.

Sorbona:

- Modelo:BJPX-D70

- Marca: BIOBASE.

- S/N: ZY31613091610

Procesador de ultrasonido:

- Modelo: GEX 130.

- Marca: DAIGGER-GEN

- S/N: 77002w-09-13.

Estereoscopio modificado.

- Modelo: LABOVAL 4

- Marca: Carl Zeiss Jena

Cámara fotográfica 640x480 VGA

- Modelo: MikrOkular-II.

~ 50 ~

- Marca: BRESSER

CPU clon, mouse, teclado y monitor marca AOpen A55P.

Materiales.

Cubreobjetos de 22 x 22 mm. Marca (LABORGLASS).

Pinza de teflón de 10cm.

3 Vasos de precipitación de 50ml.

3 Vasos de precipitación de 100ml.

Micropipetas de 1- 20ul.

Micropipeta de 20-200ul.

5 Cajas Petri de vidrio.

Caja de plástico de 17cm x 10cm con tapa.

3 cajas de plástico con divisiones pequeñas de 10cm x 3cm.

Desecador

Reactivos

Agua destilada: producida en los laboratorios del CIZ.

Jabón o detergente.

Cloroformo: Chloroform acs iso european pharmacopéia, FR 1000 ML, Sigma-

Aldrich.

Heptano: Heptane Gren Altermative anhydrous al 97%, ESPECTROCROM.

Etanol: ETHYL ALCOHOL ABSOLUTE 99,8% ACS, FR 1000 ML, Sigma-

Aldrich.

Oxígeno Industrial: Tanque de 9,5 m3, LINDE GAS AGA S.A. Ecuador.

(7-octen-1-il) trimetoxisilano: Trimethoxy (7-Octen-1-yl)silane technical al

100%, ESPECTROCROM. (Una vez abierto almacenar en un desecador para

evitar la degradación del reactivo).

~ 51 ~

3.5.2. Método

Para realizar la investigación se realizó en 4 grandes etapas: la primera fue la parte

de la limpieza de la superficie, la segunda la variación de tiempos de exposición del

reactivo silano, la tercera la eliminación del exceso de silano en el vidrio y la cuarta es

la medición del ángulo de contacto.

Para iniciar con los diferentes tratamientos se escogió al azar con la enumeración

indicada en la tabla 3.1, para tratar 7 cubreobjetos por día. La distribución aleatoria se

muestra a continuación.

Día 1: 8 – 20 – 11 – 2 – 18 – 5 – 19.

Día 2: 9 – 7 – 14 – 13 – 17 – 3 – 21.

Día 3: 10 – 12 – 1 – 4 – 6 – 15 – 16.

Cada día se trató 7 cubreobjetos con las 3 primeras etapas, es decir, se procedió a la

pre-silanización, silanización y a la post-silanización, dejando la etapa de la medición

del ángulo de contacto para cuando se ha tratado los 21 cubreobjetos a las diferentes

horas.

A. Metodología de limpieza (pre-silanización)

Para una máxima limpieza de materia inorgánica, se colocó un cubreobjeto

(22x22mm) en un recipiente limpio y se añadió una solución de jabón /agua, con

agitación constante durante 2min.

Se pasó a un vaso de precipitación con 20ml de agua destilada y se pasó

nuevamente a otro vaso de precipitación con 50ml de agua destilada para

eliminar todo el jabón.

Se enjaguó con 10ml de etanol en otro vaso de precipitación.

Se pasó a otro recipiente con 20ml de etanol y se dejó reposar durante 2min.

Se colocó en una superficie limpia y libre de impurezas para dejar secar.

~ 52 ~

Para eliminar la materia orgánica se traspasó dentro de la cámara de UV/Ozono.

Se repitió este proceso con los 7 cubreobjetos escogidos a lazar en el primer día.

Una vez que los 7 cubreobjetos se encontraron dentro de la cámara se cerró la

tapa y por el conducto de entrada se adaptó una bomba y se llevó al vacío.

Muy cuidadosamente se sacó la bomba y se colocó un globo con oxígeno

industrial en el mismo conducto y se prendió los focos de luz UV.

Para que la radiación no se disperse se tapó la caja con una tela negra y se

mantuvo la reacción durante 3 horas. Las imágenes con los pasos se muestran en

el (Anexo 1).

B. Metodología de Silanización de cubreobjetos

Se preparó tres soluciones en tres cajas petri. En cada caja petri se preparó una

solución de (7-octen-1-il) trimetoxisilano al 0,00399 M en heptano.

Se colocó 15ml de heptano y 15ul de (7-octen-1-il) trimetoxisilano en cada caja

de petri.

Se etiquetó cada caja de la siguiente manera: 1) tiempo 6h, 2) tiempo 7h y 3)

tiempo 8h.

Transcurrido el tiempo de la reacción de 3 horas en la cámara UV/Ozono, los

cubreobjetos se sacaron y se transportó hacia las cajas petri según la distribución

aleatoria iniciada anteriormente dejando reaccionar durante las horas

correspondientes.

Una vez culminada la reacción de silanización con una piza de teflón se sacó los

cubreobjetos uno por uno, a las cajas de plástico con divisiones, previamente

etiquetadas con la distribución a lazar.

Se trabajó todo el tiempo dentro de una Sorbona y con la ropa adecuada para

evitar accidentes (Anexo 2).

C. Metodología post-silanización

Para la eliminación del exceso de silano adherido a la superficie del cubreobjeto

se colocó un cubreobjeto dentro de un vaso de precipitación con 20ml de n-

heptano y se llevó al ultrasonido por 5 min.

~ 53 ~

Se traspasó a otro vaso de precipitación con 20ml de cloroformo y se llevó al

ultrasonido por 5 min.

