บทท 1บทนำ�

DNA profiling เปนเทคนคทางวทยาศาสตรทถกกำาหนดมาอยางด ถกนำามาใชงานตางๆ ทวโลก สำาหรบการทดสอบแหลงกำาเนด ความเขาใจทางอาชญากรรมและการพสจนบคคล หนงในคณลกษณะทโดดเดนของเทคนคนมาจากขอเทจจรงทวา DNA profiling สามารถดำาเนนการบนตวอยางทางชวภาพตางๆ ทำาใหเกด DNA degradation นอยมาก ทกๆปจ ำานวนของการเกดหายนะตางๆ เกดขนตามทตางๆทวโลก โดยยนยนไดจากจำานวนผเสยชวตนบพนคน ความหายนะเหลานสามารถเกดขนไดจากเหตผลตางๆ มากมาย แตสามารถจดเปนประเภทอยางกวางๆ คอ ทางดาน environmental ทางดาน medical ทางดาน industrial ทางดาน vehicle หรอเกยวของกบผกอการราย ซงในระยะหลง บางทเกดจากการเตรยมสำาหรบใชเปนองคประกอบทางเคม ชวภาพ หรอทาง radiological แตไมวาจะสาเหตใดจะมความตองการดานกฎหมายและดานมนษยธรรม สำาหรบการพสจนตวบคคลของเหยอ และในกรณของการแตกแยกเปนชนๆ ของรางกาย จะทำาการ re-association ของสวนทเหลอ ทงเพอชวยในกระบวนการประกอบพธของญาตผตาย และอาศยใชสำาหรบสบสวนหาสาเหตทางกฎหมายของเหตการณทเกดขน ความหายนะสามารถสรปจำานวนของผตาย Mukaida และคณะ รายงานถงการพสจนเอกลกษณทาง DNA ของบคคลสองศพ ซงเนาเป อยในอบตเหตจากการฝกซอมขบเครองบนทางทหาร ทเกดขนในทะเล อบตเหตน สรปไดวาเปนจ ำานวนของบคคลกลมเลกๆ อยางไรกตามมนมลกษณะของการเกด body fragmentation ท สง ทำาใหผลจากการกคนพบ 33 สวนรางกาย หลงจากสองวนของการคนหา [1] ในทางตรงขามกบรายงานน เหตการณสนามท

1

มหาสมทรอนเดย เกดขน ณ วนท 26 ธนวาคม 2004 ผลจากการตรวจสอบพบการสญเสย กวา 200,000 คนสงผลกระทบมากกวา 10 ประเทศในพนททนท [2] ในกรณนจำานวนของรางกาย ถกกคนเปนจ ำานวนมาก แสดงถงการเกด fragmentation เพยงเลกนอยหรอไมพบเลย แตจะพบเกดการสลายตวและเนาเป อย ซงเกดจากทนมภมอากาศเปนเขตรอน ทำาใหแสดงถงความทาทายทเกดขนตางๆกนในแตละกรณของทมพสจนเหยอความหายนะ (disaster victim identification (DVI) teams) [3] มหลายวธทสามารถใชสำาหรบพสจนการเสยชวต สำาหรบ DVI มหลกเกณฑในการพสจนเอกลกษณเบองตนอย 4 หลก ทสามารถใชเปนหลกฐานสำาหรบการพสจนตวบคคล คอ

1. Odontology2. Fingerprinting3. DNA4. ก า ร ส ง เ ก ต ล ก ษ ณ ะ พ เ ศ ษ (ท ไ ม ซ ำา ) เ ช น numbered

surgical prostheses เทคนคเหลาน DNA profiling สามารถใชพสจนหรอใชในการระบเอกลกษณ และการ re-association ของสวนทแตกหก, ไหม หรอ ศพทเนาเป อยซงเปนไปไดยากหรอเปนไปไมไดในการใชเทคนคดงเดม อยางไรกตามความสำาเรจของ DNA profiling ตองอาศยการเกบตวอยางและการรกษาวตถหลกฐานทางชวภาพอยางเหมาะสม จากศพทตายแลวและการเขาถงตวอยางอางอง ทซ งสามารถนำา DNA profile มาเปรยบเทยบกน ตวอยางทเกบสำาหรบการพสจนทาง DNA มกจะเกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยส เพอหยดกระบวนการสลายตวทจะเรมทำางานหลงจากทเสยชวต ทางเลอกของวธสำาหรบการเกบรกษาตวอยาง อาจจะชวย DNA-DVI ในการสำารวจ ในงานวจยน ผวจยไดท ำาการศกษากบสารละลายบฟเฟอรสองชนด ส ำาหรบความสามารถในการรกษา

2

ตวอยางเนอเยอออนของมนทอณหภมหอง ในการเกบรกษานานกวา 52 สปดาห

บทท 2ทบทวนวรรณกรรมและง�นวจยทเกยวของ

คว�มรเบองตนของ DNA [4] DNA profiling หรอ DNA fingerprint มาจากคำาวา DNA เปนตวยอของ "Deoxy ribonucleic acid" ซงเปนองคประกอบพนฐานของสารพนธกรรม สวนค ำาวา "Fingerprint" หมายถง ลายพมพนวมอทปลายนวทงสบของมนษย ซงลายพมพนว

3

ม อ ท ง ส บ ข อ ง ม น ษ ย ใ ช เ ป น ล ก ษ ณ ะ เ ฉ พ า ะ บ ค ค ล (Individualization) ในการพส จน บ คคล (Identification) ทางนตเวชมาแตเดม เมอนำามารวมกนเปน DNA Fingerprint จะมความหมายวา ลายพมพ DNA ซงมลกษณะเฉพาะบคคลเหมอนลายพมพนวมอ ในปจจบนนกวทยาศาสตรไดตรวจพบลำาดบของ DNA ในสวนทเรยกวา "ยน"(Gene) ซงเปน DNA ในสวนของหนวยควบคมการทำางานของเซลตาง ๆ ในรางกาย ดงนนการตรวจลำาดบของ DNA หรอการหาขอมล DNA จงอาจเรยกวา "DNA Profiling" ซงมความหมายกวางกวาเดม ในรางกายของสงมชวตทกชนด จะประกอบไปดวยเนอเยอของอวยวะตางๆซงอวยวะตาง ๆ เหลานจะประกอบไปดวยเซลเลกๆ มากมาย เซลทกเซลในรางกายจะมองคประกอบคอ นวเคลยส (Nucleus) และไซโตพลาสซม (Cytoplasm) ยกเวนเซลเมดเล อดแดงไมมน วเคลยส โดยสารพนธกรรม DNA จะมอยในนวเคลยสโดยอยในโครโมโซม (Chromosome) และมอยในไซโตพลาส ซมโดยอยในไมโตคอนเดรย (Mitochondria)โครโมโซมในเซลของรางกายมนษย เกดมาจากการผสมกนระหวางไข (Ovum) จากมารดา ซงจะพาโครโมโซมมา 23 อน กบเชออสจ (Sperm) จากบดา ซงพาโครโมโซมมา 23 อนเชนกน เมอมการผสมกนเปนตวออนจะรวมตวเปนโครโมโซม 23 ค ดงนน สารพนธกรรม DNA ในนวเคลยสจงมาจากบดาและมารดาอยางละคร ง แตในการเกดตวออนของมนษยนน ไซโตพลาสซมจะมาจากมารดา 100 เปอรเซนต ไมเหมอนนวเคลยส ดงนนDNA ในไมโตคอนเดรย จงไดรบมาจากมารดา 100 เปอรเซนต โครโมโซมมสวนประกอบของสารพนธกรรม DNA ขดตวจบกบโปรตน โดย DNA จะมโครงสรางพนฐาน เปนเสนค (Double - stand) บดเปนเกลยว (Helix) สารพนธกรรม DNA ประกอบไปดวย การจบตวขององคประกอบทางเคม 4 ชนด หรอเรยกวา base

