การคัดแยกแอคติโนมัยซีทจากมูลสัตวเพื่อใชในการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตน

Isolation of Actinomycetes from Animal Waste for Agricultural Materials Degradation

จามจุร ี เกตุบัวขาว ณิชาภา ชมภ ูสุพัตรา ชาวสวน

วิทยาศาสตรบัณฑิต สาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี มหาวิทยาลยัเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี

มีนาคม 2555

การคัดแยกแอคติโนมัยซีทจากมูลสัตวเพื่อใชในการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตน

Isolation of Actinomycetes from Animal Waste for Agricultural Materials Degradation

จามจุร ี เกตุบัวขาว ณิชาภา ชมภ ูสุพัตรา ชาวสวน

โครงงานดานชีววิทยานี้เปนสวนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรวิทยาศาสตรบัณฑิต

สาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี มหาวิทยาลยัเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี

มีนาคม 2555

การคัดแยกแอคติโนมัยซีทจากมูลสัตวเพื่อใชในการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตน

Isolation of Actinomycetes from Animal Waste for Agricultural Materials Degradation

จามจุร ี เกตุบัวขาว ณิชาภา ชมภ ูสุพัตรา ชาวสวน

โครงงานดานชีววิทยานี้ไดรับการพิจารณาอนุมัติใหนับเปนสวนหนึ่งของการศึกษาตาม

หลักสูตรวิทยาศาสตรบัณฑิต สาขาวิชาชีววิทยา

คณะกรรมการโครงงานดานชีววิทยา

……………………………………………….ประธานกรรมการ (อาจารย ประดับรัฐ ประจันเขตต) ………………………………………………กรรมการ

(ดร. สุทธวรรณ สุพรรณ) ……………………………………………….กรรมการ

(ผูชวยศาสตราจารย สุจยา ฤทธิศร)

ก

กิตติกรรมประกาศ

โครงงานวิจัยนี้ประสบผลสําเร็จลงไดอยางดีดวยความกรุณาของอาจารยประดับรัฐ ประจันเขตต อาจารยที่ปรึกษาโครงงาน ดร.สุทธวรรณ สุพรรณ และผูชวยศาสตราจารย สุจยา ฤทธิศร อาจารยที่ปรึกษารวมโครงงานที่กรุณาใหคําปรึกษา คําแนะนําและแนวทางใน การวิจัยตลอดจนตรวจแกไขงานวิจัยจนเสร็จสมบรูณ ขอกราบขอบพระคุณคณบดีคณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี หัวหนาสาขาวิชาชีววิทยาและคณาจารยในสาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีทุกทาน ที่ใหการสนับสนุนและสงเสริมการทําวิจัย ขอขอบคุณเจาหนาที่หองปฏิบัติการชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ที่กรุณาสละเวลาแนะนําการใชอุปกรณตางๆ เพื่อใหการทํางานวิจัยสําเร็จลุลวงตามเปาหมาย คณะผูวิจัยขอขอบพระคุณอาจารยประดับรัฐ ประจันเขตต ดร.สุทธวรรณ สุพรรณ ผูชวยศาสตราจารย สุจยา ฤทธิศร และเพื่อน พี่นอง สาขาชีววิทยา ตลอดจนทุกทานที่ไดมีสวนรวมในการชวยเหลือในดานอุปกรณ เครื่องมือ คําแนะนํา และเปนกําลังใจ อันเปนประโยชนอยางยิ่งตอการดําเนินงานวิจัยคร้ังนี้

จามจุรี เกตุบัวขาว ณิชาภา ชมภ ู

สุพัตรา ชาวสวน

มีนาคม 2555

ข  

จามจุรี เกตุบัวขาว ณิชาภา ชมภู และสุพัตรา ชาวสวน 2555 : การคัดแยกแอคติโนมัยซีทจาก มูลสัตวเพื่อใชในการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตน ปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต (ชีววิทยา) ประธานกรรมการที่ปรึกษา : อ.ประดับรัฐ ประจันเขตต

บทคัดยอ งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงคเพื่อคัดแยกแอคติโนมัยซีทจากมูลสัตวเบื้องตนและทดสอบการ

สรางเอนไซมเซลลูเลสบนอาหาร Carboxymethyl cellulose Agar สามารถคัดแยกแอคติโนมัยซีทไดทั้งหมด 6 ไอโซเลต คือ JJN-1255, JJN-1300, JJN-1500, JJN-1501, JJN-1816 และ JJN-1700 โดย JJN-1501 มีอัตราสวนเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสตอโคโลนีสูงที่สุดเทากับ 6.2 เซนติเมตร รองลงมาคือ JJN-1500, JJN-1816 และ JJN-1255 โดยมีอัตราสวนเทากับ 5.3, 3.2 และ 1.7 เซนติเมตร ตามลําดับ สวน JJN-1300, JJN-1700 ไมสามารถสรางบริเวณใสได การศึกษากิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทที่เพาะเลี้ยงใน 0.5 % Carboxymethyl cellulose Broth พบวา JJN-1501 มีกิจกรรมของเอนไซมสูงสุด ในวันที่ 1 มีคาเทากับ 0.217 U/ml. รองลงมา คือ JJN-1255, JJN-1500 และ JJN-1816 มีกิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลสเทากับ 0.165 U/ml., 0.156 U/ml. และ 0.151 U/ml. ในวันที่ 5 ตามลําดับ เมื่อนําแอคติโนมัยซีทที่มีความสามารถในการสรางเอนไซมเซลลูเลสทั้ง 4 ไอโซเลต มาเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37, 45, 55, 60 และ 65 องศาเซลเซียส พบวา JJN-1501 เจริญไดที่อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส สวน JJN-1500, JJN-1255 และ JJN-1816 สามารถเจริญไดที่อุณหภูมิสูง 45 องศาเซลเซียส สําหรับผลการทดสอบประสิทธิภาพการยอยวัสดุทางการเกษตรพบวา ในชุดทดลองที่ 3 คือ วัสดุทางการเกษตรที่ไมผานการฆาเชื้อและเติมแอคติ-โนมัยซีทที่มีกิจกรรมของเอนไซมสูงที่สุด คือ JJN-1501 มีประสิทธิภาพการยอยสลายสูงที่สุดโดยน้ําหนักของวัสดุทางการเกษตรลดลงจาก 2 กิโลกรัม เหลือ 0.9 กิโลกรัม หลังทําการทดลองเปนเวลา 28 วัน ระหวางการยอยสลายตรวจวัดคาความเปนกรดดางไดในชวง 6.29-7.77 อุณหภูมิอยูในชวง 31-42 องศาเซลเซียส ความชื้นอยูในชวง 58-89 % และการเจริญของแอคติโนมัยซีทระหวางการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรตรวจพบไดมากที่สุดในชวงสัปดาหที่ 3-4 ของการทดลอง

คําสําคัญ : แอคติโนมัยซีท การยอยสลาย เซลลูเลส ……………….…………………………… ……/……/…… ลายมือช่ือประธานกรรมการ

ค  

Jamjuree Getbuakhow Nichapa Chompooand and Suputta Chowsuan 2012 : Isolation of Actinomycetes from Animal Waste for Agricultural Materials Degradation. Bachelor of Science (Biology). Thesis Advisor : Mr. Pradabrat Prajankate

ABSTRACT This project was purposed to isolate actinomycetes from animal waste for cellulase

production on Carboxymethyl cellulose Agar (CMC Agar). Six isolates of Gram positive filamentous form actinomycetes as JJN-1255, JJN-1300, JJN-1500, JJN-1501, JJN-1700 and JJN-1816 were investigated. JJN-1501 exhibited the highest cellulase production on CMC Agar that considerate from ratio of clear zone by colony’s diameter was 6.2 centimeter. The ratio of JJN-1500, JJN-1816 and JJN-1255 were measured that 5.3, 3.2 and 1.7 centimeter respectively. Furthermore, JJN-1300 and JJN-1700 was missing of clear zone. The study of Cellulase activity in 0.5 % Carboxymethyl cellulose Broth shown that maximum result by JNN-1501 was 0.217 U/ml. after a day of incubation. Moreover, JJN-1255, JJN-1500 and JJN-1816 were observed that 0.165 U/ml., 0.156 U/ml. and 0.151 U/ml. at 5 days of incubation consecutively. The cultivation of actinomycetes on CMC Agar at different temperature of 37, 45, 55, 60 and 65oC indicated that JNN-1501 was growth at 37-55 oC. Including, JJN-1500, JJN-1816 and JJN-1255 were growth 37-45 ºC. The efficiency degradation of Agricultural materials by JJN-1501 shown that under the condition of unautoclave agricultaural materials mixed with the JJN-1501 was highest treatment by 2 kilograms of agricultaural materials were decreased to 0.9 kilograms at 6.29-7.77 of pH, 31-42 oC and 58-89 % moisture for 30 days. In addition, the most number of actinomycetes presented at 3-4 weeks during degradation time.