Se guardó nuevamente a la caja de plástico etiquetada con cuidado y a

temperatura ambiente.

Se repitió este proceso con los 7 cubreobjetos (Anexo 3).

Es recomendable colocar las placas dentro de un desecador para que el tiempo

de duración sea mayor.

De esta manera se trató los 21 cubreobjetos en una forma ordenada en los tres

diferentes días.

D. Medición del Ángulo de contacto.

Para el caso de la medición del ángulo de contacto se ocupó “la técnica

goniométrica de gota yacente o “sessile drop” en donde una gota del fluido a analizar es

depositada de forma vertical sobre una superficie de análisis, debido a que ésta técnica

presenta mejores resultados al realizarse con volúmenes pequeños, y así, disminuir

posibles errores generados a causa de deformaciones de la gota por efecto de su tamaño”

(Teran, 2013).

Una vez terminado el proceso de producción de los cubreobjetos silanizados y

guardados adecuadamente en las cajas de plástico y etiquetados uno por uno, se

procedió a la medición del ángulo de contacto mediante un estereoscopio modificado

realizado en el Laboratorio de Coloides de la Facultad de Ciencias Químicas.

Cada cubreobjeto se colocó sobre la platina del microscopio del equipo

modificado y al lente ocular se acopló una cámara fotográfica 640x480 VGA, la

misma que ésta conectada a la computada por medio de un cable USV (Figura

2.12)

En la pantalla del computador se abrió el programa webcam.

Una vez dentro del programa en la parte superior, en el botón “Archivo” se da

clic en “crear la carpeta de archivo captura” (figura 3.2).

~ 54 ~

Figura 3. 2. Crear carpeta de archivo de captura. Rivera, 2016.

Se eligió la carpeta donde se desea guardar las capturas fotográficas

Se prendió el estereoscopio modificado y con una micropipeta se colocó 5ul de

agua bidestilada sobre la superficie del cubreobjeto con mucho cuidado y de tal

forma que la imagen generada en el computador tenga la mayor definición

posible de la gota y de la interfase, para ello se utilizó el lento ocular de 1,6

(figura 3.3 y 3.4).

Figura 3. 3. Funcionamiento de estereoscopio modificado. Rivera, 2016.

~ 55 ~

Figura 3. 4. Mayor definición de gota en el computador. Rivera, 2016.

Se capturó la imagen dando click en la aplicación “captura y snap shot” cómo se

indica en la figura 3.5.

Figura 3. 5. Forma de capturar la Imagen. Rivera, 2016.

En la carpeta de guardar la imagen ya se observa la misma y se procede a

cambiar el nombre por la etiqueta dada anteriormente.

Éste procedimiento se continuó realizando con todos los cubreobjetos tratados.

Una vez que se culminó con la toma de fotografías se procedió a medir el ángulo

de contacto.

Para procesar las imágenes de perfil de la gota se utilizó el software libre

ImageJ, “el cual es un programa Java de procesamiento y análisis de imágenes de

dominio público inspirado por NIH Image para Macintosh. Este programa se puede

~ 56 ~

utilizar online o descargando la aplicación en cualquier computador con un Java 1.5.

Este software puede mostrar, editar, analizar, procesar, grabar e imprimir imágenes

de 8-bits, 16-bits y 32-bits. Puede procesar varios formatos de imágenes incluyendo

TIFF, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS y ‘raw’ ” (Teran, 2013).

Una de las funcionalidades de su software ofrece es el uso de la aplicación

“Angle tool” que se encuentra en la barra de herramientas y que permite determinar

el ángulo que se forma en una interfase (figura 3.6). Por ésta razón se ha

seleccionado éste software ya que es de uso muy fácil y de descarga libre.

Figura 3. 6. Herramienta Angle Tool en el software IMAGEJ. Rivera, 2016.

A continuación se muestra el procedimiento para obtener el valor del ángulo

formado entre el vidrio del cubreobjeto y la solución acuosa.

Dar “click” en la opción “File” en la barra de tareas del programa,

seleccionar la opción “Open” ó “Ctrl+O” como se muestra en la figura 3.7,

abrir la carpeta que contiene las imágenes de las gotas y seleccionar la

imagen que se desea analizar, ésta aparecerá como se observa en la figura

3.8.

~ 57 ~

Figura 3. 7. Selección de OPEN. Rivera, 2016.

Figura 3. 8. Imagen de estudio de IMAGEJ. Rivera 2016.

En la barra de herramientas dar clic en la opción “Angle tool” el cual se presenta

de esta forma. . Con ésta herramienta colocamos el cursor en la foto donde

se observa la superficie del vidrio, se nos despliega unas líneas amarillas y con

el mouse se llevó a la intefase donde se quiere medir el ángulo (Figura 3.9).

~ 58 ~

Figura 3. 9 Medición de ángulo de contacto. Rivera, 2016.

Para obtener el valor del ángulo se da clic en “Analyze” y en “Measure” o “Ctrl

+ M” (figura 3.10) y podemos observar cómo se despliega un nuevo cuadro de

resultados con los valor del ángulo (figura 3.11).

Figura 3. 10 Herramienta para obtener valores de ángulo de contacto. Rivera,

2016.

~ 59 ~

Figura 3. 11.Tabla con valores del ángulo de contacto. Rivera, 2016.

Éste proceso se repite tanto para la medición del ángulo formado a lado

izquierdo como al derecho y de igual manera para las demás repeticiones de los

cubreobjetos tratados, obteniendo una lista con los valores de los ángulos.

Estos valores obtenidos se utilizaron para realizar la estadística planteada.

