รายงานฉบบสมบรณ

การยอยสลายฟนอลโดยเชอผสม Methylobacterium sp.NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 ตรงบนวสดเหลอใชปาลมนามน

Phenol Degradation by Mixed Culture of Methylobacterium sp.NP3 and Acinetobacter

sp. PK1 Immobilized on Oil Palm Residues

ดร.อรมาศ สทธนน นางสาววชญา แกวทพย

คณะการจดการสงแวดลอม มหาวทยาลยสงขลานครนทร

ทนพฒนานกวจย ประจาป 2553  

i

รายละเอยดโครงการ ชอโครงการ (ภาษาไทย): การยอยสลายฟนอลโดยเชอผสม Methy lobacter ium sp.NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 ตรงบนวสดเหลอใชปาลมนามน

(ภาษาองกฤษ): Phenol degradation by mixed culture of Methylobacterium sp.NP3 and Acinetobacter sp. PK1 immobilized on oil palm residues

ชอคณะผวจย: หวหนาโครงการวจย : ดร.อรมาศ สทธนน คณะการจดการสงแวดลอม ม.สงขลานครนทร วทยาเขตหาดใหญ ต.คอหงส อ.หาดใหญ จ.สงขลา 90112 โทรศพท: 074-286-829 ผรวมโครงการวจย : นางสาววชญา แกวทพย คณะการจดการสงแวดลอม ม.สงขลานครนทร วทยาเขตหาดใหญ ต.คอหงส อ.หาดใหญ จ.สงขลา 90112 โทรศพท: 074-286-839 ทปรกษาโครงการวจย : ผชวยศาสตราจารย ดร.เอกวล ลอพรอมชย ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย ถนนพญาไท เขตปทมวน แขวงวงใหม กรงเทพฯ 10330 โทรศพท: 02-2185087 ไดรบทนอดหนนการวจยจาก: เงนรายได ม.สงขลานครนทร ประเภท ทนพฒนานกวจย ประจา 2553 เปนจานวนเงน 110,000 บาท ระยะเวลาตลอดโครงการ: 2 ป ตงแต เมษายน พ.ศ. 2553 ถงเดอน เมษายน พ.ศ. 2554

ii

กตตกรรมประกาศ

คณะผวจยขอขอบคณ มหาวทยาลยสงขลานครนทร ทไดจดสรรทนอดหนนงานวจยจากเงนรายได ประจาป 2553 ใหแกคณะผวจย ขอขอบพระคณ ผศ.ดร.เอกวล ลอพรอมชย ทชวยอนเคราะหเชอแบคทเรยสาหรบการทดลอง ตลอดจนการใหคาปรกษา และคาแนะนาในการแกไขปญหาจนทาใหงานวจยนสาเรจลลวงไปดวยด อกทงนางสาวปยะมาศ คงแขม สาหรบความชวยเหลอเรองเทคนคการเลยงเชอแบคทเรย ขอขอบคณบรษทลาภทวปาลม จากด และบรษทนามนพชบรสทธ จากด ทอานวยความสะดวกในการเกบตวอยางนาเสย และวสดเศษเหลอปาลมนามน นอกจากนนขอขอบคณนกวทยาศาสตร คณะการจดการสงแวดลอม ทใหคาแนะนาในการใชเครองมอ และอปกรณวทยาศาสตรในหองปฏบตการดวยดเสมอมา และหนวยวจยเทคโนโลยชวภาพสงแวดลอม คณะการจดการสงแวดลอม ทอานวยความสะดวกในการใชพนทสาหรบทางานวจยน คณะผวจย

iii

บทคดยอ

งานวจยนมงเนนพฒนาวธการตรงเชอแบคทเรยผสมระหวาง Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobactersp. PK1 เพอกาจดฟนอลในอาหารเลยงเชอเหลว carbon free mineral medium (CFMM) และในนาทงโรงงานสกดนามนปาลม โดยเลอกใชวสดเศษเหลอจากกระบวนการสกดนามนปาลม ไดแก ทะลายเปลา (Empty fruit bunches: EFB) และเสนใยปาลมนามน (Pericarp fiber: PF) มาใชเปนวสดตรงเซลล จากผลการศกษาการสงเคราะห exopolysaccharide (EPS) พบวาระยะเวลาทเหมาะสมในการตรงเซลลบน EFB และ PF คอ 6 และ 8 วน ตามลาดบ เมอเปรยบเทยบระหวางวสดตรงเซลลทง 2 ชนด พบวาเซลลตรงบน EFB และ PF สามารถลดปรมาณฟนอลทความเขมขน 30 มลลกรมตอลตรในอาหารเลยงเชอเหลวไดใกลเคยงกนคอ 98% ภายในเวลา 24 ชวโมง อยางไรกตามเซลลตรงบน EFB มอตราการยอยสลายฟนอลสงกวา เนองจากวสดมความเปนรพรนสง เซลลเกาะตดไดด ลดขอจากดในการแพรผานของสาร และดดซบฟนอลนอยจงเลอกเซลลตรงบน EFB มาทดสอบการกาจดฟนอลทความเขมขนในชวง 10 -5,000 มลลกรมตอลตร พบวาทความเขมขนตากวา 30 มลลกรมตอลตร เซลลอสระบาบดฟนอลไดสงกวาเซลลตรงเลกนอย และทระดบความเขมขนตงแต 30 มลลกรมตอลตรขนไปเซลลตรงสามารถกาจดฟนอลไดสงกวาเซลลอสระ จากผลการนาเซลลตรงมากาจดฟนอลในนาทงโรงงานสกดนามนปาลมทมฟนอลปนเปอนประมาณ 30 มลลกรมตอลตร พบวาเซลลตรงทผานการกระตนดวยฟนอลและการปรบตวในนาทงทถกเจอจางสามารถกาจดฟนอลไดสงสด 72% และสามารถลดสในนาทงไดประมาณ 25% ในขณะทเซลลตรงทไมผานวธการดงกลาวกาจดฟนอลไดเพยง 35% ภายในเวลา 7 นอกจากนเซลลตรงบน EFB สามารถนากลบมาใชซาไดอยางนอย 10 ครง และเกบไวไดนาน 4 สปดาห ทอณหภม 4oC โดยมประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลเทากบเซลลตรงทเพงเตรยมใหม

iv

ABSTRACT

This research aims to develop an immobilized mixed of Methylobacterium sp. NP3 and Acinetobacter sp. PK on oil palm residues for phenol degradation in CFMM liquid medium and palm oil mill effluent (POME). The oil palm residues such as empty fruit bunch (EFB) and pericarp fiber (PF) were selected as immobilizing materials in this study. The results showed that the optimum incubation period for bacterial immobilization on EFB and PF were 6 and 8 days, respectively. Comparing between these two immobilized bacteria, the phenol removal efficiencies were almost similar in which bacteria immobilized on EFB and PF were able to remove 98% of 30 mg/L phenol in liquid medium after 24 hr incubation. However, the bacteria immobilized on EFB provided higher phenol degradation rate and was selected as supporting material for further experiments, since its high porous structure could promote the attachment of bacteria as well as reduce mass transfer limitations and phenol adsorption on material. It was found that at lower phenol concentration than 30 mg/L, immobilized bacteria had lower degradation ability than those of suspended cells. Meanwhile the degradation ability of immobilized bacteria was greater at 30 mg/L or higher concentrations. The immobilized bacteria were later tested with POME contaminated with 30 mg/L phenols. Approximately 72% of phenols in POME was removed and 25% decolorization was obtained after immobilized bacteria were activated in CFMM containing phenol and acclimated in diluted POME, whereas non-activated and non-acclimated immobilized cells had lower removal efficiency of 35% after 7 days incubation. Moreover, the immobilized bacteria could be repeatedly used at least 10 times both in CFMM and POME, and stored at 4 oC for 4 weeks with the comparable phenol removal efficiency comparing to the freshly prepared inoculums.

v

สารบญ หนา

รายละเอยดโครงการ i กตตกรรมประกาศ ii บทคดยอ iii สารบญ v สารบญตาราง vii สารบญรป viii 1. บทนา 1 2. วตถประสงค 2 3. ขอบเขตการวจย 2 4. การตรวจเอกสาร และงานวจยทเกยวของ 4.1 แหลงกาเนดฟนอล 2 4.2 คณสมบตทางกายภาพ-เคม และความเปนพษของฟนอล 4 4.3 อตสาหกรรมสกดนามนปาลม 5 4.4 กระบวนการยอยสลายทางชวภาพของฟนอล 8 4.5 แบคทเรยทสามารถยอยสลายฟนอล 9 4.6 แบคทเรยสกล Methylobacterium และ Acinetobacter 11 4.7 การตรงเซลล (Cell immobilization) 12 4.8 การใชเซลลตรงในการยอยสลายสารมลพษ 14 4.9 การยอยสลายฟนอลโดยใชเซลลตรง 15 5. วธดาเนนการวจย 5.1 ภาพรวมของการดาเนนงานวจย 18 5.2 นาทงโรงงานสกดนามนปาลม 19 5.3 การเพาะเลยงและเตรยมหวเชอแบคทเรย 19 5.4 ศกษาการผลต extracellular polymeric substance (EPS) ของแบคทเรย 20 5.5 การตรงเซลลแบคทเรย 21 5.6 ทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรง 24 ในอาหารเลยงเชอเหลว 5.7 ศกษาประสทธภาพการยอยสลายฟนอลในนาทงโรงงานสกดนามนปาลม 26 5.8 วธวเคราะห 29

vi

หนา 6. ผลการทดลอง และวจารณผลการทดลอง 6.1 การผลต extracellular polymeric substance (EPS) ของแบคทเรยแตละชนด 31 6.2 การพฒนาเซลลตรงบนวสดเศษเหลอปาลมนามน 33 6.3 ประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงบน EFB 39 ในอาหารเลยงเชอเหลว CFMM

6.4 ประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงบน EFB 46 ในนาทงโรงงานสกดนามนปาลม

7. สรปผลการทดลอง และขอเสนอแนะ 7.1 สรปผลการทดลอง 53 7.2 ขอเสนอแนะ 55 8. บรรณานกรม 56 9. ภาคผนวก 66

vii

สารบญตาราง ตารางท หนา ตารางท 1 ความเขมขนของฟนอลในนาเสยจากอตสาหกรรมตาง ๆ 3 ตารางท 2 คณสมบตทางกายภาพ-เคมของฟนอล 4 ตารางท 3 คณลกษณะนาทงโรงงานสกดนามนปาลม 7 ตารางท 4 ปรมาณสารอาหารโดยเฉลยในวสดเศษเหลอปาลมนามน 8 ตารางท 5 จลนทรยทสามารถยอยสลายฟนอล 10 ตารางท 6 การยอยสลายสารมลพษโดยแบคทเรยสกล Methylobacterium 11 ตารางท 7 การยอยสลายสารมลพษโดยแบคทเรยสกล Acinetobacter 12 ตารางท 8 วธวเคราะหคณลกษณะของวสด 21 ตารางท 9 การวเคราะหลกษณะสมบตของนาทงโรงงานสกดนามนปาลม 29 ตารางท 10 คณสมบตของวสดเศษเหลอปาลมนามนทใชเปนวสดตรงเซลล 35 ตารางท 11 ประสทธภาพการตรงเซลลบน EFB และ PF 37 ทระยะเวลาการตรงเซลล 6 และ 8 วน ตามลาดบ ตารางท 12 อตราการยอยสลายจาเพาะของฟนอล ทความเขมขนตาง ๆ 44 ตารางท 13 องคประกอบของนาทงโรงงานสกดนามนปาลมกอน 49

และหลงการบาบดดวยเซลลตรงบน EFB ทผานการกระตนดวยฟนอล ตารางท 14 ปรมาณฟนอลทลดลง (%)โดยใชเซลลตรงดวยวธตาง ๆ 51

viii

สารบญรป รปท หนา รปท 1 กระบวนการสกดนามนปาลม 6 รปท 2 ทะลายเปลาปาลมนามน (a) เสนใยปาลมนามน (b) 7 รปท 3 วถการยอยสลายฟนอล (a) วถออโท (Ortho-Pathway) (b) วถเมทา (Meta-Pathway) 9 รปท 4 วธการตรงเซลล 14 รปท 5 ลกษณะบอบาบดนาเสย (a) และลกษณะนาทงโรงงานสกดนามนปาลม (b) 19 รปท 6 แบคทเรย Methylobacteriumsp. NP3 (a) และ Acinetobactersp. PK1 (b) 20

ในอาหารเลยงเชอเหลว CFMM รปท 7 วสดเศษเหลอปาลมนามน (a) ทะลายปาลมนามน (b) เสนใยปาลมนามน 22 รปท 8 ทดสอบการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงในขวดแกวฝาเกลยวแลวบมตวอยาง 25 ทความเรวรอบ 130 รอบตอนาท ทอณหภมหอง รปท 9 เปอรเซนตการลดลงของส Alcian blue ท A606 จากการผลต EPS 32 ของเซลลแบคทเรย Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 เพอเกาะตดบน EFB รปท 10 ลกษณะพนผวของวสดเศษเหลอปาลมนามนสองโดย SEM 34 กาลงขยาย 250x-500x; เสนใยปาลมนามน (a-b) และทะลายปาลมนามน (c-d) รปท 11 เปอรเซนตการลดลงของส Alcian blue ท A606 แสดงการผลต EPS ของเซลลแบคทเรย 36

ระหวางการตรงเซลลบน EFB และ PF เปรยบเทยบกบชดควบคมซงเปนวสดเพยง อยางเดยวไมมเซลล รปท 12 การเกาะตดของเซลลในวสดเศษเหลอปาลมนามนสองโดย SEM 38 กาลงขยาย 3000x-10000x; เสนใยปาลมนามน (a-b) และทะลายปาลมนามน (c-d) รปท 13 ปรมาณฟนอลทเหลอหลงจากถกยอยสลายโดยเซลลตรงบน EFB และ PF 39 เปรยบเทยบกบชดควบคม (วสดตรงทไมมเซลล) ใชความเขมขนฟนอล เรมตน 30 มลลกรมตอลตร

ix

สารบญรป (ตอ) รปท หนา รปท 14 ประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของสดสวนเซลลตรงบน EFB 40 ตออาหารเลยงเชอเหลว CFMM 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) โดยมเขมขนฟนอล 30 มลลกรมตอลตร รปท 15 ปรมาณฟนอลทเหลอหลงจากถกยอยสลายโดยเซลลตรงบน EFB 42 เปรยบเทยบกบเซลลอสระ (free cells) โดยทดลองทความเขมขนฟนอล 10 และ 30 มลลกรมตอลตร ทเวลา 24 ชวโมง ความเขมขนฟนอล 50 มลลกรมตอลตร ทเวลา 72 ชวโมง ความเขมขนฟนอล 100 มลลกรมตอลตรทเวลา 96 ชวโมง และความเขมขนฟนอล 500 และ 5,000 มลลกรมตอลตร ทเวลา 120 ชวโมง รปท 16 คาคงทอตราการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงบน EFB 43 และเซลลอสระทฟนอลความเขมขนตางๆ รปท 17 ปรมาณฟนอลทถกยอยสลายโดยเซลลตรงบน EFB 45

หลงจากผานการใชงานแลว 10 ครงในอาหารเลยงเชอ CFMM ทเตมฟนอล รปท 18 ลกษณะการเปลยนแปลงของพนผว EFB และเซลลทถกตรง วเคราะหดวยเทคนค 46 SEM ทกาลงขยาย 10000x-15000x; กอนการยอยสลายฟนอล (a) และหลงการนากลบ

มาใชยอยสลายฟนอลซาจานวน 5 ครง (b) รปท 19 ประสทธภาพการยอยสลายฟนอลในนาทงโรงงานสกดนามนปาลม 47 ของเซลลตรงบน EFB โดยการแปรผนปรมาณของเซลลตรงทสดสวนตางๆ รปท 20 ปรมาณฟนอลทถกยอยสลายโดยเซลลตรงบน EFB 53 ทผานการใชซาจานวน 10 ครง ในนาทงโรงงานสกดนามนปาลม รปท ข.1 คาคงทอตราการยอยฟนอลของเซลลตรงบน EFB 69 ทความเขมขนฟนอล 5,000 มลลกรมตอลตร

1

1. บทนา ฟนอลเปนสารเคมทนามาใชกนอยางแพรหลายในอตสาหกรรมหลายชนด เชน ในอตสาหกรรมการผลตยารกษาโรค อตสาหกรรมสกดนามนมะกอก อตสาหกรรมผลตเรซน อตสาหกรรมกระดาษ ฟอกเยอกระดาษ อตสาหกรรมฟอกหนง และอตสาหกรรมปโตรเลยม (Leitao et al., 2007) ฟนอลเปนสารทมความเปนพษตอมนษยและสงมชวตในระบบนเวศน แมในปรมาณความเขมขนเพยงเลกนอย (Van-Schie and Young, 2000; Ahmaruzzaman, 2008) ฟนอลเปนสารพษชนดหนงทถกกาหนดอยใน priority pollutants ของ USEPA (U.S. Environmental Protection Agency) โดย USEPA ไดกาหนดคามาตรฐานคณภาพนาทงจากอตสาหกรรมใหมปรมาณฟนอลสงสดไมเกน 0.1 มลลกรมตอลตร นอกจากอตสาหกรรมดงกลาวขางตน ยงพบปญหาการปนเปอนของฟนอลในนาทงจากโรงงานสกดนามนปาลม ซงเปนอตสาหกรรมหลกทสาคญในภาคใต โดยฟนอลเปนสารประกอบอยในผลของปาลมนามน เมอผานกระบวนการนงฆาเชอในการสกดนามนปาลมแบบใชนาหรอแบบมาตรฐานฟนอลจงถกสกดออกมาปนเปอนในนาเสย นอกจากนฟนอลยงเปนสารตวกลางทเกดจากการยอยสลายลกนนผานกระบวนการ wet oxidation (Kongjan et al., 2010) จากการศกษาทผานมาพบการปนเปอนของสารประกอบฟนอลในนาทงจากอตสาหกรรมสกดนามนปาลมในระดบความเขมขนแตกตางกนตงแต 5 ถง 1,200 มลลกรมตอลตร (ธรรมศกด ศรสขใส, 2547; Alam et al., 2009; Cordova-Rosa et al., 2009) ซงความเขมขนของสารประกอบฟนอลทพบมปรมาณสงกวาคามาตรฐานคณภาพนาทงอตสาหกรรม ตามประกาศกระทรวงวทยาศาสตรเทคโนโลยและสงแวดลอม ฉบบท 3 (พ.ศ.2539) กาหนดไวไมเกน 1 มลลกรมตอลตร อกทงอตสาหกรรมสกดนามนปาลมยงมการปลอยของเสยปรมาณมากในรปของวสดเศษเหลอทเกดจากกระบวนการสกดนามน เชน ทะลายปาลมเปลา (Empty fruit bunches: EFB) เสนใยปาลมนามน (Pericarp fiber: PF) ดงนนจงมความจาเปนในการพฒนาวธการบาบดฟนอลออกจากนาทงพรอมทงศกษาทางเลอกในการใชประโยชนจากวสดเศษเหลอของโรงงานสกดนามนปาลม วธการบาบดฟนอลทางชวภาพนบเปนวธทมประสทธภาพสามารถยอยสลายสารมลพษไดอยางสมบรณ ประหยด และเปนมตรตอสงแวดลอม (Banerjee et al., 2001) เมอเปรยบเทยบกบวธการบาบดทางกายภาพและเคม อยางไรกตามจากรายงานทผานมาพบวาจลนทรยอสระ (Suspended cells) สามารถทนตอความเขมขนของฟนอล หรอสารมลพษอน ๆ ทปนเปอนในนาเสยไดทความเขมขนตา (Ruiz-Ordaz et al., 2001) จงทาใหประสทธภาพในการยอยสลายสารมลพษลดลง งานวจยนจงสนใจนาเซลลตรงมาใชในการบาบดฟนอลทปนเปอนในนาเสย เนองจากเซลลตรงมความทนทานตอความเขมขนของสารพษทปนเปอนในนาเสย และมอตราการอยรอดสงแมในสภาวะแวดลอมทไมเหมาะสม (Obuekwe et al., 2001) ทงนเลอกใชการตรงเซลลแบคทเรยบนวสดเศษเหลอปาลมนามน ไดแก EFB และ PF ซงเปนทางเลอกหนงในการนาของเสยมาใชประโยชนและยงเปนการกาจดของเสยอกทางหนงดวย นอกจากนการนาวสดเศษเหลอจากอตสาหกรรมสกดนาปาลมมาใชเปนวสดตรง ยงเปนการลดคาใชจายในการสงซอสารเคม หรอการสงเคราะหวสดตรงทมราคาแพง และลดความเสยงจากความเปนพษของสารเคมทใชในการสงเคราะหวสดตรง รวมทงยงสามารถนาเซลลตรงกลบมาใชซาได ซงชวยลด

2

ระยะเวลา และคาใชจายในการเตรยมหวเชอใหม เพอเปนแนวทางในการศกษาพฒนาเทคโนโลยทเหมาะสม มประสทธภาพ งาย ราคาถก และสามารถนาไปประยกตใชในการบาบดสารฟนอลออกจากนาเสยและนาทงจากภาคอตสาหกรรมตอไป 2. วตถประสงคของงานวจย 1. เพอศกษาวธการตรงเชอผสม Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 บนวสดเศษเหลอปาลมนามน 2. เพอศกษาประสทธภาพของเชอผสม Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 ทตรงบนวสดเศษเหลอปาลมนามนในการยอยสลายฟนอลในอาหารเลยงเชอเหลว และนาทงจากโรงงานสกดนามนปาลม 3. ขอบเขตการวจย งานวจยนศกษาวธการตรงเซลลแบคทเรย ซงใชแบคทเรยเชอผสม Methylobacterium sp. NP3และ Acinetobacter sp. PK1 โดยตรงบนวสดเศษเหลอปาลมนามน 2 ชนด ไดแก ทะลายปาลมนามนและเสนใยปาลมนามน ศกษาลกษณะพนผวของวสดและการเกาะตดของจลนทรยในวสดตรงดวยกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด (Scanning Electron Microscope : SEM) รวมทงศกษาระยะเวลาทเหมาะสมในเกาะตดของเซลลบนวสดตรง ดวยการวเคราะหการผลต exopolysaccharide ของแบคทเรยศกษาประสทธภาพการยอยสลายฟนอลในอาหารเลยงเชอเหลว เพอคดเลอกวสดตรงเซลลทสามารถยอยสลายฟนอลไดดทสด นาเซลลตรงบนวสดทคดเลอกไดไปศกษาผลของความเขมขนของฟนอลตอประสทธภาพการยอยสลายฟนอล รวมทงศกษาประสทธภาพของเซลลตรงในการยอยสลายฟนอลในนาทงจากโรงงานสกดนามนปาลม โดยศกษาผลของการกระตนเซลลตรงดวยฟนอลและการปรบตวของเซลลตรงในนาทงทเจอจางกอนนาไปใชงาน และการนาเซลลตรงกลบมาใชซา 4. การตรวจเอกสารและงานวจยทเกยวของ 4.1 แหลงกาเนดฟนอล ฟนอล และอนพนธของฟนอล เปนสารมลพษหรอสารเคมอนตรายทพบในนาเสยของอตสาหกรรมหลายประเภท เชน โรงกลนปโตรเลยม โรงงานปโตรเคม โรงงานถานหน โรงงานผลตนามนมะกอก โรงงานผลตถานหน (Aksu, 2005; Yan et al., 2006; Bai et al., 2007) สารกาจดศตรพช อตสาหกรรมผลตยา เยอกระดาษ อตสาหกรรมกระดาษ อตสาหกรรมสเคลอบเงา และอน ๆ (Rao and Viraraghavan, 2002; Aleksieva et al., 2002; Jung et al., 2001; Diez et al., 1999) ซงมกจะมฟนอลปนเปอนในความเขมขนตงแต 1 มลลกรมตอลตร ถงหลายรอยมลลกรมตอลตร (Prieto et al., 2002; Shetty et al., 2007; Nair et al., 2007; Pan and Kurumada, 2008) (ตารางท 1) นอกจากนนยงพบการปนเปอนของฟนอลในนาทงจากอตสาหกรรมสกดนามนปาลมความเขมขน