 

Keywords : Actinomycetes, Degradation, Cellulase

...........…………………………………… ……/……/…… Thesis Advisor’s Signature

ง

สารบาญ

หนา

กิตติกรรมประกาศ บทคัดยอภาษาไทย บทคัดยอภาษาอังกฤษ สารบาญ สารบาญตาราง สารบาญภาพ บทที่ 1 บทนํา บทที่ 2 ทบทวนเอกสาร บทที่ 3 อุปกรณและวิธีการทดลอง บทที่ 4 ผลและวจิารณผลการทดลอง บทที่ 5 สรุปผลการทดลอง เอกสารอางอิง ภาคผนวก ก ข ค ง จ ฉ ประวัติผูดําเนนิการทดลอง

ก ข ค ง จ ฉ 1 3

31 39 51 53

58 61 66 70 83 86 88

จ

สารบาญตาราง ตารางที่ หนา

1 ปริมาณเซลลูโลสในวัสดุอินทรีย 2 ลักษณะโคโลนีของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได 3 อัตราสวนเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสตอโคโลนีของแอคติโนมัยซีท ที่คัดแยกได 4 การทดสอบการทนความรอนของแอคตโินมัยซีทที่คัดแยกได 5 การเจริญของแอคติโนมยัซีทระหวางการยอยสลายวสัดุทางการเกษตร 6 คาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 550 นาโนเมตร ของสารละลายกลูโคสมาตรฐาน 7 กิจกรรมเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN-1255 ที่อุณหภูม ิ 37 องศาเซลเซียส นาน 7 วัน 8 กิจกรรมเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN-1500 ที่อุณหภูม ิ 37 องศาเซลเซียส นาน 7 วัน 9 กิจกรรมเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN-1501 ที่อุณหภูม ิ 37 องศาเซลเซียส นาน 7 วัน 10 กิจกรรมเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN-1816 ที่อุณหภูม ิ 37 องศาเซลเซียส นาน 7 วัน 11 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุควบคุม 12 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุทดลองที่ 1 13 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุทดลองที่ 2 14 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุทดลองที่ 3 15 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุควบคุม 16 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุทดลองที่ 1 17 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุทดลองที่ 2

22 37

41 44 50 67

68

68

69

69 71 72 73 74 75 76 77

ฉ

สารบาญตาราง (ตอ) ตารางที่ หนา

18 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุทดลองที่ 3 19 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุควบคุม 20 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุทดลองที่ 1 21 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุทดลองที่ 2 22 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชดุทดลองที่ 3 23 การยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตร ชุดควบคุม 24 การยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 1 25 การยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 2 26 การยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 3

78 79 80 81 82 84 84 85 85

ฉ

สารบาญภาพ ภาพที่ หนา

1 ลักษณะรูปรางของแอคติโนมัยซีท 2 การสรางสปอรเดี่ยวของแอคติโนมัยซีทชนิดตางๆ 3 กานชูสปอรไมแตกแขนง 4 ภาพภายใตกลองจุลทรรศนแสดงลักษณะสปอรของแอคติโนมัยซีท 5 โครงสรางสปอรตางๆ ของ streptomycetes 6 แอคติโนมัยซีทกลุมที่สรางสปอรเปนสายคูและสายสัน้ 7 รูปทรงของอับสปอรที่เจริญบนสายใยอาหาร 8 รูปทรงของอับสปอรที่เจริญบนสายใยอากาศ 9 โครงสรางของเซลลูโลสในผนังเซลลพืชช้ันสูง 10 เสนใยเซลลูโลสในผนังเซลลพืชช้ันสูง 11 โครงสรางของเซลลูโลส 12 ลักษณะการสานกันเปนรางแหของเซลลูโลส 13 ตัวอยางมลูสัตวที่ทําการคัดแยกแอคติโนมันซีท 14 วิธีการศึกษาสัณฐานวิทยาของแอคติโนมัยซีท 15 การเตรียมตัวอยางเศษวสัดุลงในถังพลาสติก 16 ลักษณะโคโลนีของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได 17 สัณฐานวทิยาของแอคตโินมัยซีทภายใตกลองจุลทรรศนกําลังขยาย 1,000 เทา 18 การทดสอบความสามารถในการสรางเอนไซมเซลลูเลส ของแอคติโนมัยซีทไอโซเลต JJN-1501 19 กิจกรรมเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได 20 ลักษณะโคโลนีของ JJN-1501บนอาหาร CMC Agar ที่อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส  

4 7 7 8 8

10 11 12 19 20 21 21 32 34 36 38 40

42 43

45

สารบาญภาพ (ตอ) ภาพที่ หนา

21 คาความเปนกรด-ดางระหวางการทดสอบการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตน 22 อุณหภูมิระหวางการทดสอบการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตน 23 ความชื้นระหวางการทดสอบการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตน 24 น้ําหนกัของวัสดุทางการเกษตรระหวางการทดสอบการยอยสลายเบื้องตน 25 การทดสอบการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตนในชุดการทดลองตางๆ 26 ผลการทดสอบการสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN-1255 บนอาหารวุน 27 ผลการทดสอบการสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN-1500 บนอาหารวุน 28 ผลการทดสอบการสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN-1501 บนอาหารวุน 29 ผลการทดสอบการสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN-1816 บนอาหารวุน 30 กราฟมาตรฐานของสารละลายกลูโคส

46 46 47 47 48

62

63

64

65 67

บทที่1

บทนํา

1.1 ท่ีมาและความสําคัญ

เซลลูโลส (cellulose) เปนสารประกอบอินทรียที่มีอยูมากที่สุดในโลกสามารถหาไดงายเมื่อเทียบกับสารประกอบอินทรียชนิดอ่ืนพบไดทั่วไปในผนังเซลลของพืชช้ันสูงทุกชนิดสาหรายและเชื้อราบางชนิด (Nishida, 2007) สําหรับในประเทศไทยประชากรสวนใหญประกอบอาชีพเกษตรกรรมซึ่งกอใหเกิดผลพลอยไดและวัสดุอินทรียที่เหลือทิ้งเชนใบไมและเศษวัชพืชจํานวนมาก (Prasertsri et al., 2000) ซ่ึงในทุกปจะมีเซลลูโลสสะสมในสิ่งแวดลอมเพิ่มขึ้นถึงส่ีพันลานตัน (Beguin, 1990) ในปจจุบันไดมีการนําวัสดุเหลือท้ิงไปใชประโยชนอยางหลากหลายแตก็ยังมีเหลือทิ้งอีกจํานวนมากกอใหเกิดปญหามลภาวะขึ้นการคิดหาวิธีนําเศษซากใบไมและวัชพืชไปแปรรูปหรือเพ่ิมมูลคาเชนการนําไปผลิตปุยหมักหรือเปนสารตั้งตนในการผลิตพลังงานทดแทนจึงเปนอีกแนวทางหนึ่งในการแกปญหาดังกลาวในการใชเศษใบไมและวัชพืชเปนสารตั้งตนนั้นจําเปนตองอาศัยเอนไซมเซลลูเลส (cellulase) เขาทําการยอยสลายเซลลูโลสเอนไซมเซลลูเลสนี้พบไดในส่ิงมีชีวิตหลายชนิดรวมทั้งจุลินทรียโดยเอนไซมที่ไดจากจุลินทรียเปนเอนไซมที่ผลิตออกมาสูภายนอกเซลล (extracellular enzyme) สามารถผลิตไดในปริมาณสูงเมื่อเปรียบเทียบกับการผลิตโดยวิธีอ่ืน และจุลินทรียที่มีการศึกษาอยางมากไดแกเชื้อราอยางไรก็ตามมีรายงานแบคทีเรียที่สามารถผลิตเอนไซมเซลลูเลสได เชน Clostridium sp., Pseudomonas sp. และ Streptomycetessp. (Haward and Elliott, 1988) เปนตน ในการพัฒนาการผลิตเอนไซมใหมีประสิทธิภาพยิ่งขึ้นนั้นวิธีการหนึ่งคือการเลือกแบคทีเรียที่สามารถเจริญไดดีในอุณหภูมิสูงเนื่องจากเปนการลดการปนเปอนจากจุลินทรียอ่ืนการที่ประเทศไทยอยูในภูมิภาครอนชื้นและมีความหลากหลายทางชีวภาพสูงทําใหมีศักยภาพในการคนหาจุลินทรียชนิดใหมที่สามารถยอยสลายเซลลูโลสไดอยางมีประสิทธิภาพมากยิ่งขึ้นดังนั้นจึงทําการคัดแยกสายพันธุแอคติโนมัยซีทที่สามารถผลิตเอนไซมเซลลูเลสที่มีบทบาทสําคัญในการเปนจุลินทรียชวยเรงการยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตรโดยเอนไซมเซลลูเลสที่ไดจากจุลินทรียเปนเอนไซมที่ผลิตออกมาสูภายนอกเซลล (extracellular enzyme) จัดเปนแหลงผลิตเอนไซม เซลลูเลสที่ดีที่สุดเนื่องจากสะดวกตอการสกัดสามารถผลิตไดในปริมาณมากตนทุนการผลิตต่ําทั้งนี้พบวาสภาพการเพาะเลี้ยงมีผลตอชนิดและปริมาณของเอนไซมที่สรางขึ้นเชนองคประกอบของ