~ 60 ~

4. CAPITULO IV

ANÁLISIS Y DISCUCIÓN DE RESULTADOS

4.1. Resultados

A continuación se exponen los resultados de la metodología que se utilizó para la

realización de superficies hidrofóbicas mediante un tratamiento con (7-octen-1-il)

trimetoxisilano a diferentes tiempos de exposición, utilizando la comprobación del

ángulo de contacto y comparándolo con superficies tratadas en Francia al tomarlos

como referencia.

Para iniciar la exposición de resultados se ha visto la necesidad de presentar

pruebas previas que se realizaron a cubreobjetos. Se obtuvo información muy

importante para estandarizar la metodología actual.

4.2. Resultados de pruebas previas.

En el transcurso del desarrollo de la parte experimental de la investigación, se

realizó diferentes ensayos como son:

El primer ensayo se trabajó con la metodología descrita anteriormente en el

capítulo 3 apartado 3.5.2., con la diferencia que se hizo reaccionar a 5 tiempos

diferentes.

El segundo ensayo se trabajó para determinar si era o no necesario el tratamiento

de post-silanización de la metodología del apartado 3.5.2.

4.2.1. Resultados de primer ensayo con 5 tiempos diferentes de exposición del (7-

octen-1-il) trimetoxisilano

En estos ensayos previos se realizó dos experimentaciones con el mismo

tratamiento descrito en la metodología del capítulo 3 en el apartado 3.5.2., con la

diferencia que se trabajó a 5 tiempos diferentes de exposición del (7-octen-1-il)

~ 61 ~

trimetoxisilano (2h-7h-12h-17h y 14h) y con 4 repeticiones por cada uno de ellos. La

limpieza de la primera experimentación se realizó con un solo foco de luz UV de 254nm

en la cámara construida, mientras que en la segunda experimentación se utilizó los tres

focos de luz UV con las dos longitudes de onda 254nm y 189nm.

Experimentación 1:

A continuación se muestran los resultados del ángulo de contacto como respuesta a

la reacción de 5 tiempos diferentes (2h-7h-12h-17h y 24h) en la primera

experimentación, es decir, con la luz UV de 254nm.


un tiempo de exposición de 2 horas y con luz UV de 254nm.

Repeticiones Ángulo de

Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 61,475 62,436 61,956

2 60,989 61,216 61,103

3 63,065 62,593 62,829

4 61,015 61,002 61,009

Promedio (°) 61,724

Desviación

estándar (°)

0,851

Varianza 0,724

~ 62 ~




Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 89,746 89,333 89,540

2 89,61 90 89,805

3 90,993 90,551 90,772

4 89,105 88,107 88,606


Desviación

estándar (°)

0,891

Varianza 0,794




Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 74,612 80,115 77,364

2 79,433 74,16 76,797

3 80,2 76,535 78,368

4 77,312 79,417 78,365


Desviación

estándar (°)

0,778

Varianza 0,605

~ 63 ~




Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 80,743 78,139 79,441

2 79,274 80,204 79,739

3 80,789 80,326 80,558

4 80,972 81,447 81,210


Desviación

estándar (°)

0,802

Varianza 0,643



Repeticiones

Ángulo de

Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 80,794 77,142 78,968

2 78,69 79,592 79,141

3 78,69 77,377 78,034

4 80,27 80,027 80,149


Desviación

estándar (°)

0,867

Varianza 0,751

~ 64 ~

Experimentación 2:

A continuación se muestran los resultados del ángulo de contacto como respuesta a

la reacción de 5 tiempos diferentes (2h-7h-12h-17h y 24h) en la segunda

experimentación, es decir, con la luz UV de 254nm y 180nm.


un tiempo de exposición de 2 horas y con luz UV de 254nm y 180nm.


Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 64,736 63,963 64,350

2 62,856 64,012 63,434

3 63,975 64,783 64,379

4 64,754 64,643 64,699


Desviación

estándar (°)

0,544

Varianza 0,296

~ 65 ~




Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 92,073 92,781 92,427

2 91,973 91,539 91,756

3 92,642 92,852 92,747

4 92,843 92,884 92,864


Desviación

estándar (°)

0,497

Varianza 0,247




Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 79,782 80,013 79,898

2 79,953 79,751 79,852

3 79, 243 80,932 80,932

4 79,623 79,673 79,648


Desviación

estándar (°)

0,577

Varianza 0,333

~ 66 ~




Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 82,041 81,743 81,892

2 81,274 80,834 81,054

3 81,073 82,326 81,700

4 82,62 82,447 82,534


Desviación

estándar (°)

0,609

Varianza 0,371




Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 81,163 81,634 81,399

2 80,63 79,952 80,291

3 79,529 80,734 80,132

4 80,803 80,027 80,415


Desviación

estándar (°)

0,572

Varianza 0,327

~ 67 ~

En la gráfica que se presenta a continuación se puede observar como el ángulo de

contacto depende del tiempo de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano sobre la

superficie previamente limpia de materia orgánica e inorgánica en las dos diferentes

experimentaciones.

Figura 4. 1. Comportamiento del ángulo de contacto promedio con respecto a los

diferentes tiempos de exposición en dos experimentaciones diferentes. Por Rivera,

2016.