3

แตกตางกนตงแต 5 ถงมากกวา 1,000 มลลกรมตอลตร (ธรรมศกดศร สขใส, 2547; Alam et al., 2009; Cordova-Rosa et al., 2009) เมอโรงงานอตสาหกรรมปลอยนาทงสสงแวดลอม อาจสงผลกระทบตอมนษย พชและสตว เชนเดยวกนเมอมนษยกนสตวและพชทมฟนอลปนเปอน อาจทาใหเกดอาการคลนไส อาเจยน อมพาตหรออาจเสยชวตจากการลมเหลวของระบบทางเดนหายใจ หรอหวใจหยดเตน ดงนนจงมความจาเปนตองกาจดฟนอลใหตากวาเกณฑมาตรฐานคณภาพนาทงกอนปลอยออกสแหลงนาธรรมชาต ตารางท 1 ความเขมขนของฟนอลในนาเสยจากอตสาหกรรมตาง ๆ

อตสาหกรรม ความเขมขนฟนอล (มลลกรมตอลตร)

อางอง

เยอกระดาษและกระดาษ 268 Sharma and Gupta (2012)

สงทอ 12.3 Kunz et al. (2001)

นามนมะกอก 3000-10,000 Knupp et al. (1996); Robards and Ryan (1998)

ถานหน 4-4780 Parkhurst et al. (1979)

ผลตเรซน 1200->10,000 Patterson (1985); Kavitha and Palanivelu (2004)

กลนนามนปโตรเลยม 33.5 Pfeffer (1979)

สกดนามนปาลม >1000 Alam et al. (2009)

4

4.2 คณสมบตทางกายภาพ-เคม และความเปนพษของฟนอล ฟนอลเปนสารกงของแขงทปราศจากส มกลนฉนเฉพาะตว เมอละลายนาแลวมฤทธเปนกรดออน อาจเรยกวา กรดคารบอลก ฟนอลละลายไดดในเอทานอล ไดเอทลอเทอรและคลอโรฟอรม ซงมคณสมบตทางกายภาพ-เคม ดงตารางท 2 ตารางท 2 คณสมบตทางกายภาพ-เคมของฟนอล

คณสมบต คา

สตรโมเลกล สตรโครงสราง นาหนกโมเลกล (กรมตอโมล) จดเดอด (˚C) จดหลอมเหลว (˚C) ความสามารถในการละลายนา (r.t.) คาการแตกตวของกรด (pKa) ความสามารถในการตดไฟในอากาศ (vol%) จดวาบไฟ (˚C) อณหภมทสารลกตดไฟไดเอง(˚C)

C6H5OH

94.11 40.9 181.75 9.3 g phenol/100 ml H2O 9.89 1.7 (ตาสด) 8.6 (สงสด) 79 (closed cup) 715

ทมา: Busca et al. (2008) ฟนอลมความเปนพษตอสงมชวตทกชนดและตอระบบนเวศน ในระดบความเขมขนฟนอลตาหรอเจอจางมากๆ จะมผลยบยงการเจรญเตบโตของแบคทเรย (Shetty et al., 2007) และในระดบความเขมขนทเพมขนรอยละ 2-5 จะมฤทธในการฆาเชอจลนทรยในทนท ถาความเขมขนฟนอลเพมสงขน จะทาใหเซลลจลนทรยแตก โปรตนในเซลลตกตะกอน ยบยงการทางานของเอนไซม ทาลายโครงสรางของเซลล ทาใหการผานเขาออกของสารในเซลลผดปกต เปนสาเหตสาคญททาใหเซลลจลนทรยตาย (นงลกษณ สวรรณพนจและคณะ, 2547; Seymour, 2001) สาหรบมนษยเมอฟนอลโดนผวหนงจะถกดดซมไดอยางรวดเรว หากสมผสรางกายจะเกดการกดกรอนเนอเยออยางรนแรง และเมอเขาสรางกายจะมผลตอตบ ไต ปอด และระบบเลอด อาจทาใหถงแกชวตได (Busca et al., 2008) ความเขมขนของฟนอลสงกวา 50 ppb มความเปนพษตอสตว พช และสงมชวตทอยในนา และหากมนษยกลน กนฟนอล 1 กรม

5

ทาใหเสยชวตได (Seetharam and Saville, 2003) และทระดบความเขมขนฟนอลระหวาง 10 และ 240 มลลกรมตอลตร ถาบรโภคฟนอลอยางตอเนองเปนเวลานาน อาจทาใหทองเสย ปสสาวะมสเขม (Barker et al., 1978) ทงนฟนอลยงมผลตอระบบประสาท และอวยวะทสาคญ เชน มาม ตบออน และไต (Manahan, 1994) นอกจากนสารประกอบฟนอลยงสงผลกระทบตอความหลากหลายทางชวภาพของสงมชวตในระบบนเวศน (Gonzalez et al., 1990) 4.3 อตสาหกรรมสกดนามนปาลม อตสาหกรรมการสกดนามนปาลมเปนหนงในอตสาหกรรมทกอใหเกดรายได และการจางงานในภาคใตของประเทศไทย และมความสาคญตอเศรษฐกจของประเทศ ซงมการขยายตวอยางรวดเรวและมการเพาะปลกเพมมากขน จากขอมลการสารวจในป พ.ศ.2551 พบวามพนทปลกปาลมนามนรวมทงประเทศประมาณ 2,834,600 ไร (ศนยวจยปาลมนามนสราษฎรธาน, 2551) และมโรงงานสกดนามนปาลมทงหมดจานวน 66 โรงงาน (กรมสงเสรมสหกรณ, 2555) กระบวนการสกดนามนปาลมสามารถแบงตามการผลตได 2 แบบ คอ 1) การผลตแบบมาตรฐานหรอแบบใชนา และ 2) การผลตแบบไมใชนาหรอแบบแหง ซงกระบวนการทง 2 แบบกอใหเกดวสดเศษเหลอจานวนมาก เชน ทะลายปาลมเปลา (empty fruit bunch) กะลาผลปาลม (palm shell) เสนใยปาลม (pericarp fiber) และกากเนอปาลม (palm kernel cake) (รปท 1) นอกจากนนการสกดนามนปาลมแบบมาตรฐานมการใชนาในการผลตมาก มรายงานวากระบวนการสกดนามนปาลมดบ 1 ตนตองการใชนา 5 – 5.7 ตน และนาทใชในการผลตมากกวารอยละ 50 กลายเปนนาทง (palm oil mill effluent, POME) (Wu et al., 2009) ปรมาณนาทงสวนใหญมาจากขนตอนการอบทะลายปาลมในรปนาทงจากหมอนงฆาเชอ (sterilizer condensate) และนาทงจากเครองดแคนเตอร (decanter effluent) นาทงจากหมอนงฆาเชอมประมาณ 200 ลตรตอ 10 ตนทะลายปาลม (พนสข ประเสรฐสรรพและคณะ, 2533) โดยในนาทงจะประกอบดวย BOD, COD, ของแขงแขวนลอย, นามน และไขมน (oil and grease) ในปรมาณสง (ตารางท 3) และพบวานาเสยจากโรงงานสกดนามนปาลมมความเขมขนของสารอนทรยสง เชน รงควตถพวกแอนโทไซยานน แคโรทน แทนนน สารประกอบพวกเมลานอยดน สารประกอบพวกกม และโพลฟนอล เปนตน (พนสข ประเสรฐสรรพและคณะ, 2544) ซงเปนรงควตถททาใหนาทงมสนาตาลเขมถงนาตาลปนดา ทงนฟนอลและสารทเปนอนพนธของฟนอลเปนสารทพบเปนองคประกอบอยในผลปาลมปรมาณ 0.006 มลลกรมตอลตรตอกรมผลปาลม เมอผานกระบวนการนงฆาเชอผลปาลมทใชความรอนและความดนสง จะเกดการยบยงการทางานของเอนไซม polyphenol oxidase เปนผลใหฟนอลไมถกยอยสลายและปนเปอนออกมากบนาทงจากกระบวนการสกดนามนปาลม (Sundram et al., 2003) นอกจากนฟนอลยงเปนสารตวกลางทเกดจากการยอยสลายลกนนผานกระบวนการ wet oxidation อกดวย (Kongjan et al., 2010)

6

หมายเหต * วสดทนามาใชตรงเซลล รปท 1 กระบวนการสกดนามนปาลม ทมา: ดดแปลงจากพนสข ประเสรฐสรรพ และคณะ (2533)

แยกเสนใย 

*ทะลายเปลา

ปาลมนามน

ทะลายทยงมผลปาลมตดอย 

บอดกไขมน

ทะลายปาลม

อบดวยไอนา

แยกผลปาลมออกจาก

นาทงจากหมอฆาเชอ

นา  นามน 

ผลปาลม

ยอยผล

หบนามนปาลม

*เสนใย 

กากผลปาลม นามนจากสวนเปลอก 

เพาะเหด/

เชอเพลงโรงงาน

เมลด

อบ

เมลดแหง 

เครองสกดแยกนามน

(Decanter) 

นา  สลด นามนปาลมดบ 

บอรวบรวมนาเสย  สวนปาลม

7

ตารางท 3 คณลกษณะนาทงโรงงานสกดนามนปาลม

พารามเตอร คา Temperature (°C) 80-90 pH 4.7 Biochemical Oxygen Demand BOD3; 3days at 30 °C (mgL-1)

25,000

Chemical Oxygen Demand (mgL-1) 50,000 Total Solids (T.S) (mgL-1) 40,500 Total Suspended Solids (T.S.S) (mgL-1) 18,000 Total Volatile Solids (T.V.S ) (mgL-1) 34,000 Oil and Grease (O&G) (mgL-1) 4,000 Ammonia-Nitrate (NH-N)(mgL-1) 35 Total Kjeldahl nitrogen (TKN) (mgL-1) 750 ทมา : Rupani et al. (2010)

สาหรบวสดเศษเหลอในรปของแขง เชน ทะลายเปลา และเสนใยปาลมนามน (รปท 2) มการผลตประมาณ 40×106 ตนตอป โดยมการนาวสดเศษเหลอไปเปนเชอเพลงในหมอนงไอนา (Alam et al., 2007) นอกจากนนยงมการนาไปใชประโยชนในดานอนดวย เชน การเพาะเหด หมกป ย เปนตน ทงนในวสดเศษเหลอปาลมนามนพบปรมาณสารอาหารตางๆ ดงแสดงในตารางท 4

(a) (b) รปท 2 วสดเศษเหลอปาลมนามน (a) ทะลายเปลาปาลมนามน (b) เสนใยปาลมนามน ทมา : ดดแปลงจาก Sridhar et al. (2009)

8

ตารางท 4 ปรมาณสารอาหารโดยเฉลยในวสดเศษเหลอปาลมนามน

วสดเศษเหลอ

Water content (%)

N

P (kg/tdry residue )

K

Mg

EFB 60 8 0.6 24.1 1.8

PF 20 23 0.1 2 0.4

ทมา : Bureau of Industrial Environment Technology, Department of Industrial Works and Ministry of Industry (1997) งานวจยนสนใจนาวสดเศษเหลอปาลมนามนจากกระบวนการสกดนามนปาลม 2 ชนด ไดแก ทะลายปาลมนามน และเสนใยปาลมนามน ใชเปนวสดตรงเซลลแบคทเรย โดยเปนทางเลอกหนงในการนาของเสยมาใชประโยชนและยงเปนการกาจดของเสยอกทางหนงดวย นอกจากนการนาวสดเหลอใชจากอตสาหกรรมสกดนาปาลมมาใชเปนวสดตรง ยงเปนการลดคาใชจายในการสงซอสารเคมเพอการสงเคราะหวสดตรงทมราคาแพง 4.4 กระบวนการยอยสลายทางชวภาพของฟนอล การยอยสลายทางชวภาพของฟนอลโดยจลนทรยสามารถเกดขนไดภายใตสภาวะทมอากาศ (aerobic condition) และไมมอากาศ (anaerobic condition) แตโดยทวไปพบวากระบวนการยอยสลายฟนอลภายใตสภาวะทมอากาศเกดขนไดอยางแพรหลายมากกวา (Melo et al., 2005) ทงนเนองจากฟนอลสามารถยบยงกระบวนการยอยสลายสารมลพษของจลนทรยชนดทไมใชอากาศไดงาย (Grady et al., 1999) ซงกระบวนการยอยสลายฟนอลภายใตสภาวะทมอากาศพบได 2 วถ คอ วถเมทา (meta-pathway) และวถออโท (ortho-pathway) โดยเรมตนจากการเกดปฏกรยาออกซจเนชน (oxygenation) โดยเอนไซมฟนอล ไฮดรอกซเลส (phenol hydroxylase) เปลยนฟนอลใหอยในรปของสารตวกลาง คอ เคตคอล (catechol) จากนนจะเขาสปฏกรยาการแตกวงของเคตคอล (ring cleavage) หากยอยสลายผานวถเมทาไดสารตวกลางคอ 2-ไฮดรอกซมโคนคเอซค (2-hydroxymuconic acid) โดยเอนไซมเคตคอล 1,2 ไดออกซจเนส (1,2-dioxygenase) หรอผานวถออโธไดสารตวกลางเปน ซส-ซสมโคนคเอซด (cis,cis-muconic acid) โดยเอนไซมเคตคอล 2,3 ไดออกซจเนส (2,3 dioxygenase) ดงแสดงในรปท 3 กอนจะเขาสวฏจกร Krebs และเมทาบอลซมทวไปของสงมชวต (Van-Schie และ Yung, 2000) ในการยอยสลายทางชวภาพทสมบรณไดสารประกอบอยางงาย เชน CO2, H2O และสารอนนทรยอนๆ (Nair et al., 2008)

9

(a) (b) รปท 3 วถการยอยสลายฟนอล (a) วถออโท (Ortho-Pathway) (b) วถเมทา (Meta-Pathway) ทมา : Van-Schie และ Yung (2000) 4.5 แบคทเรยทสามารถยอยสลายฟนอล ฟนอลเปนสารพษทยบยงการทางานของจลนทรย โดยเฉพาะในระดบความเขมขนฟนอลสง ๆ ซงมจลนทรยหลายชนดทไวตอสารน อยางไรกตามจลนทรยหลายชนดทมความสามารถในการยอยสลายและมความทนทานตอฟนอล จากรายงานทผานมาพบวาแบคทเรย รา และยสต สามารถยอยสลายฟนอลได ซงจลนทรยเหลานใชฟนอลเปนแหลงคารบอนและพลงงานในการเจรญ ตารางท 5 แสดงตวอยางจลนทรยทสามารถยอยสลายฟนอลไดซงคดแยกจากสงแวดลอม ไดแก จนส Acinetobacter, Candida และ Pseudomonas เปนตน

10

ตารางท 5 จลนทรยทสามารถยอยสลายฟนอล

จลนทรย แหลงทมาของจลนทรย เอกสารอางอง Pseudomonas Putida

Wastewater treatment plant Movahedyan et al. (2009)

Candida parapsilopsis

Industrial chemistry effluent Rigo and Alegre (2004)

ESDSPB1, ESDSPB2 and ESDSPB3

Coke processing wastewater Chakraborty et al. (2010)

Acinetobacter, Kelibsiella, Citrobacter, Pseudomonas and Shigella

Lake Parishan Kafilzadeh et al. (2010)

Streptococcus epidermis

Oil contaminated soil Mohite et al. (2010)

Proteobac teria PH002 East River, New York, N.Y. Van-Schie et al. (1998) Azoarcus CR23 Rain forest, Costa Rica Thauera FL05 Orange grove, Florida RWC-Cr1 and ISC-Tra

Wastewater treatment plant and industrial oil-contaminated soil.

Mailin and Firdausi (2006)

Candida tropicalis and Alcaligenes faecalis

Amazonian rain forest soil Bastos et al. (2000)

Acinetobacter Activated sludge Hao et al. (2002) Rhizosphere of duckweed Yamaga et al. (2010) Wastewater treatment plant at Alexandria, Egypt

Abd-El-Haleem et al. (2002)

11

4.6 แบคทเรยสกล Methylobacterium และ Acinetobacter แบคทเรยสกล Methylobacterium มลกษณะโคโลนเปนสชมพเขม จดเปนแบคทเรยประเภท facultative methylotrophs ทสามารถเจรญเตบโตไดงายและพบในสงแวดลอมโดยทวไป เชน ในดนและเนอเยอพช (Aken et al., 2004; Lidstrom and Chistoserdova, 2002) ทงนพบไดงายบรเวณราก (rhizosphere) และในตนพช (endosphere) ทมความสามารถในการดดซบหรอบาบดสารมลพษ (Dourado et al., 2011) แบคทเรยชนดนสามารถใชสารอนทรยเปนแหลงคารบอนในการเจรญเตบโตไดหลายชนด เชน เมทานอล (methanol ) และเมทลเอมน (methylamine) รวมทง C2, C3 และ C4

(Lidstrom and Chistoserdova, 2002) นอกจากนนมรายงานการนาแบคทเรยชนดนมาใชในการบาบดสารมลพษตางๆ ในสงแวดลอม เชน Cyanide, formamide, formaldehyde และ phenol เปนตน ดงตวอยางแสดงในตารางท 6 ตารางท 6 การยอยสลายสารมลพษโดยแบคทเรยสกล Methylobacterium สายพนธแบคทเรย สารมลพษทยอย

สลาย อางอง

Methylobacterium sp. RXM CCMI 908 Methylobacterium organophilum DSMZ 760 Methylobacterium mesophilicum Sr Methylobacterium sp. MF1 Methylobacterium sp BJ 001 เชอผสมระหวาง Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1

Cyanide และ formamide Methanolic distillation residues Dimethyl isophthalate Formaldehyde Nitro-substituted explosives phenol

Campos et al. (2006) Stepnowski et al.(2004) Li and Gu (2007) Mitsui et al. (2005) Aken et al.(2004) ปยะมาศ คงแขม (2552)

แบคทเรยสกล Acinetobacter พบไดแพรหลายในธรรมชาต เชน ในนา ดน สงมชวตตามธรรมชาต และจากผวหนงมนษย แบคทเรยสกลนมความนาสนใจในการนามาประยกตใชทางดานเทคโนโลยชวภาพและในดานในสงแวดลอม ซงเปนทรจกในการยอยสลายสารมลพษไดหลากหลายชนด เชน biphenyl, chlorinated biphenyl, amino acids (analine), phenol, benzoate, crude oil, acetonitrile, phosphate และ heavy metals (Abdel-El-Haleem, 2003) (ตารางท 7) เนองจากมความสามารถในการใชสารประกอบหลากหลายชนดเปนแหลงคารบอนและพลงงาน เชน ฟนอล (phenol) และเบนโซเอท (benzoate) เปนตน ทาใหเพาะเลยงไดงายในอาหารเหลว (Caposio et al.,

12

2002; Cui et al., 2008) รวมทงมความสามารถในการผลต emulsifying agents ทาใหสารมลพษทละลายนาไดนอย (low solubility) ถกยอยสลายไดงายขน (Marin et al., 1995) ตารางท 7 การยอยสลายสารมลพษโดยแบคทเรยสกล Acinetobacter

สายพนธแบคทเรย สารมลพษทยอยสลาย อางอง Acinetobacter radioresistens USTB-04 Acinetobacter calcoaceticus MM5 Acinetobacter calcoaceticus NCIM 2890 Acinetobacter calcoaceticum A-122 Acinetobacter sp. HY-7 Acinetobacter sp. PD12

Methyl parathion Diesel และ heating Oil Diazo dye direct brown MR P-nitrophenol (PNP) Carbamazepine Phenol

Fang-yao et al. (2007) Marin et al. (1995) Ghodake et al. (2009) Ignatov et al. (1999) Cui et al., (2008) Ying et al. (2007)

จากการศกษาของ Khongkhaem et al.(2011) การเพมประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเชอผสมระหวาง Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 โดยวธตรงเซลลแบบกกขง (entrapment) ในซลกาทสงเคราะหขนใหม พบวาเซลลตรงสามารถยอยสลายฟนอลทความเขมขนเรมตน 5,000 มลลกรมตอลตร ไดถง 80-85 % ในขณะทเซลลอสระสามารถยอยสลายฟนอลทความเขมขนเรมตนนอยกวา 2,500 มลลกรมตอลตร ภายใน 10 วนนอกจากนนยงพบวาเชอผสมระหวาง Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 มประสทธภาพการยอยสลายฟนอลไดเปน 2 เทา เมอเปรยบเทยบกบเชอบรสทธสายพนธเดยวแตละชนด ดงนนในการศกษานจงสนใจใชแบคทเรยเชอผสมระหวาง Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 ในการยอยสลายฟนอล 4.7 การตรงเซลล (Cell immobilization) การบาบดสารมลพษดวยวธการเตมจลนทรยลงไปในพนททมการปนเปอน (bioaugmentation) ถกนามาใชอยางกวางขวางในปจจบน โดยจลนทรยทเตมลงไปอาจเปนจลนทรยทองถนทมในพนทนน (indigenous microorganisms) หรอเรยกอกอยางวาเทคนค autochthonous bioaugmentation หรออาจเปนจลนทรยสายพนธตางถน (exogenous microorganisms) เพอเรงกระบวนการยอยสลายสารมลพษวธการนมขอด คอ สามารถควบคมกระบวนการบาบดสารมลพษ โดยการกาหนดชนดและปรมาณของจลนทรยทมความจาเพาะเจาะจงตอการยอยสลายสารมลพษแตละชนด และมความทนทานตอสารมลพษนนๆ โดยจลนทรยทใชในการยอยสลายสารมลพษสวนใหญคดแยกไดจากสงแวดลอม และม

13

การศกษากจกรรมการยอยสลายสารมลพษในหองปฎบตการแลว (Obuekwe and Al-Muttawa, 2001; Cunningham et al., 2000) ทผานมามรายงานการใชทงเซลลอสระและเซลลตรงในการบาบดสารมลพษ อยางไรกตามพบวาเซลลตรงสามารถทนทานตอความเขมขนของสารมลพษทสงกวาเมอเปรยบเทยบกบเซลลอสระ และสามารถปองกนเซลลจากผลการเปลยนแปลงของ pH และอณหภม ทงนยงสามารถนากลบมาใชซาไดและเกบไวไดเปนเวลานาน ซงชวยลดระยะเวลาและคาใชจายในการเตรยมหวเชอใหม (Aksu and Bulbul, 1999; Kourkoutas et al., 2004) กระบวนการตรงเซลลจลนทรยสามารถแบงเปน 2 ประเภท คอ (1) การเกาะตด/ดดซบของเซลลบนวสดดวยวธธรรมชาต (self-attachment/adsorption immobilization) และ (2) การตรงแบบสงเคราะห (artificial immobilization) เชน การกกขงเซลลในพอลเมอร (entrapment within polymers) การสรางพนธะโควาเลนทระหวางเซลลกบวสดตรง (covalent bonding) เปนตน (Cohen et al., 2001) (รปท 4) การเกาะตด/ดดซบเปนวธการตรงเซลลทงาย โดยใหเซลลดดซบกบวสดทเปนตวตรงดวยแรง Electrostatic interactions, Covalent bond formation หรอ Hydrophobic interactions ซงมแรงดดซบคอนขางออน อาจมการสญเสยเซลลไดงายในระหวางการใชงาน และเมอมการเปลยนแปลงคาความเปนกรด-เบส อณหภม เปนตน (Cheetham et al., 1979) การตรงเซลลโดยใหจลนทรยดดซบหรอยดเกาะกบวสดนน เซลลจะมการสราง biofilm ซงจะเกดการรวมตวกนอยบนผวหนาของวสด เปนสารพอลเมอรทเซลลสรางขนแลวขบออกมาภายนอกเซลลโดยสวนใหญจะเปนสารพวก extracellular polymeric substance หรอ exopolysaccharide (EPS) ซงมองคประกอบ ไดแก คารโบไฮเดรต โปรตน ดเอนเอ และไขมนซงสดสวนจะมความแตกตางกนขนอยกบชนดของจลนทรย และสภาวะแวดลอม (Rosche et al., 2009) โดย biofilm ดงกลาวมสวนชวยใหจลนทรยสามารถยดเกาะกบผวหนาของวสดไดดยงขน สาหรบจลนทรยทมการสราง biofilm มหลายชนด สวนใหญ biofilm จะมลกษณะเปนเสนสาย (filament) มสวนชวยสาคญททาใหเซลลยดเกาะกบวสดไดดยงขน (Davey et al., 1991) อยางไรกตามเทคนคการเกาะตดของเซลลดวยวธธรรมชาตเปนวธทมประสทธภาพ และสามารถขยายขนาดเพมจานวนเซลลตรงไดงายกวาการตรงแบบสงเคราะห นอกจากนนการตรงเซลลแบบกกขงยงมขอจากดเรองการแพรผานของสารไดนอยกวาอกดวย (Lee and Palsson, 1994) ปจจยทสาคญอกประการหนงทตองคานงถงในการตรงเซลลจลนทรย คอ การคดเลอกวสดตรงเซลล ซงตองเปนวสดทมความเปนรพรนสง มพนทผวมากเพอใชในการเกาะตด ไมละลายนา มความแขงแรง ทนตอสภาพแวดลอมทางกายภาพ-เคม การยอยสลายโดยจลนทรย และแรงกระทบกระเทอน เนองจาการตรงเซลลตองทาในภาวะปลอดเชอ จงตองทนตอความรอน ความดนไดสง นอกจากนนวสดทใชไมควรเปนอนตรายตอเซลลและสงแวดลอม ไมดดซบสารพษทปนเปอน และสามารถนากลบมาใชซาได วสดทนามาใชสามารถเตรยมไดงายและมเทคนคการตรงทไมยงยาก ประหยดคาใชจาย มความคงทนในการนาไปใชงาน และเกบรกษาไวไดนาน (Kourkoutas et al., 2004) ทผานมามการนาวสดจากธรรมชาตและวสดทสงเคราะหขนมาใชเปนวสดตรงเซลลไดแก natural zeolite, rice chaff, rubber