2  

อาหารเลี้ยงเชื้อไดแกชนิดและปริมาณของเซลลูโลสที่ใชปริมาณเกลือของโลหะตางๆสภาพความเปนกรด-ดางอุณหภูมิและออกซิเจน เปนตน (Alexander, 1967)

เชื้อจุลินทรียที่มีบทบาทสําคัญในกระบวนการยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตร ไดแก แบคทีเรีย เชื้อรา และแอคติโนมัยซีท โดยการเจริญของเชื้อกลุมดังกลาว จะทําใหมีการสะสมของมวลเซลลและสารเมทาบอไลทตางๆ รวมถึงการเกิดความรอนขึ้นจากกิจกรรมของจุลินทรีย จากบทบาทของจุลินทรียดังกลาวจะทําใหแบคทีเรียและเชื้อราหยุดการเจริญเติบโต เนื่องจากอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นภายในกองวัสดุทางการเกษตร จากนั้นแอคติโนมัยซีทจะมีบทบาทสําคัญในการยอยสลายอินทรยีสาร 1.2 วัตถุประสงค 1.2.1 เพื่อคัดแยกและศกึษาสัณฐานวิทยาของแอคติโนมัยซีท 1.2.2 เพื่อศึกษาความสามารถในการสรางเอนไซมเซลลูเลสและกิจกรรมของเอนไซม เซลลูเลสโดยแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได 1.2.3 เพื่อทดสอบประสิทธิภาพการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรโดยแอคติโนมัยซีทที่คัด แยกได

บทที่2

ทบทวนเอกสาร

2.1 แอคติโนมยัซีท (Actinomycetes)

แบคทีเรียกลุมแอคติโนมัยซีทเปนแบคทีเรียแตมักจะถูกแยกออกมาศึกษาออกจากแบคทีเรียทั่วไปเนื่องจากแอคติโนมัยซีทจะมีลักษณะพิเศษ คือมีลักษณะโคโลนีขนาดคอนขางใหญและมีลักษณะผิวที่หยาบ รูปรางแบบฟลาเมนทที่ตอเปนสายยาว ซ่ึงมีลักษณะคลายเชื้อราแตมีขนาดเสนผาศูนยกลางเลก็กวาเชื้อรา คือประมาณ 0.5-1.2 ไมโครเมตร ผนังเซลลมีลักษณะคลายแบคทีเรียแกรมบวกสวนความคลายคลึงกับฟงไจ คือ มีการสรางสปอรแบบไมอาศัยเพศ (Asexual spore) เมื่ออยูในสภาวะเหมาะสมจะเจริญเปนเสนใย เจริญไดดีที่อุณภูมิ 45-65 °C แอคติโนมัยซีทจะมีปริมาณเทากับชีวมวลของจํานวนแบคที เ รียทั้งหมดในดินทําใหมีผลดีตอการเจริญของ แอคติโนมัยซีทในดิน (รัตนาภรณ, 2548) คือ

2.1.1 ในสภาวะที่แหงเสนฟลาเมนทของแบคทีเรียกลุมแอคติโนมัยซีทจะเชื่อมโยงระหวางกอนดิน 2 กอน

2.1.2 เสนฟลาเมนทของแบคทีเรียกลุมแอคติโนมัยซีทจะทําใหเชื้อที่มีพื้นที่ผิวมากที่สุดเมื่อเทียบกับรูปรางแบคทีเรียแบบอื่นๆ ซ่ึงจะทําใหมีประโยชนตอการดดูอาหาร

แอคติโนมัยซีทจะพบในดินประมาณ 10-33 เปอรเซนตของแบคทีเรียในดินกลุมที่พบมากที่สุดในดิน คือ Streptomyces และ Nocardia สวนกลุมที่อาศัยอยูในดินแตมีปริมาณนอยคือ แอคติ-โนมัยซีท อ่ืนๆในดินที่มีแอคติโนมัยซีทจะมีกล่ินเหม็นอับเนื่องจากแอคติโนมัยซีทมีแบคทีเรียที่สามารถสรางสารที่เรียกวา “จีโอสมิน” (Geosmin) ที่ทําใหเกิดกลิ่นเหม็นอับ แบคทีเรียกลุมแอคติ-โนมัยซีทคอนขางทนตอความแหงแลงจึงสามารถรอดชีวิตไดในสภาวะที่แหงแลงมาก เชน ดินในทะเลทราย นอกจากนั้นยังชอบเจริญในสภาวะที่เปนดางหรือเปนกลางแตไมทนสภาวะที่ เปนกรด แอคติโนมัยซีทไดรับความสนใจมากขึ้นเมื่อมีการคนพบวาบางสกุลของแอคติโนมัยซีท เชน Streptomyces สามารถผลิตสารปฏิชีวนะ  

4  

ภาพที ่ 1 ลักษณะรูปรางของแอคติโนมยัซีท ที่มา : สายพณิ (2550) 2.1.1 ลักษณะโคโลนีของแอคติโนมัยซีท

โคโลนีของแอคติโนมัยซีทเกิดจากการรวมกันของกลุมเสนใยโคโลนีของ แอคติโนมัยซีทตางจากโคโลนีของแบคทีเรียเนื่องจากโคโลนีของแบคทีเรียเกิดจากเซลลเดียวหรือกลุมเซลลที่มีลักษณะเหมือนกันแตโคโลนีของแอคติโนมัยซีทเกิดจากการรวมกันของเสนใยเปนกลุมเสนใยที่มีความหนาแนนการเจริญของโคโลนีเร่ิมจากการที่หัวเชื้อเจริญในปริมาณที่พอเหมาะบนอาหารเลี้ยงเชื้อหัวเชื้ออาจมาจากสปอรเดี่ยวอับสปอร สวนที่แตกหักของเสนใยหรือจากสวนของโคโลนีที่มีอายุมาก และจะพัฒนาเปนสายใยอาหารเมื่อสายใยอาหารเจริญเต็มที่ในแนวตั้งแทงผานอาหารขึ้นมาเปนสายใยอากาศและจะมีการเปลี่ยนแปลงลักษณะของโคโลนีเชนสรางสปอร เสนใยจะเริ่มแบงตัวเริ่มจากการสรางผนังกั้นภายในโดยทั่วไปเสนใยมีผนังกั้นชั้นเดียวเพื่อความคงตัวและสรางเปนเสนใยแข็งจึงเปนการยากที่จะสรุปความหลากหลายทั้งหมดของลักษณะโคโลนีเชนเดียวกับการบงชี้สปชีสของแอคติโนมัยซีทความแตกตางของสายใยอาหารและสายใยอากาศจึงนํามาใชเปนหลักในการแยกชนิดของโคโลนีเชนกรณีของ Streptomyces มีทั้งสายใยอาหารและสายใยอากาศเปนโครงสรางหลักของโคโลนีใน Micromonospora และ Actinoplanes ไมมีสายใยอากาศ นอกจากนี้ยังพบวา Sporichthya จะมีวงชีวิตที่สมบูรณเมื่อมีการสรางสายใยอากาศสั้นๆโคโลนีของแอคติโนมัยซีทอาจฟู (Raised) หรือเรียบแบน (Flat) บางครั้งปกคลุมดวยช้ันมีลักษณะคลายหนัง (Leather) ลักษณะอาจมีตั้งแตนุมมากเหนียวจนถึงแข็งมากสีของโคโลนี เชน ขาว เหลือง สม ชมพู แดงมวงฟา เขียว น้ําตาล และดํา พื้นผิวของโคโลนีมีลักษณะเรียบ (Smooth) นูน (Ridged) ขรุขระ (Rough) เปนรอยยน (Wrinkled) เปนเม็ดเล็ก (Granular) เปนผง (Powder) หรือเปนเกล็ด ( Squamous) ขนาดของโคโลนีขึ้ นอยู กับ สปชีส อายุ และสภาวะในการ เจริญ เติบโต เสนผาศูนยกลางของโคโลนี ความแตกตางตั้งแตหนวยมิลลิเมตรจนถึงเซนติเมตร (สายพิณ, 2550)