Con los datos obtenidos del ángulo de contacto a los diferentes tiempos de

exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano (figura 4.1), se puede observar que en las

dos experimentaciones el ángulo de contacto es mayor cuando se trata de un tiempo de

7 horas. En el experimento 1 alcanza un valor de 89,681° y en la experimento 2 alcanza

un valor de 92,448° estos valores nos indican que las superficies son hidrofóbicas a este

tiempo de exposición con (7-octen-1-il) trimetoxisilano, por lo cual es el más adecuado

2; 61,724

7; 89,681

12; 77,723 17; 80,237 24; 79,073

2;64,215

7; 92,448

12; 80,082

17; 81,795 24; 80,559

0,000

20,000

40,000

60,000

80,000

100,000

0 5 10 15 20 25 30

Án

gu

lo d

e co

nta

cto (

°)

Tiempo de exposición de

(7-octen-1-il) trimetoxisilano (h)

Tiempo de exposición de (7-octen-1-il) trimetoxisilano Vs

Ángulo de contacto

Exp1. Luz 254nm

Exp2. Luz 254nm y 180nm

~ 68 ~

para utilizar en la metodología propuesta. Además se observa que a partir del tiempo de

exposición de 12 horas con (7-octen-1-il) trimetoxisilano se muestra un

comportamiento lineal o constante de los valores del ángulo de contacto, esto puede

darse debido a que la formación de multicapas desordenadas no permite la formación de

superficies con comportamientos hidrofóbicos.

Otra observación en esta figura es cómo influye la luz UV en la limpieza de

materia orgánica y por lo tanto en la formación de superficies hidrofóbicas. La curva de

color rojo correspondiente a la experimentación 2 realizada con las dos longitudes de

onda de luz UV adquiere valores más altos que cuando la limpieza de materia orgánica

se realiza solo con una longitud de onda (experimento 1), por tal razón a una mayor

limpieza mayor será la hidrofobicidad de la superficie tratada. Esto se debe a que en el

experimento 1 no existe la formación y destrucción del ozono y del radical oxígeno el

cual es el agente oxidante para eliminar totalmente la materia orgánica y por lo tanto la

activación de los grupo OH no es la adecuada.

4.2.2. Resultados del segundo ensayo.

Uno de los pasos fundamentales de la metodología es la determinación de la

limpieza posterior a la silanización y gracias a la información que se obtuvo del primer

ensayo, que el mejor tiempo de exposición es de 7 horas, el segundo ensayo realizó dos

experimentaciones a éste tiempo y con 7 repeticiones cada una. La primera

experimentación fue determinar los ángulos de contacto sin realizar un tratamiento

posterior a la silanización, mientras, que la segunda experimentación se la realizó con

un tratamiento de limpieza de exceso de (7-octen-1-il) trimetoxisilano con heptano y

cloroformo. A continuación se pueden observar los datos obtenidos.

~ 69 ~

Tabla 4. 11. Ángulo de contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados

sin tratamiento pos-silanización.

Tiempo (h) Ángulo de

Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 89,347 89,483 89,415

2 89,294 90,851 90,073

3 90,975 89,842 90,409

4 90,358 90,236 90,297

5 89,471 88,942 89,207

6 89,761 90 89,881

7 89,476 90 89,738


Desviación

estándar (°)

0,443

Varianza 0,196

Tabla 4. 12. Ángulo de contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados

con tratamiento pos-silanización.

Tiempo (h) Ángulo de

Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio (°)

1 92,857 91,983 92,42

2 93,746 93,012 93,379

3 91,363 91,745 91,554

~ 70 ~

4 92,834 91,934 92,384

5 93,747 92,154 92,9505

6 91,263 93,674 92,4685

7 91,736 91,783 91,7595


Desviación

estándar (°)

0,631

Varianza 0,398

Figura 4. 2. Comportamiento del ángulo de contacto sobre superficies con o sin

tratamiento post-silanización. Rivera, 2016.

88,500

89,000

89,500

90,000

90,500

91,000

91,500

92,000

92,500

7

89,860

92,473

Án

gu

lo d

e C

on

tact

o (

°)

Tiempo de exposición del


Ángulo de contacto vs con o sin tratamieno post-

silanización.

Sin tratamiento

Con tratamiento

~ 71 ~

Como se puede observar en el diagrama de columnas (figura 4.2) los valores de los

ángulos de contacto obtenidos sobre las superficies con tratamiento post-silanización

son mucho más altos que los de sin tratamiento post-silanización. Éstos sobrepasan los

90° lo que indica que estas superficies son mucho más hidrofóbicas y por lo tanto

presentar una mayor funcionalidad para el peinado molecular. La diferencia se debe a

que en el tiempo de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano se pueden crear

posiblemente más de monocapa de silano sobre el vidrio determinando que la

superficies no es totalmente lineal y por lo tanto afecta al ángulo de contacto formado

en esta interfase. Cuando el exceso de capas de (7-octen-1-il) trimetoxisilano ha sido

eliminado de la superficie, ésta queda aproximadamente homogénea dejando los grupos

insaturados del (7-octen-1-il) trimetoxisilano en la parte superior de la superficie como

se muestra en la figura 2.6.

Con los datos que se mostraron anteriormente se pudo determinar que los tiempos

adecuados para analizar en la presente investigación deben estar cercanos de 7 horas ya

que el comportamiento de 2 y 12 horas son muy extensos entre sí, por lo tanto se

escogió los tiempos de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano de 6,7 y 8 horas.

4.3. Resultados de la experimentación.

Para expresar los resultados de hidrofobocidad de los cubreobjetos tratados con la

metodología propuesta en el capítulo 3 en el apartado 3.5.2, se lo realizó mediante un

diseño experimental completamente aleatorio (DCA) y prueba de rangos múltiples

como el método de la diferencia mínima significativa (LSD), cuyos resultados han sido

colocados tablas y gráficas que facilitan al observador entender de una forma fácil y

clara.

En las 3 tablas siguientes se muestras los valores de los ángulos de contacto

obtenidos en el programa IMAGEJ al ser tratados a 3 diferentes tiempos de exposición

del (7-octen-1-il) trimetoxisilano (6h, 7h y 8h).

~ 72 ~



valores se observan en el Anexo 4.