14

wood meal, coconut husk meal, ฟางขาว, ใยบวบ หรอวสดทเปนโพลเมอร เชน calcium alginate, polyvinyl alcohol (PVA) หรอวสดสงเคราะห เชน ซลกา เปนตน ซงวสดแตละชนดมขอดขอเสยแตกตางกน มรายงานวาการใชวสดจากธรรมชาตจาพวก organic material มขอด คอปรมาณสารอาหารในวสดอาจชวยสงเสรมการเจรญของเซลลตรง (Santos et al., 2005) วสดทใชไมมความเปนพษตอเซลล วสดสามารถยอยสลายไดตามกลไกทางกายภาพ-เคม ซงชวยลดคาใชจายในการกาจดวสดทมการดดซบสารมลพษอกทางหนง และมราคาไมแพง

รปท 4 วธการตรงเซลล ทมา: Cassidy et al. (1996) 4.8 การใชเซลลตรงในการยอยสลายสารมลพษ จากการศกษาทผานมามการนาเทคนค self-attachment immobilization และวสดจากธรรมชาตมาใชในการตรงเซลลแบคทเรย เชน Obuekwe and Al-Muttawa (2001) พบวาเซลลแบคทเรย Arthrobacter sp. และแบคทเรยแกรมลบ (ยงไมไดจาแนกชนด) ซงคดแยกจากบอนามนในประเทศคเวต ถกตรงบนขเลอย (sawdust), styroform และราขาวสาล (wheat bran) สามารถรกษาประสทธภาพการยอยสลายปโตรเลยมไฮโดรคารบอน หลงจากเกบเซลลตรงไวนาน 6 สปดาหท 45 องศาเซลเซยส และพบวาเซลลมการสราง extracellular structure เรยกวา เสนใย exopolysaccharide เพอใหเซลลเกาะตดบนวสดไดดขน และชวยปองกนเซลลจากสารมลพษ โดยเสนใยดงกลาวสามารถมองเหนภายใตกลอง SEM นอกจากนนจากรายงานของ Pattanasupong et al. (2004) พบวากลมจลนทรยทตรงบนใยบวบ (Loofa sponge) มประสทธภาพสงในการยอยสลายและขจดความเปนพษของยากาจดศตรพช คอ Carbendazim (MBC) และ2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) โดยสารทง

Flocculation  Adsorption to surfaces 

Entrapment in matrix Encapsulation in polymer‐gel

        Cross‐linking of cells 

Covalent bonding to carrier

15

สองชนดสามารถยอยสลายไดอยางสมบรณภายใน 5.5 และ 1.5 วนตามลาดบ พบวาทพเอชอยในชวง 6-9 และอณหภม 15-37 องศาเซลเซยสเซลลตรงมประสทธภาพการยอยสลายสารชนดนไมแตกตางกนอกทง Suttinun et al. (2010) ศกษาวธการยอยสลายสารไตรคลอโรเอธลน (trichloroethylene: TCE) แบบโคเมแทบอลซม (co-metabolism) โดย Rhodococcus sp. L4 ตรงบนวสดจากพชทมนามนหอมระเหย ไดแก เมลดยหรา เปลอกสม และใบตะไคร พบวาเซลลทตรงในเมลดยหรามประสทธภาพในการยดระยะการยอยสลาย TCE ไดดกวาวสดชนดอน และสามารถทนตอ TCE ทความเขมขนสง นอกจากนนยงพบวาเซลลตรงสามารถนากลบมาใชในการยอยสลาย TCE ไดใหม หลงนาไปเลยงในอาหารเลยงเชอ mineral salts นาน 12 ชวโมง และจากรายงานของ Kasamsuk and Khanongnuch (2007) ใชเซลลแบคทเรย Coriolus versicolor RC3 ตรงบนแกลบ (rice chaff) ไมยางพารา (rubber wood meal) กาบมะพราว (coconut husk meal) และฟางขาวสบ (chopped rice straw) ยอยสลายสในนาเสยอตสาหกรรมสงทอ พบวาเซลลตรงบนแกลบมประสทธภาพในการยอยสลายสไดดทสด ซงยอยสลายสได 80% ในเวลา 24 ชวโมง และสามารถนากลบมาใชซาได 2 ครง นอกจากนนมการใช zeolite ตรง Pseudomonas sp. ADP เพอใชยอยสลาย atrazine โดยสามารถยอยสลายสารดงกลาวไดอยางสมบรณภายใน 10 สปดาห ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส (Stelting et al., 2010) 4.9 การยอยสลายฟนอลโดยใชเซลลตรง จากการศกษาทผานมามการบาบดนาเสยทปนเปอนฟนอลโดยใชเซลลตรงบนวสดตาง ๆ เชน การใชโพลยรเทนโฟม (polyurethane foam) ตรง Acinetobacter sp. พบวาเซลลทมการตรงจะสามารถเจรญไดทความเขมขนของฟนอล 1,500 มลลกรม/ลตร และสามารถยอยสลายฟนอลได 19.7 มลลกรม/ลตร/ชวโมง ในขณะทเซลลทไมไดตรงบนโพลยรเทนโฟม (เซลลอสระ) ถกยบยงการเจรญเตบโตทความเขมขนของฟนอล 1,000 มลลกรม/ลตร (Adav et al., 2007) Ying et al. (2007) ใช polyvinyl alcohol (PVA) ตรงเซลล Acinetobacter sp. สายพนธ PD 12 ซงคดแยกเชอจากกากตะกอนเรง (Activated sludge) ของระบบบาบดนาเสยจากโรงงานผลตสารเคม โดยศกษาปจจยทมผลตอการยอยสลายฟนอล ไดแก ความเขมขนของฟนอล พเอช และอณหภม พบวาพเอชทเหมาะสมในการยอยสลายฟนอลคอ 7.2 และเซลลทนตอความเขมขนฟนอลไดสงถง 500 มลลกรม/ลตร การตรงเซลลชวยปองกนแบคทเรยเมอมการเปลยนแปลงอณหภม พเอช และสามารถเกบเซลลทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ไดนาน 50 วน Liu et al. (2009) ทาการตรงเซลล Acinetobacter sp. XA05 และSphingomonas sp. FG03 บน polyvinyl alcohol (PVA) โดยใชเชอทแยกจากกากตะกอนเรง (Activated sludge) พบวาเซลลทไมตรงบน PVA มอตราการยอยสลายฟนอล (phenol degradation rate) 0.95 มลลกรมฟนอล/ชวโมง สวนเซลลทตรงบน PVA มอตราการยอยสลายฟนอล 1.20 มลลกรมฟนอล/ชวโมง และเซลลตรงสามารถทนอณหภมและพเอชไดในชวงกวางทมากกวาเซลลอสระ อณหภมทใชในการทดลองอยในชวง 20-40

16

องศาเซลเซยส ทความเขมขนเรมตนของฟนอล 800 มลลกรม/ลตรโดยเซลลตรงสามารถนากลบมาใชใหมได ซงยงสามารถลดปรมาณฟนอลได 93% หลงจากเกบไว 50 วน แตเซลลอสระจะมอตราการยอยสลายฟนอลลดลง หลงจากทเกบไว 10 วน ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส อยางไรกตามการตรงเซลลสายพนธ XA05 และ FG03 สามารถนากลบมาใชใหมไดอยางนอย 20 ครง Santos et al. (2009) ศกษาประสทธภาพของเซลลตรง Aureobasidium pullulans FE13 (คดแยกเชอไดจากนาเสยของโรงงานเหลกกลา) ในอลจเนตพบวาเซลลตรงมอตราการยอยสลายฟนอลได 20.45 มลลกรม/ลตร/ชวโมง ในขณะทเซลลอสระมอตราการยอยสลายฟนอล 18.35 มลลกรม/ลตร/ชวโมง โดยเซลลตรงมประสทธภาพในการยอยสลายไดมากกวาเซลลอสระ Lee et al. (2009) ใชเมดบดตรงกากตะกอนเรง (Activated sludge) ซงไดจากระบบบาบดนาเสยของโรงงานเหลก พบวาเซลลตรงมการยอยสลายฟนอลไดทชวงพเอชทกวางและทความเขมขนของฟนอลสง โดยมอตราการยอยสลายมากกวา 95% ภายในเวลา 28 ชวโมง โดยเซลลอสระถกยบยงการยอยสลายทความเขมขนของฟนอล 3,000 มลลกรม/ลตร แตในขณะทเซลลตรงไมถกยบยงทความเขมขนดงกลาว El-Naas et al. (2009) ทาการตรง Pseudomonas putida บน polyvinyl alcohol (PVA) พบวาเซลลตรงมอตราการยอยสลายฟนอลไดดทอณหภม 30 องศาเซลเซยส ทพเอช 7 ซงลดปรมาณฟนอลได 95% โดยเซลลตรงสามารถยอยสลายฟนอลไดจนถงความเขมขนของฟนอล 75 มลลกรม/ลตร Zhao et al. (2009) ศกษาการใช polyurethane foam (PUF) และ organic modified montmorillonite (OMMT-PSF capsule) เปนวสดสาหรบตรงจลนทรย จากการศกษาพบวาเซลลตรงมประสทธภาพการยอยสลายฟนอลสงกวาเซลลอสระ โดยเซลลตรงมอตราการยอยสลายฟนอล 342.4 มลลกรม/(ลตร-ชวโมง) สวนเซลลอสระมอตราการยอยสลายฟนอล 208.4 มลลกรม/(ลตร-ชวโมง) Yordanova et al. (2009) ศกษาการตรง Aspergillus awamori สายพนธ NRRL3112 บน polyacrylonitrile membrane พบวาเซลลอสระและเซลลตรงมอตราการยอยสลายฟนอล 1.16 และ 6.25 มลลกรม/ชวโมง ตามลาดบ Khongkhaem et al. (2011) ศกษาการเพมประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเชอผสมระหวาง Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 โดยวธตรงเซลลแบบกกขง (entrapment) ในซลกาทสงเคราะหขนใหม พบวาเซลลตรงสามารถยอยสลายฟนอลทความเขมขนเรมตน 5,000 มลลกรมตอลตร ไดถง 80-85 % ในขณะทเซลลอสระสามารถยอยสลายฟนอลทความเขมขนเรมตนนอยกวา 2,500 มลลกรมตอลตร ภายใน 10 วน อยางไรกตามเนองจากการสงเคราะหซล

17

กาตองมคาใชจายในการซอสารเคมเปนสารตงตน และมขนตอนเฉพาะในการผลต ดงนนจงมความจาเปนในการพฒนาวธการตรงเซลลทงาย มประสทธภาพ ราคาถก และสามารถขยายขนาดเพมจานวนไดงาย เพอความสะดวกในการนาไปประยกตใช ดงนนงานวจยนจงสนใจใชเทคนคการตรงเซลลแบคทเรยบนวสดเศษเหลอปาลมนามน เพอใหเซลลตรงมความทนทานตอสารฟนอลและอนพนธของฟนอลทปนเปอนอยในนาทง การใชวสดเศษเหลอดงกลาว เปนทางเลอกหนงในการใชประโยชนของเสย และการกาจดของเสย อกทงขนตอนการตรงเซลลไมยงยาก และชวยลดคาใชจายในการผลตวสดสงเคราะหได

18 5. ระเบยบวธดาเนนการวจย 5.1 ภาพรวมของงานวจย

แบคทเรยเชอผสมระหวาง Methylobacterium sp. NP3และ

Acinetobacter sp. PK1 

วสดตรงเซลลแบคทเรย ไดแก ทะลายปาลมนามน

และเสนใยปาลมนามน 

ศกษาระยะเวลาทเหมาะสมในการตรงเซลลแบคทเรย

ศกษาวธการตรงเซลลแบคทเรย

คดเลอกวสดตรง

ศกษาลกษณะพนผววสดตรง โดย SEM

ศกษาลกษณะสมบตทางกายภาพ และเคมเชน ปรมาตรร

พรน พนทผว ปรมาณสารอาหาร

การนาเซลลตรงกลบมาใชซา

อาหารเลยงเชอเหลว(CFMM) ทเตมฟนอล นาทงโรงงานสกดนามนปาลม 

Acclimation

Activation

วธรวมระหวาง Activation และAcclimation

ศกษาการผลต Exopolysaccharide

ทะลายปาลมนามน (EFB)

แปรผนปรมาณเซลลตรง

ผลของความเขมขนฟนอล

แปรผนปรมาณเซลลตรง

การนาเซลลตรงกลบมาใชซา

19

5.2 นาทงโรงงานสกดนามนปาลม เกบตวอยางนาทงจากบอบาบดนาเสยบอสดทายของโรงงานสกดนามนปาลมแหงหนงในจงหวดสตล (รปท 5) โดยระบบบาบดนาเสยของโรงงานเปนแบบบอปรบเสถยร (บอดน) ซงมจานวน 4 บอ นาตวอยางนาทงกรองดวยผาขาวบาง และเกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส จนกวาจะนามาทดลอง

(a) (b) รปท 5 ลกษณะบอบาบดนาเสย (a) และลกษณะนาทงโรงงานสกดนามนปาลม (b) 5.3 การเพาะเลยงและเตรยมหวเชอแบคทเรย งานวจยนใชจลนทรยเชอผสมระหวาง Methylobacterium sp. NP3 (รปท 6a) ซงคดแยกจากดนทปนเปอนนามน (นนทธร เภาราช, 2550) และ Acinetobacter sp. PK1 (รปท 6b) คดแยกจากอาหารทมการเจรญเตบโตของ Methylobacterium sp. NP3 (ปยะมาศ คงแขม, 2552) เลยงเชอ 2 ชนด แยกกนในอาหารเหลว carbon free mineral medium (CFMM) ทมการเตมฟนอลความเขมขน 10 มลลกรมตอลตร เปนแหลงคารบอนสาหรบการเจรญเตบโตของเชอแบคทเรย บมเชอท 30 องศาเซลเซยส เขยาท 200 รอบตอนาท เปนเวลา 48 ชวโมง หลงจากนนเกบเกยวเซลลทชวง late-log phase เพอใหไดปรมาณเซลลทยง active มากทสด โดยเชอแบคทเรยทง 2 ชนดมการเจรญเทากน หลงจากนนนาแบคทเรยแตละชนดมาปนแยกเซลลดวยเครองปนเหวยงทความเรว 8,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท แยกสวนนาใสทง แลวลางเซลลดวย 0.85% NaCl 2 ครง จากนนละลายตะกอนเซลลดวยอาหาร CFMM นาเซลลทไดไปวดคา OD578 ใหไดคา OD เทากบ 1.0 (Khongkham et al., 2011) โดยมจานวนเซลลแบคทเรยประมาณ 108 CFU/มลลลตร ซงคา OD578 กบการนบจานวนเซลลแบคทเรยไมสมพนธกบการผสมสดสวนเซลล 1:1 ไมไดแตกตางกนทางสถต ทงนเซลลจลนทรยทไดจะนาไปใชในการศกษาขนตอนตอไปโดย 1) นาเซลลทงสองชนดมาผสมกนในสดสวน 1:1 เพอนาไปใชในขนตอนการตรงเซลล

20

(a) (b) รปท 6 แบคทเรย (a) Methylobacteriumsp. NP3 และ (b) Acinetobactersp. PK1 ในอาหารเลยงเชอเหลว CFMM 5.4 ศกษาการผลต extracellular polymeric substance (EPS) ของแบคทเรย การทดลองนมวตถประสงค เพอทดสอบประสทธภาพในการผลต extracellular polymeric substance หรอ exopolysaccharide (EPS) ของแบคทเรย Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 ซงทาหนาทเสมอนกาวชวยใหแบคทเรยยดตดกบวสดตรงไดด วสดเศษเหลอปาลมนามนทใชเปนวสดตรงเซลล คอ ทะลายเปลาปาลมนามน (empty fruit bunch: EFB) ทดลองโดยการนาหวเชอแบคทเรยแตละชนด (ตรงแยกแบคทเรยแตละชนด) ทเตรยมไดจากขอ 5.3 มาบมรวมกบชนสวน EFB ทเตรยมตามขอ 5.5.1 ในอตราสวน 1:10 (w/v) โดยไมมการใหแหลงคารบอนใดๆ เพม เพอใหเซลลอยในภาวะอดอาหาร (carbon starvation) ซงชวยกระตนการสราง EPS ของเซลล (Sanin et al., 2003) ทงนใชหวเชอปรมาตร 5 มลลลตร (OD578=1.0) มาบมรวมกบวสดปรมาณ 0.5 กรม ในขวดแกวฝาเกลยว ขนาด 22 มลลลตร สดสวนปรมาณหวเชอ และวสดตรงดงกลาว ทาใหเกดการเคลอนทของวสดตรงไดอยางอสระ และชวยใหวสดตรงสมผสกบเซลลทแขวนลอยอยในอาหารเหลวไดด เตรยมชดการทดลองละ 3 ซา (triplicate) จากนนนาไปเขยาทความเรวรอบ 130 รอบตอนาท บมตวอยางทอณหภมหอง เกบตวอยางทกๆ 24 ชวโมง เปนเวลา 6 วน จากนนแยกเซลลทถกตรงบนวสดแลวออกจากเซลลอสระทเหลออยในอาหารเหลว โดยการกรองดวยกระดาษกรอง GF/C ขนาด 45 มลลเมตร ลางเซลลตรงดวย 0.85% NaCl 2 ครง หลงจากนนนามาทดสอบการสราง EPS ดวยวธ Alcian blue adsorption assay ตามวธการซงดดแปลงจาก Vandevivere and Kirchman (1993) ในหวขอ 5.8.3

เตรยมชดควบคมประกอบดวยวสดเศษเหลอ EFB ทผานการฆาเชอดวยการ Autoclave และไมมการเตมเชอแบคทเรย

PK1 NP3

21

5.5 การตรงเซลลแบคทเรย

5.5.1 การเตรยมวสดตรงเซลล เตรยมวสดตรงเซลลจากวสดเศษเหลอปาลมนามน 2 ชนด ทไดจากโรงงานสกดนามนปาลมในจงหวดสตล ไดแก เสนใยปาลมนามน (pericarp fiber: PF) และทะลายเปลาปาลมนามน (empty fruit bunch: EFB) (รปท 7) โดยนาวสดมาตากใหแหง แลวเตรยมขนาดของวสดทตองการโดย 1) นาวสดมาตดหรอบด แลวรอนผานตะแกรงรอนขนาด 500 ไมโครเมตรถง 1 มลลเมตร เพอใหไดขนาดของวสดทง 2 ชนดทมความใกลเคยงกน 2) การทดลองยอยสลายฟนอลในนาเสยจากโรงงานสกดนามนปาลม เลอกใชวสดทะลายปาลมนามน โดยการตดวสดใหมขนาด 1×1×1 เซนตเมตร เพอความสะดวกในการนาไปใชงาน

นาวสดไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนงอบฆาเชอ (autoclave) ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ทงไวขามคน แลวนามานงฆาเชอซาอก เพอตองการกาจดเชอจลนทรยทมความคงทนในวสดกอนนาไปใชในขนตอนการตรงเซลล นอกจากนนศกษาคณลกษณะอนๆ ของวสดดงตารางท 8

ตารางท 8 วธวเคราะหคณลกษณะของวสด

พารามเตอร วธ/วเคราะหโดย

Nitrogen (%):

Phosphorus (%):

อางองจาก Attanun และ Juncharoensuk (1999)

TOC (%): TOC analyzer (Solid sample module-SSM-5000A,Shimadzu)/ NCE-EHWM, จฬาลงกรณมหาวทยาลย

Total pore volume (cc g-1) Specific surface area (m2g-1) Average pore diameter (nm)

Surface area analyzer (Quantachrome,Autosorb-1)/ วทยาลยปโตรเลยม และปโตรเคม, จฬาลงกรณมหาวทยาลย

Zeta potential (mV) Zeta potential analyzer (ZetaPALS, Brookhaven)/ ศนยเครองมอวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร

Scanning electron microscopy (SEM)

WI-RES-SEM Quanta 400-001และ WI-RES-SEM-001/ ศนยเครองมอวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร

22

(a) (b)

รปท 7 วสดเศษเหลอปาลมนามน (a) ทะลายปาลมนามน (EFB) (b) เสนใยปาลมนามน (PF) 5.5.2 การตรงเซลลบนวสดเศษเหลอปาลมนามน การตรงแบคทเรยบนวสดเศษเหลอปาลมนามน อาศยเทคนคการเกาะตดของเซลลบนวสดดวยวธธรรมชาต (self-attachment immobilization) โดยศกษาระยะเวลาทเหมาะสมของการตรงเซลลบน PF และ EFB ดวยการวเคราะหปรมาณการสราง extracellular polymeric substance หรอ exopolysaccharide (EPS) ของแบคทเรยบนวสดตรงแตละชนด ทงนเพอใหเกดการเกาะตดของแบคทเรยบนวสดอยางดเพยงพอ และเซลลไมหลดออกจากวสด เมอมการนามาใชหรอใชซาอยางตอเนอง ขนตอนการตรงเซลลอางองจาก Suttinun et al. (2010) โดยนาหวเชอแบคทเรยผสมทเตรยมไดจากขอ 5.3 บมรวมกบวสดแตละชนดแยกกนในอตราสวน 1:10 (w/v) โดยไมมการใหแหลงคารบอนใดๆ เพม เพอใหเซลลอยในภาวะขาดแคลนแหลงคารบอน (carbon starvation) ซงชวยกระตนการสราง EPS ของเซลล (Sanin et al., 2003) ทงนใชหวเชอปรมาตร 5 มลลลตร (OD578=1.0) มาบมรวมกบวสดปรมาณ 0.5 กรม ในขวดแกวฝาเกลยว ขนาด 22 มลลลตร สดสวนปรมาณหวเชอและวสดตรงดงกลาว ทาใหเกดการเคลอนทของวสดตรงไดอยางอสระ และชวยใหวสดตรงสมผสกบเซลลทแขวนลอยอยในอาหารเหลวไดด เตรยมชดการทดลองละ 3 ซา (triplicate) จากนนนาไปเขยาทความเรวรอบ 130 รอบตอนาท บมตวอยางทอณหภมหอง เกบตวอยางทกๆ 24 ชวโมง จากนนแยกเซลลทถกตรงบนวสดแลวออกจากเซลลอสระทเหลออยในอาหารเหลว โดยการกรองดวย GF/C ขนาด 45 มลลเมตร ลางเซลลตรงดวย 0.85% NaCl 2 ครง หลงจากนนนามาทดสอบการสราง EPS ดวยวธ Alcian blue adsorption assay ตามวธการซงดดแปลงจาก Vandevivere and Kirchman (1993) ในหวขอ 5.8.3 เกบตวอยางจนกวาการสราง EPS จะคงท ซงถอเปนระยะเวลาทเหมาะสมในการตรงเซลลแบคทเรยบนวสดแตละชนด จากผลการทดลอง พบวาระยะเวลาทเหมาะสมในการตรงเซลลบนวสดเศษเหลอ EFB คอ 6 วนและบน PF คอเวลา 8 วน กอนนาเซลลตรงไปทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลในขนตอนตอไป เตรยมชดควบคมประกอบดวยวสดเศษเหลอ EFB และ PF ทผานการฆาเชอดวยการ Autoclave และไมมการเตมเชอแบคทเรย