5  

2.1.2 ลักษณะสายใย (Mycelium) ของแอคติโนมัยซีท โคโลนีของแอคติโนมัยซีทจะมีสายใย 2 แบบ คือ สายใยอาหาร (Substrate mycelium)

และสายใยอากาศ (Aerialmycelium) ซ่ึงจะแสดงลักษณะและหนาที่ทางชีววิทยาที่แตกตางกัน โดยทั่วไปแอคติโนมัยซีทจะมีการสรางสายใยทั้ง 2 แบบ แตบางชนิดสรางเฉพาะสายใยอาหารปกติไมพบผนังกั้นเซลลภายในสายใย อาจพบไดในชวงแรกของกระบวนการแตกหักเปนชิ้น (Fragmentation) ของสายใยโครงสรางภายในสายใยที่แสดงวาแอคติโนมัยซีทเปนโปรคาริโอต ประกอบดวยผนังเซลลซ่ึงหนาประมาณ 10-20 นาโนเมตร ภายในเยื่อหุมเซลลประกอบดวย ไซโทพลาสซึม ซ่ึงมีบริเวณของสาย ดีเอ็นเอ ไรโบโซม และสารตางๆ ที่สะสมภายในเซลล เชน Polyphosphates, Lipids หรือ Polysaccharides มีเยื่อหุมเซลลหอหุมไซโทพลาสซึม ซ่ึงเยื่อหุมเซลลบางสวนตรงบริเวณที่ติดกับผนังเซลลสามารถพฒันาไปเปนมีโซโซม (Mesosomes)

สายใยอาหาร คือ สายใยที่สรางขึ้นในชวงเปน Vegetative cell เจริญอยูในอาหารเลี้ยงเชื้อโดยจะมีขนาดรูปรางแตกตางกัน ชวงแรกสีของสายใยจะเปนสีขาวขุนหรือครีม แตเมื่อโตหรือเจริญเต็มที่แลวจะกลายเปนสีเหลือง แดง ชมพู เขียว สม หรือน้ําตาล และเมื่อเพาะเลี้ยงตอไปบนอาหารเล้ียงเชื้อจะเกิดการเจริญอยางรวดเร็วภายใน 2-6 ช่ัวโมงโดยจะมีการสรางทอเจริญ (Germ tube) หนึ่งทอหรือหลายทอ ซ่ึงจะเจริญตอไปเปนสายใยที่ยาวขึ้นและพัฒนาไปเปนสายใยที่ซับซอนยิ่งขึ้นเสนผาศูนยกลางของสายใยประเภทนี้พบตั้งแต 0.2-0.8 ไมโครเมตร บางชนิดสายใยมีลักษณะโคงและแตกแขนงโครงสรางของสายใยจะมีความแตกตางกันขึ้นกับสวนประกอบของอาหารเลี้ยงเชื้อ ภาวะที่เชื้อเจริญ โดยเฉพาะอยางยิ่งอุณหภูมิและสารเคมี เมื่อเชื้อมีอายุมากสายใยชนิดนี้จะมีการแตกหักเปนชิ้นสวนส้ันๆ บางชนิดอาจมีการแตกหักอยางรวดเร็ว โดยเฉพาะเมื่ออยูในอุณหภูมิสูงหรือเจริญอยูในภาวะที่เปนของเหลว (สายพิณ, 2550)

สายใยอากาศ (Aerial mycelium) คือ สายใยที่สรางขึ้นดานบนของสายใยอาหาร พบมากในแอคติโนมัยซีทสวนใหญโดยเฉพาะสกุล Streptomyces ลักษณะของสายใยอากาศจะแตกตางกันไปตามชนิดของแอคติโนมัยซีทสวนประกอบของอาหาร และสภาวะของการเลี้ยงเชื้อสวนใหญ มีเสนผาศูนยกลางตั้งแต 1-1.4 ไมโครเมตร การเจริญของสายใยอากาศจะเริ่มจากการแตกหนอ(Sprout) หรือแตกแขนง (Branching) สวนของเสนใยอาหาร แลวเจริญขึ้นดานบนสัมผัสกับอากาศและเกิดการแบงตัว (Subdivision) เพื่อเจริญตอไปเปนเซลลที่จะพัฒนาไปเปนสปอรตอไปโดยปกติสายใยชนิดนี้จะมีลักษณะสั้น หรือยาวตรง หรือโคง และมีการแตกแขนงจํานวนมากสายใยอากาศจะเจริญปกคลุมทั้งโคโลนีเมื่อสังเกตดูอาจเห็นลักษณะคลายฝุนชอลกอยูบนสายใยอาหาร

6  

แอคติโนมัยซีทบางกลุมสรางสายใยอากาศที่มีลักษณะวงแหวนเมื่อมองจากดานบนของโคโลนี โดยลักษณะดังกลาว เกิดจากการชักนําของยีนของสายใยที่จะพัฒนาไปเปนสปอร ปจจัยที่มีอิทธิพลตอปรากฏการณนี้คือการแพรของสารเคมีบางชนิด ความเขมของแสงอุณหภูมิ และความชื้น (สายพิณ, 2550) 2.1.3 สปอรของแอคติโนมัยซีท

2.1.3.1 ลักษณะการสรางสปอรของแอคติโนมัยซีท ลักษณะการสรางสปอรของแอคติโนมัยซีท สามารถแบงออกเปน 2 แบบ สามารถ

แบงออกเปน 2 แบบ คือ Endogenous formation เปนสปอรที่มีคุณสมบัติทนความรอนไดดีอยูภายใน

Cytoplasm ของเสนใยเดิม (Parent hyphae) และสวนมากพบในพวก Themophilic actinomycetes เชน Thermoactinomyces และ Actinobifida

Exogenous formation แอคติโนมัยซีทสวนใหญสรางสปอรแบบ Exogenousโดยเฉพาะ Streptomyces spp.

การสรางสปอรของแอคติโนมัยซีท มีหนาที่ในการสืบพันธุและแสดงถึงความแตกตางของชนิดสปอรที่มีรูปรางหลากหลาย เชน กลม (Globose) รูปไข (Ovoid) รูปแทง (Rod) และมีผิวสปอรหลายรูปแบบ เชน เรียบ (Smooth) ขรุขระ (Irregular rough) รอยนูนเปนรองขนาน (Parallel rugose) ปุม (Warty) ตุมยาว (Tuberculate) หนาม (Spiny) และเปนขน (Hairy)

2.1.3.2 ลักษณะการสรางสปอรประเภทตางๆ การสรางสปอรประเภทตางๆแบงได 3 ประเภท ตามลักษณะโครงสรางภายนอก

คือ สปอรเดี่ยว สายสปอร และสรางสปอรภายในอับสปอร (ศิราภรณ, 2550) - กลุมที่สรางสปอรเดี่ยว (Monosporus) พบในหลายสกุล เชน Micromonospora

กานชูสปอร (Sporophores) เกิดขึ้นบนสายใยอาหาร สรางสปอรติดอยูกับกานชูสปอรส้ันๆและแยกออกมาเดี่ยวๆ การสรางสปอรเร่ิมจากสวนปลายสุดของเสนใยมีการพองตัวออกจากน้ันมีการสรางผนังกั้นระหวางการชูสปอร และสวนที่พองออกเปนสปอร และสรางผนังสปอรหนาขึ้น ปลายสุดของกานชูสปอรอาจแตกแขนงหรือไมแตกแขนง การแตกแขนงของปลายกานชูสปอรทําให Thermomonospora ที่สรางสปอรเดี่ยวตรงบริเวณปลายกานชูสปอรมีสปอรอยูรวมกันเปนกลุมและอาจสรางสปอรบนเสนใยอาหารดวย Saccharomonospora มีการสรางสปอรเดี่ยวรูปไขที่ปลาย

 

สายใยอากาAleuriospore

(A) ภาพที ่ 2 กา ทีม่ ภาพที ่ 3 กา ทีม่

ศ มีกานชูสปes เพราะสปอ

) Micromono

รสรางสปอรมา : ศิราภรณ

นชูสปอรไมแมา : สายพิณ (

ปอรส้ันและอรเกิดจากปลา

ospora (B) T

เดี่ยวของแอค (2550)

แตกแขนง (2550)

7

ไมแตกแขนายเสนใยมีกา

Thermomomo

คติโนมัยซีทช

นง อาจเรียกสรโปงออก (ส

onospora (C)

ชนิดตางๆ

สปอรเดี่ยวทั้สายพิณ, 2550

Saccharomo

ทั้งสามสกุลข0)

nospora

ขางตนวา

 

ภาพที ่ 4 ภา ทีม่ ภาพที่ 5 โคร ทีม่

พภายใตกลอมา : สายพณิ (

รงสรางสปอรมา : สายพณิ (

องจลุทรรศนแ2550)

รตางๆ ของSt2550)