Repeticiones

Ángulo de

Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio

1 92,054 91,318 91,686

2 91,337 91,397 91,367

3 90,659 91,785 91,222

4 91,265 90,954 91,110

5 92,318 91,914 92,116

6 91,762 91,39 91,576

7 91,507 90,063 90,785


Desviación

estándar (°)

0,432

Varianza 0,187





Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio

8 93,611 93,24 93,426

9 91,569 92,637 92,103

~ 73 ~

10 93,013 93,574 93,294

11 92,936 92,454 92,695

12 93,576 92,621 93,099

13 93,252 92,42 92,836

14 93,053 93,066 93,060


Desviación

estándar (°)

0,442

Varianza 0,195





Contacto

Izquierdo (°)

Ángulo de

Contacto Derecho

(°)

Ángulo de

Contacto

Promedio

15 89,409 89,012 89,211

16 88,986 88,963 88,975

17 89,076 90,204 89,640

18 89,063 88,919 88,991

19 88,831 89,157 88,994

20 88,781 90,433 89,607

21 89,045 88,238 88,642


Desviación

estándar (°)

0,363

Varianza 0,132

~ 74 ~

A continuación las tablas 4.16 presenta los valores del ángulo de contacto

promedio entre la interfase vidrio silanizado y agua bidestilada de las 7 repeticiones y

de los 3 tratamientos diferentes (6h -7h - 8h), para proceder a realizar el ANOVA del

DCA.

Tabla 4. 16. Ángulo de Contacto de agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados en

tres tratamientos diferentes.

Tiempo de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano (h)

6h 7h 8h

91,686 93,426 89,211

91,367 92,103 88,975

91,222 93,294 89,640

91,110 92,695 88,991

92,116 93,099 88,994

91,576 92,836 89,607

90,785 93,060 88,642

Promedio (°) 91,409 92,930 89,151

Desviación

estándar (°)

0,432 0,442 0,363

Varianza 0,187 0,195 0,132

~ 75 ~

Debido a que el objetivo de análisis de varianza en el DCA es probar la hipótesis

de la igualdad de los tratamientos con respecto a la media de la correspondiente variable

de repuesta, es decir, si las media de los 3 tiempos de exposición del (7-octen-1-il)

trimetoxisilano son iguales mediante los datos obtenidos del ángulo de contacto, para

esto se planteó las siguientes hipótesis.

𝑯𝒐: 𝝁𝟏 = 𝝁𝟐 = 𝝁𝟑

𝑯𝒂: 𝝁𝟏 ≠ 𝝁𝟐 ≠ 𝝁𝟑

Donde

𝜇1 = Media del tratamiento a 6h



La cual se puede escribir en forma equivalente como:

𝑯𝒐: 𝝉𝟏 = 𝝉𝟐 = 𝝉𝟑 = 𝟎

𝑯𝒂: 𝝉𝟏 ≠ 𝟎; 𝝉𝟐 ≠ 𝟎; 𝝉𝟑 ≠ 𝟎

Donde 𝝉𝟏, 𝝉𝟐, 𝝉𝟑 es el efecto del tratamiento (tiempo de exposición del (7-octen-1-

il) trimetoxisilano) sobre la variable respuesta (ángulo de contacto). Si se acepta la Ho,

se confirma que los efectos sobre la respuesta de los tratamientos son estadísticamente

nulos, y en caso de rechazar se determina que al menos un efecto es diferente de cero.

Para ello se representó las medias y efectos de los tratamientos que están dados por

𝝉𝒊 = 𝝁𝒊 − 𝝁, en el siguiente gráfico característico del DCA (figura 4.3). Donde 𝝁𝒊 es la

media del tratamiento y 𝝁 es la media global.

~ 76 ~

Figura 4. 3. Representación de las medias y de los efectos de los tratamientos en el

DCA, indicando que 𝝉𝟏 = 𝟎, 𝟐𝟒𝟓; 𝝉𝟐 = 𝟏, 𝟕𝟔𝟕; 𝝉𝟑 = −𝟐, 𝟎𝟏𝟐. Rivera, 2016.

Mediante la figura anterior se determina que se rechaza la Ho, ya que se demuestra

que los tratamientos no son estadísticamente nulos, es decir, los efectos de los

tratamiento son diferentes a cero. Para entender de una mejor manera si los tratamientos

son diferentes entre sí se realizó un ANOVA de DCA.

Tabla 4. 17. ANOVA del DCA de los tiempos de exposición del (7-octen-1-il)

trimetoxisilano para la formación de cubreobjetos silanizados.

Fuente de

variabilidad

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Cuadrados

medios

Fo Valor-p

Tratamiento

(tiempo e

exposición del

(7-octen-1-il)

trimetoxisilano

50,613 2,000 25,307 147,768 0,000

Error 3,083 18,000 0,171

Total 53,696 20,000

0,245

1,767

[VALOR DE Y]

-2,500

-2,000

-1,500

-1,000

-0,500

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5

Me

dia

de

án

gulo

de

co

ntc

ato

(°)

Tiempo de exposición del


Efecto del tiempo de exposición (7-octen-1-il) trimetoxisilano

sobre el ángulo de contacto

Series1

~ 77 ~

Como se muestra el análisis de varianza del cuadro anterior, el valor-p =0,000 es

menor que la significancia prefijada de 𝛼 = 0,05, por lo tanto se rechaza la Ho y se

acepta que al menos un de los tiempos de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano

actúa de diferente manera en el proceso de silanización de cubreobjetos o superficies

hidrofóbicas. Además en la tabla 14 se observa que la variación total en 21 datos de

experimentación fue de 53,696, de la cual 50,613 se deben a los tiempos de exposición

del (7-octen-1-il) trimetoxisilano y 3,083 corresponde al error, el mismo que al ser

ponderado por los grados de libertad es de 0,171. Determinando de esta manera que el

valor de Fo =147,768 es muy alto lo que indica que las diferencias observadas por los

diferentes tiempos de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano son significativas y

que no se debe a pequeñas variaciones muéstrales de factores que no se pueden

determinar directamente.