23

นอกจากนนนาเซลลตรงทเตรยมไดไปศกษาลกษณะการเกาะตดของเซลลแบคทเรยบนวสดทงกอน และหลงการทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอล โดยการวเคราะหดวย SEM ดงรายละเอยดในภาคผนวก ข.1 พรอมทงคานวณประสทธภาพการตรงเซลล (%) ดงตอไปน ประสทธภาพการตรงเซลล (%) = ทงนนบจานวนเซลลทถกตรงในวสด และเซลลอสระในอาหารเหลวโดยวธ total plate count สาหรบการสกดเซลลออกจากวสดตรง ไดตามวธการดดแปลงจาก Pattanasupong et al. (2004) โดยเตมอาหารเหลว CFMM ลงในหลอดแกวทบรรจเซลลตรงแบคทเรย ตงทงไว 3 นาท เพอใหเซลลสามารถหลดออกจากวสดตรงไดงาย นาไป sonicate ดวยเครอง Ultrasonic bath เปนเวลา 2 นาท และเขยาดวยเครอง vortex 2 นาท จากนนทาซา 2 ครง หลงจากนนนาสารละลายตะกอนเซลลทไดไปเหวยงแยกเซลลทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ความเรว 7,500 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท จากนนลาง และแขวนลอยเซลลดวยอาหารเลยงเชอ CFMM กอนนาไปนบจานวนแบคทเรย (CFU ตอกรมวสดตรง) นาสารละลายเซลลมาเจอจางเชอแบคทเรยโดยวธ 10-fold dilution และนบจานวนเซลลดวยวธ total plate count 5.5.3 คดเลอกวสดตรงเซลล คดเลอกวสดตรงระหวางเซลลตรงบน EFB และเซลลตรงบน PF โดยนาเซลลตรงแตละชนดทเตรยมจากขอ 5.5.2 มาทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลตามวธการขอ 5.6 โดยใชความเขมขนของฟนอลเทากบ 30 มลลกรมตอลตร เตรยมชดการทดลองละ 3 ซา เกบตวอยางทกๆ 24 ชวโมง เพอวเคราะหปรมาณฟนอลทเหลอในอาหารเลยงเชอตามวธการของ Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA and WEF, 2005) ในหวขอ 5.8.2 ซงคดเลอกวสดตรงเซลลทมประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลไดดทสด โดยพจารณาจากขอมลการลดลงของฟนอลในอาหารเลยงเชอ ประกอบกบผลการศกษาประสทธภาพการตรงเซลล (%) และการวเคราะหลกษณะเซลลตรงบนวสดดวยกลอง SEM จากผลการทดลองพบวาชนสวน EFB เปนวสดทเหมาะสมมากกวา PF ในการตรงเซลล จงคดเลอกเซลลตรงบน EFB ไปใชในการศกษาขนตอไป เตรยมชดควบคม เพอศกษาผลของกระบวนการทางกายภาพและเคมตอการลดลงของ ฟนอล (abiotic controls) เชน การดดซบของฟนอลบนวสดตรง โดยชดควบคมประกอบดวยชนสวนของ

จน. เซลลทงหมดในวสด (CFU) * 100%

จน.เซลลทงหมดในอาหารเหลว (CFU) + จน. เซลลทงหมดในวสด (CFU)

24

EFB และ PF ทผานการฆาเชอโดยวธ Autoclave ในอาหารเลยงเชอ CFMM ทมฟนอลความเขมขน 30 มลลกรมตอลตร 5.6 ทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงในอาหารเลยงเชอเหลว การทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงในอาหารเลยงเชอเหลว ใชเซลลตรงบน EFB ทผานการตรงเซลลเปนระยะเวลา 6 วน โดยมจานวนเซลลเรมตน 2.27 x1010 CFU/กรมวสด 5.6.1 ผลของปรมาณเซลลตรงตอประสทธภาพการยอยสลายฟนอล ศกษาผลของปรมาณเซลลตรงบน EFB ตอประสทธภาพการยอยสลายฟนอล โดยแปรผนปรมาณเซลลตรง ดงน 0.5, 1.5 และ 3.0 กรม ซงคดเปนสดสวนเซลลตรงตออาหารเหลวเทากบ 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) เรมตนเตมเซลลตรงตามปรมาณขางตนในอาหารเลยงเชอเหลว Carbon Free Mineral Medium (CFMM) ปรมาตร 5 มลลลตร ทมฟนอลความเขมขน 30 มลลกรมตอลตร ในขวดแกวฝาเกลยว ขนาด 22 มลลลตร ทาการทดลองตวอยางละ 3 ซา จากนนนาตวอยางไปบมทความเรวรอบ 130 รอบตอนาท ทอณหภมหอง เกบตวอยางทกๆ 24 ชวโมง เพอวเคราะหปรมาณฟนอลทเหลอในอาหารเลยงเชอตามวธการของ Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA and WEF, 2005) ในหวขอ 5.8.2 คานวณเปอรเซนตการยอยสลายฟนอลของเซลลตรง จากผลการทดลองพบวาการเตมเซลลตรงในปรมาณดงกลาวขางตนใหประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลใกลเคยงกน จงเลอกเตมปรมาณเซลลตรง 1 กรม (1:10 w/v) ไปใชศกษาขนตอไป เตรยมชดควบคม เพอศกษาผลของกระบวนการทางกายภาพ และเคมตอการลดลงของฟนอล (abiotic controls) เชน การดดซบของฟนอลบนวสดตรง โดยชดควบคมประกอบดวย ชนสวนปาลมนามนทผานการฆาเชอแลวเตมในอาหารเลยงเชอ CFMM ทมฟนอลความเขมขน 30 มลลกรมตอลตร 5.6.2 ศกษาประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงทความเขมขนตาง ๆ นาเซลลตรงบน EFB มาทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลในระบบกะ (batch) ซงใช สดสวนปรมาณเซลลตรงตออาหารเหลว CFMM เทากบ 1:10 (w/v) โดยใชอาหารเลยงเชอปรมาตร 5 มลลลตร ตอเซลลตรงบน EFB ปรมาณ 0.5 กรม ทดสอบในขวดแกวฝาเกลยว ขนาด 22 มลลลตร (รปท 8) แปรผนความเขมขนของฟนอลตงแตความเขมขนตาไปจนถงความเขมขนสง ไดแก 10, 30, 50, 100, 500 และ5,000 มลลกรมตอลตร ทาการทดลองตวอยางละ 3 ซา จากนนนาตวอยางไปบมทความเรวรอบ 130 รอบตอนาท ทอณหภมหอง (รปท 8) เกบตวอยางทกๆ 24 ชวโมง เพอวเคราะหปรมาณฟนอลทเหลอในอาหารเลยงเชอตามวธการของ Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA and WEF, 2005) ในหวขอ 5.8.2 คานวณเปอรเซนต และอตราการยอยสลายฟนอลของ

25

เซลลตรง ซงผลทไดจะนาไปเปรยบเทยบกบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลอสระ (108 CFU/มลลลตร) (แบคทเรยเชอผสมจากขอ 5.3) เตรยมชดควบคม เพอศกษาผลของกระบวนการทางกายภาพ และเคมตอการลดลงของฟนอล (abiotic controls) เชน การดดซบของฟนอลบนวสดตรง โดยชดควบคมประกอบดวย ชนสวนปาลมนามนทผานการฆาเชอแลวเตมในอาหารเลยงเชอ CFMM ทมการแปรผนปรมาณฟนอลตามทตองการศกษา

รปท 8 ทดสอบการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงในขวดแกวฝาเกลยวแลวบมตวอยางทความเรวรอบ 130 รอบตอนาท ทอณหภมหอง 5.6.3 ศกษาประสทธภาพการนาเซลลตรงกลบมาใชซา นาเซลลตรงบน EFB ทผานการทดสอบการยอยสลายฟนอล ทความเขมขน 30 มลลกรมตอลตร แลวจากขอ 5.6.1 มากรองดวย GF/C ขนาด 45 มลลเมตร ทผานการฆาเชอลางเซลลดวย 0.85% NaCl 2 ครง หลงจากนนนาเซลลตรงทผานการใชงานแลวไปทดสอบการยอยสลายฟนอลซา ทความเขมขน 30 มลลกรมตอลตร ทาการทดลองตวอยางละ 3 ซา เกบตวอยางทกๆ 24 ชวโมง เพอวเคราะหปรมาณฟนอลทเหลอ จากนนทาการทดลองซาขนตอนเดม โดยนาเซลลตรงกลบมาใชซา 10 ครง เพอทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรง วาสามารถนากลบมาใชงานซาอยางตอเนองไดหรอไม และประสทธภาพการยอยสลายฟนอลหลงการใชงานแลวลดลงหรอไม

26

5.7 ศกษาประสทธภาพการยอยสลายฟนอลในนาทงโรงงานสกดนามนปาลม การทดลองนเลอกใชนาทงจากโรงงานสกดนามนปาลมเปนนาเสยตนแบบทมการปนเปอนของ ฟนอล เนองจากสารประกอบฟนอลถกสกดออกมาจากผลปาลมในระหวางกระบวนการสกดนามนปาลมแบบมาตรฐาน (แบบใชนา) จงมการปนเปอนของกลมสารดงกลาวอยในนาเสยจากอตสาหกรรมสกดนามนปาลมในปรมาณมาก ซงเตรยมตวอยางนาทง โดยนามากรองดวยผาขาวบาง เพอแยกเอาตะกอนดน และเศษวสดทปนเปอนในนาทงออก แลวนาไปนงอบฆาเชอ (autoclave) ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท กอนนาไปใช 5.7.1 ผลของปรมาณเซลลตรงตอประสทธภาพการยอยสลายฟนอล ศกษาผลของปรมาณเซลลตรงบน EFB ตอประสทธภาพการยอยสลายฟนอล โดยการแปรผนปรมาณเซลลตรง 3, 9 และ 18 กรม (ขนาด 1×1×1 เซนตเมตร) ในขวดรปชมพ (Erlenmeyer flask) ขนาด 250 มลลลตร ซงบรรจนาทง 30 มลลลตร ทผานการกรองดวยผาขาวบาง และฆาเชอจลนทรยในนาทงดวยการ Autoclave เพอใหไดสดสวน 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) ซงนาทงมปรมาณฟนอลปนเปอนประมาณ 30 มลลกรมตอลตร จากนนนาตวอยางไปบมทความเรวรอบ 130 รอบตอนาท ทอณหภมหอง ทาการทดลองตวอยางละ 3 ซา เกบตวอยาง เพอวเคราะหปรมาณฟนอลทเหลอในนาทงตามวธการของ Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA and WEF, 2005) ในหวขอ 5.8.2 เพอคานวณเปอรเซนตการยอยสลายฟนอลของเซลลตรง จากผลการทดลองพบวาปรมาณเซลลตรงทสดสวน 3:10 (w/v) มประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลสงทสด จงเลอกใชสดสวนเซลลตรงตอนาเสยดงกลาวในการทดลองตอไป เตรยมชดควบคม เพอศกษาผลของกระบวนการทางกายภาพ และเคมตอการลดลงของ ฟนอล (abiotic controls) เชน การดดซบของฟนอลบนวสดตรง โดยชดควบคมประกอบดวยชนสวน EFB ทผานการฆาเชอแลวเตมในนาทง 5.7.2 ศกษาการกระตน (Activation) และการปรบตว (Acclimation) ของเซลลตรง เพอเพมประสทธภาพของเซลลตรงบน EFB ในการยอยสลายฟนอลในนาทง จงนาเซลลตรงไปผานขนตอนการกระตนดวยฟนอล หรอ การปรบตวดวยการเจอจางนาทง หรอวธการรวมระหวางการกระตนและการปรบตวดงน 5.7.2.1 การกระตนเซลลตรงดวยฟนอล เนองจากกระบวนการตรงเซลลแบบเกาะตดทนามาใชในงานวจยน ตองอาศยระยะเวลาในการบมเซลลรวมกบวสดไวถง 6 วน เพอใหเกดการสงเคราะหเสนใย EPS ในการยดตดกบผนงของวสดตรง EFB ซงในกระบวนการดงกลาว ไมมการเตมแหลงคารบอนใดๆ ดงนน ทาใหเซลลอยในภาวะ

27

ขาดอาหาร และอาจสงผลตอการเจรญ และการผลตเอนไซมทเกยวของในการยอยสลายฟนอลในนาทง จงทดลองนาเซลลตรงมากระตนในอาหารเหลวทมการเตมฟนอล 10 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 24 ชวโมง เพอเปนการชกนา และรกษาการผลตเอนไซมภายในเซลลกอนนาไปใช จากนนนาเซลลตรงมาทดสอบการยอยสลาย ฟนอลในนาทงทผานการกรองดวยผาขาวบาง เพอแยกเอาตะกอนดนและเศษวสดทปนเปอนในนาทงออก และผานการนงอบฆาเชอ (Autoclave) ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท เกบตวอยางเปนเวลา 7 วน ซงเกบตวอยางทเวลาเรมตน (T0) และเวลาสดทาย (T7) เพอวเคราะหปรมาณฟนอลตามวธการของ Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA and WEF, 2005) ในหวขอ 5.8.2 คานวณเปอรเซนตการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงเปรยบเทยบกบเซลลตรงทยงไมผานการกระตนดวยฟนอล นอกจากนนทดสอบการยอยสลายฟนอลในนาทงทไมผานการนงอบฆาเชอดวย (กรองดวยผาขาวบาง เพอแยกเอาตะกอนดน และเศษวสดทปนเปอนในนาทงออก) เกบตวอยางเปนเวลา 7 วน เพอวเคราะหปรมาณฟนอลตามวธการของ Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA and WEF, 2005) ในหวขอ 5.8.2 คานวณเปอรเซนตการยอยสลายฟนอลของเซลลตรง 5.7.2.2 การปรบตวของเซลลตรงดวยนาทงทผานการเจอจาง เพอลดความพษจากกลมของสารประกอบฟนอลทเปนองคประกอบในนาทง ซงอาจมผลยบยงการทางานของแบคทเรยตรง จงทดลองนาเซลลตรงมาเลยงในนาทงทผานการเจอจาง โดยมการปรบความเขมขนของนาทงใหเพมขนอยางชาๆ ทงน เพอใหเวลาเซลลตรงมการปรบตวกอนนาไปทดสอบดวยนาทงทไมผานการเจอจาง ใชสดสวนนาทงทฆาเชอแลวตออาหารเหลว CFMM 25, 50 และ 100% (v/v) ตามลาดบ โดยบมตวอยางทความเรวรอบ 130 รอบตอนาท ทอณหภมหอง ทาการทดลองตวอยางละ 3 ซา แลวเกบตวอยางในวนท 0, 1, 3, 5 และ 7 เพอวเคราะหปรมาณฟนอลตามวธการของ Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA and WEF, 2005) ในหวขอ 5.8.2 คานวณเปอรเซนตการยอยสลายฟนอลของเซลลตรง เปรยบเทยบกบชดควบคม ซงเปนชนสวน EFB ทปราศจากเซลล 5.7.2.3 วธรวมระหวางการกระตนและการปรบตวของเซลลตรง ใชวธการขอ 5.7.2.1 รวมกบวธการขอ 5.7.2.2 โดยนาเซลลตรงมากระตนในอาหารเหลวทมการเตมฟนอล 10 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากนนนาเซลลตรงมาเลยงในนาทงทผานการเจอจาง โดยมการปรบความเขมขนของนาทงใหเพมขนอยางชาๆ ใชสดสวนนาทงทฆาเชอแลวตออาหารเหลว CFMM 25, 50 และ 100% (v/v) ตามลาดบ โดยบมตวอยางทความเรวรอบ 130 รอบตอนาท

28

ทอณหภมหอง ทาการทดลองตวอยางละ 3 ซา แลวเกบตวอยางในวนท 0, 5, 7 และ 10 เพอวเคราะหปรมาณฟนอลตามวธการของ Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA and WEF, 2005) ในหวขอ 5.8.2 คานวณเปอรเซนตการยอยสลายฟนอลของเซลลตรง เปรยบเทยบกบชดควบคม ซงเปนชนสวน EFB ทปราศจากเซลล จากการทดลอง 5.7.2.1 ถง 5.7.2.3 เตรยมชดควบคมการทดลองทางกายภาพ และเคมตอการลดลงของฟนอล (abiotic controls) เชน การดดซบของฟนอลบนวสดตรง โดยชดควบคมประกอบดวยชนสวน EFB ทผานการฆาเชอแลว เตมในนาทงทผานการฆาเชอ 5.7.3 ศกษาประสทธภาพการนาเซลลตรงกลบมาใชซา นาเซลลตรงบน EFB ทผานการทดสอบการยอยสลายฟนอลในนาทงทความเขมขน 30 มลลกรมตอลตร แลวจากขอ 5.7.2.1 มากรองดวย GF/C (ขนาด 45 มลลเมตร) ทผานการฆาเชอ ลางเซลลดวย 0.85% NaCl 2 ครง หลงจากนนนาเซลลตรงทผานการใชงานแลวไปทดสอบการยอยสลายฟนอลซาในนาทงทความเขมขนฟนอล 30 มลลกรมตอลตร ในขวดรปชมพ (Erlenmeyer flask) ขนาด 250 มลลลตร ซงบรรจนาทง 30 มลลลตร และมเซลลตรงปรมาณ 9 กรม จากนนนาตวอยางไปบมทความเรวรอบ 130 รอบตอนาท ทอณหภมหอง ทาการทดลองตวอยางละ 3 ซา เกบตวอยางทกๆ 7 วน เพอวเคราะหปรมาณฟนอลทเหลอ จากนนทาการทดลองซาขนตอนเดมโดยนาเซลลตรงกลบมาใชซา 10 ครง เพอทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงวาสามารถนากลบมาใชงานซาอยางตอเนองไดหรอไม และประสทธภาพการยอยสลายฟนอลหลงการใชงานแลวลดลงหรอไม 5.8 วธวเคราะห 5.8.1 การวเคราะหลกษณะสมบตของนาทงโรงงานสกดนามนปาลม วเคราะหลกษณะนาทงดวยวธการมาตรฐานสาหรบการวเคราะหนาและนาเสยใน Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA and WEF, 2005) โดยวเคราะหคาพารามเตอรตอไปนดงแสดงในตารางท 9

29

ตารางท 9 การวเคราะหลกษณะสมบตของนาทงโรงงานสกดนามนปาลม

พารามเตอร วธวเคราะห Dissolved oxygen (DO) Azide modification Biological oxygen demand (BOD) 5 – day BOD test Chemical oxygen demand (COD) Open reflux method ไนโตรเจน Kjeldahl method ฟอสฟอรส Persulfate / Ascorbic acid method สารประกอบฟนอล (phenols) Colorimetric method

5.8.2 การวเคราะหปรมาณฟนอลดวยเทคนค colorimetric method วเคราะหปรมาณฟนอลโดยใชวธมาตรฐานของ Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA and WEF, 2005) โดยนาตวอยางนาเสยทกรองเซลลตรงออกดวยกระดาษกรอง หรอตวอยางนาเสยทมเซลลอสระซงผานการปนเหวยงทความเรวรอบ 7,500 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท มาเตมสารดงตอไปน 0.5 นอรมอล สารละลายแอมโมเนยมไฮดรอกไซด 2.5 มลลลตร ฟอสเฟตบฟเฟอร 2.5 มลลลตร แลวเตม 4-อะมโนแอนตไพรน 1 มลลลตร และ โปแตสเซยมเฟอรกไซยาไนด 1 มลลลตร ลงในตวอยางทตองการวเคราะหฟนอล แลวตงทงไว 15 นาท โดยจะเกดปฏกรยาระหวาง ฟนอล และ 4-อะมโนแอนตไพรน ซงเปน color reagent ในสภาวะทมโปแตสเซยมเฟอรกไซยาไนด ไดผลตภณฑเปน antipyrine dye ทมสแดง แลววดคาการดดกลนแสงท 500 นาโนเมตร เพอหาเปอรเซนตฟนอลทเหลออยเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐานของฟนอลทความเขมขนตางๆ 5.8.3 วเคราะหการผลต exopolysaccharide ของแบคทเรย วเคราะหการผลต exopolysaccharide ของแบคทเรย โดยใชเทคนค Alcian blue adsorption assay เนองจากส alcian blue จะยอมตดเฉพาะ exopolysaccharide ทเซลลผลต ซงไมยอมตดเซลล และวสดตรง ใชวธทดดแปลงจาก Vandevivere and Kirchman (1993)โดยการเตม 1% สารละลายส alcian blue ลงในตวอยางเซลลตรงทเลยงในอาหารเหลว CFMM หลงจากนนเกบตวอยางเซลลตรงทบมทก 24 ชวโมง นาไปเขยาท 80 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท และกรองเอาเซลลตรงออกดวยกระดาษกรอง จากนนนาสวนทเปนอาหารเหลว (supernatant) ไปวดคาการดดกลนแสงท 606 นาโนเมตร คาดดกลนแสงทลดลงในอาหารเหลว หลงจากส alcian blue ถกดดซบโดย exopolysaccharide จะแปรผนตามคา exopolysaccharide ทเซลลผลตขน ณ เวลาตางนนๆ โดยเปรยบเทยบกบคาดดกลนแสงของสารละลายตวอยางในระยะเรมตนตรงเซลล (T0)

30

5.8.4 การนบจานวนแบคทเรย และวเคราะหนาหนกเซลลแหง การสกดและนบจานวนแบคทเรยทถกตรงบนวสดเศษเหลอทะลายปาลมนามน ทาตามวธการทดดแปลงจาก Pattanasupong et al. (2004) ขนตอนแรกสกดเซลลแบคทเรยใหหลดออกจากวสดตรงกอนโดยเตมอาหารเหลว CFMM ลงในหลอดแกวทบรรจเซลลตรงแบคทเรย ตงทงไว 3 นาท เพอใหเซลลสามารถหลดออกจากวสดตรงไดงาย นาไป sonicate ดวยเครอง Ultrasonic bath เปนเวลา 2 นาท และเขยาดวยเครอง vortex 2 นาท จากนนทาซา 2 ครง หลงจากนนนาสารละลายเซลลแขวนลอยทไดไปเหวยงแยกเซลลทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ความเรว 7,500 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท จากนนลางเซลลและแขวนลอยเซลลดวยอาหารเลยงเชอ CFMM กอนนาไปวเคราะหดงตอไปน (1) นบจานวนแบคทเรย (CFU ตอกรมวสดตรง) นาสารละลายเซลลมาเจอจางเชอแบคทเรยโดยวธ 10-fold dilution และนบจานวนเซลลดวยวธ total plate count โดยการ Spread plate ซงใชตวอยาง 100 ไมโครลตร เกลยใหทวอาหารเลยงเชอแขง CFMM หลงจากนนนาเซลลบมทอณหภมหองเปนเวลา 3-5 วน มานบจานวนโคโลนในชวง 30-300 โคโลน แลวคานวณคา CFU ตอกรมวสด และ (2) วเคราะหนาหนกเซลลแหง โดยนาสารละลายเซลลใสใน crucible นาไปชงนาหนก และอบทอณหภม 103-105 องศาเซลเซยส ขามคนจนเซลลแหงและนาหนกคงท หลงจากนนปลอยใหเยนในโถดดความชนแลวนามาชงนาหนก นานาหนกเซลลทไดมาหาสวนตางระหวางนาหนกของสารละลายเซลลกอนอบและนาหนกของสารละลายเซลลหลงอบ ซงจะไดเปนปรมาณนาหนกเซลลแหงทงหมด (Grothe et al., 1999) ผลการวเคราะหนาหนกเซลลแหงมคาประมาณ 1.09-1.13 กรมตอมลลลตร 5.8.5 การวเคราะหความเขมสในนาทง วเคราะหความเขมสโดยใชวธมาตรฐานของ Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA and WEF, 2005) โดยนาตวอยางนาทงกอนและหลงบาบด นามาปนเหวยงทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท เพอกาจดของแขงแขวนลอย จนไดตวอยางทใส นาตวอยางสวนใสเจอจางดวยนากลนทความเจอจาง 5 เทา วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 475 นาโนเมตร เพอคานวณเปอรเซนตความเขมสทเหลออยโดยเปรยบเทยบกบความเขมส ณ เรมตนการทดลอง ไดตวอยางทใส นาตวอยางสวนใสเจอจางดวยนากลนทความเจอจาง 5 เทา วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 475 นาโนเมตร เพอคานวณเปอรเซนตความเขมสทเหลออยโดยเปรยบเทยบกบความเขมส ณ เรมตนการทดลอง