4

คอ Adenine Thymine Cytosine และ Guanine ซงการเรยงตวของเบส (Base) เหลาน เปรยบเสมอนเปนรหสขอมลภายในเซล สารพนธกรรมทมในโครโมโซมนจะแบงเปน 2 สวน โดยสวนแรกจะทำาหนาท ควบคมการทำางานในการสรางโปรตนตางๆ เพอนำาไปใชในการทำางานของเซลตางๆ ในอวยวะของรางกายสวนนเรยกวา "Gene" ซงมเพยงสบเปอรเซนตของจำานวน DNA ในนวเคลยส ส วนท สองเป นส วนท ไม ได ท ำาหน าท อ ะ ไร เป นพ เศษเร ยกว า "Stutters" ซ งมถ งเกาสบเปอรเซนตของดเอนเอทงหมด ซ ง DNA ในสวนนมความหลากหลายในการเรยงตวของเบส โดยนกจตวทยาไดศกษาพบวาการเรยงตวของเบสในสวนทเปนยนส อาจจะมการซำากนไดในคนแตละคน เพราะเปนสวนทควบคมหนาทตางๆ ของอวยวะในรางกายซงมความหลากหลายไมมากนก เชน ยนสควบคมสตากจะมแคสฟา สนำาตาล เปนตน การเรยงตวของเบสในสวนนจงไมสามารถนำามาพสจนบคคลได แตในปจจบนไดมการศกษาลำาดบเบสในสวน Gene นเพอนำามาตรวจหาความผดปกตของ Gene ได จะมสวนเกยวของในการวนจฉย รกษาโรคตางๆ เชน โรคเลอดทาลสซเมย หรอโรคมะเรง เปนตน ซ งในปจจบน ไดมการถอดรหสของ Gene ไดหมดแลว สารพนธกรรม DNA ในสวน "Stutters" น เปรยบเสมอนเปนลายเซนตของเรา (Signature) เนองมาจากคณลกษณะเฉพาะบคคล ทงนนกวทยาศาสตรทคนพบคณสมบตเฉพาะ โดยไดทำาการวจยและยนยนไดวา โอกาสทการเรยงตวของเบสใน DNA สวนนจะมโอกาสซำากนระหวางคนสองคนซงไมมความเกยวพนทางพนธกรรมกนเลยเพยงหนงในหนงลานพนล า น ค น (million - billion) ก า ร ต ร ว จ ล ำา ด บ เ บ ส ใ น ส ว น "Stutter" เพอพสจนบคคล ไมไดตรวจสอบใหครบทกเบสของโครโมโซมทกเสน แตนกจตวทยาไดศกษาวจยพบวา สามารถใชบางตำาแหนงบนโครโมโซม 23 คน มาเปรยบเทยบ เน องจากบางตำาแหนงมความหลากหลายมาก โดยไดกำาหนดเกณฑมาตรฐานวา ใน

5

การพสจนบคคลดวยวธ DNA Fingerprint น ตองใชการเปรยบเท ยบต ำาแหน ง (Locus) อยางน อย 10 ตำาแหน ง (Loci) ซ งปจจบน FBI ของอเมรกาไดกำาหนดเกณฑวาตองตรวจถงสบสามตำาแหนง และกำาลงจะปรบเปลยนเปนสบหกตำาแหนง

ขนตอนก�รทำ� DNA Fingerprint 1. ก�รเกบตวอย�งสงตรวจ การเกบรวบรวมวตถพยานตางๆ มกรรมวธแตกตางกนตามชนดของวตถพยาน โดยตองยดหลกเกณฑดงนคอ 1. ตวอยางทจะสงตรวจ DNA ตองเปนเซลทมนวเคลยส 2. ตวอยางทจะสงตรวจตองม DNA ทมคณภาพ ปจจยทจะทำาให DNA เสอมสลาย มดงน 1. ระยะเวลานาน 2. อณหภมทสงเกนไป 3. ความชนสง 4. แสงอาทตย หรอรงส 5. สารเคม 6. เชอโรค ปจจยดงกลาวนไมสามารถทำาใหเกดลายพมพ DNA เปนของบคคลอนไดเพยงแตทำาให DNA เสอมสลายจนไมสามารถหาลายพมพได โดยความเป นจรงแล ว DNAเส อมสลายได ยากกวา Genetic markers ตวอนทใชในทางนตเวช เชน กรปเลอด เอ, บ, โอ โดย DNA สามารถคงอย ได หลายป ในขณะทโปรต น หร อ marker ตวอน จะเสอมสลายภายใน 2 ถง 3 เดอนเทานน วธทจะรกษา DNA ใหคงสภาพดทสด คอ การทำาแหง และเยนจด 3. การเกบตวอยางสงตรวจการเกบตวอยางสงตรวจ โดยทวไปม 2 วธหลกๆ คอ 1. การเกบโดยตรง เชน ตดเศษเสอผาทมคราบเลอด คราบอสจ หรอตดชนเนอจากศพมาตรวจ

6

2. ตองมการเคลอนยายวตถสงตรวจ เชน พบคราบเลอดทผนงหองนำาหรอพน วธทดสดคอ ควร ใชมดขด (Scrape) หรอพรมนำาลงไปแลวใชผาพนแผลหรอสำาลทไมมสารเคมใด ๆ ซบ แมแต Cottonbud ท ม ขายในท องตลาดก ไม ควรน ำามาใช เนองจากมสารเคมตดอย จากนนปลอยให แหงก า ร เ ก บ ต ว อ ย า ง ส ง ต ร ว จ ต อ ง ร ะ ม ด ร ะ ว ง ก า ร ป น เ ป อ น (Contamination)การปนเป อน เกดจากสาเหต 3 กลม ดงน 1. การปนเป อนจากส ง ไม ม ช ว ต (Non - biological contamination) โดยสวนใหญเปนสารเคม เชน สยอมผม สยอมผา สบ หรอสารเคมอนๆ ซงจะมผลทำาใหไม สามารถหาลายพมพ DNA ได 2. การปนเป อนจากสงมชวตทไมใชมนษย (Non - human biological contamination) ซง หมายถง ม DNA จากสงมชวตอนๆ ทไมใชมนษย เชน เชอโรค เชอราสตว เชอแบคทเรย หรอ พช มาปนเป อน เปนตน 3. การปนเป อนจาก DNA ของมนษย (Human source contamination) เป นการปนเป อนทอ นตราย และตองระมดระวงท สด เนองจากมความสำาคญในการแปรผล ลายพมพ DNA มาก โดยเราตองแยกวาวตถทสงตรวจเปนของคนหลายคนจรงๆ "Mixed sample" เชนกรณทมผขมขนกระทำาชำาเราหญงหลายคน คอ เปนการปนเป อน"Contaminated

7

sample" จากขบวนการกอนการวเคราะหลายพมพ DNA เชน จากการเกบวตถสงตรวจ (Collection) อาจมเซลเนอเยอจากมอของผเกบวตถพยาน จากการเกบรกษาวตถพยาน (Preservation) จากการนำาสงวตถพยาน (Handling) และจากการตรวจวเคราะหลายพมพ DNA (Analysis) ซงขนตอนทงหมดตองทำาโดยมนษยทงนน จงอาจมการปนเป อนได ในธรรมชาต DNA ไมสามารถลอยมาในอากาศ นำา หรอ ดน โดยอสระได 4. การเกบรกษาวตถสงตรวจ (Preservation) มหลกการ 2 อยาง คอ แหง(Dried) และเยน (Frozen) 2. ก�รประเมนวตถทสงตรวจ เนองจากการตรวจลายพมพ DNA เปนเทคนคทคอนขางยากและมตนทนสง อกทงบางครงวตถพยานมจ ำานวนนอยผเก บรวบรวมวตถพยานทสงตรวจจะตองระมดระวงเกบรกษาวตถพยานไมใหสญหาย หรอเสอมสลายนอยทสด และจะตองพยายามใหไดผลดทสดและแมนยำา จงตองมการประเมนคณภาพวตถทสงตรวจ โดยมหลกการดงน คอ 1. ตรวจดวาวตถพยานแยกวาจะเปนเนอเยออะไรกอน เชน เปนเลอด นำาลายหรอคราบอสจ กระดกหรอผม เพอเลอกวธสกด DNA ใหเหมาะสมกบเนอเยอ 2. ตรวจคณภาพ (Quality) DNA ของวตถพยาน 3. ตรวจดปรมาณของ DNA (Quantity) หากมปรมาณนอยจะตองมวธเพมจำานวน DNA (Amplification) ดวยเทคนคอนๆ 4. ตรวจดวา DNA ทไดเปนของมนษยหรอไม