Una vez que se concluyó que se rechaza la Ho y que si al menos un tiempo de

exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano actúa de diferente manera en la formación

de superficies hidrofóbicas, se determinó cuales tiempos son diferentes entre sí

mediante el método de la diferencia mínima significativa LSD de las pruebas de rangos

múltiples. Para ellos se probó la igualdad de todos los posibles pares de medias con las

hipótesis:

𝐻𝑜: 𝜇1 = 𝜇2; 𝜇1 = 𝜇3; 𝜇2 = 𝜇3

𝐻𝑎: 𝜇1 ≠ 𝜇2; 𝜇1 ≠ 𝜇3; 𝜇2 ≠ 𝜇3

Cálculo del valor del LSD

𝐿𝑆𝐷 = 𝑡𝑎2

.𝑁−𝐾 √𝐶𝑀𝐸 {

1

𝑛𝑖+

1

𝑛𝑗}

Donde el valor del 𝒕𝒂

𝟐.𝑵−𝑲 es obtenido en la tabas de distribución T de Student con N-k,

para nuestro caso es 1,734 con un α =0,05 (Anexo 7).

𝐿𝑆𝐷 = 1,734 √0,171 {1

7+

1

7}

~ 78 ~

𝑳𝑺𝑫 = 𝟎, 𝟑𝟖𝟑

El estadístico de pruebas para cada una de las hipótesis dadas es la correspondiente

diferencia en valor absoluto entre sus medias muéstrales del ángulo de contacto (θ)

|𝜃1 − 𝜃2

|.

Tabla 4. 18. Aplicación de la prueba LSD para los diferentes tiempos de exposición del

(7-octen-1-il) trimetoxisilano.

Diferencia poblacional Diferencia muestral en valor

absoluto

Decisión.

𝝁𝟏 = 𝝁𝟐 *1,521 > 0,383 significativa

𝝁𝟏 = 𝝁𝟑 *2,258 > 0,383 significativa

𝝁𝟐 = 𝝁𝟑 *3,779 > 0,383 significativa

Como todos los valores de las diferencias de medias muestrales son mayores al

valor del LSD se determina que todos los tratamientos son diferentes, es decir, que

todos los tiempos de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano si influyen en la

producción de superficies hidrofóbicas de cubreobjetos silanizados. Rechazando la

hipótesis Ho y aceptando la HI planteada en esta investigación.

Por lo tanto se determinó que los mejores tiempos de exposición del (7-octen-1-il)

trimetoxisilano para producir superficies hidrofóbicas en cubreobjetos silanizados son

los tiempos de 6 horas y 7 horas, ya que presenta los valores más altos del ángulos de

contacto formado en la interfase vidrio silanizado-agua bidestilada como se puede

observar en la tabla 4,16. Debido a que los cubreobjetos silanizados producidos en ésta

investigación tienen la funcionalidad de peinado molecular del ADN, se realizó un

comparación entre los ángulos de contacto formados a tiempos de 6h y 7h con

cubreobjetos silanizados importados desde Francia que ya tienen aplicación en el área

bioquímica como es el peinado molecular.

~ 79 ~

Tabla 4. 19. Valores de ángulos de contacto en los mejores tiempos de exposición del

(7-octen-1-il) trimetoxisilano, cubreobjetos silanizados de Francia y Cubreobjetos sin

tratamiento.

Cubreobjetos

tratados a 6h con

(7-octen-1-il)

trimetoxisilano

Cubreobjetos

tratados a 7h con

(7-octen-1-il)

trimetoxisilano

Cubreobjetos

silanizados de

Francia

Cubreobjetos sin

ningún tratamiento.

91,409° 92,930° 93,031° 54,930°

Mediante los valores de la tabla 4.19 podemos observar que la metodología que se

aplicó es muy buena ya que tanto los ángulos de tratamiento de 6h y 7h son muy altos a

comparación de un cubreobjetos normal o que no ha expuesto ningún tratamiento. Otra

observación es que el tratamiento de 7h adquiere un ángulo de contacto (92,930°) que se

acerca al valor del ángulo de contacto (93,031°) de los cubreobjetos silanizados en el

país de Francia (tomado como referencia). Mediante ésta observación se puede

determinar que la mejor metodología para formar cumbreobejtos silanizados con

funcionalidad para peinado molecular es la que se trata a 7h con (7-octen-1-il)

trimetoxisilano, sobre superficies totalmente limpia y posterior tratamiento de

eliminación de excesos de reactivo.

~ 80 ~

5. CAPITULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1. Conclusiones.

Se concluye que se produjo superficies con buenas capas hidrofóbicas con (7-

octen-1-il) trimetoxisilano/ n-heptano, tras una minuciosa metodología, las

mismas que fueron comprobadas mediante la comparación de ángulos de

contacto con superficies silanizadas tomadas como referencia (Francia),

determinando así que las características de los cubreobjetos tratados en Ecuador

y en Francia son similares. Por ésta razón se confirma que los cubreobjetos

tratados en esta investigación tienen aplicaciones para el desarrollo del peinado

molecular de ADN.

Se creó un protocolo para la eliminación de residuos orgánicos de la superficies

de vidrio, mediante la construcción de una cámara UV/Ozono, la cual está

provista de tres focos de luz UV: un foco que presenta una radiación de luz UV

de 245nm (15w) y los otros dos focos que tiene una radiación de 180nm (8w).