8

แสดงลักษณะ

treptomycete

สปอรของแอ

s

อคติโนมัยซีทท

9  

- กลุมที่สรางสปอรเปนสาย การสรางเปนสายเกิดจากเสนใยมีการแบงตัวเปน Segmentsตามขวาง แตละ Segments สามารถพัฒนาเปนสปอรได ในแอคติโนมัยซีทมีการสรางสปอรแบบนี้เปนสวนมาก สามารถแบงเปนกลุมไดโดยพิจารณาถึงความยาวของสายอากาศสปอร หรือจํานวนสปอร คือ สปอรคู (Bisporous) สปอรสายส้ัน (Oligosporous) และสปอรสายยาว (Polysporous) สปอรคูประกอบดวยคูของสปอรตอกันตามยาว พบในสกุล Microbispora เปนการสรางสปอรที่พบไดยาก มีลักษณะเปนคูทรงรีมีเสนผาศูนยกลางมากกวา 2 ไมโครเมตร อาจเกิดขึ้นบนสายใยอากาศโดยตรง หรือเกิดบนกานชูสปอรส้ันๆ ลักษณะสปอรของ Microbispora เร่ิมจากการสรางเสนใยอากาศแตกหนอออกทางดานขางเปนกิ่งสั้นๆ จากนั้นสวนที่เปนกิ่งมีการพองออกและสรางผนังกั้นตรงกลาง แอคติโนมัยซีทที่สรางสปอรแบบ Bisporous ไมไดพบเฉพาะในสกุล Microbisporaเทานั้น ซ่ึงลักษณะสปอร 2 สปอร ที่พบตอกันตามแนวยาวยังพบใน Actinomadura echinospora, Actinomadura rugatobispora และสกุล Actinobispora (สายพิณ, 2550)

สปอรสายส้ันสวนมากพบ 7-20 สปอรตอสาย นอยที่สุดคือ 3 สปอร และบางสปชีสจะมีสปอรมากถึง 30 สปอร เชน Nocardia brevicatena สรางสปอรสายสั้นๆ บนสายใยอาหารและสายใยอากาศ โดยมีจํานวนสปอร 2-7 สปอรอยูบนกานชูสปอร สายสปอรอาจมีการแตกแขนงและ มีการแตกหักของเสนใยอาหาร Saccharopolyspora ectivirgula สรางสปอรตอกันเปนสาย มีจํานวนสปอรนอยกวา 5 สปอรบนกานชูสปอรที่อยูบริเวณดานขาง และปลายของเสนใยในสกุล Actinomadura สรางสปอรสายสั้นๆ บนสายใยอากาศ จํานวนสปอรบนสายใยอากาศมีตั้งแต 4 สปอร ถึง 20 สปอร สายสปอรอาจมีลักษณะตรง (Straight) เปนขอ (Hooked) เปนวงเปด (Open loop) หรือเปนเกลียว (Spiral) ที่ซอนกัน 1-4 ชั้น เชน Actinomadurapusilla สรางสายสปอรเปนเกลียวพันกันแนน Streptoverticillum มีลักษณะเฉพาะ คือ สรางกานชูสปอรเปนวงรอบเสนใยแกน สายสปอรส้ันอาจมีลักษณะบิดเปนเกลียวซอนติดกัน หรือโคงงอ (ศิราภรณ, 2550) และเสนใยแกนที่มีสายสปอรจะมีการบิดตัวสกุล Macrospora, Microcelobosporia และ Elytrosporangium จะมีการสรางสปอรขนาดใหญในสายสปอรส้ันๆ อยูบนสายใยอาหาร Sporichthya polymorphaสรางสปอรสายสั้นบนสายใยอากาศ ซ่ึงสปอรมีลักษณะเปนรูปแทงจนถึงรูปกลม Catellatospora สายสปอรมีลักษณะตรงจนถึงโคงงอ มีจํานวนสปอร 5-30 สปอร อยูบนปลายกานชูสปอรที่แทงขึ้นมาจากอาหาร กานชูสปอรมีขนาดสั้นและอาจแตกแขนงหรือไมแตกแขนง (สายพิณ, 2550)

 

ภาพที ่ 6 แอ ทีม่

- ก

มีสปอรอยูมสปอรบนสาอาหาร ประกรูปทรงที่ไมแที่ปลายสุดขอผนังหอหุมบอับสปอรเฉล่ีเปนสายอีกสมีรูปทรงกระขนานกัน หรืหลายสกุลทีOligosporou

อคติโนมัยซีทมา : สายพณิ (

กลุมที่สรางสปากมาย สามายใยอาหาร แกอบดวยสกุลแนนอน มีเสนองกานชูอับสบางสปชีสในล่ียกวาง 10 ไมสกุลที่มีการสระบอก ทรงกลรือวกวนไมเที่มีการสรางs คือ มีสปอร

กลุมที่สรางส2550)

ปอรในอับสปารถแบงกลุมละกลุมที่สราล Actinoplansนผาศูนยกลางสปอรมีการแตนสกุล Actinoมโครเมตร ยารางสปอรในอลม ขนาดประเปนระเบียบ อับสปอร เชประมาณ 2-5

10

สปอรเปนสาย

ปอร มีหลายสมที่สรางอับสางอับสปอรบs อับสปอรมีงประมาณ 5-ตกแขนงออกoplans สรางอาว 15 ไมโครเอับสปอร คือะมาณ 10-15 ลักษณะของชน สกุล Da5 สปอร อยูใน

ยคูและสายสั้น

สกุลที่สรางสสปอรไดเปนบนสายใยอากลักษณะทรง

-15 ไมโครเมกเปนสายสปออับสปอรรูปเมตร ภายในออ Pilimelia อั ไมโครเมตร งอับสปอรในactylosporangนอับสปอรที่มี

น

สปอรในอับสสองกลุมใหญาศ กลุมที่สรกลม หรือเกืตร ยื่นขึ้นมาจอรหลายสายขทรงกระบอกอับสปอรมีสปอับสปอรสรา สปอรเปนรูปนสกุล Pilimegium สกุลนี้มรูีปรางคลาย

สปอร ภายในอญ คือ กลุมที่างอับสปอรบอบกลม จนถึจากสายใยอาขดกันเปนกอก ทรงขวดขปอรเปนรูปแงขึ้นบนผิวขอปแทงเรียงตัวelia นอกจากมีจํานวนสปนิ้ว (ศิราภรณ

อับสปอร ที่สรางอับบนสายใยถึงไมเปนหาร และอนภายในนาดของ ทงตอกันองอาหาร วเปนแถวนี้ยังมีอีกปอรแบบ ณ, 2550)

 

ภาพที ่ 7 รูป (A (B ทีม่

- กลุม

รูปทรงกระบอับสปอรสกุสกุล Planoมีสปอรจํานสวนมากอับสเปนสปอรเดี่แยกออกจาก48ไมโครเมตรูปทรงกลมหสปอรเรียงตัสปอรเปนรูป

ปทรงของอับสA) ActinoplanB) Pilimelia : มา : ศิราภรณ

มที่สรางอับสปบอก ภายในมเีล Planotetraopolyspora วนมหาศาลตสปอรเปนรูปยวตอกันเปนสกุล Streptosตร อับสปอรหรือรูปรางเหัวกันเปนสายปแทง และโค

สปอรที่เจริญบns : 1) ทรงกล 6) ทรงรี 7) รู (2550)

ปอรบนสายใเพียงหนึ่งสป

aspora สรางอเมื่อเจริญเต็

ตอกันเปนแถปทรงกลมมีเสนสายยาวขดเปsporangium ซรมีผนังบางติดหมือนหนอน ยและขดเปนงงอ (ศิราภรณ

11

บนสายใยอาหลม 2) ทรงกระรูปทรงระฆัง 8

ใยอากาศประอร สกุล Planอับสปอรทรงต็มที่สปอรจะถวเดี่ยวตอกันสนผาศูนยกลปนวงอยูภายซ่ึงสรางอับสดอยูบนกานช(Vermiform)วง ภายในวงณ, 2550)

หาร ะบอก 3) เปน8) ทรงกระบอ

กอบดวยสกุลnobispora สรงกระบอก ภามีลักษณะเปนนอยูภายในอัลางประมาณ ในอับสปอร ปอรลูกกลมขชูสปอรยาว ส) มีเสนผาศูนยงของสายสป

พู 4) กึ่งทรงกอก 9) รูปทรง

ล Planomonoรางสปอรคูตอยในมี 4 สปอนเสนยาวปรอับสปอร สกุ10 ไมโครเมต ในปจจุบันสขนาดใหญเสนสกุล Spirillosยกลางประมาอรมีการแตก

กลม 5) ไมเปนงกระบอง

ospora สรางออกันตามยาวออร ตอกันเปนะมาณ 30ไมกุล Streptospoตร มีการสราสกุล Kutznerนผาศูนยกลาspora มีอับสาณ 5-24 ไมกแขนงของส