31

6. ผลการทดลองและวจารณผลการทดลอง 6.1 การผลต extracellular polymeric substance (EPS) ของแบคทเรยแตละชนด การศกษานสนใจตรงเซลลแบคทเรยบนวสดเศษเหลอปาลมนามนโดยอาศยการเกาะตดดวยวธธรรมชาต (self-attachment immobilization) โดยอาศยการสงเคราะห EPS ของเซลล (Vandevivere and Kirchman, 1993; Obuekwe and Al-Muttawa, 2001; Olofsson et al., 2003; Suttinun et al., 2010) ผวจยจงเรมจากการศกษาความเปนไปไดในการผลต EPS ของแบคทเรย Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 ในภาวะขาดแคลนแหลงคารบอน (carbon starvation) โดยนาแบคทเรยแตละชนดบมรวมกบชนสวนทะลายเปลาปาลมนามน (empty fruit bunch; EFB) เกบตวอยางทก 24 ชวโมง เพอศกษาปรมาณการผลต EPS ของแบคทเรยแตละชนด ทงนวเคราะหการผลต EPS โดยใชวธ Alcian blue adsorption assay ตามวธการซงดดแปลงจาก Vandevivere and Kirchman (1993) ปรมาณ EPS ทผลตขนคดจากการลดลงของคา absorbance ท 606 นาโนเมตร ในสารละลายตวอยาง เนองจากสจะถกดดซบโดย EPS ทเซลลผลตขนมา กาหนดให A606 ของวนทเรมตนทดลอง (T0) มคา baseline เทากบ 100% จากผลการทดลองในรปท 9 แสดงใหเหนวาในชวง 3 วนแรก คาสท A606 ในสารละลายตวอยางของแบคทเรยทง 2 ชนด มคาไมเปลยนแปลง แตหลงจากวนท 3 ถงวนท 6 พบการลดลงของสท A606 ประมาณ 70% ในตวอยางของ Methylobacterium sp. NP3 แสดงวาเซลลมการผลต EPS เพมขนอยางตอเนอง และรวดเรวในชวง 3 วนดงกลาว หลงจากนนเปอรเซนตการลดลงของสท A606 เรมคงท ซงแสดงวาเซลลมอตราการผลต EPS คงทหลงจากวนท 6 ในขณะท Acinetobacter sp. PK1 สามารถลดสไดประมาณ 50% ในชวงวนท 3 ถง 6 และมเปอรเซนตการลดลงของสคงทประมาณ 70% หลงจากวนท 7 นอกจากนนพบวา Methylobacterium sp. NP3 มอตราในการสงเคราะหเสนใย EPS ไดเรวกวา Acinetobacter sp. PK1 อยางไรกตาม ชดควบคมซงเปนวสดตรงเพยงอยางเดยว (ปราศจากเซลล) มการลดลงของส alcian blue นอยมาก ประมาณ 0-5% ทงนอาจเนองมาจากปจจยทางกายภาพ (abiotic factors) อนๆ เชน การเกาะตดของสบรเวณขวดทดลอง เปนตน

32

รปท 9 เปอรเซนตการลดลงของส Alcian blue ท A606 จากการผลต EPS ของเซลลแบคทเรย Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 เพอเกาะตดบน EFB โดยทวไป EPS ทาหนาทเสมอนกาวใหเซลลยดตดกบพนผวของวสด และเปนสวนสาคญทชวยใหเกดการปกคลมเซลลในรปแบบฟลมชวภาพ (biofilm) องคประกอบของ EPS ไดแก คารโบไฮเดรต โปรตน ดเอนเอ และไขมน ซงสดสวนจะมความแตกตางกนขนอยกบชนดของจลนทรย และภาวะแวดลอม (Rosche et al., 2009) อยางไรกตามทงปรมาณ และองคประกอบของ EPS มผลตอศกยภาพในการเกาะตดของแบคทเรยบนพนผววสด ทงนมรายงานวาในภาวะขาดแคลนแหลงคารบอน หรอมไนโตรเจนเพยงพอ อาจสงผลตอการเปลยนแปลงคณสมบตดาน hydrophobic ของพนผวของแบคทเรย รวมถงคณสมบตการเกาะตดพนผววสดดวย โดยในภาวะนเซลลจะเปลยนไนโตรเจนไปเปนโปรตน และ amino acid ใน EPS ทาใหคา hydrophobicity ของเซลลเพมขน ซงชวยเพมการเกาะตดของเซลลบนวสดดวยเชนกน (Sanin et al., 2003) จากการศกษาทผานมารายงานวาทงแบคทเรยในจนส Acinetobacter และ Methylobacterium สามารถผลต EPS ทมความหลากหลายขององคประกอบทางเคม เชน จนส Acinetobacter อาจผลต EPS ทมองคประกอบ ไดแก D-galactose, D-2-acetamido-2-deoxy-D-glucose, 3-(L-2-hydroxypropionamido)-3,6-dideoxy-D-galactose, rhamnose,3-deoxy-3-(D-3 hydroxybutyramido)-D-quinovose, S-(+)-2-(4-sobutylphenyl)proprionicacid หรอ lipopolysaccharide

33

(Haseley et al.,1997; Kunii et al., 2001) ในขณะท Methylobacterium ผลต EPS ทมลกษณะเปน slime สชมพ ซงมองคประกอบหลกจาพวก α-(1,3)-galactan polysaccharide (Verhoef et al., 2003) เปนตน 6.2 การพฒนาเซลลตรงบนวสดเศษเหลอปาลมนามน 6.2.1 คณสมบตของวสดตรงเซลล

การทดลองนใชวสดเศษเหลอปาลมนามน 2 ชนด เปนวสดตรงเซลล ไดแก เสนใยปาลมนามน (pericarp fiber: PF) และทะลายเปลาปาลมนามน (empty fruit bunch: EFB) ซงเปนวสดเศษเหลอจากกระบวนการสกดนามนปาลม การใชวสดตรงเซลลดงกลาว เปนทางเลอกหนงในการนาของเสยมาใชประโยชน และยงเปนการกาจดของเสยอกทางหนงดวย นอกจากนยงชวยลดคาใชจายในการสงซอ หรอสงเคราะหวสดตรงเซลลทมราคาแพง รวมทงมวธการเตรยมวสด และขนตอนการตรงเซลลทไมยงยาก จากการศกษาลกษณะพนผวของวสดทง 2 ชนด โดยการสองดวยกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด (SEM) แสดงใหเหนดงรปท 10 พบวาลกษณะพนผวของวสดทงสองชนดประกอบดวยโครงสรางซบซอน พนผวคอนขางขรขระ มลกษะเปนรพรนคลายรงผงดงรปท 10 (a-d) โดยสวนใหญพบจานวนของรพรนในทะลายปาลมนามน (รปท 10 c-d) มากกวาเสนใยปาลมนามน (รปท 10 a-b) เลกนอย

จากการวเคราะหคณสมบตทางกายภาพ-เคมของวสดดงกลาว (ตารางท 10) พบวาวสด PF

(2.16%) มปรมาณสารอาหารไนโตรเจนมากกวา EFB (0.91%) ในขณะทวสดทง 2 ชนด มปรมาณฟอสฟอรสใกลเคยงกน คอประมาณ 0.21-0.22% อกทงมปรมาณคารบอนรวมทงหมด 35.93% ใน PF และ 41.49% ใน EFB อยางไรกตาม ปรมาณสารอาหารทมในวสด อาจสงผลโดยตรงตอปรมาณการผลต และองคประกอบของ EPS ทเซลลสรางขน ทงนปรมาณและองคประกอบของ EPS มผลตอศกยภาพในการเกาะตดของแบคทเรยบนพนผววสด นอกจากนนพบวาวสดทง 2 ชนด มคณสมบตทางกายภาพ ไดแก เสนผานศนยกลางรพรนเฉลย (average pore diameter) และพนทผวจาเพาะ(specific surface area) ใกลเคยงกน นนคอ มคาประมาณ 4.24 (EFB) และ 5.01 (PF) nm และ 4.17 (EFB) และ 5.45 (PF) m2g-1 ตามลาดบ อยางไรกตาม EFB มคาปรมาตรรพรนทงหมด (total pore volume) มากกวา PF ถง 64 เทา โดย EFB มคาปรมาตรรพรนทงหมด 0.44 cc g-1 ในขณะท PF มคาปรมาตรรพรนทงหมดเทากบ 0.0068 cc g-1 ซงคาทไดเปนไปในทศทางเดยวกบภาพถาย SEM ซงเหนวา EFB มจานวนรพรนสงกวา PF และจากการศกษาประจของพนผววสดทงสองโดย zeta potential analyzer พบวาใหคาประจลบ ประมาณ -25.23 mV (EFB) และ -25.30 mV (PF)

34

(a) (b)

(c) (d) รปท 10 ลกษณะพนผวของวสดเศษเหลอปาลมนามนสองโดย SEM กาลงขยาย 250x-500x; เสนใยปาลมนามน (a-b) และทะลายปาลมนามน (c-d) หากเปรยบเทยบกบวสดตรงชนดอนทนามาใชในการบาบดนาเสย เชน ทราย หรอ ผงกรอง (Celite) ซงมปรมาตรรพรนทงหมดอยในชวงระหวาง 0.055-1.050 cc g-1 และพนทผวประมาณ 3.690 (ผงกรอง) และ 0.755 (ทราย) m2g-1 (Wang et al., 2005) แสดงวา EFB มปรมาตรรพรนทงหมดระดบปานกลาง ในขณะท PF มคาดงกลาวคอนขางนอย อยางไรกตาม วสดเศษเหลอทงสองมพนทผวสงกวาทราย และผงกรอง นอกจากนน Ng et al. (2004) ศกษาการตรง Thiomonas sp. บนถานกมมนต (activated carbon) เพอกาจด H2S จากระบบบาบดนาเสย พบวาปจจยของพนทผว ปรมาตรของรพรน และการกระจายของรพรนมผลตอการยดเกาะ และการเจรญของเซลล ซงทาใหเพมประสทธภาพในการกาจด H2S อยางไรกตาม หากเปรยบเทยบกบวสดสงเคราะห เชน ซลกา จะเหนไดวสดทสงเคราะหขน มขอไดเปรยบในเชงสมบตทางกายภาพดกวาเศษวสดเหลอใช โดย Khongkheam et al. (2011) รายงานวาซลกาท

35

สงเคราะหเพอใชเปนวสดตรงเซลล ในการยอยสลาย ฟนอล มปรมาตรรพรนทงหมด 0.87 cc g-1 เสนผานศนยกลางรพรนเฉลย 8.75 nm และพนทผว 397.79 m2g-1 ซงทาใหสามารถตรงเซลลแบคทเรยปรมาณมากไวในวสดไดดกวาวสดจากธรรมชาต ตารางท 10 คณสมบตของวสดเศษเหลอปาลมนามนทใชเปนวสดตรงเซลล

หมายเหต : Zeta potential ของแบคทเรย Methylobacterium sp. NP3 = -6.27 mV, Acinetobacter sp. PK1 = -6.90 mV 6.2.2 การตรงเซลลแบคทเรยบนวสดเศษเหลอปาลมนามน การทดลองนจงสนใจศกษาระยะเวลาทเหมาะสมในการเกาะตดของเซลลแบคทเรยบนวสดตรง โดยพจารณาจากการผลต EPS ของเซลลแบคทเรย โดยใชวธ Alcian blue adsorption assay จากผลการทดลองในรปท 11 แสดงใหเหนวา ในชวง 3 วนแรก เซลลมการผลต EPS ในวสดทง 2 ชนด ในปรมาณนอยประมาณ 1-8% หลงจากวนท 3 พบวาเซลลแบคทเรยผลต EPS เพมขนอยางรวดเรว โดยในวนท 6 มปรมาณ EPS ทผลตขนจากเซลลทตรงบนวสดทง 2 ประมาณ 80% หลงจากนนเปอรเซนตการลดลงของสท A606 เรมคงทในตวอยางเซลลตรงบน EFB ซงแสดงวาเซลลมอตราการผลต EPS คงทนบจากวนท 6 ในขณะทเซลลตรงบน PF ยงคงผลต EPS อยางตอเนองจนเรมคงทในวนท 8 อยางไรกตาม ชดควบคมซงเปนวสดตรงเพยงอยางเดยว (ปราศจากเซลล) มการลดลงของส Alcian blue นอยมากประมาณ 0-5% ทงนสทลดลงอาจเนองมาจากปจจยทางกายภาพอนๆ (abiotic factor) เชน การเกาะตดของสบรเวณขวดทดลอง

องคประกอบ

ชนดของวสด

ทะลายเปลาปาลมนามน (EFB)

เสนใยปาลมนามน (PF)

Nitrogen (%): 0.91 2.16 Phosphorus (%): 0.22 0.21

TOC (%): 41.49 35.93

Total pore volume (cc g-1) 0.44 0.0068 Specific surface area (m2g-1) 4.17 5.45 Average pore diameter (nm) 4.24 5.01

Zeta potential (mV) Negative (-25.23)

Negative (-25.30)

36

หรอเกดจากกระบวนการโฟโตออกซเดชน (photo oxidation) เปนตน ดงนนจงตรงเซลลในชวงเวลา 6 และ 8 วน สาหรบเซลลตรงบน EFB และ PF ตามลาดบ กอนนาเซลลตรงไปทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลในนาเสย ซงชวยลดการหลดของเซลลจากวสดตรงระหวางการนาไปใช

รปท 11 เปอรเซนตการลดลงของส Alcian blue ท A606 จากการผลต EPS ของเซลลแบคทเรย ระหวางการตรงเซลลบน EFB และ PF เปรยบเทยบกบชดควบคมซงเปนวสดเพยงอยางเดยวไมมเซลล จากการศกษาประสทธภาพของการตรงเซลล โดยการนบจานวนเซลลแบคทเรยทเกาะตดกบวสด และเซลลอสระทยงคงหลงเหลออยในอาหารเหลว ดงตารางท 11 ผลการทดลองแสดงใหเหนวา ประสทธภาพการตรงเซลลบน EFB เทากบ 17% ในขณะทการตรงเซลลบน PF มประสทธภาพนอยกวา ซงมคาประมาณ 6% ซงสอดคลองกบผลการวเคราะหดวย SEM ทแสดงวาลกษณะแบคทเรยทถกตรงบน EFB (รปท 12 c-d) มการจบตวอยางหนาแนนมากกวาแบคทเรยทถกตรงบน PF (รปท 12 a-b) ทงนอาจเนองมาจาก EFB มลกษณะพนผวทมความซบซอน และมความเปนรพรนสง ซงชวยในการเพมพนทผวในการเกาะตดของเซลลในวสดไดมากกวา PF ดงจะเหนไดจากคณสมบตคา total pore volume ทสงมากกวาหลายเทา (ตารางท 10) อยางไรกตาม ปรมาณ และอตราการผลต EPS ยงขนอยกบปจจยอนๆ อกดวย เชน องคประกอบของวสด เชน ปรมาณอนทรยคารบอน ไนโตรเจน และฟอสฟอรส

37

ตารางท 11 ประสทธภาพการตรงเซลลบน EFB และ PF ทระยะเวลาการตรงเซลล 6 และ 8 วน

ชนดของเซลลตรง

จานวนเซลลทงหมดในวสด (0.5 กรม)

(x 1010CFU)

จานวนเซลลทงหมดในอาหารเหลว CFMM (5

mL) (x 1010CFU)

ประสทธภาพการตรงเซลล

(%)

เซลลตรงบน EFB 1.14 5.65 17 เซลลตรงบน PF 1.81 28.4 6

จากผลการทดลองมความสอดคลองกบงานวจยทผานมา ซงพบวาในระหวางกระบวนการตรงเซลลแบบเกาะตด (Attachment immobilization) เซลลแบคทเรยทถกดดซบบนผววสดจะมการสงเคราะหโครงสรางขนมาภายนอกเซลลจาพวก EPS เชน Quek et al. (2006) รายงานวาเซลลตรง Rhodococcus sp. F92 บน polyurethane foam สามารถยอยสลายอลเคนในผลตภณฑปโตรเลยมไดด โดยเซลลมการผลตเสนใยจาพวก EPS ซงสามารถตรวจพบโดยการสองดวย SEM เสนใยเหลานทาหนาทในการสราง monolayer ทแขงแรงคงทน และบางเซลลถกหอหมไวภายในเสนใย ซงชวยใหเกดการเกาะตดกบพนผววสดตรงไดดขน จากการศกษาของ Obuekwe and Muttawa (2001) รายงานวาเซลล Arthrobacter sp. ทตรงบนราขาว สามารถยอยสลายสารประกอบไฮโดรคารบอนในนามนดบได และพบวาเซลลมการสราง EPS ในการยดเกาะกบวสดตรง นอกจากนนจากการศกษาของ Prieto et al. (2002) รายงานวาเซลลตรง Rhodococcus erythropolis UPV-1 บน Biolite® และ diatomaceous earth ในระบบ packed-bed reactor สามารถยอยสลายฟนอลในนาเสยสงเคราะหและนาเสยโรงงานผลตเรซนไดด และพบวาเซลลมการสราง EPS เปนโครงขายของเสนใยทมลกษณะเปนไบโอฟลม เพอหอหมเซลล และยดเกาะกบวสดตรง ทงนกระบวนการดดซบ (Adsorption) ของเซลลแบคทเรยระหวางการเกาะตดบนวสดตรงเกดขนไดจากหลายกระบวนการ เชน โดยอาศยปฏกรยาระหวางกลม hydrophobic บนพนผวของวสด และโครงสรางพนผวของเซลลแบคทเรย (Cohen, 2001) และ/หรอความแตกตางของประจบนพนผว (Surface charge) ของวสดและแบคทเรย จากผลการวเคราะหประจในการทดลองน (ตารางท 10) พบวาพนผวของแบคทเรยและวสดตรงทง 2 ชนด มประจลบ อยางไรกตาม คาระดบประจทแตกตางกนอาจเปนสาเหตหนงของกลไกการดดซบทเกดขนระหวางการตรงเซลล

38

(a) (b)

(c) (d)

รปท 12 การเกาะตดของเซลลในวสดเศษเหลอปาลมนามนสองโดย SEM กาลงขยาย 3000x-10000x; เสนใยปาลมนามน (a-b) และทะลายปาลมนามน (c-d) 6.2.3 การคดเลอกวสดตรงเซลล การคดเลอกชนดของวสดตรงระหวาง EFB และ PF เพอเลอกเซลลตรงทมประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลไดดทสด พบวาเซลลตรงบน EFB และเซลลตรงบน PF สามารถลดปรมาณฟนอล ทความเขมขนฟนอลเรมตน 30 มลลกรมตอลตร ไดประมาณ 98% ภายในเวลา 8 และ 12 ชวโมง ตามลาดบ (รปท 13) ซงแสดงใหเหนวาเซลลตรงบน EFB มอตราการกาจดฟนอลสงกวาเซลลตรงบน PF นอกจากนนเมอเปรยบเทยบชดควบคม ซงประกอบดวยวสดตรงแตละชนดทปราศจากเซลล พบวาชนสวน EFB ดดซบฟนอลไดนอยกวาชดควบคม PF ทงนอาจเนองมาจากคณสมบตทางกายภาพ-เคมของวสดทแตกตางกน เชน ปรมาณรพรนทงหมด พนทผว ปรมาณคารบอน อาจมผลตอการดดซบปรมาณฟนอลทแตกตางกน ซงการดดซบของฟนอลโดยวสดตรงน อาจสงผลใหประสทธภาพการยอยสลายฟนอลทาง

39

ชวภาพโดยแบคทเรยตาลง เนองจากมวลของสารทถกดดซบไว ทาใหสารถกกาจดไดยากขน เพราะฉะนน จากผลการทดลองขางตนจงเลอกใชเซลลตรงบน EFB มาใชทดสอบในขนตอนตอไป เนองจากวสดดงกลาวมประสทธภาพในการตรงเซลลสงกวา PF ซงชวยสงเสรมการยอยสลายฟนอลโดยจลนทรยไดด และดดซบฟนอลนอย จงมความเหมาะสมในการนาไปประยกตใช เพอยอยสลายฟนอลในนาเสย

รปท 13 ปรมาณฟนอลทเหลอหลงจากถกยอยสลายโดยเซลลตรงบน EFB และ PF เปรยบเทยบกบชดควบคม (วสดตรงทไมมเซลล) ใชความเขมขนฟนอลเรมตน 30 มลลกรมตอลตร 6.3 ประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงบน EFB ในอาหารเลยงเชอ CFMM 6.3.1 ผลของปรมาณเซลลตรงตอประสทธภาพการยอยสลายฟนอล ศกษาปรมาณเซลลตรงทเหมาะสม ซงมประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลไดดทสด โดยแปรผนปรมาณเซลลตรงบน EFB 0.5, 1.5 และ 3.0 กรม เพอใหไดสดสวนเซลลตรงตออาหารเหลว CFMM เทากบ 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) และใชความเขมขนของฟนอล 30 มลลกรมตอลตร จากผลการทดลอง แสดงใหเหนวาการเตมเซลลตรง 0.5 กรม (1:10 w/v) ใหประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลสงถง 98% ภายในเวลา 24 ชวโมง (รปท 14) ดงนนการเตมเซลลตรงเพมขนเปน 1.5 และ 3.0 กรม จงไมมผลในการเพมประสทธภาพการยอยสลายฟนอลอยางมนยสาคญ ทงนอาจกลาวไดวาปรมาณเซลล 0.5 กรม หรอ

40

สดสวนเซลลตรงตออาหารเหลว 1:10 มปรมาณเซลลแบคทเรยเพยงพอในการยอยสลายมวลของฟนอลทเตมลงไปในอาหารเลยงเชอ อกทงปรมาณเซลลทมากเกนไป อาจทาใหเกดขอจากดในการแพรผานของสารฟนอล และออกซเจนเขาสเซลลตรง รวมถงการเตมปรมาณเซลลตรงเพมขน อาจทาใหเกดการดดซบของฟนอลในเซลล และวสดตรงมากขน ซงสงผลตอความยงยนในการยอยสลายฟนอลทางชวภาพได ในขณะทชดควบคมซงเปนวสดปราศจากเซลลมฟนอลลดลงประมาณ 3-7% ซงเกดจากปจจยทาง abiotic จะเหนวาเมอมปรมาณวสดมากขนจะทาใหปรมาณฟนอลถกกาจดมากขน และสดสวนเซลลตรงตออาหารเหลว 1:10 (w/v) มการกาจดฟนอลลดลงอยางมนยสาคญ เมอเทยบกบสดสวนเซลลตรงตออาหารเหลว 3:10 และ 6:10 (w/v) เพราะฉะนนจงเลอกใชสดสวนของเซลลตรงตออาหารเหลวท 1:10 (w/v) มาศกษาประสทธภาพการยอยสลายฟนอลทความเขมขนตางๆ ในขนตอนตอไป อยางไรกตาม เนองจากการทดลองนไมไดมการศกษาการใชเซลลตรงตออาหารเหลวในปรมาณนอยกวาสดสวน 1:10 (w/v) ซงอาจเปนไปไดวาถาใชปรมาณเซลลตรงนอยกวาน ประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลอาจยงมคาใกลเคยงกบสดสวนขางตน ซงแสดงวาเซลลตรงมความสามารถในการยอยสลายฟนอลไดดถงแมจะใชในปรมาณนอย

รปท 14 ประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของสดสวนเซลลตรงบน EFB ตออาหารเลยงเชอเหลว CFMM 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) โดยมความเขมขนฟนอลเรมตน 30 มลลกรมตอลตร