8

5. ตรวจดสภาพของ DNA (State) เชน เป น Single strand หรอเปนDouble stand จะไดเลอกวธ ตรวจไดถกตอง 3. ก�รสกด DNA จ�กเซล กรรมวธในการสกด DNA คอนขางยาก มเทคนคทตองใชบคลากรระดบนกวจย ตองรวาสกด DNA จากนวเคลยส หรอจากไมโตคอนเดรยตองรวาเปนเนอเยอประเภทใดจะใชวธสกดสวนทไมตองการออกไดถกตอง เชน หากเปนการตรวจจากคราบเลอดจะสกดงายกวาการตรวจชนสวนของกระดก หรอกลามเนอ เปนตน กระบวนการทำา DNA profiling โดยปกตม 2 กระบวนการ คอ [8] 1. Restriction fragment length polymorphism (or RFLP for short) RELP เ ป น ก ร ะ บ ว น ก า ร ท ใ ช ใ น ก า ร identify Colin Pitchfork เปนกระบวนการทตองการปรมาณของตวอยางคอนขางมากและคณภาพของ DNA ขนกบความสดของต วอยาง จ ดน เป นอปสรรคส ำาค ญในกรณของงานด านนตวทยาศาสตรทซง DNA โดยสวนใหญมาจากเนอเยอจะเกดการสลายตวหรอปนเป อนกบวตถตางๆ รปท 1 ตวอยางกระบวนการทำา DNA profiling ในตวอยางเลอดหรอนำาลาย หลงจากทำาการสกด DNA แล ว จ ะน ำามาผสมก บสาร เคมท เ ร ยกว า Restriction enzyme ซ ง ท ำา ห น า ท ต ด DNA อ อ ก เ ป น ส ว น ๆ (เ ร ย ก ว า Restriction fragments) ท specific points ในล ำาด บของ DNA ขนตอนตอมาจะทำาการเรยงลำาดบ fragments ทไดโดยใชเทคนค Electrophoresis เมอใหกระแสไฟฟาหลายรอยโวลต สวนของ fragments ทสนกวาจะเคลอนทไดเรวกวาสวน fragments ทยาว เมอหยดใหกระแส fragments จะมการเรยงตวตามความยาว ซ งจะได actual DNA pattern จากนนทำาการตด label ท ำาการล าง DNA แล วจ งท ำา X-ray film ภาพท ได เ ร ยกว า autoradiograph หร อ autorad คล า ยก บ เป น bar code pattern ของ DNA fingerprint

9

2. Allele-specific testing คลายกบ RFLP ทำางานโดยก า ร ค น ห า ส ว น polymorphic fragments ข อ ง DNA ม specific type เรยกวา alleles โดยกระบวนการทำางานนจะมองหาเฉพาะ particular alleles ในตวอยาง DNA มความแมนยำานอยกวากระบวนการ RFLPแตสามารถใชตวอยางนอยกวา มความบรสทธ น อยกวาและใชเวลานอยกวากระบวนการ RFLP ซงเปนประโยชน ในการศ กษาทางน ต ว ทยาศาสตร และด วยการใช กระบวนการทเรยกวา Polymerase Chain Reaction (PCR) รปท 2ซงจะมข นตอน amplify ทำาใหใชปรมาณตวอยาง DNA นอยกวา โดยโมเลกล DNA สามารถคดลอกตวมนเองได โดยการเตม enzyme ทเรยกวา polymerase ในตวอยาง DNA จากนนวางลงในอปกรณทเรยกวา Thermocycler โดยจะเกดการสราง chain reaction ซ ง DNA จะทำาการคดลอกหรอเป นการเพมจำานวน โดยจะเพมแบบ exponential ไดผลผลตใน n cycle เปน 2n ค จากปฏกรยาประกอบดวย 3 ขนตอนหลกของการปรบเปลยนอณหภมวนไปวนมา 30 ถง 40 รอบ คอ 1. Denaturation ทอณหภม 95 องศาเซลเซยสเปนการทำาลายพนธะระหวาง nucleotides ทำาใหสาย DNA ทมวนเกลยวอยเปนคแยกออกจากกนเปนเสนตรง 2 เสน และปฏกรยาตางๆ จากเอนไซมในรอบกอนหนาจะหยดลงทงหมด 2. Annealing ทอณหภมประมาณ 50 ถ ง 60 องศาเซลเซยส ทำาให primer ไปเกาะตดกบ template เพอเตรยมตวตงตนตอสายคของ template 3. Extension ทอณหภม 72 องศาเซลเซยส เอนไซม polymerase จะเร มทำางานโดยทำาใหมการนำาเบสตางๆ มาตอทางด า น 3’ ข อ ง primer โ ด ย ต อ ใ ห complementary ก บ sequence บน template ท primer มาเกาะไว

10

นอกจากกระบวนการทำา PCR แลวยงมกระบวนการทถกพฒนาขนใหม มความเรวมากกวาและมความจำาเพาะมากกวา เรยกวา Short tandem repeats (STRs) ร ปท 3 โดยอาศยพ นฐานเดยวกนกบ PCR เมอได DNA ทถก amplified แลวจะทำาการ run บน Electrophorisis

รปท 1 กระบวนการ Restriction fragment length polymorphism (RFLP) [8]

11

รปท 2 กระบวนการ Polymerase chain reaction (PCR) [8]

รปท 3 กระบวนการ Short tandem repeats (STRs) [8]

12

4. ก�รตรวจล�ยพมพ DNA กรรมวธในขนตอนนยากกวาขอ 3 ซงโดยทวไปม 2 วธ คอ การทำาดวยมอ (Manual) และการทำาโดยเคร องมอ อตโนมต (Automate) แตหลกการในการตรวจจะเหมอนกน กลาวคอ จากความรพนฐานวา DNA ในสวน "Stutter" เราจะนำามาใชพสจนบคคล ซง DNA สวนนจะมาจากโครโมโซมทกอน นกวจยไดท ำาการวจยไวแลว และจะพบวา "Stutter" ของแตละโครโมโซมจะมบางสวนของ DNA ทซำากนในแตละคนนอยมากซงเราสามารถเลอกตดเฉพาะทอนของ DNA เหลานไดโดยใชเอนไซมทมลกษณะตดเฉพาะ(Restricted endonuclease) ดงรปท 1 จากนนแยกทอน DNA ทถกตดตามความยาวแลวเปลยนถายแถบของ DNA ไปอยบนแผนทเหมาะสม ตดฉลากทอน DNA ทอยบนแผนโดยสารกมมนตภาพรงส หรอ สารปลอดกมมนตภาพรงส เปลยนถายแถบ DNA ทตดฉลากแลวดวยเทคนคเฉพาะ จากนนกตรวจหาตำาแหนงของแถบ DNA โดยถาเปนการใชสารกมมนตภาพรงส กจะผานเคร องเอกซเรย ผลจะปรากฏออกมาในลกษณะ "Bar code" แตหากไมใชสารกมมนตภาพรงส กจะใชวธยอมสแลวอานดวยเครองปรากฏเปนเสนกราฟในตำาแหนงตางๆ กน โดยเคร องอนจะอานตำาแหนงใหโดยอตโนมต โดยทวไปเทคนคทใชกมมนตภาพรงสเปนเทคนคททำาดวยมอตนทนตำากวาเทคนคทไมใชสารกมมนตภาพรงส ซงใชเคร องตรวจอตโนมต ทง 2 วธมขอดขอเสยตางกนคอ การตรวจดวยมอมตนทนทถกกวา แตจะตรวจวตถพยานไดไมมากตอการตรวจหนงคร ง และมโอกาสทจะเกดขอผดพลาดจากมนษยไดหลายขนตอน เชน การควบคมเวลา อณหภม การปนเป อน แตการตรวจดวยเครองแมนยำาเรองเทคนค สามารถตรวจวตถพยานไดครงละเปนจำานวนมาก ประโยชนทด อกเหตผล คอ หากมวตถพยานเปรยบเทยบในภายหลง ซงอาจจะมระยะเวลาหางกนสามารถตรวจลายพมพ DNA ของวตถพยานครงหลงอยางเดยวแลวมาเปรยบเทยบขอมลกบลายพมพทเคยตรวจไวไดเลย ไมตองนำาวตถพยานมา