นรูปทรง

อับสปอรอยูภายในนหนึ่งแถวโครเมตร orangium างผนังกั้นria ไดถูกงมากกวาสปอรเปนโครเมตร สายสปอร

 

ภาพที ่ 8 รูป (A (B (C (D (E (F ที

2.1.3

(Submerged ของเสนใยที่เหลวที่มีการและแบบ Fraอาหารเชนเดีแนนกับผิวหเจริญของเชื้อพบได 3 แบ

ปทรงของอับสA) สกุล PlanoB) สกุล PlanoC) สกุล PlanoD) สกุลPlanoE) สกุล SpirilF) สกุล Strepที่มา : ศิราภรณ

3.3 ลักษณะก ลักษณะก culture) มีเรียกวา Pelleรเขยาใหอากาagmentation ยวกับในอาห

หนาอาหารวุนอบนอาหารแบ (วราภรณ,

สปอรที่เจริญบomonospora obispora : สรotetraspora : opolyspora : สllospora : สรptosporangiumณ (2550)

การเจริญของแารเจริญของเลักษณะตางกั

ets แตสําหรัาศเชื้อจะมีลักเมื่อหยุดการเหารเหลว เชื้อเนและมี Fragmแข็งจะมีลักษณ 2551) คือ

12

บนสายใยอาก : สราง Monoราง Disporou สราง Tetraspสราง Polyspoาง Polysporom : สราง Pol

แอคติโนมัยซีเชื้อบนอาหารกัน คือ การเจรับเชื้อบางชนิกษณะเปนรูปเจริญ ในขณะเจริญแบบสร

mentation ขอณะของโคโล

กาศ ospora รูปกระus รูปทรงกระporous รูปทรorous รูปทรงous รูปทรงกลlysporous รูป

ซท รแข็ง (Surfacริญในอาหาร

นิด เชน Norcaปแทง (Rod) มะที่การเจริญบางเสนใย (Filองเสนใยเมื่อมีลนีที่แตกตางก

ะบอก ะบอก รงกระบอก คลายทอ ลม ทรงกลม

ce culture) รเหลวเซลลจadia coralliมีการแบงเซลบนอาหารแข็งlamentous forมีอายุมากขึ้นโกันขึ้นอยูกับ

และในอาหะเจริญจับกัน

ine เมื่อเจริญใลลแบบ Binaงที่มีสวนประrm)ในลักษณโดยทั่วไปลักชนิดของเชื้อ

หารเหลว นเปนกลุมในอาหารaryfission ะกอบของณะที่ยึดติดกษณะการ

สามารถ

13  

-โคโลนีแบบหยาบหรือโคโลนีแบบเรียบยึดกับผิวหนาอาหารอยางหลวมๆ เปนการสราง Aerial mycelium ปกคลุมบนผิวหนาอาหาร มักพบในแอคติโนมัยซีทที่มีการเจริญในระยะ Transient mycelia มีการเจริญของ Mycelia ที่ไมแนนอน

-โคโลนีไมมี Substrate mycelium มี Aerial mycelium ที่ยึดเกาะกับอาหารดวยสวนที่ยึดเกาะพิเศษที่เรียกวา Holdfast

-โคโลนีมีลักษณะเกาะกันแนนคลายแผนหนัง Aerial mycelium คอนขางโปงและยึดกับSubstrate ดวยเสนใยที่แทงลงไปในอาหาร โดยเสนใยที่อยูเหนืออาหารเรียกกวา Aerial mycelium และเสนใยที่อยูภายใตอาหาร เรียกวา Substrate mycelium สําหรับในอาหารเหลวเรียกเสนใยที่อยูบนผิวอาหารวา Generative mycelium และเสนใยที่อยูในอาหารวา Vegetative mycelium

การสร าง เซลล สืบพันธุ ของแอคติโนมัยซีทโดยท่ัวไปพบได 2 แบบ คือ แบบMyceliumfragmentation และแบบ Sporulation ในพวก Streptomyces spp. จะมีการสรางเซลลที่มีลักษณะพิเศษตามความยาว Aerialconidia เกิดจากการขยายตัวของเซลล และมีผนังหนาขึ้น เรียกวา Chlamydospore หรือ Arthrospore มักพบแบบเดี่ยวๆ (Single spore) หรือตอกันเปนสายโซ (Chain) ในพวก Actinoplanes armenicus สามารถสรางสปอรได 2 แบบ คือ สปอรแบบมี Flagella เรียกวา Zoospore ที่สามารถเคลื่อนที่ได และสรางสปอรแบบ Streptomyces type คือ สราง Arthrospore บน Aerialmycelium ในการสรางสปอรแบบใดนั้นมักขึ้นอยูกับสภาพแวดลอมที่ เชื้อ เจริญอยู เชื้อ Kitasatoa spp. และ Pilimalia spp. มักจะพบมีการสรางสปอรที่สามารถเคลื่อนที่ไดภายใน Vesicle และแบบเคลื่อนที่ไมไดมีลักษณะตอกันเปนสายโซใน Micromonospora spp. สรางสปอรแบบ Chlamydopore เปนคูที่มีตําแหนงปลายเสนใยตรงบริเวณ Intercalary และบริเวณ Interminat (ชนิกานต, 2544)

2.1.4 การเจริญของแอคติโนมัยซีท แอคติโนมัยซีทเจริญไดในสภาพแวดลอมที่แตกตางกันพอสมควร คือ นอกจากจะพบในดินที่เปนสภาพธรรมชาติแลวยังพบในกองปุยหมักที่มีอุณหภูมิสูงมากๆ ในโคลน แมน้ําใตทะเลสาบ แตโดยปกติมักจะเจริญอยูผิวดิน หรือในดินที่ไมลึกไปกวา 4 เซนติเมตร จากการนับจํานวนจากดินตัวอยางที่ไมมีการจํากัดการเจริญพบวามีจํานวนใกลเคียงกับแบคทีเรีย แตถาในดิน ที่มีสภาพที่เปนดางจะพบแอคติโนมัยซีทในอัตราสวนที่สูงขึ้น เชน ดินที่มีคาความเปนกรดดาง 6.5-8 จะมีแอคติโนมัยซีทสูงถึงรอยละ 95 ของจุลินทรียในดินทั้งหมด แตในดินดางทั่วๆไปจะพบประมาณรอยละ 10-70 ของจุลินทรียในดินทั้งหมด จากความสามารถในการทนความแหงแลงไดดี

14  

ทําใหสภาพดินแหงจะพบแอคติโนมัยซีทเปนอัตราสวนสูงขึ้น จึงมักพบในดินเขตรอนมากกวาเขตอบอุน สภาพเหมาะแกการเจริญของแอคติโนมัยซีท ไดแก บริเวณทุงหญาธรรมชาติ ทุงหญาเลี้ยงสัตว แตในดินที่ทํ าการเกษตรจะพบนอย และจะไมคอยพบในดินที่คอนข าง เปนกรด แอคติโนมัยซีทจะสรางสปอรได แตลักษณะของสปอรแอคติโนมัยซีทไมสามารถทนทานตอสภาพแวดลอมได สปอรแอคติโนมัยซีทสามารถทนความรอนไดมากกวาเซลลปกติเพียงเล็กนอยเทานั้น จากลักษณะการเจริญที่ชากวาแบคทีเรีย และเชื้อรา ทําใหแอคติมัยซีทไมสามารถที่จะแขงขันกับจุลินทรีย 2 ชนิดดังกลาว แตแอคติโนมัยซีทมีความสามารถพิเศษในการยอยสลายสารประกอบที่ยอยสลายยาก จึงพบวาการเจริญมักจะเพิ่มจํานวนมากขึ้นหลังจากที่จุลินทรียชนิดอ่ืนๆ เจริญลดลงแลว จากสภาพดังกลาวทําใหสภาพที่เหมาะสมกับแอคติโนมัยซีท อยูในลักษณะ ที่ไมคอยพบจุลินทรียชนิดอื่นเจริญได เชน ดินที่คอนขางเปนดาง แหงแลง และอุณหภูมิสูง (นฤมล, 2550) 2.1.5 การจัดกลุมของแอคติโนมัยซีท แอคติโนมัยซีทสามารถ แบงเปน 8 กลุม ดังนี้

2.1.5.1 Nocardioform actinomycetes มีลักษณะที่ตางกันอยางหลากหลาย Substrate mycelium จะแตกหักออกเปนทอนสั้นๆ และบางสกุลสราง Aerial hypha ที่ปลายมี Arthrospore ประกอบดวยสมาชิกสกุลตางๆ ที่มี Wall chemotypes แตกตางกัน หรือการมี Mycolic acid เปนองคประกอบที่ผนังเซลล หรือลักษณะอื่นๆแบงเปน 4 กลุมยอย ดังนี้ กลุมยอยที่ 1 ผนังเซลลมี Mycolic acid เปนองคประกอบ กลุมยอยที่ 2 Pseudonorcardia และสกุลอ่ืนๆ ที่เกี่ยวของ กลุมยอยที่ 3 Norcardiodes และ Terrabacter กลุมยอยที่ 4 Promicromonospora และสกุลอ่ืนๆที่เกี่ยวของ