41

หมายเหต: เปรยบเทยบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลระหวางสดสวนเซลลตรงตออาหารเหลว 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) ของเซลลตรงบน EFB มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต เมอตวอกษรภาษาองกฤษตวใหญแตกตางกน, เปรยบเทยบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลระหวางเซลลตรงบน EFB และชดควบคม EFB ปราศจากเซลลในแตละสดสวนเซลลตรงตออาหารเหลว มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต เมอตวอกษรภาษาองกฤษตวเลกแตกตางกน และเปรยบเทยบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลระหวางสดสวนเซลลตรงตออาหารเหลว 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) ของ EFB ปราศจากเซลล มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต เมอตวอกษรภาษาไทยแตกตางกน (ทระดบความเชอมน 95%, P<0.05) 6.3.2 ประสทธภาพการยอยสลายฟนอลทความเขมขนตาง ๆ นาเซลลตรงบน EFB โดยใชอาหารเลยงเชอปรมาตร 5 มลลลตร ตอเซลลตรงบน EFB ปรมาณ 0.5 กรม มาทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลในอาหารเลยงเชอเหลว CFMM ทมการแปรผนความเขมขนฟนอลตงแต 10, 30, 50, 100, 500 และ 5,000 มลลกรมตอลตร เปรยบเทยบกบเซลลอสระ (108 CFU/มลลลตร) ทความเขมขนฟนอลดงกลาวขางตน ในดานประสทธภาพของเปอรเซนตการลดลงของฟนอล (% phenol removal) คาคงทอตราการยอยสลายฟนอล (first-order degradation rate constant: k1) และอตราการยอยสลายฟนอลจาเพาะสงสด (maximum specific degradation rate: k2) ซง k1 และ k2 เปนพารามเตอรทชวยใหสามารถเปรยบเทยบประสทธภาพระหวางสองระบบไดชดเจนขน ในกรณปรมาณเซลลเรมตนของเซลลตรง และเซลลอสระอาจไมเทากน จากผลการทดลอง (รปท 15, 16 และตารางท 12) แสดงใหเหนวาทความเขมขนฟนอล 10 มลลกรมตอลตร เซลลอสระสามารถบาบดฟนอลไดดกวาเซลลตรง ซงมความแตกตางอยางมนยสาคญ (P < 0.05) โดยสามารถลดปรมาณฟนอลได 95% และ 80% ตามลาดบ ภายในเวลา 24 ชวโมง มคา k1 เทากบ 0.38 และ 0.31 h-1 และมคา k2 เทากบ 0.0010 และ 0.0013 มลลกรมฟนอลตอมลลกรมเซลลตอชวโมง ตามลาดบ อยางไรกตามเมอความเขมขนฟนอลเพมขนตงแต 30–5,000 มลลกรมตอลตร พบวาเซลลตรงสามารถกาจดฟนอลไดดกวาเซลลอสระซงมความแตกตางอยางมนยสาคญ (P < 0.05) โดยเซลลตรงมคาการยอยสลายฟนอลประมาณ 70-98% มคา k1 และคา k2 อยในชวงระหวาง 0.0019-0.048 h-1 และ 0.0007–0.0360 มลลกรมฟนอลตอมลลกรมเซลลตอชวโมง ตามลาดบ ในขณะทเซลลอสระสามารถยอยสลายฟนอลไดประมาณ 17-52% ซงมคา k1 และคา k2 อยในชวงระหวาง 0.0017–0.03 h-1 และ 0.0001–0.0060 มลลกรมฟนอลตอมลลกรมเซลลตอชวโมง ตามลาดบ

42

รปท 15 ปรมาณฟนอลทเหลอหลงจากถกยอยสลายโดยเซลลตรงบน EFB เปรยบเทยบกบเซลลอสระ (free

cells) โดยทดลองทความเขมขนฟนอล 10 และ 30 มลลกรมตอลตร ทเวลา 24 ชวโมง ความเขมขนฟนอล

50 มลลกรมตอลตร ทเวลา 72 ชวโมง ความเขมขนฟนอล 100 มลลกรมตอลตรทเวลา 96 ชวโมง และ

ความเขมขนฟนอล 500 และ 5,000 มลลกรมตอลตร ทเวลา 120 ชวโมง

หมายเหต: เปรยบเทยบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลระหวางเซลลตรงบน EFB และเซลลอสระในแตละความเขมขนฟนอล มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (ทระดบความเชอมน 95%, P<0.05) เมอตวอกษรแตกตางกน จากผลการทดลองแสดงใหเหนวา ประสทธภาพของเซลลตรง และเซลลอสระในการกาจด ฟนอลในเชง % การกาจด คา k1และ k2 มแนวโนมเปนไปในทศทางเดยวกน นนคอ เมอความเขมขนฟนอลตาประมาณ 10 มลลกรมตอลตร เซลลอสระมคาคงทอตราการยอยสลายฟนอลสงกวาเซลลตรง อาจเปนไปไดวาทความเขมขนดงกลาวมวลของฟนอลจะแพรผานเขาสเซลลตรงไดนอยและชา เนองจากเซลลตรงมขอจากดในการแพรผานของสาร (Wang et al., 2007; Passos et al., 2010) ในขณะทเซลลอสระสามารถสมผสกบฟนอลไดโดยตรง จงทาใหการกาจดฟนอลทความเขมขนดงกลาวเกดขนไดดกวา แตเมอความเขมขนฟนอลสงกวา 10 มลลกรมตอลตร เซลลอสระมคาคงทอตราการยอยสลายฟนอลตากวาเซลลตรง (รปท 16) ทงนอาจเนองมาจากฟนอลทความเขมขนสงมผลยบยงการเจรญหรอการทางานหรอมความเปนพษ

43

ตอเซลลอสระ ทาใหประสทธภาพในการกาจดฟนอลลดลง ในขณะทเซลลตรงมวสดตรงทาหนาทปกปองเซลลจากความเขมขนฟนอลสงได จงทาใหมประสทธภาพในการกาจดฟนอลไดดกวาเซลลอสระ

รปท 16 คาคงทอตราการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงบน EFB และเซลลอสระทฟนอลความเขมขนตางๆ ผลการศกษามความสอดคลองกบงานวจยทผานมา ซงรายงานวาเซลลตรงมประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลความเขมขนสงไดดกวาเซลลอสระ เชน จากการศกษาการใชโพลยรเทน โฟม (polyurethane foam) ตรง Acinetobacter sp. พบวาเซลลทมการตรงจะสามารถเจรญไดทความเขมขนของฟนอล 1,500 มลลกรมตอลตร และสามารถยอยสลายฟนอลได 19.7 มลลกรมตอลตรตอชวโมง ในขณะทเซลลทไมไดตรงบนโพลยรเทนโฟม (เซลลอสระ) ถกยบยงการเจรญเตบโตทความเขมขนของฟนอล 1,000 มลลกรมตอลตร (Adav et al., 2007) จากการตรงเซลล Acinetobacter sp. XA05 และ Sphingomonas sp. FG03 บน polyvinyl alcohol (PVA) โดยใชเชอทแยกจากกากตะกอนเรง (Activated sludge) ซงไดทาการศกษาการยอยสลายฟนอลเปรยบเทยบระหวางเซลลอสระ และเซลลตรง พบวาเซลลทไมตรงบน PVA (เซลลอสระ) มอตราการยอยสลายฟนอล 0.95 มลลกรมฟนอลตอชวโมง สวนเซลลทตรงบน PVA มอตราการยอยสลายฟนอล 1.20 มลลกรมฟนอลตอชวโมง (Liu et al., 2009) และจากรายงานการใชเมดบดตรงกากตะกอนเรง พบวาเซลลตรงมการยอยสลายฟนอลไดทชวงความเขมขนของฟนอล 3,000 มลลกรมตอลตร โดยมประสทธภาพการยอยสลายมากกวา 95% ในเวลา 28 ชวโมง ทงนเซลลอสระถกยบยงการยอยสลายทความเขมขนของฟนอล 3,000 มลลกรมตอลตร แตในขณะทเซลลตรงไมถกยบยงทความเขมขน

44

ดงกลาว (Lee et al.,2009) จากรายงานการตรง Aspergillus awamori สายพนธ NRRL 3112 บน polyacrylonitrile membrane พบวาเซลลอสระ และเซลลตรงมอตราการยอยสลายฟนอล 1.16 และ 6.25 มลลกรมตอชวโมง ตามลาดบ (Yordanova et al., 2009) นอกจากนนจากรายงานการศกษาของ Ahmad et al. (2012) พบวาเซลลตรง Acinetobacter sp. สายพนธ AQ5NOL 1 ใน gellan gum สามารถยอยฟนอลไดอยางสมบรณภายในเวลา 108, 216 และ 240 ชวโมง ทความเขมขนฟนอล 1,100, 1,500 และ 1,900 มลลกรมตอลตร ตามลาดบ ในขณะทเซลลอสระยอยสลายฟนอลไดสมบรณภายในเวลา 240 ชวโมง ทความเขมขนฟนอล 1,100 มลลกรมตอลตร ตารางท 12 อตราการยอยสลายจาเพาะของฟนอลทความเขมขนตางๆ

ความเขมขนฟนอล (มลลกรมตอลตร)

อตราการยอยสลายฟนอลจาเพาะ (มลลกรมฟนอลตอมลลกมเซลลตอชวโมง)

เซลลตรงบน EFB เซลลอสระ

10 0.0013 0.0010 30 0.0360 0.0012 50 0.0013 0.0004 100 0.0007 0.0001 500 0.0029 0.0007

5,000 0.0250 0.0060 6.3.3 การนาเซลลตรงกลบมาใชซา เมอนาเซลลตรงบน EFB ทผานการทดสอบการยอยสลายฟนอลทความเขมขน 30 มลลกรมตอลตร มาทดสอบการนากลบมาใชซา เพอศกษาประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงวาสามารถนากลบมาใชซาไดกครง พบวาเซลลตรงมประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลคอนขางคงทประมาณ 98% ภายใน 24 ชวโมง เมอผานการใชซา 10 ครง (รปท 17) ทงนเซลลตรงยงคงประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลไดเทากบเซลลตรงทเพงใชงานครงแรก ซงชวยลดระยะเวลา และคาใชจายในการเตรยมหวเชอใหม และจากการศกษาลกษณะการเปลยนแปลงของพนผววสดและเซลลตรงหลงจากการใชซา ดวยเทคนค SEM แสดงใหเหนวาวสดมลกษณะเปลยนแปลงไปเลกนอย และยงมปรมาณเซลลทถกตรงหลงเหลออยบนวสด ดงรปท 18 นอกจากนนผลการทดสอบการเกบเซลลตรงทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 4 สปดาห พบวาเซลลตรงทเกบไวสามารถยอยสลายฟนอลได 90% ภายในเวลา 24 ชวโมง แสดงวาเซลลตรงทเกบรกษาไวยงคงมประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลไดใกลเคยงกบเซลลตรงทเพงเตรยมใหม

45

อาจมสาเหตมาจากเซลลตรงมความเสถยร และวสดตรงสามารถปกปองเซลลแบคทเรยจากสภาวะทไมเหมาะสม รวมทงจากการปนเปอนไดด ในขณะทการเกบเซลลตรงทอณหภมหองอาจมความเสยงตอการปนเปอนจลนทรยชนดอนไดงาย เนองจากแบคทเรย และเชอราหลายชนดสามารถเจรญไดดในสภาวะอณหภมหอง

รปท 17 ปรมาณฟนอลทถกยอยสลายโดยเซลลตรงบน EFB หลงจากผานการใชงานแลว 10 ครงในอาหารเลยงเชอ CFMM ทเตมฟนอล จากการศกษาของ Obuekwe and Al-Muttawa (2001) พบวาเซลลแบคทเรย Arthrobacter sp. ตรงบนขเลอย Styrofoam และราขาวสาล สามารถรกษาประสทธภาพการยอยสลายปโตรเลยมไฮโดรคารบอน หลงจากเกบเซลลตรงไวนาน 6 สปดาหท 45 องศาเซลเซยส Liu et al. (2009) รายงานวาเซลลตรง Acinetobacter sp. XA05 และ Sphingomonas sp. FG03 บน polyvinyl alcohol (PVA) สามารถนาเซลลกลบมาใชใหมได ซงยงสามารถลดปรมาณฟนอลได 93% หลงจากเกบไว 50 วน แตเซลลอสระจะมอตราการยอยสลายฟนอลลดลงหลงจากทเกบไว 10 วน ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส อยางไรกตามการตรงเซลลสายพนธ XA05 และ FG03 สามารถนากลบมาใชใหมไดอยางนอย 20 ครง จากรายงานของ Ying et al. (2007) ใช polyvinyl alcohol (PVA) ในการตรงเซลล Acinetobacter sp. สายพนธ PD 12 พบวาสามารถเกบเซลลทอณหภม 4 องศาเซลเซยล ไดนาน 50 วน นอกจากนการศกษาของ Ahmad et al. (2012) พบวาเซลลตรง Acinetobacter sp. สายพนธ AQ5NOL1 ใน gellan gum สามารถรกษาประสทธภาพการยอยสลายฟนอลโดยนาเซลลตรงกลบมาใชซาไดอยางนอย 45 ครง

46

(a) (b) รปท 18 ลกษณะการเปลยนแปลงของพนผว EFB และเซลลทถกตรงวเคราะหดวยเทคนค SEM ทกาลงขยาย 10000x-15000x; กอนการยอยสลายฟนอล (a) และหลงการนากลบมาใชยอยสลายฟนอลซาจานวน 5 ครง (b) 6.4 ประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงบน EFB ในนาทงโรงงานสกดนามนปาลม การทดลองนเลอกใชนาทงจากโรงงานสกดนามนปาลมเปนนาเสยตนแบบทมการปนเปอนของ ฟนอล ปาลมนามนถอเปนพชเศรษฐกจทสาคญของประเทศไทย อตสาหกรรมสกดนามนปาลมดบกอใหเกดนาเสยทมสารอนทรยสง มสคลา ซงสวนหนงมสาเหตมาจากสารประกอบฟนอลทเปนองคประกอบในนาเสย ซงสารประกอบฟนอลถกสกดออกมาจากผลปาลมในระหวางกระบวนการสกดนามนปาลมแบบมาตรฐาน (แบบใชนา) จงมความจาเปนในการพฒนาเทคโนโลยทมประสทธภาพ ราคาถก และไมกอใหเกดผลกระทบตอสงแวดลอมในการจดการปญหานาเสยจากอตสาหกรรมสกดนามนปาลม 6.4.1 ผลของปรมาณเซลลตรงตอประสทธภาพการยอยสลายฟนอล เนองจากองคประกอบของนาทงมปรมาณสารอนทรยคอนขางสง เมอเปรยบเทยบกบการศกษาในอาหารเลยงเชอ รวมทงมการเพมขนาดของวสดทใชตรงใหมขนาดใหญขน เพอความสะดวกในการนาไปใชงานบาบดนาเสย จงตองทาการแปรผนปรมาณของเซลลตรงตอสดสวนนาทงเพมเตม โดยการแปรผนปรมาณเซลลตรงตอนาทง 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) ทดสอบในนาทงทผานการทาใหปราศจากเชอจลนทรย เพอศกษาวาปรมาณเซลลตรงตอนาทงทอตราสวนใดมประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลได

47

ดทสด ผลการทดลองพบวาสดสวนเซลลตรงตอนาทง 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) สามารถยอยสลายฟนอลไดแตกตางกนอยางมนยสาคญ คอ 40%, 64% และ 53% ตามลาดบ (รปท 19) ทงนอาจกลาวไดวาปรมาณเซลลตรง 3 กรม หรอสดสวนเซลลตรงตอนาทง 3:10 (w/v) มปรมาณเซลลแบคทเรยเหมาะสมเพยงพอในการยอยสลายฟนอลในนาทง เมอเปรยบเทยบกบผลการทดลองสดสวนเซลลตรงตออาหาร CFMM พบวาสดสวนเซลลตรงทเหมาะสมสาหรบนาทงมปรมาณมากกวาความตองการในอาหารเหลว ซงใชเพยงสดสวน 1:10 (w/v) ทงนอาจเปนไปไดวาในการทดลองนมการเพมขนาดของวสดตรงทใชจาก 0.5-1 มลลเมตรเปน 1x1x1 เซนตเมตร ซงขนาดทเพมขนอาจมผลตอปรมาณการเกาะตดของเซลลบนวสด และอตราการแพรผานของสารเขาสเซลลตรง และอกปจจยหนง ไดแก องคประกอบของนาทง อาจมผลตอประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรง ดงนนจงนาอตราสวนของเซลลตรงตอนาทงท 3:10 (w/v) มาศกษาในการทดลองตอไป สาหรบชดควบคมเพอศกษาผลของกระบวนการทางกายภาพและเคมตอการลดลงของฟนอล (abiotic controls) พบวาชดควบคม EFB ปราศจากเซลลดดซบฟนอลไดแตกตางกนอยางมนยสาคญ ทสดสวน EFB ตอนาทง 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) คอ 3, 7 และ 9% ตามลาดบ (รปท 19) ซงทสดสวนเซลลตรงตอนาทง 1:10 (w/v) มการกาจดฟนอลลดลงอยางมนยสาคญ เมอเทยบกบสดสวนเซลลตรงตอนาทง 3:10 และ 6:10 (w/v)

รปท 19 ประสทธภาพการยอยสลายฟนอลในนาทงโรงงานสกดนามนปาลมของเซลลตรงบน EFB โดยการแปรผนปรมาณของเซลลตรงทสดสวนตางๆ

48

หมายเหต: เปรยบเทยบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลระหวางสดสวนเซลลตรงตอนาทง 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) ของเซลลตรงบน EFB มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต เมอตวอกษรภาษาองกฤษตวใหญแตกตางกน, เปรยบเทยบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลระหวางเซลลตรงบน EFB และชดควบคม EFB ปราศจากเซลลในแตละสดสวนเซลลตรงตอนาทง มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต เมอตวอกษรภาษาองกฤษตวเลกแตกตางกน และเปรยบเทยบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลระหวางสดสวนเซลลตรงตอนาทง 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) ของ EFB ปราศจากเซลล มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต เมอตวอกษรภาษาไทยแตกตางกน (ทระดบความเชอมน 95%, P<0.05) 6.4.2 ผลการกระตน (Activation) และการปรบตว (Acclimation) ของเซลลตรง 6.4.2.1 การกระตนเซลลตรงดวยฟนอล ศกษาผลการกระตนเซลลตรงดวยฟนอลตอประสทธภาพการยอยสลายฟนอลในนาทง โดยการนาเซลลตรงบน EFB มากระตนดวยฟนอลทความเขมขน 10 มลลกรมตอลตรในอาหาร CFMM เปนเวลา 24 ชวโมง ทงนการกระตนเซลลตรงดวยฟนอลจะเปนการชกนา และรกษาการผลตเอนไซมภายในเซลลกอนนาไปใช เนองจากในขนตอนการตรงเซลลจลนทรยตองอาศยระยะเวลาในการบมเซลลรวมกบวสดไวถง 6 วน เพอใหเกดการสงเคราะหเสนใย EPS ในการยดตดกบผนงของวสดตรง ซงในกระบวนการดงกลาวไมมการเตมแหลงคารบอนใดๆ ดงนนทาใหเซลลอยในภาวะขาดแคลนอาหาร และอาจสงผลตอการเจรญ และการผลตเอนไซมทเกยวของในการยอยสลายฟนอลในนาทง จากการทดลองพบวาเซลลตรงบน EFB ทผานการกระตนดวยฟนอลสามารถลดปรมาณฟนอลในนาทงได 64% ภายในเวลา 7 วน ซงมความสามารถในการกาจดฟนอลไดสงกวาเซลลตรงทยงไมผานการกระตนดวยฟนอลอยางมนยสาคญ ซงลดฟนอลไดเพยง 35% (ตารางท 13) นอกจากนนผลการทดสอบประสทธภาพของเซลลตรงในการยอยสลายฟนอลในนาทงทไมผานการฆาเชอจลนทรย พบวาเซลลตรงบน EFB ยงสามารถยอยสลายฟนอลไดประมาณ 71% ภายในเวลา 7 วน ซงสงกวาการใชนาทงทผานการฆาเชอเลกนอย อาจเปนผลเสรมมาจากจลนทรยทสามารถยอยสลายฟนอลไดทมอยเดมในนาทง จากการนบจานวนเซลลแบคทเรยในวนเรมตนและหลงการบาบดพบวา ในวนท 0 ของการทดลอง เซลลตรงมจานวนแบคทเรย 2.27×1010 CFU/กรมวสด และหลงการทดลองผานไป 7 วน พบวาจานวนแบคทเรยมจานวนเพมขน ซงมจานวนเทากบ 4.83×1010 CFU/กรมวสด และพบวามจานวนแบคทเรยในนาทงเทากบ 2.0×1010 CFU/มลลลตร โดยพบวาเซลลตรงมจานวนเซลลเพมขน ในขณะทปรมาณฟนอล และสารอนทรยในรป BOD และ COD ในนาทงลดลง แสดงใหเหนวาเซลลตรงสามารถยอย

49

สลายฟนอล โดยใชฟนอล รวมทงสารอนทรยอนๆ ในนาทงเปนแหลงคารบอนและพลงงานในการเจรญเตบโต ตารางท 13 องคประกอบของนาทงโรงงานสกดนามนปาลมกอน และหลงการบาบดดวยเซลลตรงบน EFB ทผานการกระตนดวยฟนอล

พารามเตอร *คามาตรฐานคณภาพนาทง **กอนบาบด หลงบาบด

pH 5.5-9.0 8.2 7.9 BOD (มก./ล.) ไมเกน 60 มก./ล. 725 61.5

COD (มก./ล.) ไมเกน 400 มก./ล. 10,296 1,355

TKN (มก./ล.) ไมเกน 200 มก./ล. 210 64

TP (มก./ล.) - 17.2 16.2 Oil & Grease (มก./ล.)