13

ตรวจเปรยบเทยบพรอมกนอกครง แตหากเปนการตรวจดวยมอจะตองนำามาตรวจเปรยบเทยบพรอมๆ กนเสมอ เพอปองกนการผดพลาดทางเทคนค เพยงแตราคาของเคร องมอตรวจอตโนมตคอนขางสง คอ ราคาประมาณสลานบาท นอกจากน การตดทอน DNA น ตามหลกสากลควรทำาหลายตำาแหนงเพอใหเกดความแมนยำา โดยทวไปใชสบตำาแหนง ซ งในชวงกลางป 2541 ทางหนวยงาน FBI ของสหรฐอเมรกาไดใชเกณฑใหม คอ ตองตรวจเปนจำานวนสบสามตำาแหนง ในขณะทประเทศไทยไมมการกำาหนดเกณฑมาตรฐานจงทำาใหการฟงผลการตรวจ DNA ไมสามารถบอกไดวาตรวจท ำาทงหมดกตำาแหนง จงยงไมอาจเชอถอไดเสมอไปเนองจากตำาแหนงตางๆ เหลา นไดมการทำาการวจยในกลมประชากรตางๆ เพอคำานวณคา P.D ค อ Probability of Discrimination ซ งต องเป นท ยอมรบโดยสากลจงจะนำามาใชได

ก�รแปรผลจ�กล�ยพมพ DNA การตรวจลายพมพ DNA ม 2 วธ ดงกลาวขางตน การแปรผลจงม 2 ลกษณะ กลาวคอ การตรวจดวยมอ (Manual) จะเปนการใชสารกมมนตภาพรงส ซงผลจะออกมาเปนลกษณะแบบบารโคด สวนการตรวจดวยเครองอตโนมต (Automate) นน เครองจะรายงานผลตามตำาแหนงทตดเฉพาะแตละตำาแหนง โดยเครองจะอานเลขตำาแหนงใหโดยอตโนมต ซงงายตอการแปรผล ตวอยางของการรายงานผลมดงรปประกอบ เมอไดผลการตรวจมาแลวจะตองมการสรปผลการตรวจ ซงการสรปผลมได 3 แบบ ดงน คอ 1. Exclusion หมายถง ผลการตรวจยนยนไดถงความขดแยงรอยเปอรเซนตโดยไมจำาเปนตอง ทำาการตรวจเพมเตมเพอยนยนอก

14

2. Inconclusion หมายถง ผลการตรวจไมสามารถสรปผลได เนองมาจากปญหาทเกดขนใน ขนตอนตางๆ เชน เสอมสภาพ มการปนเป อนของ DNA หรอมความผดพลาดเกดขนใน กรรมวธการตรวจ เชน นำายาหมดอาย เปนตน 3. Conclusion เปนการยนยนบคคล ซงการสรปผลจะตองไมมขอขดแยงตามเกณฑ มาตรฐานสากลกคอ จะตองตรงกนทงสบตำาแหนง เชน ในการพสจน บดา มารดาและบตร ผลการตรวจทจะบอกวาเปนบตรแนนอนนนจะตองตรวจพบลายพมพ DNA ของบตรมาจาก บดา และมารดาอยางละ 50 % ทงสบตำาแหนง สวนการตรวจวตถพยานผลการตรวจลาย พมพ DNA ทงสบตำาแหนงตองตรงกนทกประการ

ประโยชนของก�รตรวจล�ยพมพ DNA ในปจจบนเรานำาการตรวจลายพมพ DNA มาใชในขบวนทางวทยาศาสตรมากมายรวมทงการแพทย เชน การวนจฉยโรคทางพนธกรรม การวเคราะหยนสมะเรง และรวมถงการตรวจทางนตเวชวทยา ซงการนำาการตรวจลายพมพ DNA มาใชในทางนตเวชวทยา มกเปนการพสจนสายพนธมนษยในกรณตางๆ เชน 1. การตรวจในคดขมขนกระทำาชำาเรา ซงเปนการพสจนบคคลทไดกระทำาชำาเราโดยสามารถตรวจ DNA จากคราบอสจ เสนขนทหวเหนาทมรากขน นำาลายซงอาจมเยอบกระพงแกม และคราบเลอด ในการหาหลกฐานในคดขมขนกระทำาช ำาเรา วาชายผใดเปนผมเพศสมพนธกบฝายหญง สามารถตรวจหาวตถพยาน หรอขนเพชรของฝายชายทอยบนรางกายฝายหญงหรอตวอสจวาเปนของใคร การตรวจในเบองตนสามารถบอกไดวาเปนเชออสจหรอขนเพชรหรอไม โดยการดดวยกลองจลทรรศน แตการจะบอกวาวตถพยานนนเปน

15

ของใครจะตองใชการตรวจ DNA ในสหรฐอเมรกา คดฆาตกรรมขมขนกระทำาชำาเรา จะมการตรวจ DNA ของวตถพยานทพบในผตายไวเสมอ แมจะยงจบผรายไมได นอกจากนในบางครงผตองหาอาจจะฝากรอยกดไวบนรางกายของผเสยหาย หรอผตาย ซ งสามารถพสจนไดดวยกรปเลอด หรอพมพฟนหรอ DNA ของเซลเยอบกระพงแกมได ในปจจบนมการตรวจในคนไขทตงครรภจากการถกขมขนซงมาทำาแทง โดยสามารถทำาการตรวจ DNA จากรกเทยมกบเลอดแม และนำาไปดำาเนนคดกบผตองหาทกระทำาชำาเราได 2. การตรวจในคดฆาตกรรม ในคดฆาตกรรมทมการทำารายกน ทำาใหมเลอดออกกสามารถใชการตรวจ DNA จากคราบเลอดทพบเพอหาฆาตกรได 3. การตรวจพสจน บดา มารดาและบตร (Parentage test) เปนการตรวจพสจนยนยนวาเปนบตรของบดา (Parentage test) หรอ เปนบตรของมารดา (Maternity test)ใชหรอไม 4. การตรวจพสจนซากโครงกระดกหรอชนสวนมนษย ทพบในกรณอบตเหตเคร องบนตก สงคราม คดฆาตกรรมฆาหนศพ หรอ พสจนสายพนธมนษยในประวตศาสตรซงอาจใชการตรวจ DNA ทงในโครโมโซม และไมโตคอนเดรย กได 5. ประโยชนดานอนๆ ทใชการตรวจ DNA มาใชในการดำาเนนคดดานอนๆ ไปเชน การตรวจ DNA ของพชหรอสตว กสามารถกระทำาไดลกษณะคดทจะมาใช คอ การละเมดลขสทธ การขโมยพชหรอสตวทมราคา

ง�นวจยทเกยวของ ภายใตสถานการณทวๆไป การเกบตวอยางสำาหรบการทำา DNA profiling จะเกดขนระหวางการชนสตรภายในสถานทเกบศพ ตวอยางสามารถแชเยนหรอแชแขงเพ อรกษา DNA โดยการ cooling ตวอยาง หลายปจจยททำาให DNA เกดการสลายตว เชน การทำางานของ endogenous enzymes และการสลายตวทาง