La combinación de estas dos radiaciones y la entrada de oxígeno industrial

dentro de una caja de vidrio hermética, permite la formación y destrucción del

ozono, dentro del mismo proceso se forma el radical oxígeno el cual es una

agente oxidante muy fuerte eliminando de esta manera a la materia orgánica en

forma de CO2 y dejando a los grupos OH de la estructura del vidrio activados.

Se estructuró una metodología sencilla para producir superficies de vidrio

silanizadas con características hidrofóbicas y a bajos costos. Mediante los

análisis estadísticos se determinó que la mejor metodología a seguir será

mediante una reacción de 7 horas con (7-octen-1-il) trimetoxisilano una vez que

el vidrio presente los grupos OH activos y tras un posterior tratamiento de

eliminación de excesos de reactivo mediante la acción del ultrasonido en

heptano y cloroformo.

~ 81 ~

Se concluye que las superficies hidrofóbicas en la producción de cubreobjetos

silanizados para peinado molecular de ADN sí depende del tiempo de

exposición (7-octen-1-il) trimetoxisilano ya que mediante la comprobación del

ángulo de contacto formado en la interfase vidrio silanizado - agua bidestilada,

medido en un estereoscopio modificado es mayor a 90° cuando se trabajó a 6 y

7 horas, es decir, que se observa claramente que la superficies es hidrofóbica o

que repele a soluciones acuosas al tener fuerzas adhesivas y cohesivas que se

encuentren en equilibrio.

El software IMAGEJ siendo un programa que se los puede descargar libremente,

presentó aplicaciones de forma eficiente para le medición de ángulos de contacto

mediante la herramienta Angle Tool en la presente investigación, que en

conjunto con todo el equipo que se encuentra en el Laboratorio de Coloides la de

Facultad de Ciencias Químicas ha permitido obtener resultados claros, sin

esperar de la utilización de equipos caros y sofisticados.

La obtención se superficies hidrofóbicas con ángulos de contacto mayores a 90°,

requiere de superficies de vidrio completamente limpias. Se comprobó que una

mejor limpieza se da cuando la cámara UV/ozono presenta dos diferentes

longitudes de onda una de 254nm y el otra de 180nm, ya que la combinación del

oxígeno industrial y las dos longitudes de onda, crean el medio de reacción

adecuado para eliminar residuos orgánicos. En la construcción de la cámara

UV/Ozono se utilizó focos de 254 y 180nm muy cercanas a las recomendadas en

el marco teórico (253,7 y 184,9nm). Gracias a los buenos resultados obtenidos

se determinó que esta variación de longitud de onda no influye en la

metodología propuesta.

5.2. Recomendaciones.

Se recomienda probar la técnica de peinado molecular con los cubreobjetos

tratados a 6h y 7h en estudios posteriores, ya que en los dos casos presentan

características hidrofóbicas y determinar así si es conveniente utilizar

~ 82 ~

cubreobjetos silanizados a 6h ya que el tiempo es un recurso muy importante

dentro de una producción y de igual manera los costos serán menores.

Para la disminución de costos y para que la producción sea eficaz se recomienda

la construcción de vasos de precipitación o recipientes de vidrios con pequeñas

separaciones internas para ocupar en el momento de la eliminación de materia

inorgánica con etanol y la eliminación de exceso de reactivo en el ultrasonido

con heptano y cloroformo, ya que se los hace uno por uno alargando el tiempo

de producción.

Con respecto a la seguridad todo el tiempo se recomienda trabajar con el equipo

adecuado, es decir, con mandil, gafas de protección, guantes y bajo una campana

de ventilación, ya que se debe tener cuidado al tratar reactivos químicos.

Se recomienda realizar ensayos con las superficies expuestas al medio ambiente

tras la limpieza de la materia orgánica en la cámara UV/Ozono y hacer

reaccionar con el silano después de unos minutos u horas, debido a que en la

presente investigación este paso se lo realizó de inmediato. Ésta observación

ayudará a determinar si éste factor influye en la formación de superficies

hidrofíbicas, ya que los OH del vidrio pueden volver a inactivarse.

~ 83 ~

6. BIBLIOGRAFÍA

1. Attension. (2 de Diciembre de 2010). Dynamic Contac Angle. Recuperado el 11

de Enero de 2016, de Attensión.

2. Bensimon, A. (1994). Alignment and Sensitive Detection of DNA by a Moving

Interface. American Association for the Advancement of Science, 2-3.

doi:10.1126/science.7522347

3. Biohacking. (4 de Mayo de 2011). Piranha solution. Recuperado el 11 de

Noviembre de 2015, de http://forum.diybio.club/viewtopic.php?t=116

4. Calderon, M. (Noviembre de 2013). Tipos de investigación. Recuperado el 18 de

Julio de 2015, de Investigación Científica.

5. Cañete, A., & Fernández, C. (Septiemrbe de 2013). Estudio de la Hidrofobicidad

y Nanotratamientos Superficiales. Universidad Autónoma de Barcelona.

Recuperado el 13 de Noviembre de 2015

6. CIZ-UCE. (2015). Información Institucional. Recuperado el 10 de Octubre de

2015, de Centro Internacional de Zonoosis, Universidad Central del Ecuador.