ไมเกน 15 มก./ล. 30 5

Phenols (มก./ล.) ไมเกน 1.0 มก./ล. 30 8 Color (%) - 100 75

ทมา: *ประกาศกระทรวงวทยาศาสตร เทคโนโลยและสงแวดลอม ฉบบท 3 (พ.ศ. 2539) ลงวนท 3 มกราคม 2539 เรองกาหนดมาตรฐานควบคมการระบายนาทงจากแหลงกาเนดประเภทโรงงานอตสาหกรรมและนคมอตสาหกรรม ตพมพในราชกจจานเบกษา เลมท 113 ตอนท 13 ลงวนท 13 กมภาพนธ 2539 ** นาทงจากโรงงานสกดนามนปาลม จงหวดสตลเกบตวอยางวนท 29 มนาคม 2554 จากการวเคราะหองคประกอบของนาทงกอนและหลงการบาบดดงตารางท 13 พบวาปรมาณ COD ลดลงประมาณ 87 % จากความเขมขนเรมตน 10,296 มลลกรมตอลตร เหลอประมาณ 1,355 มลลกรมตอลตร และปรมาณ BOD ลดลงประมาณ 92% จาก 725 มลลกรมตอลตร เหลอ 61.5 มลลกรมตอลตร ซงเปนขอดของการบาบดนาทงดวยเซลลตรงบน EFB ดวยวธการน ทงนพบวาคา pH หลงการบาบดเทากบ 7.94 คา TKN, TP และ Oil & Grease หลงการบาบดเทากบ 64, 16.2 และ 5 มลลกรมตอลตร ตามลาดบ ดงนน นอกจากคา COD แลว พบวาคาพารามเตอรอนมคาอยในเกณฑคามาตรฐานคณภาพนาทง นอกจากนนพบวาหลงการบาบดสามารถลดความเขมของสทเกดจากสารประกอบฟนอลลงไดประมาณ 25% (ตารางท 13) อยางไรกตามพบวาประสทธภาพของเซลลตรงในการบาบดฟนอลลดลง เมอเทยบกบ

50

การศกษาในอาหารเหลว CFMM เนองจากในองคประกอบของนาทงยงมสารประกอบในกลมฟนอลกชนดอนๆ รวมอยดวย ซงอาจมผลตอการทางานของเซลลตรง ในขณะทการศกษาในอาหารเหลวมเฉพาะฟนอลเพยงชนดเดยว 6.4.2.2 การปรบตวของเซลลตรงดวยนาทงทผานการเจอจาง ศกษาผลการปรบตวของเซลลตรงดวยการเลยงในนาทงทผานการเจอจาง โดยการนาเซลลตรงบน EFB มายอยสลายฟนอลในนาทงทมการปรบความเขมขนของนาทงใหเพมขนอยางชาๆ เพอใหเวลาเซลลตรงมการปรบตวกอนนาไปทดสอบดวยนาทงทไมผานการเจอจาง เนองจากในนาทงยงมอนพนธของฟนอลเปนองคประกอบดวย ซงอนพนธของฟนอลบางชนดแมวาจะมความเขมขนตา กอาจมความเปนพษตอเซลลตรง และสามารถยบยงการทางานของเซลลได โดยใชสดสวนนาทงทฆาเชอแลวตออาหารเหลว CFMM 25, 50 และ 100% (v/v) ตามลาดบ จากการทดลองพบวาทสดสวนนาทงตออาหารเหลว CFMM 25% เซลลตรงลดฟนอลได 13, 23 และ 29% ทเวลา 1, 3 และ 5 วน และสดสวนนาทงตออาหารเหลว CFMM 50% เซลลตรงลดฟนอลได 29, 50 และ 51% ทเวลา 1, 3 และ 5 วน และสดสวนนาทงตออาหารเหลว CFMM 100% เซลลตรงสามารถลดฟนอลได 30, 41, 52 และ 54% ภายในระยะเวลา 1, 3, 5 และ 7 วน (ตารางท 14) ซงทสดสวนาทงตออาหารเหลว 25% มประสทธภาพการกาจดฟนอลแตกตางอยางมนยสาคญ เมอเทยบกบสดสวนนาทงตออาหารเหลว CFMM 50% และ 100% ณ วนสนสดการทดลอง และเมอใชเซลลตรงทไมผานการปรบตว พบวาเซลลตรงลดฟนอลได 35% ทงนอาจเนองมาจากสารประกอบ ฟนอลทเปนองคประกอบในนาทงมผลยบยงการทางานของเซลลตรง จงทาใหเซลลตรงทไมผานการปรบตว มประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลนอยกวาเซลลตรงทผานการปรบตวดวยการเลยงในนาทงเจอจางกอน จากการศกษาทผานมารายงานวาจลนทรยทผานขนตอนการปรบตว จะมความสามารถในการยอยสลายมลพษเพมขน ดงรายงานของ Lu et al. (2009) ซงใชเชอราผขาว (white rot fungus) ตรงบนเศษไม เพอยอยสลายสารประกอบฟนอลกจากนาทงโรงงานผลตโคก โดยทาการปรบสภาพเชอราในนาทงเจอจาง 50% กอน พบวาเชอราสามารถยอยสลายสารประกอบฟนอลกได 87% ภายในเวลา 6 วน และจากการศกษาของ Gonzalez et al. (2001) รายงานการยอยสลายฟนอลในนาเสยโรงงานผลตเรซนโดย Psuedomonas putida ATCC 17484 ตรงบน calcium alginate gel ซงมความเขมขนฟนอลประมาณ 1,000 มลลกรมตอลตร พบวาเซลลตรงลดปรมาณฟนอลจาก 340 ชวโมง (ปรบสภาพเซลลครงท 1) เหลอ 260 ชวโมง หลงจากการปรบสภาพเซลลครงท 2 ดวยการเจอจางนาเสย

51

ตารางท 14 ปรมาณฟนอลทลดลง (%) โดยใชเซลลตรงดวยวธตางๆ

วธ สดสวนนาทงตอ

อาหารเหลว CFMM *ปรมาณฟนอลท

ลดลง (%) เวลาทใชในการยอยสลายฟนอล (วน)

Non-activation 100: 0 35A 7 Activation 100: 0 64B 7 Acclimation 25:75 29a 5

50: 50 51b 5

100:0 53Cb 7

Activation and Acclimation

25: 75 52 a 5

50: 50 65 b 7

100: 0 72D b 10

* เปรยบเทยบระหวางวธไมผานการกระตนเซลลตรงดวยฟนอล (Non activation) และวธการกระตนเซลลตรงดวยฟนอล (Activation) วธการปรบตวของเซลลตรงดวยการเจอจางนาทง (Acclimation) และวธรวมระหวางการกระตนและการปรบตวของเซลลตรงดวยนาทงทผานการเจอจาง (Activation and Acclimation) มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต (ทระดบความเชอมน 95%, P<0.05) เมอตวอกษรภาษาองกฤษตวใหญแตกตางกน และเปรยบเทยบระหวางวธการปรบตวของเซลลตรงดวยการเจอจางนาทง (Acclimation) และวธรวมระหวางการกระตนและการปรบตวของเซลลตรงดวยนาทงทผานการเจอจาง (Activation and Acclimation) ทสดสวนนาทงตออาหารเหลว CFMM 25%, 50% และ 100% ทชดการทดลองเดยวกน มความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต เมอตวอกษรภาษาองกฤษตวเลกแตกตางกน 6.4.2.3 ผลการกระตนรวมกบการปรบตวของเซลลตรง ศกษาผลการกระตนและการปรบตวของเซลลตรง โดยการนาเซลลตรงบน EFB มากระตนดวยฟนอลทความเขมขน 10 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 24 ชวโมง จากนนนาเซลลตรงมาเลยงในนาทงทผานการเจอจาง โดยมการปรบความเขมขนของนาทงใหมากขนอยางชาๆ ใชสดสวนนาทงทฆาเชอแลวตออาหารเหลว CFMM 25, 50 และ 100% (v/v) ตามลาดบ จากการทดลอง พบวาหลงการกระตนดวยฟนอล แลวนาเซลลตรงไปปรบตวในนาทงทเจอจางตงแต 25-100% พบวาเซลลตรงลดฟนอลไดเพมขนเปนลาดบ โดยในสดสวนนาทงตออาหารเหลว CFMM 25% เซลลตรงลดฟนอลได 52% ภายในเวลา 5 วน จากนนเลยงในสดสวนนาทงตออาหารเหลว CFMM 50% เซลลตรงลดฟนอลได 66% เปนเวลา 5 วน และสดสวนนาทงตออาหารเหลว CFMM 100% เซลลตรงลดฟนอลได 72% ภายในระยะเวลา 10 วน (ตารางท 14)

52

ในขณะทสดสวนนาทงตออาหารเหลว 25% มประสทธภาพการกาจดฟนอลแตกตางอยางมนยสาคญ เมอเทยบกบสดสวนนาทงตออาหารเหลว CFMM 50% และ 100% และเมอใชเซลลตรงทยงไมผานการกระตนดวยฟนอล และไมผานการปรบตวดวยการเจอจางนาทง พบวาเซลลตรงลดฟนอลได 35% อาจเนองมาจากเซลลตรงขาดการกระตนเพอชกนา และรกษาการผลตเอนไซมภายในเซลล จงทาใหเซลลตรงมประสทธภาพการยอยสลายฟนอลนอยกวาเซลลตรงทผานการกระตน และการปรบตว จากการวเคราะหความแปรปรวนทางเดยว โดยใชสถต one way-ANOVA เปรยบเทยบความแตกตางระหวางวธการเตรยมเซลลตรงกอนนาไปใชดวยวธตางๆ ไดแก 1) ไมผานการกระตนและการปรบตว (Non-activation and non-acclimation) 2) วธการกระตนเซลลตรงดวยฟนอล (Activation) 3) วธการปรบตวเซลลตรงในนาทงเจอจาง (Acclimation) และ 4) วธรวมระหวางการกระตนและการปรบตว (Activation and acclimation) มประสทธภาพการยอยสลายฟนอลแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถตทระดบ 0.05 อยางไรกตาม จะเหนไดวาประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงทถกกระตนหรอปรบตวแลวในนาทงโรงงานสกดนามนปาลม มคาตากวาการบาบดฟนอลในอาหารเลยงเชอทมฟนอล ทงนอาจเนองมาจากในนาทงโรงงานสกดนามนปาลมมทงฟนอล อนพนธของฟนอล และสารมลพษอนๆ ทปนเปอนในนาทงดวย ซงอาจสงผลตอการเจรญและกจกรรมการยอยสลายฟนอลของเซลลตรง จากงานวจยนพบวาเซลลตรงมประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลในอาหารเหลวเกอบ 100% ในขณะทสามารถยอยสลายฟนอลในนาทงไดประมาณ 64-72% ซงมประสทธภาพสงกวาการศกษากอนหนาน โดย Limkhuansuwan and Chaiprasert (2010) รายงานวาพบการปนเปอนของสารประกอบฟนอลก 33.64 มลลกรมตอลตร ในนาทงจากโรงงานสกดนามนปาลม และพบวา lactic acid bacteria สามารถยอยสลายสารประกอบฟนอลกไดประมาณ 44% จากผลการศกษาการยอยสลายฟนอลในนาทงโรงงานสกดนามนปาลมดวยเซลลตรงบน EFB ในงานวจยน พบวาความเขมขนฟนอลทเหลอในนาทงยงมคาสงกวาคามาตรฐานคณภาพนาทงจากอตสาหกรรม ซงกาหนดใหมปรมาณฟนอลสงสดไมเกน 0.1 มลลกรมตอลตร อยางไรกตาม สามารถนานาทงทผานการบาบดแลว มาผานการบาบดซาอกครง หรออาจมการศกษาประสทธภาพการบาบดฟนอลในระบบบาบดแบบกงกะ (Fed batch system) หรอระบบทมความตอเนอง (Continuous system) ซงอาจทาใหคาความเขมขนฟนอลในนาทงลดลงอยในเกณฑมาตรฐานคณภาพนาทงได 6.4.3 การนาเซลลตรงมาใชซาเพอบาบดนาทง เมอนาเซลลตรงบน EFB ทผานการกระตนดวยฟนอล มาทดสอบการยอยสลายฟนอลในนาทงซา เพอดประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของเซลลตรงวาสามารถนากลบมาใชซาไดกครง และยงคงมประสทธภาพการยอยสลายฟนอลไดเหมอนกบการใชครงแรกหรอไม ซงจะทาใหชวยลดระยะเวลา และคาใชจายในการเตรยมหวเชอใหม พบวาสามารถนาเซลลตรงกลบมาใชซาไดอยางนอย 10 ครง โดยเซลล

53

ตรงมประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลไดประมาณ 50-68% ภายในเวลา 7 วน (รปท 20) โดยพบวาประสทธภาพการนาเซลลตรงกลบมาใชซายอยสลายฟนอลในนาทงมประสทธภาพตากวาการนาเซลลตรงกลบมาใชซาในการยอยสลายฟนอลในอาหารเลยงเชอทมฟนอล อาจเนองมาจากองคประกอบตางๆ ในนาทงโรงงานสกดนามนปาลม สงผลตอการเจรญและกจกรรมการยอยสลายฟนอลของเซลลตรง รวมทงสงผลตอการเปลยนแปลงคณสมบตของพนผววสดตรง ซงอาจทาใหเซลลตรงเกดความเสยหาย และหลดออกจากวสดได เมอมการนามาใชซาหลายๆ ครง

รปท 20 ปรมาณฟนอลทถกยอยสลายโดยเซลลตรงบน EFB ทผานการใชซาจานวน 10 ครง ในนาทงโรงงานสกดนามนปาลม 7. สรปผลการทดลองและขอเสนอแนะ 7.1 สรปผลการทดลอง การผลต EPS ของแบคทเรย แบคทเรย Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp. PK1 ทง 2 ชนด มการผลต EPS ในระหวางการตรงเซลลบนวสดเศษเหลอปาลมนามน ซงพบวา Methylobacterium sp. NP3 มอตราในการสงเคราะหเสนใย EPS ไดเรวกวา Acinetobacter sp. PK1 และเมอนาแบคทเรยผสม 2 ชนด มาตรงบน

54

วสด EFB และ PF พบวาเซลลแบคทเรยผลต EPS บน EFB และ PF ไดคงทในวนท 6 และวนท 8 ตามลาดบ โดยปรมาณ EPS ทผลตขนมจานวนเพมขนประมาณ 80% เมอเทยบกบเรมตนทดลอง ดงนนจงทาการตรงเซลลทระยะเวลา 6 และ 8 วน บน EFB และ PF ตามลาดบ เพอใหเซลลมการเกาะตดกบวสดไดดเพยงพอ และปองกนการหลดของเซลลตรง เมอมการนาไปใช การทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของแบคทเรยตรงในอาหารเลยงเชอเหลว จากการคดเลอกวสดตรงระหวาง EFB และ PF โดยดจากประสทธภาพของเซลลตรงในการกาจด ฟนอลทความเขมขนเรมตน 30 มลลกรมตอลตร พบวาเซลลตรงทง 2 ชนด สามารถยอยสลายฟนอลไดเกอบสมบรณ (98%) โดยเซลลตรงบน EFB มอตราการกาจดฟนอลสงกวาเซลลตรงบน PF และมการดดซบฟนอลนอยกวา ดงนนจงเลอกใชเซลลตรงบน EFB มาใชทดสอบการยอยสลายฟนอลตอไป จากการแปรผนปรมาณเซลลตรงบน EFB ทสดสวนเซลลตรงตออาหารเหลว CFMM เทากบ 1:10, 3:10 และ 6:10 (w/v) พบวาการเตมเซลลตรงสดสวน 1:10 (w/v) มประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลสงถง 98% ภายในเวลา 24 ชวโมง เพราะฉะนนจงเลอกใชสดสวนของเซลลตรงตออาหารเหลวท 1:10 (w/v) มาศกษาประสทธภาพการยอยสลายฟนอลทความเขมขนตางๆ ในขนตอนตอไป จากการทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลดวยเซลลตรงบน EFB ในอาหารเลยงเชอเหลวทความเขมขนตางๆ ไดแก 10, 30, 50, 100, 500 และ 5,000 มลลกรมตอลตร พบวาทความเขมขนฟนอล 10 มลลกรมตอลตร เซลลอสระสามารถบาบดฟนอลไดดกวาเซลลตรง โดยสามารถลดปรมาณฟนอลได 95% และ 80% ตามลาดบ ภายในเวลา 24 ชวโมง อยางไรกตาม เมอความเขมขนฟนอลเพมขนตงแต 30–5,000 มลลกรมตอลตร พบวาเซลลตรงสามารถกาจดฟนอลไดดกวาเซลลอสระ ซงมคาการยอยสลายประมาณ 70-98% ในขณะทเซลลอสระสามารถยอยสลายฟนอลไดประมาณ 17-52% และผลการทดลองยงแสดงวาเซลลตรงมอตราการยอยสลายฟนอลสงกวาเซลลอสระททกความเขมขนของฟนอล นอกจากนนเซลลตรงยงสามารถนากลบมาใชซาไดอยางนอย 10 ครง โดยมประสทธภาพการยอยสลายฟนอลทความเขมขน 30 มลลกรมตอลตร ถง 99% ภายในเวลา 24 ชวโมง รวมทงสามารถเกบเซลลตรงไวไดนาน 1 เดอน ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส โดยประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลยงคงเดม การทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอลของแบคทเรยตรงในนาทงโรงงานสกดนามนปาลม จากการศกษาผลของการกระตนเซลลตรงดวยฟนอลความเขมขน 10 มลลกรมตอลตร เปนเวลา 24 ชวโมง พบวาเซลลตรงลดฟนอลในนาทงโรงงานสกดนามนปาลมได 64% ภายในเวลา 7 วน ในขณะทเซลลตรงทไมผานการกระตนดวยฟนอลสามารถกาจดฟนอลไดเพยง 35% และจากการศกษาผลของการ

55

ปรบตวเซลลตรงในนาทงทผานการเจอจางกอนนาไปใช พบวาเซลลตรงหลงการปรบสภาพสามารถลดปรมาณฟนอลในนาทงทไมไดเจอจางได 54% ภายในเวลา 7 วน นอกจากนนจากการยอยสลายฟนอลดวยวธรวมระหวางการกระตน และการปรบตวของเซลลตรง พบวาลดปรมาณฟนอลได 72% ภายในเวลา 10 วน และสามารถนาเซลลตรงกลบมาใชซาในการบาบดนาทงไดอยางนอย 10 ครง ซงมประสทธภาพในการยอยสลายฟนอลไดประมาณ 50–69% ดงนน ผลการศกษาแสดงใหเหนวาการเตรยมเซลลตรงบนวสดเศษเหลอปาลมนามน EFB และ PF สามารถทาไดโดยการบมเซลลแบคทเรยรวมกบวสด โดยใหอตราการเขยาประมาณ 130 รอบตอนาท เปนระยะเวลา 6 และ 8 วน ตามลาดบ อยางไรกตาม เซลลตรงทเตรยมไดควรนาไปผานการกระตนดวยฟนอลในอาหารเลยงเชอเหลว หรอผานการปรบตวในนาทงทเจอจาง หรอวธรวมระหวาง 2 วธการดงกลาว เพอชกนาและรกษาการผลตเอนไซมทเกยวของในการยอยสลายฟนอล รวมทงใหเซลลปรบตวมความทนทานตอสารประกอบฟนอล และอนพนธของฟนอลในนาทงโรงงานสกดนามนปาลมกอนนาไปใชงาน นอกจากนนยงสามารถนาเซลลตรงกบมาใชซาไดอยางนอย 10 ครง ซงชวยประหยดเวลา และคาใชจายในการเตรยมหวเชอใหม 7.2 ขอเสนอแนะ 1) ควรศกษาหรอคดเลอกวสดชนดอนๆ มาใชเปนวสดตรงเซลลเพมเตม หรอศกษาการปรบปรง

สภาพพนผวของวสดเศษเหลอปาลมนามน เชน สมบตในเชง hydrophobic interaction เพอเพม

ความสามารถในการเกาะตดของเซลลแบคทเรยบนวสด

2) จากการศกษานไดทาการทดลองในระบบกะ (batch system) เพอศกษาประสทธภาพการยอยสลายฟนอลเบองตน ดงนนควรมการศกษาเพมเตมโดยระบบทมความตอเนอง (continuous system) เพอประโยชนในการนาไปใชจรงในระบบบาบดนาเสยของโรงงานสกดนามนปาลม 3) ควรศกษาแนวทางการนาเซลลตรงไปประยกตใชบาบดนาทง เชน เตรยมเซลลตรงใสในภาชนะ ซงทาเปนลกษณะทนลอยในบอนาทง หรอพฒนาเปนระบบถงปฏกรณชวภาพทบรรจเซลลตรง เปนตน

56

8. บรรณานกรม ธรรมศกด ศรสขใส. 2547. การกาจดสารประกอบฟนอลในนาทงโรงงานนามนปาลมโดยการใช เอนไซมเปอรออกซเดส จากใบยางพารา, วทยานพนธวทยาศาสตรหาบณฑต สาขาการจดการ สงแวดลอม คณะการจดการสงแวดลอม มหาวทยาลยสงขลานครนทร. นงลกษณ สวรรณพนจ และปรชา สวรรณพนจ. 2544. จลชววทยาทวไป.สานกพมพแหงจฬาลงกรณ มหาวทยาลย. กรงเทพมหานคร. Seymour, 2001 นนทธร เภาราช . 2550. การคดแยกและศกษาลกษณะของแบคทเรยทนตอตวทาละลายจากดน. โครงการการเรยนการสอนเพอเสรมประสบการณ วทยานพนธปรญญาบณฑต ภาควชาจล ชววทยา คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย. พนสข ประเสรฐสรรพ, เสาวลกษณ จตรบรรเจดกล และอรญ หนพงศกตตกล. 2533. กระบวนการผลต การ ใชประโยชนวสดเศษเหลอทง และคณลกษณะของนาทงจากโรงงานสกดนามนปาลม. วารสาร สงขลานครนทร. 12: 169-176. พนสข ประเสรฐสรรพ, อรญ หนพงศกตตกลและโสภา จนทโสภา. 2544. เปรยบเทยบนาทงโรงงานสกด นามนปาลมดวยวธการทางชวภาพ ทางเคม และทางกายภาพ. วารสารสงขลานครนทร. 23: 807- 819. ปยะมาศ คงแขม. 2552. การตรงเชอผสมระหวาง Methylobacterium sp. NP3 และ Acinetobacter sp.

PK1 บนซลกาเพอใชยอยสลายฟนอล, วทยานพนธวทยาศาสตรหาบณฑต สาขาจลชววทยา อตสาหกรรม คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

Abd-El-Haleem, D., Zaki, S., Zaki, E and Moawad, H. 2002. Isolation and molecular characterization of Egyptian phenol degrader isolates. Microbial Ecology 43: 217-224.

Abdel-El-Haleem, D. 2003.Acinetobacter : environmental and biotechnological Applications. African Journal of Biotechnology 2 : 71-74.

Adav, S. S., Chen, M. Y., Lee, D.J. and Ren, N. Q. 2007. Degradation of phenol by Acinetobacter strain isolated from aerobic. Chemosphere 67: 1566–1572.

Ahmad, S. A., Shamaan, N. A., Koon, G. B., Shukor, M. Y. A. and Syed, M. A. 2012. Enhanced phenol degradation by immobilized Acinetobacter sp. strain AQ5NOL 1. World Journal of Microbiology and Biotechnology 28: 347-352.

Ahmaruzzaman, Md. 2008. Adsorption of phenolic compounds on low-cost adsorbents: A review. Advances in Colloid and Interface Science 143: 48–67.

57

Aken, V. B., Yoon, J. M. and Schnoor, J. L. 2004. Biodegradation of nitro-substituted explosives 2,4,6-trinitrotoluene, hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine, and octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5-tetrazocine by a phytosymbiotic Methylobacterium sp. associated with poplar tissues (Populus deltoides x nigra DN34). Applied Environmental Microbiology 1:508-517.

Aksu, Z. and Bulbul, G. 1999. Determination of the effective diffusion coefficient of phenol in Ca-alginate-immobilized P. putida beads. Enzyme and Microbial Technology 25: 344–348.

Aksu, Z. 2005. Application of biosorption for removal of organic pollutants: a review. Process Biochemistry 40: 997-1026.

Alam, Md. Z., Muyibi, S. A., Mansor, M. F. and Wahid, R. 2007. Activated carbons derived from oil palm empty fruit bunches: Application to environmental problems. Journal of Environmental Sciences 19: 103-108.

Alam, Md. Z., Ameem, E. S., Muyibi, S. A. and Kabbashi, N. A. 2009. The factors affecting the performance of activated carbon prepared from oil palm empty fruit bunches for adsorption of phenol. Chemical Engineering Journal 155: 191–198.

Aleksieva Z, Ivanova, D. and Godjevargova, T. 2002. Degradation of some phenol derivatives by Trichosporon cutaneum R57[J]. Process Biochemistry 37: 1215-1219.

Ali, S., Fernandez-Lafuente, R. and Cowan, D. A. 1998. Meta-pathway degradation of phenolics by thermophilic Bacilli. Enzyme and Microbial Technology 23 : 462– 468. APHA, AWWA and WEF. 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21th

edition. American Public Health Association. Washington DC. Attanun, T. and Chanchroensuk, J. 1999. Soil and plant analysis. Departmen of geology, Faculty of

agriculture, Kasertsart University, Bangkok, Thailand. Bai, J., Wen, J.P., Li, H.M. and Jiang, Y. 2007. Kinetic modeling of growth and biodegradation of

phenol and m-cresol using Alcaligenes faecalis. Process Biochemistry 42: 510-517. Banerjee, I., Modak, M. J., Bandopadhyay, K., Das, D. and Maiti, R. B. 2001. Mathematical model

for evaluation of mass transfer limitations in phenol biodegradation by immobilized Pseudomonas putida. Journal of Biotechnology 87: 211–223.

Barker, E.L., Peter, E.B., Petrecia, H.F. and Grant, S.K. 1978. Phenol poisoning due to contaminated drinking water. Archives of Environmental Health 33: 89-94. Bastos, A. E. R., Moon, D. H., Rossi, A., Trevors, J. T. and Tsai, S. M. 2000. Salt-tolerant phenol-

degrading microorganisms isolated from Amazonian soil samples. Archives of Microbiology 174: 346–352.

58

Bureau of Industrial Environment Technology, Department of Industrial Works and Ministry of Industry. 1997. Environmental Management Guideline for the Palm Oil Industry. Environmental Advisory Assistance for Industry.