16

จลนทรย/แบคทเรย เปนไปอยางชาๆ หรอหยดชะงกทอณหภมต ำามากๆ (-70 ถง -80 องศาเซลเซยส) ในบางสถานการณรวมไปถงเหตการณอบตเหตทมผสญเสยจำานวนมาก ขนอยกบ สถานทและจำานวนของผท ตกเปนเหยอ การท ำาใหตวอยางเยนทนทอาจไมสามารถเปนไปได ทางเลอกวธอนของการเกบรกษา DNA สำาหรบใชในกรณดงกลาวน ตนทนตำาของ LST buffer ถกพฒนาขนสำาหรบการขนสงและการเกบรกษาตวอยาง โดยไมตองใชการแชเยน [5,6] buffer นประกอบดวยการรวมของสารเคมตางๆทออกแบบมาเพอ lyse cells, inactivate nucleases, ปองกนการเจรญเตบโตของจลนทรย และการรกษา DNA มงานวจยทเกยวของเดมทำาการการทดสอบ พบวา LST buffer มประสทธภาพสำาหรบการเกบรกษา DNA เปนเวลาถง 8 สปดาหทอณหภมหองจากตวอยางทงเลอดและเนอเยอ [5] งานวจยตอมา ใชตวอยาง biopsy ทางคลนกโดยตรง ทำาการเปรยบเทยบกบ preservation capacity ของ LST buffer ดวยวธ snap-freezing และเก บท อณหภม -75 องศาเซลเซยส [6] พบวา มประสทธภาพมากขนในการเกบรกษา DNA แตยงสรปไดวา LST buffer มความเหมาะสม, ประหยดตนทนในระยะเวลาสนๆในการเกบรกษาตวอยางเนอเยอ (ประมาณ 4 สปดาห) [6] การใช LST buffer ในโครงการ DVI ไมไดถกกลาวถงโดยตรงจากผเขยนในสวนน อยางไรกตาม งานวจยนผเขยนคาดวามบทบาททดในการเกบรกษา DNA ได การใช buffer ทคลายกนน ถกเสนอโดย Fregeau และคณะ สำาหรบวตถประสงคทาง DVI [7] buffer ทางเลอกน คอ GenoFix TM (บ . DNA Genotek) เ ป น alcohol-based tissue ถกออกแบบใหมความยดหยนส ำาหรบการเกบตวอยางเนอเยอทอณหภมหอง ทำาการทดสอบบน biopsies ของกลามเนอเรยบ พบวา GenoFix TM มประสทธภาพสำาหรบการรกษา DNA หลงจากเกบรกษาเปนเวลา 1 ปทอณหภมหอง และเกบรกษา 3 ป

17

ครงทอณหภม -20 องศาเซลเซยส [7] อกทง Fregeau และคณะไดใหขอคดเหนสนบสนนการใช GenoFix TM และยงแนะนำาถงการเก บรกษา RNA โดยใชสารละลายน ได อยางเท าเท ยมก น [7] สารละลายบฟเฟอรทใชในงานวจยน คอ Oragene TM DNA self-collection kit (บ. DNA Genotek) ถกออกแบบสำาหรบการรวบรวมและเกบรกษา DNA ทอณหภมหอง สามารถใชงานไดจาก DNA ของตวอยางนำาลาย และถกนำามาทดสอบในทำานองเดยวกน

บทท 3วธก�รทดลอง

1. ขนตอนก�รเกบตวอย�ง

18

คณะกรรมการจรยธรรมทองถน อนญาตในการใหสทธส ำาหรบการเกบตวอยาง limbs จากการตดแขนขาผป วยทโรงพยาบาลมหาวทยาลย Leicester NHS Trust, Leicester, UK (LREC, 06/Q2501/17) การอนญาตแจงเปนลายลกอกษรโดยไดรบบรจาคจากผปวยทตองรบการตดสวนแขน ขาออก สงไปยง หน วย Forensic Pathology มหาวทยาล ย Leicester, UK ส ำาหรบการท ำา DNA identification research สวน limbs ดานลาง สองสวนถกเกบสำาหรบใชศกษาในงานวจยน ซงเปนสวนทถกตดออกเนองจาก ระยะเรอรงในสวนตำากวาขาจากภาวะอดตนของทางเดนโลหต มสาเหตจากโรคเบาหวาน ทนทหลงจากตดออก สวน limbs จ ะ ถ ก ส ง ไ ป ย ง ห น ว ย Forensic Pathology แ ล ะเนอเยอกลามเนอทยงทำางานไดถกแยกออกจากสวน limbs โดยกลามเนอถกเลอกใหเปนประเภทเนอเยอออนทเดน มกนยมใชในปจจบน และงายในการระบสวนรางกายทถกแตกหก 2. วธก�รเกบรกษ�ตวอย�ง จาก Literature review พบ 2 วธของการเกบตวอยางท อ ณ ห ภ ม ห อ ง 1. ว ธ Lysis storage แ ล ะ ก า ร Transportation (LST) buffer ท ม 100 mM Tris-HCl ท pH 7.6, 0.5 M KCl, 4.5% Nonidet P40, 4.5% Tween 20 และ 1% sodium azide และ 2. Oragene TM DNA self-collection kit (ข อ ง บ . DNA Genotek, Ottawa, ON, Canada) 3. ก�รออกแบบก�รทดลอง ชนสวนของกลามเนอถกแยกออกตาม receipt ของแตละ limbs สองสวนและวางลงในสารละลายทกำาหนด ปรมาณทตองการของตวอยางในแตละบฟเฟอร และระยะเวลายาวนานเทาไหรในการเกบรกษา DNA ทอณหภมหอง จากนนชงตวอยางนำาหนกตางๆ 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 10 และ 5 mg วางลงบน Oragene TM collection pots และช งตวอยาง 1000, 500,

19

250, 100 และ 50 mg ลงใน 5 mL ของ LST buffer สดทายชงตวอยาง 100, 50, 25, 10 และ 5 mg ลงใน 1 mL ของ LST buffer แลวจงทำาการสกด DNA ในแตละตวอยางหลงจากเกบเปนระยะเวลา 1, 2, 4, 12, 36 และ 52 สปดาห 4. ขนตอนก�รสกด DNA นำาตวอยางทเกบใน Oragene TM ทงหมด ทำาการอบทอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง ตามคำาแนะนำาของผผลต ขนตอนการทำาใหบรสทธของ Oragene TM รวมทงการเตม 1/25th Oragene TM เปน purifier solution ในตวอยาง และทำาการ incubation ในนำาแขงเปนเวลา 10 นาท จากนนตามดวย ชดของ centrifugation และตามดวยขนตอนการลาง สดทายทำาการกคน DNA ในรป pellet ทซ งตองทำาการ re-hydration โดยเลอกปรมาณของสารละลายบฟเฟอรหรอนำาทเหมาะสม เทคนคการทำาใหบรสทธน ถกแนะนำาโดยผผลต ซงไดออกแบบสำาหรบใชกบตวอยางนำาลายและพบวา ไมเหมาะสำาหรบการ purification DNA จากตวอยางกลามเนอทยงไมไดถกยอยเนอเยอ หลงจากขนตอนของการทำาใหบรสทธ ทำาซำา 3 ครง ขนตอนทแนะนำาของ Qiagen DNA mini kit (บ. Qiagen, West Sussex, UK) ไมไดนำามาใช ซงออกแบบเพอกคน DNA จากจำานวนทตางๆกนของ body fluids และเนอเยอ รวมไปถงการเพมขนตอนการยอยซงขนอยกบวธท เล อก โดย 100 µL ของ aliquots ถกแยกออกจากท ง Oragene TM และ LST preservation buffer สำาหรบการสกด DNA โดยใช Qiagen DNA mini kit ข นตอนในกรณ ของตวอยาง เลอด/body fluids ตามคำาแนะนำาของผผลต DNA ถกชะใน 100 µL buffer AE (Qiagen) 5. DNA quantification ในขนตอนการหาปรมาณ DNA ถกดำาเนนการใน 1 µL ของแตละตวอยางทสกดไดใน 2 ซำา โดยใช Quantifiler Human DNA Quantification kit (บ . Applied Biosystems) ใ น