2.1.5.2 สกุลตางๆ ที่สราง Multiculocular sporangia Substrate mycelium จะแบงตามยาวและตามขวางหลายระนาบจึงทําใหไดสปอรคอนขางกลม เคล่ือนที่ได เชน สกุล Dermatophilus หรือเคลื่อนที่ไมได เชน สกุล Frankia

2.1.5.3 Actinoplanetes Substrate mycelium ไมแตกหักเปนทอนๆอาจสราง Aerial mycelium บางเล็กนอยหรือไมสรางเลย และสราง Motile spore ภายใน Sporangium หรือสราง Non motile spore เดี่ยวๆ เชน สกุล Micromonospora หรืออาจสรางสปอรตอกันเปนสาย ผนังเซลล

15  

มี Meso-DAP และGlycin เปนองคประกอบ และWhole cell hydrolysates มี Arabinose, Xylose เปนองคประกอบ

2.1.5.4 Streptomycetes และสกุลอ่ืนๆมีลักษณะตางกันอยางหลากหลายผนังเซลลมี L-DAP และ Glycin เปนองคประกอบสราง Substrate mycelium และ Aerial mycelium ซ่ึงที่ปลาย มี Conidia ตอกันเปนสายยาว ไดแก Streptomyces, Streptoverticillum และสกุลท่ีไมสราง Aerial mycelium หรือสรางเล็กนอย สรางสปอรหลายรูปแบบ 2.1.5.5 Maduromycetesสราง Substrate mycelium ที่ไมแตกหักเปนทอน และสราง Aerial mycelium ซ่ึงสรางตอกันเปนสาย เชน Microbisspora ประกอบดวย 2 สปอร Microtetraspore ประกอบดวย 4 สปอร Actinomadura ซ่ึงมีจํานวนสปอรแตกตางกันบนแตละสายของสปอร สกุลที่สราง Motilespore ใน Sporangium ไดแก Planobisspora, Planomonospora, Spirillospora และสกุล Streptosporangium สราง Non motile spore ใน Sporangium ผนังเซลลประกอบดวย Meso-DAP และ Cell hydrolysate ประกอบดวย Madurose

2.1.5.6 Thermomonospora และสกุลอ่ืนๆ ที่คลายกันสราง Substrate mycelium ที่ไมแตกหักเปนทอนๆสราง Aerial mycelium สกุลที่สรางสปอร1อัน ไดแก Thermomonospora และสรางสปอรเปนสายไดแก Norcardiopsis, Actinosynnema หรือสรางสปอรภายในโครงสรางคลายSporangium ไดแก สกุล Streptoallotrichus ผนังเซลลประกอบดวย Meso-DAP ไมพบ Amino acid และ Sugar ใน Whole cell hydrolysates 2.1.5.7 Thermoactinomyces มีเพียงสกุลเดียว คือ Thermoactinomyces สราง Substrate Mycelium ที่ไมแตกหกัเปนทอนสราง Aerial mycelium สรางเอ็นโดสปอร 1 อันบนทั้ง Substrate mycelium และ Aerial mycelium เจริญไดที่อุณหภูมิสูง (Thermophile) ผนังเซลลประกอบดวย Meso-DAP ไมพบกรดอะมโินและน้ําตาล

2.1.5.8 สกุลอ่ืนๆประกอบดวย 3 สกุลที่ไมสามารถจัดไวในทั้ง 7 กลุม ไดแก Glycomyces, Saccharothrix และ Kitasatosporangia (ศรีสกุล, 2552)

16  

กลุมเชื้อแอคตโินมัยเซติส จดัอยูในอันดับ Actinomycetales กลุมเดยีวกบัวงศ Mycobacteriaceae แบคทีเรียในอนัดับ Actinomycetales

Family : Mycobacteriaceae Genus : Mycobacterium Family : Actinomycetaceae Genus : Actinomyces Genus : Arachnia Family : Dermatophilaceae Genus : Dermatophilus Family : Actinoplanaceae Genus : Actinoplanes

Genus : Spirillospora Family : Micromonosporaceae

Genus : Micromonosporaceae Genus : Termoactinomyces Family : Streptomycetaceae Genus : Streptomyces Family : Nocardiaceae Genus : Nocardia

2.2 เอนไซมเซลลูเลส (Cellulase) และแอคติโนมัยซีทท่ีผลิตเอนไซมเซลลลูเลส เซลลูเลสเปน Glycoprotein ประกอบดวยโปรตีนและคารโบไฮเดรต ในอัตราสวน 1:1

มีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 30,000-60,000 ดาลตัน มีคุณสมบัติละลายน้ําไดดี ไมตองการ Cofactor หรือโลหะอื่นๆ ในการทําปฏิกิ ริยา โดยทั่วไปเอนไซมเซลลูเลสที่ไดจากจุลินทรียจะเปน Extracellular มีอุณหภูมิที่เหมาะสมตอการทํางานประมาณ 50 องศาเซลเซียส นอกจากนี้ยังมีความคงทนตออุณหภูมิสูงทนตอความเปนกรดดาง (pH) ในชวงกวางประมาณ 4.0-8.0 และทนตอสารเคมีไดดี สามารถเก็บในอุณหภูมิที่ต่ํากวา 0 และ 4 องศาเซลเซียส ไดเปนเวลาหลายป หรือเก็บไวไดโดยวิธี Freeze dry หรือตกตะกอนดวย อะซิโตนหรือเอทานอล โดยจะไมสูญเสียคุณสมบัติ

17  

องคประกอบของเอนไซมเซลลูเลสจากการศึกษาระบบของเอนไซมเซลลูเลสพบวาเปน Multicomponent enzymes มีเอนไซมอยางนอย 3 ชนิด ที่สามารถทํางานพรอมกัน ดังนี้ คือ Exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase หรือ Exoglucanase หรือ C1 ทําหนาที่ตัดพันธะของ β-1,4-glucosidic จากปลายดานของ Non-reducing ทําใหไดเซลโลไบโอส และกลูโคส น้ําตาลที่ได

จากการยอยสลาย จะมีการเรียงตัวเปน α-configuration (Inversion) Endo-β-1,4-glucan glucanohydrolase หรือ Endoglucanase หรือ Cx ทําหนาที่ตัดพันธะของ β-1,4-glucosidic ภายในสายเซลลูโลสในบริเวณที่เปน อะมอรฟสเอนไซมจะตัดพันธะอยางสุมทําใหไดผลิตภัณฑหลายชนิด คือ กลูโคส และเซลโลไบโอส โดยจะไดเซลโลไบโอสเปนผลิตภัณฑหลัก β-1,4-glucosidase หรือ Cellobiase ทําหนาที่ยอยสลายเซลโลไบโอสใหเปนน้ําตาลกลูโคสการทาํงานของ C1 และ Cx เปนปฏิกิริยาที่เกิดภายนอกเซลล

สวนการทํางานของเอนไซม β-glucosidase เปนปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นภายในเซลล โดยเอนไซม β-glucosidase จะยอยสลายเซลโลไบโอสที่เกิดจากการทํางานของ C1 และ Cx ที่ผานผนังเซลลเขาไปภายในเซลล การทํางานของเอนไซมเซลลูเลส ดังสมการ

Cellulose Reactive cellulose Cellobiose Glucose C1 Cx β-glucosidase เซลลูโลสถูกยอยดวยเอนไซม C1ใหเกิดเปน Reactive cellulose ตอมาเอนไซม Cxก็จะยอยสลายอนุพันธเซลลูโลสท่ีเกิดจากการยอยสลายของ C1ใหกลายเปนเซลโลไบโอส ทั้งหมดนี้เปนปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นภายนอกเซลลของจุลินทรียซ่ึงสามารถตรวจสอบไดดวยกระบวนการทางชีวเคมี ทําใหทราบวาเอนไซมเซลลูเลสประกอบไปดวย C1 และ Cx หลังจากนั้นเซลโลไบโอสซึ่งเปนโมเลกุลขนาดเล็ก จะมีการแทรกซึมผานผนังเซลลเขาไปในเซลลของจุลินทรียและเอนไซม บีตา-กลูโคซิเดส (β-glucosidase) จะยอยสลายเซลโลไบโอสใหกลายเปนน้ําตาลกลูโคสตอไป