7. Clarichemo. (22 de Octubre de 2009). Diseño experimental

completamentealeatorizado(DCA):. Recuperado el 10 de Diciembre de 2015, de

https://es.scribd.com/doc/21421877/DCA-y-DBCA

8. Conti, C., & Caburet, S. (2001). Molecular Combing. Molecular Cytogenetics.

Recuperado el 27 de Septiembre de 2015

9. Diaz, C. (2011). Evaluación de propiedades fisicoquímicas de sustratos.

Recuperado el 25 de Octubre de 2015

10. Díaz, P., & Fernández, P. (Agosto de 2007). Métodos paramétricos para la

comparación de dos medias. t de Student. Recuperado el 23 de Marzo de 2016,

de https://www.fisterra.com/mbe/investiga/t_student/t_student.asp

~ 84 ~

11. Gómez, J. (24 de Abril de 2009). Modificación superficial de nanomateriales

mediante técnicas sonoquímicas y de auto-ensamblaje. Recuperado el 11 de

Enero de 2016

12. Guang, C. (2015). Trimetoxisilano CG-102 (CAS 2487-90-3, EINECS 219-637-

2). Recuperado el 15 de Octubre de 2015, de ChenGuang:

http://www.cgsilane.es/trimethoxysilane.html

13. Guard, G. (2015). Angulo de Contacto. Recuperado el 04 de Noviembre de

2015, de BriteGuard® Surface Sealer de Bohle obtiene el certificado TÜV:

http://www.briteguard.com/92.html?&L=9#c1453

14. Gutiérrez, H., & Vaca, R. (2008). Análisis y Diseño de EXperimentos (Tercera

ed.). México: Mc Graw Hill . Recuperado el 26 de Febrero de 2016

15. Harrick. (2015). Benefits of Plasma Cleaning. Recuperado el 13 de Enero de

2016, de Applications Harrick Plasma.

16. Hernández, C. (24 de Marzo de 2006). Enfoque mixto. Recuperado el 10 de

Diciembre de 2015, de Enciclopiedia Virtual.

17. INEM. (11 de Julio de 2000). NORMA INEN 2266 TRANSPORTE,

ALMACENAMIENTO Y MANEJO DE. Recuperado el 05 de Enero de 2016, de

Servicio Ecuatoriano de Normalización.

18. Labit, H. (Diciembre de 2008). A simple and optimized method of producing

silanized surfaces for FISH and replication mapping on combed DNA fibers.

BioTechniques, 650-657. doi:10.2144/000113002

19. Medardo, D. (2008). Aplicacion de diseño estadístico. Recuperado el 10 de

Diciembre de 2015, de Escula politéctinica de Chimborazo.

20. Nazari, & Gurevich, L. (15 de Enero de 2013). Peinar Molecular del ADN:

Métodos y Aplicaciones. Auto-Asamblea y Molecular Electrónica. Recuperado

el 04 de Noviembre de 2015

21. Pérez, M. A. (27 de Marzo de 2013). La nanotecnología superhidrofóbica que

repele cualquier líquido. Recuperado el 04 de Noviembre de 2015, de Ultra-

Ever Dry.

~ 85 ~

22. Roncero, B. (2015). Medida del ángulo de contacto. Recuperado el 12 de Enero

de 2016, de Universitat Politécnica de Catalunya:

http://www.upc.edu/sct/es/equip/778/medida-del-angulo-contacto.html

23. Schwob, E., Renty, C., Coulon, V., & Gostan, C. (2009). Use of DNA Combing

for Studying DNA Replication, Methods in Molecular Biology, DNA

Replication. Springer Science , 673- 675. doi:10.1007/978-1-60327-817-5_36

24. Solano, J. (25 de Septiembre de 2009). TENSIOMETRO DIGITAL PARA

MEDIR ÁNGULOS DE CONTACTO LÍQUIDOSÓLIDO. MEMORIAS DEL

XV CONGRESO INTERNACIONAL ANUAL DE LA SOMIM. Recuperado el 11

de Enero de 2016

25. Stacy, R. (2009). Contact Angle Measurement Technique for Rough Surfaces.

Recuperado el 11 de Enero de 2016, de MICHIGAN TECHNOLOGICAL

UNIVERSITY.

26. Stgo. (13 de Febrero de 2013). NANOTECNOLOGÍA HIDROFÓBICA:

APLICACIONES PRESENTES Y FUTURAS SOBRE MATERIALES.

Recuperado el 20 de noviembre de 2015, de STGO ES UN ESTUDIO DE

ARQUITECTURA Y MULTIMEDIA .

27. Sung, H., & Seung, M. (Marzo de 2014). Standard Operating Procedure, Hood

for O2 Plasma Cleaner & Spincoater. Recuperado el 13 de Enero de 2016

28. Teran, J. (2013). Determinación de ángulos de contacto en interfases sólido-

líquido mediante. Quito. Recuperado el 12 de Enero de 2016

29. Vig, J. (29 de Octubre de 1984). UV /ozone cleaning of surfaces. Journal of

Vacuum Science & Technology A. doi:10.1116/1.573115

30. Wright, H., & Cairns, W. (18 de Noviembre de 2005). DESINFECCION DE

AGUA POR MEDIO DE LUZ ULTRAVIOLETA. 3020 Gore Road.

Recuperado el 16 de Diciembre de 2015

~ 86 ~

7. ANEXOS

7.1. Anexo 1. Metodología de limpieza (pre-silanización)

Eliminación de materia inorgánica.

Cubreobjetos secándose sobre

superficies de plástico

Eliminación de materia orgánica en

cámara UV/Ozono

~ 87 ~

7.2. Anexo 2. Metodología de Silanización de cubreobjetos

En las dos fotos se

observa la formación de

la solución del (7-octen-

1-il) trimetoxisilano

sobre heptano.

Introduciendo los

cubreobjetos a la

solución de silano.

Proceso de silanización a

diferentes tiempos.

~ 88 ~

7.3. Anexo 3. Metodología post-silanización

Sonicación en Heptano y Cloroformo.

~ 89 ~

7.4. Anexo 4. Imágenes de gotas formadas en superficies tratadas a 6h de exposición de


~ 90 ~



~ 91 ~



~ 92 ~

7.7.Anexo 7. Tabla de distribución de T de Student (Díaz & Fernández, 2007)

activaciÓn y producciÓn de superficies …€¦ · para la realización del estudio activación y...

Documents