20

ปรมาณรวมของปฏกรยาเทากบ 12.5 µL ใช thermal cycling 7500 Real-Time PCR System (บ . Applied Biosystems) ตามคำาแนะนำาของผผลต 6. DNA profiling ทำาการศกษา DNA profile จากตวอยางทสกดไดทงหมด โดยใช AmpF/STR® SGM Plus ® PCR Amplification kit (บ. Applied Biosystems, Foster City, CA) สำาหรบปรมาณของปฏกรยาสดทายของ 12.5 µL และ 1 ng template DNA ถกเตมในแตละ reaction ทเปนไปได เรมตน DNA profiling ถกดำาเนนการโดยใช 28 amplification samples ตวอยางเหลาน ไมวาจะเปนแบบ partial หรอ failed DNA profile จะถกสงเกตหลงจาก 28 รอบ ซ งจะถก amplified ใหม ส ำาหรบ 34 PCR cycles PCR ผลผลตของสปดาหท 1, 2, 4, 12 และ 36 ไดสารสกดทถกแยกและทำาใหมองเหนบน ABI PRISM® 377 DNA Sequencer (บ . Applied Biosystems) ข น า ด ข อ ง ส ว นแตกหกถกดำาเนนการโดยใช GeneScan® software version 2.1 (บ . Applied Biosystems) แ ล ะ ก า ร ท ำา allele designation ถกดำาเนนการโดยใช Genotyper ® software version 3.7 (บ. Applied Biosystems) PCR ผลผลตของสปดาหท 52 สารสกดถกแยกและท ำาใหมองเหนบน Applied Biosystem 3130 Genetic Analyser และถกวเคราะหโดยใช GeneMapper ID software version 3.2 ( บ . Applied Biosystems)

21

บทท 4ผลก�รทดลอง

ในขนตอนการสกด DNA ถกดำาเนนการบน 100 µL aliquots ของแต ล ะ preservation buffer ผลของการหาปรมาณ DNA ของตวอยางทเกบทอณหภมหองทงใน Oragene TM collection pots และ LST buffer แสดงในตารางท 1

ตารางท 1 คาเฉลยของการทำา real-time PCR quantification (ทำาซำา 2 ซำา) สำาหรบตวอยางทนำามาสกดทงหมดในชวงระยะเวลา 52 สปดาห

หมายเหต ผลทงหมดแสดงความเขมขนของ DNA ในหนวย ng/µL เครองหมายดอกจน(*) แสดงถง ตวอยางทไดจาก partial DNA และ (**) สำาหรบ DNA profiling failed หลงจากการทำา amplification ท 28 cycles กรณของ Full DNA profile ไดร บ เ ม อ partial แ ล ะ failed samples ท ง ห ม ด ถ ก ท ำา re-amplified จ ำานวน 34 cycles ยกเวน 5 mg ของตวอยาง muscle A ทเกบใน Oragene TM solution เปนเวลา 1 สปดาห (***) ไมพบ DNA profile

22

อณหภมเฉลยของอณหภมหองในแตละตวอยางถกเกบท 24.2 องศาเซลเซยส มคาอณหภมตำาสด เทากบ 16 องศาเซลเซยส และอณหภมสงสดเทากบ 30.5 องศาเซลเซยส ในระหวางระยะ 52 สปดาห ปรมาณของ DNA ทถกกคนหลงจากแตละการสกดทเหลอ ยงคงสอดคลองกบการสกดทดำาเนนการไมเกน 12 สปดาห หลงจากการศกษานไดเร มตน ปรมาณของ DNA ทไดกลบคนแสดงถงผลทเพมขนทสปดาหท 36 และ 52 ผลเหลานบางทอธบายโดยปรมาณทลดลงของตวอยางทถกเก บไวมาส มต วอยางซ ำาจากตวอยางเดยวกน ทำาใหผลทไดจากปรมาณบฟเฟอรทงหมดถกลดลงครงละ 100 µL ในแตละครงทสมตวอยาง คา Ct values สำาหรบตวอยางทนำามาหาปรมาณทงหมด คาดวา อยในชวง 20 – 35 ซงระบ ได ว า ไม ม PCR inhibition เก ดข นร ะหว าง template amplification ผลของการหาปรมาณ DNA ถกวเคราะหโดยใช ANOVA โดยไมมความแตกตางอยางมนยสำาคญในผลผลต DNA สำาหรบทงกลามเนอ A (p> 0.2) และกลามเนอ B (p> 0.5) สำาหรบการสมตวอยาง ณ ชวงสปดาห DNA ผลผลตจากสารละลายทมกลามเนอ A และ B ถกวเคราะหโดยใช paired t test โดยสมมตใหไมม variance พบวาไมมความแตกตางอยางมนยสำาคญสำาหรบปรมาณทงหมดของ DNA ทไดกลบคนจากกลามเนอ A หรอ B เนองจากไมมความแตกตางอยางมนยสำาคญในผลผลตของ DNA ทไดรบระหวางตวอยางทถกสกดจากกลามเนอ A หรอ B หรอระหวางชวงระยะสปดาหท ท ำาการสมตวอยาง ผลทไดน ำามาประเมนประสทธภาพของการสกด DNA สำาหรบแตละนำาหนกของเนอเยอทเกบในแตละ preservative solution รปท 4 แสดงผลผลตเฉลยของ DNA ทได รบหลงจากการสกดบน 100 µL aliquots ของ preservative buffer สำาหรบแตละนำาหนกของเ น อ เ ย อ ท เ ก บ ใ น Oragene TM solution ข อ ม ล เ ห ล า น ถ ก normalized โดยการแบงผลผลต DNA ทงหมดตามจำานวนของ

23

เนอเยอในหนวย mg เพอใหแตละนำาหนกเนอเยอสามารถเปรยบเทยบไดโดยตรง และนำาเสนอในรปแผนภมแทง เชนเดยวกบรปท 5 แ ส ด ง ถ ง ก า ร ห า ป ร ะ ส ท ธ ภ า พ DNA ท ไ ด ก ล บ ค น ส ำา ห ร บเนอเยอกลามเนอทเกบใน 5 mL LST buffer และรปท 6 สำาหรบเนอเยอทเกบใน 1 mL LST buffer ผลทเสนอในรปท 4 แสดงใหเหนวา การเกบเนอเยอ 500 mg ใน Oragene TM collection pots ใหผลท เหมาะสมต ออตราสวนของ DNA ทได กลบคน และร ปท 6 แสดงใหเหนถง ประสทธภาพของ DNA ทไดกลบคนสงทสด สำาหรบตวอยางทเกบใน 1 mL LST buffer ทไดรบเมอเกบเนอเยอ 5 mg ผลทเสนอในรปท 6 แสดงวา 100 mg ของเนอเยอควรจะถกเกบใน 5 mL LST buffer เพอใหได DNA ทไดกลบคนสงทสดตอ mg ของเนอเยอทเกบ ผลผลตของ DNA ทไดกลบคนทงหมด โดยการสกดจาก 100 µL aliquots จาก containers ท ม 5 mL LST buffer และตวอยางเนอเยอ อยางไรกตามแสดงถงผลผลตรวมทลดลงอยางมนยสำาคญเมอเปรยบเทยบกบตวอยางทเกบใน Oragene TM pots และ 1 mL LST buffer

รปท 4

24

รปท 5

กราฟแทงแสดงปรมาณ DNA ทไดกลบคนจากเนอเยอกลามเนอทเกบใน Oragene TM solution (รปท 4), ใน 5 mL LST buffer (รปท 5) แตละกราฟแทงแทนปรมาณเฉลยของ DNA ทไดกลบคนจาก 100 µL aliquot ของแตละสารละลายในระยะเวลากวา 6 ครงททำาการสมตวอยาง ความเขมขนของ DNA ถก normalized โดยการแบงปรมาณทงหมดของ DNA ทไดกลบคน (ng) ตอปรมาณของเนอเยอทถกเกบ (mg) ในแตละตวอยาง เปรยบเทยบแตละ order ถงประสทธภาพของการสกดในแตละตวอยาง แถบ error bar บงชชวงความเชอมนท 95 % สำาหรบแตละเซตขอมล