Busca, G., Berardinelli, C. and Arrighi, L. 2008. Technologies for the removal of phenol from fluid streams: A short review of recent developments. Journal of Hazardous Materials 160: 265–288.

Campos, G. M., Pereira, P. and Roseiro, C. J. 2006. Packed-bed reactor for the integrated biodegradation of cyanide and formamide by immobilized Fusarium oxysporum CCMI 876 and Methylobacterium sp. RXM CCMI 908. Enzyme and Microbial Technology 38: 848–854.

Caposio, P., Pessione, E., Giuffrida, G., Conti, A., Landolfo, S., Giunta, C. and Gribaudo, G. 2002. Cloning and characterization of two catechol 1,2-dioxygenase genes from Acinetobacter radioresistens S13. Research in Microbiology 153 : 69–74.

Cassidy, M. B., Lee, H. and Trevors, J.T. 1996. Packed-bed reactor for the integrated biodegradation of cyanide and formamide by immobilized Fusarium oxysporum CCMI 876 and Methylobacterium sp. RXM CCMI 908. Enzyme and Microbial Technology 38: 848–854.

Chakraborty, S., Bhattacharya, T., Patel, T.N. and Tiwari, K.K. 2010. Biodegradation of phenol by native microorganisms isolated from coke processing wastewater. Journal of Environmental Biology 31 : 293-296.

Cheetham, P. S. J., Blunt, K. W. and Bucke, C. 1979. Physical studies on cell immobilization using calcium alginate gels. Biotechnology Bioengineering 21: 2155-2168.

Cohen, Y. 2001. Biofiltration-the treatment of fluids by microorganisms immobilized into the filter bedding material: a review. Bioresource Technology 77: 257–274.

Cordova-Rosa, S. M., Dams, R. I., Cordova-Rosa, E. V., Radetski, M. R., Corra, A. X. R. and Radetski, C. M. 2009. Remediation of phenol-contaminated soil by a bacterial consortium and Acinetobacter calcoaceticus isolated from an industrial wastewater treatment plant. Journal of Hazardous Materials 164: 61–66.

Cui, Z.C., Hu, Y.H., Yin, Y. and Qi, Y.Y. 2008. Isolation and characterization of a Carbamazepine- degrading strain of Acinetobacter sp. HY-7 from activated sludge. Journal of Biotechnology

136S : S678–S707. Cunningham, J. A., Kellner, J. D., Bridge, P.J., Trevenen ,C. L., Mcleod, D. R. and Davies, H. D.

2000. Disseminated bacille Calmette-Guérin infection in an infant with a novel deletion in the interferon-gamma receptor gene. International Union Against Tuberculosis and Lung Disease 4:791-794.

59

Diez M C, Mom M L, Videla, S. 1999. Adsorption of phenolic compounds and color from bleached haft mill effluent using allophonic compounds[J]. Water Resources 33: 125-130.

Dourado, M. N., Ferreira, A. Araujo, W. L., Azevedo, J. L. and Lacava, P. T. 2011. The diversity of endophytic Methylotrophic bacteria in an oil-contaminated and an oil-free mangrove ecosystem and their tolerance to heavy metals. Biotechnology Research International 2012 Article ID 759865,doi:10.1155/2012/759865.

El-Naas, M.H., Al-Muhtaseb, S.A. and Makhlouf, S. 2009. Biodegradation of phenol by Pseudomonas putida immobilized in polyvinyl alcohol (PVA) gel. Journal of Hazardous Materials 164: 720–725.

Fang-yao, M., Ming-zhang, H., Dan-mei, L., Ya-wen, L., Pei-shun, H., Hai, Y. and Guo-qing, S. 2007. Biodegradation of phenol by Pseudomonas putida immobilized in polyvinyl alcohol (PVA) gel. Journal of Environmental Sciences 19 : 1257–1260.

Ghodake, G., Jadhav, S., Dawkar, V. and Govindwar, S. 2009. Biodegradation of diazo dye Direct brown MR by Acinetobacter calcoaceticus NCIM2890. International Biodeterioration and Biodegradation 63 : 433–439.

González, D.M., Moreno, E., Sarmiento, J.Q. and Ramos-Cormenzana, A. 1990. Studies on anti bacterial activity of wastewaters from olive oil mills (Alpechin): Inhibitory activity of phenolic and fatty acids. Chemosphere 20: 423-432.

Gonzalez, G., Herrera, G., Garcia, M. T. and Pena, M. 2011. Biodegradation of phenolic industrial wastewater in a fluidized bed bioreactor with immobilized cells of Pseudomonas putida. Bioresource Technology 80 : 137-142.

Grady, Jr., C. P. L., Daigger, G. T. and Lim, H. C. 1999. Biological Wastewater Treatment, seconded. Marcel Dekker Inc, New York.

Grothe, E., Young, M. M. and Chisti, Y. 1999. Fermentation optimization for the production of poly (β-hydroxybutyric acid) microbial thermoplastic. Enzyme and Microbial Technology 25: 132-141.

Hao, O. J., Kim, M. H., Seagren, E. A. and Kim, H. 2002. Kinetics of phenol and chlorophenol utilization by Acinetobacter species. Chemosphere 46: 797–807.

Haseley, S. R., Holst, O. and Brade, H. 1997. Structural studies of the O-antigenic polysaccharide of the lipopolysaccharide from Acinetobacter. European Journal of Biochemistry 247:815-819.

60

Ignatov, V.O., Khorkina, A.N., Shchyogolev. Y. S., Singirtsev, N.I., Bunin, D.V., Tumaikina, A.Y. and Ignatov, V.V. 1999. Comparison of the electro optical properties and specie respiratory activity of Acinetobacter calcoaceticum A-122. FEMS Microbiology Letters 173 : 453–457.

Jung, M. W.,, Ahn, K. H., Lee, Y., Kim, K. P., Rhee, J. S., Park, J. T. and Paeng, K. J. 2001. Adsorption characteristics of phenol and chlorophenols on granular activated carbons (GAC). Microchemical Journal 70: 123-131.

Kafilzadeh, F., Farhangdoost, M. S. and Tahery, Y. 2010. Isolation and identification of phenol degrading bacteria from Lake Parishan and their growth kinetic assay. African Journal of Biotechnology 9: 6721-6726.

Kasamsuk, T. and Khanongnuc, C. 2007. Immobilization of Coriolus versicolor RC3 on natural carrier for textile wastewater decolorization. Available on website http://202.28.92.69/inter/images/Fervaap2007/Oral-Poster_Pre/Fullpaper/ORAL/O4-10.pdf.

Kavitha, V. and Palanivelu, K. 2004. The role of ferrous ion in Fenton and photo-Fenton process for the degradation of phenol. Chemosphere 55: 1235-1243.

Khongkhaem, P., Intasiri, A. and Luepromchai, E. 2011. Silica immobilized Methylobacterium sp. NP3 and Acinetobacter sp. PK1 degrade high concentrations of phenol. Letters in Applied Microbiology 52: 448–455. Knupp, G., Rücker, G., Ramos-Cormenzana, A., Garrido Hoyos, S., Neugebauer, M. and Ossenkop, T. 1996. Problems of identifying phenolic compounds during the microbial degradation of olive oil mill wastewater. International Biodeterioration and Biodegradation 38: 277-282. Kongjan, P., O-Thong , S., Kotay, M., Min, B. and Angelidaki, I. 2010. Biohydrogen production from

wheat straw hydrolysate by dark fermentation using extreme thermophilic mixed culture. Biotechnology and Bioengineering 105: 899–908.

Kourkoutas, Y., Bekatorou, A., Banat, M.I., Marchant, R. and Koutinas, A.A. 2004. Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production: a review. Food Microbiology 21: 377–397.

Kunii Y. and Chikatsu, H. 2001. On the Application of 3 Million Consumer Pixel Camera to Digital Photogrammetry, Videometrics and Optical Methods for 3D Shape Measurement, Proceeding of SPIE 4309 :278-287.

Kunz, A., Reginatto, V. and Durán, N. 2001. Combined treatment of textile effluent using the sequence Phanerochaete chrysosporium-ozone. Chemosphere 44: 281-287.

61

Lee, G.M. and Palsson, B.O. 1994. Monoclonal antibody production using free-suspended and entrapped hybridoma cells. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 12: 509-533.

Lee, S. Y., Chun, Y. N. and Kim. S. I. 2009. Characteristics of phenol degradation by immobilized activated sludge. Journal of Industrial and Engineering Chemistry 15: 323–327.

Leitao, A.L., Duarte, M.P. and Oliveira, J.S. 2007. Degradation of phenol by a halotolerant strain of Penicillium chrysogenum. International Biodeterioration & Biodegradation 59 : 220-225.

Li, J. and Gu, D.J. 2007. Complete degradation of dimethyl isophthalate requires the biochemical cooperation between Klebsiella oxytoca Sc and Methylobacterium mesophilicum Sr Isolated from Wetland sediment. Science of the Total Environment 380 : 181–187.

Lidstrom, E. M. and Chistoserdova. L. 2002. Plants in the Pink: Cytokinin Production by Methylobacterium. American Society for Microbiology 184 : 1818.

Limkhuansuwan, V. and Chaiprasert, P. 2010. Decolorization of molasses melanoidins and palm oil mill effluent phenolic compounds by fermentative lactic acid bacteria. Journal of Environmental Sciences 22: 1209–1217.

Liu, Y. J., Zhang, A. N. and Wang, X. C. 2009. Biodegradation of phenol by using free and immobilized cells of Acinetobacter sp. XA05 and Sphingomonas sp. FG03. Biochemical Engineering Journal 44 : 187–192.

Lu, Y., Yan, L, Wang, Y., Zhou, S., Fu, J. and Zhang, J. 2009. Biodegradation of phenolic compounds from coking wastewater by immobilized white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Journal of Hazardous Materials 165: 1091–1097.

Mailin, M. and Firdausi, R. 2006. High performance phenol degrading microorganisms isolated from wastewater and oil-contaminated soil. Malaysian Journal of Microbiology 2: 32-36. Manahan, S.E. 1994. Environmental chemistry. Boca Raton. FL: CRC Press Marín, M., Pedregosa, A., Ríos, S., Ortiz, L.M. and Laborda, F. 1995. Biodegradation of diesel and heating oil by Acinetobacter calcoaceticus MM5: its possible applications on

bioremediation. International Biodeterioration and Biodegradation 95 : 269–285. Melo, J. S., Kholi, S., Patwardhan, A. W. and D’Souza, S. F. 2005. Effect of oxygen transfer

limitations in phenol biodegradation. Process Biochemistry 40: 625–628. Mitsui, R., Omori, M., Kitazawa, H. and Tanaka, M. 2005. Formaldehyde-Limited Cultivation of a Newly Isolated Methylotrophic Bacterium, Methylobacterium sp. MF1: Enzymatic Analysis

Related to C1 Metabolism. Journal of Bioscience and Bioengineering 99 : 18–22.

62

Mohite, B. V., Jalgaonwala, R. E., Pawar, S. and Morankar, A. 2010. Isolation and characterization of phenol degrading bacteria from oil contaminated soil. Innovative Romanian Food Biotechnology 7 (RESEARCH ARTICLE).

Movahedyan, H., Khorsandi, H., Salehi, R. and Nikaeen, M. 2009. Detection of phenol degrading bacteria and Pseudomonas Putida in activated sludge by polymerase chain reaction. Iranian Journal of Environmental Health, Science and Engineering 6: 115-120.

Nair, I. C., Jayachandran, K. and Shashidhar, S. 2008. Biodegradation of phenol. African Journal of Biotechnology 7: 4951–4958.

Obuekwe, C. O,Hourani, G. and Radwan, S.S. 2001. High-temperature hydrocarbon biodegradation activities in Kuwaiti desert soil samples. Folia Microbiologica 46: 535-539.

Obuekwe, C. O. and Al-Muttawa, E. M., 2001. Self-immobilized bacterial cultures with potential for application as ready-to-use seeds for petroleum bioremediation. Biotechnology Letters 23: 1025–1032.

Parkhurst, B. R., Bradshaw, A. S., and Forte, J. L. 1979. An evaluation of the acute toxicity to aquatic biota of a coal conversion effluent and its major components. Environmental Contamination and Toxicology 23: 349-356.

Passos, C. T. d., Michelon, M., Burkert, J. F. de.M., Kalil, S. J. and Burkert, C. A. V. 2010. Biodegradation of phenol by free and encapsulated cells of a new Aspergillus sp. isolated from a contaminated site in southern Brazil. African Journal of Biotechnology 40 : 6716-6720.

Pattanasupong, A., Nagase, H., Sugimoto, E., Hori, Y., Hirata, K., Tani, K., Nasu, M. and Miyamoto, K. 2004. Degradation of Carbendazim and 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid by Immobilized Consortium on Loofa Sponge. Journal of Bioscience and Bioengineering 98: 28–33.

Patterson, J. W. 1985. Industrial wastewater treatment technology . Butterworths, Boston. Pfeffer, F. M. 1979. The 1977 screening survey for measurement of organic priority pollutants in

petroleum refinery wastewaters. ASTM Spec. Technical Publications 181-190. Prieto, M. B., Hidalgo, A, Rodriguez-Fernandez, C., Serra, J.L and Llama, M.J. 2002. Biodegradation of

phenol in synthetic and industrial wastewater by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized in an air-stirred reactor with clarifier. Applied Microbiology Biotechnology 58: 853-859.

63

Quek, E., Ting, Y. P. and Tan, H. M. 2006. Rhodococcus sp. F92 immobilized on polyurethane foam shows ability to degrade various petroleum products. Bioresource Technology 97: 32–38.

Rao, J., R . and Viaraghavan, T., 2002. Biosorption of phenol from aqueous solution by Aspergiltus niger biomass[J]. Bioresour Technology 85: 163-171.

Rigo, M. and Alegre, R. M. 2004. Isolation and selection of phenol-degradation microorganisms from industrial wastewaters and kinetics of the biodegradation. Folia Microbiligy 49: 41-45.

Robards, K. and Ryan, D. 1998. Phenolic compounds in olives. Analyst 123:31R-44R. Rosche, B., Li, X. Z., Hauer, B., Schmid, A. and Buehler, K. 2009. Microbial biofilms: a concept for

industrial catalysis. Triends in Biotechnology 27: 636–643. Ruiz-Ordaz, N., Ruiz-Lagunez, J. C., Castanon-Gonzalez, J. H., Hernandez-Manzano, E., Cristiani-

Urbina, E. and Galindeaz-Mayer, J. 2001. Phenol Biodegradation Using a Repeated Batch Culture of Candida tropicalis in a Multistage Bubble Column. Revista Latinoamericana de Microbiologia 43:19-25.

Rupani, P. F., Singh, R. P., Ibrahim, M. H. and Esa, N.2010. Review of Current Palm Oil Mill Effluent (POME) Treatment Methods : Vermicomposting as a Sustainable Practice. World Applied Sciences Journal 11: 70-81.

Sanin, S. L., Sanin, F. D. and Bryers, J. D. 2003. Effect of starvation on the adhesive properties of xenobiotic degrading bacteria. Process Biochemistry 38: 909- 914.

Santos, J. C., Mussatto, S. I., Dragone, G., Converti, A. and Siva, S. S. 2005. Evaluation of porous glass and zeolite as cells carriers for xylitol production from sugarcane bagasse hydrolysate. Biochemistry Engineer Journal 23: 1-9.

Santos, V. L., Monteiro, A. S., Braga, D. T., and Santoro, M. M. 2009. Phenol degradation by Aureobasidium pullulans FE13 isolated from industrial effluents. Journal of Hazardous Materials 161: 1413–1420.

Seetharam, G. B and Saville, B. A. 2003. Degradation of phenol using tyrosinase immobilized on siliceous supports. Water Research 37: 436–440. Sharma, N. and Gupta, V. C. 2012. Comparative Biodegradation Analysis of Phenol from Paper & Pulp Industrial Effluent by Free and Immobilized Cells of Aspergillus Niger. International Conference on Environmental Science and Technology IPCBEE 30 IACSIT Press, Singapore.

64

Shetty, K. V., Ramanjaneyulu, R. and Srinikethan, G. 2007. Biological phenol removal using immobilized cells in a pulsed plate bioreactor: Effect of dilution rate and influent phenol concentration. Journal of Hazardous Materials 149: 452–459.

Sridhar, M. K. C. and AdeOluwa, O. O. 2009. Palm Oil Industry Residues. Biotechnology for Agro-Industrial Residues Utilisation Part III 341-355.

Stelting, S., Burns, R. G., Sunna, A. Visnovsky, G. and Bun, C. 2010. Immobilization of Pseudomonas sp. strain ADP: a stable inoculant for the bioremediation of atrazine.19th World Congress of Soil Science, Soil Solutions for a Changing World 1–6 August, Brisbane, Australia. Published on DVD.

Stepnowski, P., Blotevogel, H. K. and Jastorff, B. 2004. Extraction of carotenoid produced during methanol waste biodegradation. International Biodeterioration and Biodegradation 53: 127-132.

Sundram, K., Sambanthamurthi, R. and Tan, Y. A. 2003. Palm fruit chemistry and nutrition. Asia Pacific. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition 12 :355-362.

Suttinun, O., Muller, R. and Luepromchai, E. 2010. Trichloroethylene co-metabolic degradation by Rhodococcus sp. L4 immobilized on plant materials rich in essential oils. Applied Evironmental Microbiology 76: 4684-4690.

Vandevivere, P., and Kirchman, D. L.1993. Attachment stimulate exopolysaccharide synthesis by a bacterium. Applied Evironmental Microbiology 59: 3280-3286.

Van-Schie, P. M., and Young, L. Y. 1998. Isolation and Characterization of Phenol-Degrading Denitrifying Bacteria. Applied And Environmental Microbiology 64 : 2432-2438.

Van Schie, P. M. and Young, R. J. 2000. Biodegradation of phenol: mechanisms and applications. Bioremediation Journal 4: 1-18. Verhoef, R., Waard, P., Schols, H. A., Siika-aho, M. and Voragen, A. G. J. 2003. Methylobacterium sp.

isolated from a Finnish paper machine produces highly pyruvated galactan exopolysaccharide. Carbohydrate Research 338: 1851-1859.

Wang, X., Gai, Z., Yu, B., Feng, J., Xu, C., Yuan, Y., Lin, Z. and Xu, P. 2007. Degradation of Carbazole by Microbial Cells Immobilized in Magnetic Gellan Gum Gel Beads. Applied and Environmental Microbiology 73: 6421–6428.

Wu, Y. T, Mohammad, W. A., Jahim, Md. J. and Anuar, N. 2009. A holistic approach to managing palm oil mill effluent (POME): Biotechnological advances in the sustainable reuse of POME. Biotechnology Advances 27:40–52.

65

Yamaga, F., Washio, K. and Morikawa, M. 2010. Sustainable Biodegradation of Phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 Isolated from the Rhizosphere of Duckweed Lemna aoukikusa. Environmental Science & Technology 44: 6470–6474.

Yan, J., Jianping, W., Bai, J., Daoquan, W. and Zongding, H., 2006. Phenol biodegradation by the yeast Candida tropicalis in the presence of m-cresol. Journal of Biochemistry Engineering 29: 223-227.

Ying, W., Ye, T., Bin, H., Hua-bing, Z., Jian-nan, B. and Bao-li, C. 2007. Biodegradation of phenol by free and immobilized Acinetobacter sp. strain PD12. Journal of Environmental Sciences 19: 222-225.

Yordanova, G., Ivanova, D., Godjevargova, T. and Krastanov, A. 2009. Biodegradation of phenol by immobilized Aspergillus awamori NRRL 3112 on modified polyacrylonitrile membrane . Biodegradation 20: 717-726.

Zhao, G., Zhou, L., Li, Y., Liu, X., Ren, X., Liu, X. 2009. Enhancement of phenol degradation using immobilized microorganisms and organic modified montmorillonite in a two- phase partitioning bioreactor. Journal of Hazardous Materials 169 : 402– 410.

66

ภาคผนวก

67

ภาคผนวก ก สตร และวธการเตรยมอาหารเลยงเชอ

อาหารเลยงเชอเหลว CFMM (Carbon free mineral salt medium) ประกอบดวยสารอาหารดงตอไปน

(ตอ 1 ลตรอาหารเหลว) ไดแก - แอมโมเนยมไนเตรต (NH4NO3) 3.0 กรม - ไดโซเดยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (Na2HPO4) 2.2 กรม - โพแทสเซยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH2PO4) 0.8 กรม

นาอาหารเลยงเชอเหลวดงกลาว ซงมคา pH 7 นงฆาเชอ (autoclave) ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท และเตมสารละลายความเขมขนสง (Stock solution)ของสารตอไปนอยางละ 1 มลลลตร ทปราศจากเชอโดยการกรองดวยชดกรองสาเรจรป micro filter

- แมกนเซยมซลเฟตเฮพทะไฮเดรต (MgSO4·7H2O) 0.1 กรมตอมลลลตร - เฟอรกคลอไรดเฮกซะไฮเดรต (FeCl3·6H2O) 0.05 กรมตอมลลลตร - แคลเซยมคลอไรดไดไฮเดรต (CaCl2·2H2O) 0.05 กรมตอมลลลตร

68

ภาคผนวก ข

วธวเคราะห

1. ศกษาลกษณะพนผววสดตรง และเซลลตรง โดย Scanning electron microscopy

การศกษาลกษะพนผววสดเศษเหลอปาลมนามน ทาโดยนาชนสวนของวสดมาตดบนแทนวางตวอยาง Stub) แลวนาตวอยางไปฉาบทองดวยเครอง Sputter coater และสองดดวยเครอง SEM สาหรบการศกษาลกษณะเซลลตรงทงกอนและหลงทดสอบประสทธภาพการยอยสลายฟนอล โดยดองรกษาสภาพตวอยางกอนฉาบทองดวย 2.5% glutaraldehyde (C5H8O2) ในฟอสเฟตบฟเฟอร หรอ 4% formaldehyde เปนเวลา 1-2 ชวโมง ลางดวยฟอสเฟตบฟเฟอร 2-3 ครง นาตวอยางมา Fix ครงท 2 ดวย 1% OsO4 เปนเวลา 2 ชวโมงแลวลางดวยนากลน 2-3 ครง ขจดนาออกดวยเอทานอลเปนเวลา 10 นาท นาไปทาใหแหงดวยวธ critical point drying (การวเคราะหในขนตอนนดาเนนการโดยศนยเครองมอวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร)

2. ศกษาพนทผวเสนผาศนยกลางเฉลยของรพรน และปรมาตรรพรนของวสดโดยเครอง

Surface area analyzer

การศกษาพนทผว เสนผาศนยกลางเฉลยของรพรน และปรมาตรของรพรน ทาโดยนาชนสวนของวสด 0.25 กรม outgas ทอณหภม 150 0 C ในสญญากาศ เปนเวลา 3 ชวโมง เพอเอาความชนหรอสารปนเปอนทอาจดดซบอยบนผววสดออก หลงจากนนนาตวอยางวางในหลอดตวอยางทเชอมตอกบเครองวเคราะห ซงตวอยางดดซบ N2 ท 77 K ดวยเครอง BelsorpII mini (BEL Japan, Inc., Osaka, Japan) ทงนพนทผว BET (specific surface area) คานวณตามวธ Brunauer–Emmett–Teller (BET) และ Langmuir plot methods และการกระจายตวของรพรน (pore size distribution) คานวณตามวธ Barrer–Joyner–Halenda (BJH) (การวเคราะหในขนตอนนดาเนนการวทยาลยปโตรเลยม และปโตรเคม จฬาลงกรณมหาวทยาลย)

3. ตวอยางการคานวณคาคงทอตราการยอยสลายฟนอล (phenol degradation rate

constant: k

69

รปท ข.1 คาคงทอตราการยอยฟนอลของเซลลตรงบน EFB ทความเขมขนฟนอล 5,000 มลลกรมตอลตร คานวณหาคาคงท, k

[ ][ ][ ] [ ]

( )( )

10

1 0

1

1

1

l n

l n l n

8 . 2 4 4 8 8 . 6 1

0 . 3 7 4 80 . 3 7 0 . 0 0 7 7

4 8

t

t

Ak t

A

A k t A

k

k

k

= −

= − +

= − +

− = −

−= =

−

Slope = -k