25

รปท 6กราฟแทงแสดงปรมาณ DNA ทไดกลบคนจากเนอเยอกลามเนอทเกบใน 1 mL LST buffer (รปท 6) แตละกราฟแทงแทนปรมาณเฉลยของ DNA ทไดกลบคนจาก 100 µL aliquot ของแตละสารละลายในระยะเวลากวา 6 ครงททำาการสมตวอยาง ความเขมขนของ DNA ถก normalized โดยการแบงปรมาณทงหมดของ DNA ทไดกลบคน (ng) ตอปรมาณของเนอเยอทถกเกบ (mg) ในแตละตวอยาง เปรยบเทยบแตละ order ถงประสทธภาพของการสกดในแตละตวอยาง แถบ error bar บงชชวงความเชอมนท 95 % สำาหรบแตละเซตขอมล

DNA profiling ถ ก ด ำา เ น น ก า ร บ น 1 ng ข อ ง template หรออาจลดปรมาณลงเมอความเขมขน DNA ตำากวา 0.2 ng/µL เปน 5 µL template ซงใชสำาหรบแตละปฏกรยาในปรมาณรวมของ 12.5 µL จากตวอยางทงหมดโดยสวนใหญจะไดร บ full DNA profile สวน partial DNA profile ท allele และ/หรอ ตำาแหนงของ gene ในโครโมโซมเลอนออกอยางชดเจน ซ ง ส ง เ ก ต พ บ ใ น 8.8 % ข อ ง amplifications แ ล ะ amplification failure ซงสงเกตพบใน 2.8 % ของตวอยางทงหมด ตามทระบโดยเคร องหมายดอกจนในตารางท 1 ตวอยางทงหมดแสดงถงการเลอนออกหรอลมเหลว เมอถก re-amplified

26

โดยใช 34 PCR cycles ผลทไดใน full profile สำาหรบตวอยางทงหมดมขอยกเวนเดยว ไมม DNA profile สามารถผลตได เมอพยายาม amplify วตถทไดกลบมา จาก 100 µL aliquot จากกลามเนอ A ทเกบใน Oragene TM preservative เปนเวลา 1 สปดาห นอกจากนเปนเพยงตวอยางเดยวทไมถกตรวจพบระหวางการหาปรมาณ DNA นาจะสนนษฐานไดวา จากการทเนอเยอแตกหกม ข น า ด เ ล ก ม า ก อ า จ ต ด ท ส ว น ข อ ง ฝ า ข อ ง Oragene TM

collection pot การปองกนอาจท ำาได โดยระวงการสมผสก บสารละลาย preservative ในระหวางสปดาหแรกของการเก บรกษา การดแลหลงจากเหตการณนเกดขน เพอใหแนใจวา ตวอยางเนอเยอไดอยในสารละลาย preservative ไมตดกบสวนของฝาของ Oragene TM collection points สำาหรบตวอยางทงหมด ตวอยางตางๆ แสดงใหเหนวา รปแบบ partial DNA profile เร มแรกการ amplification แบบ drop-out สามารถอธบายไดโดยการเตม template ทไมเพยงพอสำาหรบตวอยางสวนใหญ profiles น แสดงถง electropherograms ทวๆไปของกรณนทำาใหคาเฉลย peak height ตำา สงเกตขาม amplified loci ทงหมด การสงเกตทพบนถกสนบสนนโดย ขอมลทางการวเคราะหเชงปรมาณดวยทปรมาณตำา (< 0.04 ng/µL) ถกบนทกสำาหรบตวอยางเหลาน ขอยกเวนของการอธบายน มนจะไมวาทำาไม full DNA profile ไมสามารถผลตไดเม อ DNA ทถกสกด 10 mg ของเนอเยอกลามเนอ B ทเกบใน Oragene TM buffer เปนเวลา 1 สปดาห การวเคราะหหาปรมาณ DNA บงชวา ความเขมขนข อ ง DNA 0.07 ng/µL ถ ก ไ ด ก ล บ ค น ผ ล ข อ ง 34-cycle amplification สามารถผลต profile ทวๆไป ของการเพ ม DNA template มากเก นไป ด วยการหยด peaks ทสง เกต เ น อ ง จ า ก peak heights ม ค า เ ก น ก ว า 6000 RFUs ใ น electropherogram ส ง น บ า ง ท อ ธ บ า ย ถ ง human error

27

made ไดในระหวางการทำา amplification แรกโดยใชท 28 PCR cycles Partial profiles ถกสรางขนสำาหรบตวอยางเนอเยอทเกบเปนเวลา 36 และ 52 สปดาห เมอทำาการหาปรมาณ DNA บงชวา template ทเหมาะสม คอ ปอนลงในแตละปฏกรยาสำาหรบ full profile generation หล งจาก 28 PCR cycles แมว า full profile จะถกสรางข นหลงการ re-amplification โดยใช 34 PCR cycles ภาพ electropherogram แสดงร ปแบบของ amplification ทวๆไปของ template ทถกสลายตวดวย peak heights ทต ำากวา สงเกตจาก loci ทยาวกวาใน SGM Plus amplification kit เชน D18S51 และ FGA ผลเหลานระบวา คณภาพของ DNA ทไดกลบคนจากเนอเยอกลามเนอถกเกบรกษาในทง Oragene TM และ LST preservative buffers อาจเร มลดนอยลงหลงจาก 6 เดอนทอณหภมหอง

บทท 5สรปและวจ�รณผลก�รทดลอง

28

จำานวนของตวอยางทไดรบจากรางกายเพอวตถประสงคในการพสจน DNA นน ในทางนตเวชโดยสวนใหญและสภาพศพทไมกระจดกระจายสามารถตรวจสอบไดจากการชนสตร ในกรณดงกลาวตวอยางพวก buccal swabs ตวอยางเลอดหรอคราบเลอดบนกระดาษกรอง สามารถเกบรวบรวม สำาหรบการทำา DNA profiling (ขนกบงานในกรณตางๆ) เนองจากงายตอการดำาเนนงานทางหองปฏบตการของตวอยางประเภทน ในสหราชอาณาจกร (UK) ในการเกบรวบรวบตวอยาง อาจรวมถงตวอยางทงรางกาย หรอตวอยาง deep muscle แตในกรณทตวอยาง buccal cells และ/หรอตวอยางเลอดไมสามารถใชได เชน ในระหวางการตรวจสอบพบสวนของรางกายทยงคงเหลออยมความแตกหกอยางมาก หรอ ตวอยางทางชวภาพอนๆทตองทำาการรวบรวม การพสจนเอกลกษณและการทำา re-association เนอเยอออนจะถกเกบแทนทกระดกหรอฟน โดยตวอยางกลามเนอเปนสวนทถกใชบอยในปจจบน การสบสวนในงานนจงมงสนใจไปทเนอเยอกลามเนอ ซงเปนแหลงของ DNA ทางเลอก เปนทยอมรบกนอยางกวางขวางวา การเกบรกษา DNA ในกระดกและฟนดกวาในเนอเยอออน โดยเฉพาะอยางยงเมอเกดการเนาเป อยขน อยางไรกตามกระบวนการของเนอเยอแขง ใชเวลาสนเปลองมาก, ใชกำาลงคนมาก, ตองการ de-fleshing, การทำาความส ะ อ า ด , ก า ร ท ำา ใ ห แ ห ง , ก า ร ต ด , ก า ร บ ด แ ล ะ ก า ร de-calcification กอนทจะสามารถทำาการสกด DNA เปรยบเทยบกบกระบวนการทงายกวาของเนอเยอออน ตองทำาการตดตวอยางและทำาการ maceration กอนทำาการสกด DNA งานวจยนไดทดสอบความสามารถของทง Oragene TM

solution แ ล ะ LST buffer เ พ อ ร ก ษ า DNA ท ม ใ นเนอเยอกลามเนอทสดและเกบเปนระยะเวลากวา 12 เดอนทอณหภมหอง ผลจากการทดลองแสดงใหเหนวา มความเปนไปไดทจะได full DNA profiles โดยใชการสก ด DNA มาตรฐานและข นตอน

29

amplification การพจารณาขอมลทางปรมาณวเคราะห พบวา สารละลายท ใช ในการเก บรกษาท ม Oragene TM collection pots บรรจอยภายใน จะใหคาผลผลต DNA ทไดกลบคนสงกวา LST buffer โดยเฉพาะอยางยงเมอเปรยบเทยบกบผลผลต DNA ของเนอเยอกลามเนอทเกบใน 5 mL ของ LST buffer ซงจะไดรบผลผลตทตำากวามาก ผลของ DNA profiling ถกดำาเนนการกบตวอยางทถกสกดทงหมด อยางไรกตาม คณภาพของ DNA ทไดกลบคนจากเนอเยอทเกบใน LST buffer ไมไดลดลงอยางมนยส ำาค ญเม อ เท ยบก บ DNA ทได กล บค นจากต วอยางท เก บใน Oragene TM collection pots ผลผล ตของ DNA ต อ mg ของเนอเย อท เก บใน 1 mL LST buffer มค าสงกวามากเม อตวอยางถกเกบใน 5 mL LST buffer ตามทแสดงในรปท 5 และ 6 ผลเหลาน อาจแสดงวา LST buffer เป น preservation ท เหมาะสมกรณทปรมาณของตวอยางเนอเยอนอยๆ (< 100 mg) เนองจากเซตขอมลในงานวจยถกจำากด การตรวจสอบเพมเตมของปญหาน ควรจะดำาเนนการกอนจงจะสามารถสรปถงปรมาณทเหมาะสมของการใช LST buffer ทจำาเปนสำาหรบการเกบรกษาตวอยาง การทดลองนถกออกแบบทำาซำากบสถานการณทมหลายตวอยางทอาจตองกคนจากตวอยางเดยวทถกเกบสำาหรบการพสจนบคคลจากผเสยชวตขณะเกดอบตเหตในเหตการณอบตเหตทมผเสยชวตจำานวนมาก ดวยเหตน หลายตวอยางไมไดตงคาไวกอนหนาน ซงจดเป น un-sampled specimen ในแตละชวงเวลา ปรมาณท งหมดของ preservative solution ท ง LST buffer และ Oragene TM ถกออกแบบใหใชปรมาณทมากเกนพอสำาหรบการสมตวอยางเปนระยะเวลากวา 1 ป รวมปรมาณทงหมด 600 µL ผลทไดทำาใหปรมาณของ preservation solution มคาคอยๆลดลงทจดขนภายในแตละ container เปนระยะเวลา 52 สปดาหสำาหรบการสมตวอยางทดำาเนนการ การเพมผลผลต DNA หลงจาก 36

30

และ 52 สปดาหของการเกบเนอเยอ เปนคณลกษณะทพบซงเปนไปไดมากทสด เนองจากเปนการลดสดสวนเนอเยอทเหลอตออตราสวน preservative solution เน องด วยการเอาออก 100 µL ในแตละคร งท ส มตวอยาง ผลของ DNA profiling มากกวา 52 สปดาหเตมของระยะเวลาทไดทำาการศกษา อยางไรกตาม พบวา การสมตวอยางหลายครงจากตวอยางทเกบจากทเดยว ไมสงผลเสยตอผลลพธของขนาดทงทางดานคณภาพและปรมาณของ DNA ทจะลดลงตำากวามาตรฐานทจ ำาเปนสำาหรบใชในกระบวนการทท ำาอยปจจบน และตวอยางของแตละเฉพาะบคคล จาก DNA profiling ยงคงสามารถทำาได สดทาย ผลประโยชนเพมเตมของการใชบฟเฟอรเหลานในการเกบรกษาทอณหภมหอง พบวา การสกด DNA สามารถดำาเนนการไดโดยตรงในขณะทยงเปน aliquots ของสารละลาย เชน ไมตองมกระบวนการอนๆอยางในเนอเยอแขงเพมเตม หรอในกรณทเกบตวอยางทอณหภม -20 องศาเซลเซยส กอนการสกดตวอยางตองทำาการ defrosted กอน, เคลอนยายออกจาก container, แบงเปนสวนๆ, ชงนำาหนก, ทำาใหยยกอนแลวนำาไปยอย เปนเวลา 1 ถง 3 ชวโมง (หรอคางคนในหลายๆ กรณ) การใช preservation solution สามารถขจดกระบวนการเหลาน อยางส นเชง DNA สามารถทำาการสกดจาก aliquots ในปรมาณเพยงเลกนอยของบฟเฟอรทไมตองดแลรกษามากนก ใชขนตอนการสกด DNA ทสนกวา ความสามารถในการสกดไดโดยตรงน ทำาใหกระบวนการสกดทงหมดเปนแบบอตโนมตได โดยใช Robotic Platforms เชน Qiagen Biorobot (บ . Qiagen, West Sussex, UK) เปนการเพม sample throughput และอาจทำาใหเกดการเพมขนของการทำา DNA profiling ไดอยางรวดเรวกวาทไดรบจากขนตอนทใชอยในปจจบนกเปนได

คำ�แนะนำ�ของง�นวจยน

31

งานวจยนไดแสดงใหเหนถง ความเหมาะสมของการใช Oragene TM แ ล ะ LST buffers ส ำา ห ร บ ก า ร เ ก บ ร ก ษ าเนอเยอกลามเนอถง 12 เดอนทอณหภมหอง และดงทกลาวไปแลวถงอาจใชเปนวธทางเลอก เมอการแชแขงตวอยาง ไมสามารถแชเยนไดในทนท หรอตองมการขนสงตวอยางจากประเทศหนงไปอกประเทศหนง การใช preservation solutions จะเปนประโยชนตอ downstream processing ของตวอยางทางชวภาพ ขจดความตองการสำาหรบการจดการกบเนอเยอแขง ขอเทจจรงทการสกด DNA สามารถดำาเน นการในร ป aliquot ของสารละลายบฟเฟอรท งสอง โดยไมตองมกระบวนการอนเพมเขามา ท ำาให สามารถทำาการสกด DNA อยางอตโนมต เพ ม throughput processing ของตวอยางเน อเย ออ อนหลายๆตวอยางได ถ าตองการ ขอดอนๆ คอ ตองการวตถตวอยางทถกรวบรวมนอยกวาแนวทางทใชอยปจจบน จากงานวจยน แสดงวา Full SGM รวบกบ STR profile สามารถดำาเนนการไดจากจำานวนตวอยางเพยง 5 mg ของเนอเยอกลามเนอทถกเกบในทง Oragene TM และ LST buffers เปนเวลาถง 52 สปดาห ในทางปฏบต ปรมาณของการชงนำาหนกเนอเยอระหวาง 25 ถง 500 mg นาจะใหผลทดเลศในการเกบรวบรวมตวอยาง สำาหรบวตถประสงคในการพสจนเอกลกษณ เพอใหมนใจถงปรมาณของ DNA ทไดรบสำาหรบการทดสอบหลายๆครง ระบบนเปนการชวยสำาหรบการเกบรวบรวมชนเลกชนนอยของตวอยางกลามเนอ (หรอเนอเยอออนอนๆ) สำาหรบการเกบรกษาทอณหภมหองของการท ำา DNA Identification และอาจเพม sample throughput โ ด ย อ า ศ ย ร ะ บ บ อ ต โ น ม ต เ ป น ว ธ ท portable พกพาไดอยางสมบรณและสามารถทำางานรวมกบระบบการจดการแบบ Bar-coding ผลการดำาเนนงานเร มตน แสดงใหเหนวา สามารถใชได ก บตวอยางท มส วนถกเผา และเก ดการ

32

เปลยนแปลงจากการสลายตว/เนาเป อย ซงสถานการณเหลาน อาจพบไดในระหวางการสบสวนอบตเหตทมผเสยชวตเปนจ ำานวนมาก และจากทกลาวไวแลวกอนหนาน ถงงานทมการใช preservation buffer ทคลายกน ทำาใหเปนการสนบสนนการนำามาใชงานทางดาน DVI และโดยเฉพาะอยางยงใชไดในเหตการณทสวนของรางกายถกกระจดกระจาย ซงแหลง DNA ดงเดม อยางฟนหรอกระดก อาจไมสามารถน ำามาแปลผลส ำาหร บการ Identification และการ Fragment re-association ได ระบบนจดไดวาเปนวธการเพมเตมอกวธหนงสำาหรบการเกบรกษาตวอยางในงานดาน DVI ไดเชนกน

33