ในเวลาตอมา ไดมีการศึกษาเอนไซมเซลลูเลสที่ผลิตไดจาก Trichoderma viride พบวาเอนไซม Cxจะเขาทําปฏิกิริยากับเซลลูโลส จากนั้นผลิตภัณฑที่เกิดขึ้นจะถูกยอยสลายตอดวยเอนไซม C1 และยังพบวาการทํางานของเอนไซมจะถูกยับยั้งดวยผลิตภัณฑสุดทายที่เกิดขึ้นโดยเอนไซม (β-glucosidase) จะถูกยับยั้งการทํางานดวยกลูโคสกอน ทําใหเกิดการสะสมของ

18  

เซลโลไบโอสขึ้น ซ่ึงเซลโลไบโอสนี้จะไปยับยั้งการสังเคราะหเอนไซม C1 และ Cx ตอไป (ชนิกานต, 2544)

การผลิตเอนไซมเซลลูเลสการศึกษาแอคติโนมัยซีทที่มีความสามารถในการยอยเซลลูโลสโดยสวนใหญเปนพวก Thermophilic และ Mesophilic มีรายงานวาสายพันธุ Thermomonospora มีความสามารถในการยอยเซลลูโลสสูงโดยเอนไซม เซลลูเลสที่สรางขึ้นจากสายพันธุนี้ประกอบดวย Exoglucanase และ Endoglucanase ทํางานไดดีที่ pH 6 และอุณหภูมิประมาณ 60-70 องศาเซลเซยีส

พวก Mesophilic actinomycetes ที่มีรายงานวายอยเซลลูโลสได เชน Streptomyces antibioticus, Streptomyces flavogriseus, Streptomyces viridosporus และเอนไซมทํางานไดดีที่ pH 5-7 มี Activity สูงสุดที่ 40-55 องศาเซลเซียสทั้ง Mesophilic และ Thermophilic actinomycetes ที่มีความสามารถในการยอยเซลลูโลสได เมื่อเล้ียงในอาหารที่มีการเติมเซลลูโลสชนิดละลายน้ําไดเนื่องดวยความหลากหลายของโครงสรางและการละลายน้ําไดยากของเซลลูโลสบริสุทธิ์ ทําใหมีความนิยมในการใชเซลลูโลสที่ละลายน้ําได คือ Carboxymethyl cellulose Agar (CMC Agar) เปนสารตั้งตนมากขึ้นสําหรับการศึกษาการผลิตเอนไซม Endoglucanase (ณัฐวรรณ, 2548)

ความสามารถของแอคติโนมัย ซีทในการผลิต เอนไซมในระดับ อุตสาหกรรม แอคติโนมัยซีทสามารถผลิตเอนไซมที่ยอยสลายสารอินทรียที่มีโมเลกุลขนาดใหญที่มีความสําคัญทางอุตสาหกรรม เชน เชื้อที่สรางเอนไซมที่ยอยสลายเซลลูโลสที่ใชในอุตสาหกรรมที่สําคัญ ไดแก Thermomonospora ที่สามารถผลิตกลุ มของ เอนไซมที่ ย อยสลาย เซลลู โลส ไดแก กลุม Exoglucanases และ Endoglucanases ที่ทํางานไดที่อุณหภูมิ 60-70 องศาเซลเซียส นอกจากเชื้อในกลุมนี้ก็ยังมีเชื้อใน กลุม Streptomyces หลายชนิด ที่สามารถผลิตเอนไซมที่ยอยสลายเซลลูโลส เชื้อที่สรางเอนไซมที่ยอยสลายไซแลนโดยเชื้อที่สําคัญ ไดแก Streptomyces เชน S.flavogriseus และS.lividans เปนตน นอกจากนี้ยังมี เอนไซมที่ยอยไซแลนที่ทํางานที่ อุณหภูมิสูงจากเชื้อ Thermomonospora ที่มีการนําไปใชในการผลิตน้ําตาลไซโลสจากซังขาวโพด เปนตน เชื้อที่สรางเอนไซมที่ยอยสลายไคตินที่สําคัญ ไดแก S.griseus, S.antibioticus และAmycolatopsis orientalisเปนตน สามารถยอยสลายไคตินไดเปน Chitobiose และ Chitotrose นอกจากความสามารถการผลิตเอนไซมที่ใชในอุตสาหกรรมแลวยังมีการศึกษาความสามารถในการผลิตเอนไซมยอยสลายสารพิษชนิดตางๆ เชน การศึกษาความสามารถในการยอยสลาย Aliphatic-aromoticcopolyesters ที่เปนพิษตอระบบนิเวศวิทยา พบวาเชื้อ Thermomonospora fusca สามารถยอยสลายหนวยยอยของ

19  

Copolyester ไดแก 1,4-butanediol, terephthalate และ Adipate ไดถึง 99.9 % ในอาหาร Defined synthetic medium ที่ 55 องศาเซลเซียส 22 วัน (Czoch and Mordarski, 2009)

2.3 เซลลูโลส (cellulose)

เซลลูโลส เปนสารประกอบอินทรียที่พบมากที่สุดประมาณ 45% ของสารอินทรียทั้งหมดในธรรมชาติ สวนใหญสะสมอยูที่ผนังเซลลในพืชช้ันสูงทุกชนิด ซ่ึงมีสวนประกอบของเซลลูโลสมากกวา 97-99% จดัวาเปนเซลลูโลสบริสุทธิ์ ประกอบดวย polymer chain เรียงขนานกัน และยึดกันดวย dispersion force และ hydrogen bond ภายในโมเลกุลเซลลูโลสจึงยึดติดกันแนน ทําใหเซลลูโลสทําปฏิกิริยากับสารตางๆ ไดชา เซลลูโลสใน primary cell wall ประกอบดวยกลูโคสยาวประมาณ 2,000 โมเลกุล และ ไมต่ํากวา 14,000 โมเลกุลใน secondary cell wall โดยโมเลกุลของเซลลูโลสจะเกาะกันเปนคูตามยาวและเรียงขนานกันเปนกลุม 40 คู เรียกวา ไมโครไฟบริล(microfibril) เพื่อใหความแข็งแรงกับผนังเซลลของพืช (พิทยากร, 2531) ดังแสดงในภาพที่ 9 ภาพที ่ 9 โครงสรางของเซลลูโลสในผนังเซลลพืชช้ันสูง ที่มา : พิทยากร (2531)

20  

โครงสรางของเซลลูโลสในผนังเซลลพืชช้ันสูง มี 3 แบบ คือ - Fringe micelle ประกอบดวยสวนที่เปนผลึก (crystalline) และสวนที่เปนอสัณฐาน (amorphous) - โครงสรางของเซลลูโลสที่มวนหรือพับไปตามแกนของเสนใยเซลลูโลส - โครงสรางที่มีลักษณะเปนแบบริบบิ้นและมวนเปนเกลียว (ก) (ข) (ค) ภาพที่ 10 เสนใยเซลลูโลสในผนังเซลลพืชช้ันสูง (ก) แบบ Fringe micelle (ข) แบบที่มวนหรือพับไปตามแกนของเสนใยเซลลูโลส (ค) แบบริบบิ้นและมวนเปนเกลียว ที่มา : พิทยากร (2531)

โครงสรางที่แตกตางกัน 3 แบบ กอใหเกิดชองวางระหวางโมเลกุล ทําใหโมเลกุลไมตอเนื่อง ในธรรมชาติจึงไมพบเซลลูโลสในรูปอิสระแตมักรวมกับลิกนิน เฮมิเซลลูโลสเพนโตแซน กัม แทนนิน และไขมัน เปนตน ในดานโครงสรางทางเคมี เซลลูโลสเปนสารประกอบคารโบไฮเดรตที่ประกอบดวยหนวยยอยของน้ําตาลกลูโคส (glucose) จํานวน 1,000-10,000 โมเลกุล ตอกันเปนโพลีเมอร (polymer) เชื่อมกันดวย β -1, 4-glycosidic bond ระหวาง alcoholic hydroxyl groups โดยโมเลกุลสายยาวของเซลลูโลสประกอบดวยกลูโคส 2,000-15,000 โมเลกุล และมีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 20,000-2,400,000 ดาลตัน (Dalton) การเรียงตัวของโมเลกุล

 

เซลลูโลสมีลัหนวยกลูโคส

ภาพที่ 11 โ ที ภาพที่ 12 ลั ที่

ลักษณะเปนเสสทั้งหมดที่ปร

ครงสรางของที่มา : พิทยาก

ักษณะการสามา : พิทยากร

สนตรง ไมมีแระกอบกันเปน

งเซลลูโลส กร (2531)

านกันเปนรางร (2531)

21

แขนงยอยมีสูตนโครงสราง (

งแหของเซลลู

ตรเคมีทั่วไปคื(พิทยากร, 25

ลูโลส

คือ (C6H10O5

531) )n เมื่อ n คืออ จํานวน

22  

ตารางที่ 1 ปริมาณเซลลูโลสในวัสดุอินทรีย

วัสดุอินทรีย ปริมาณเซลลูโลส (%) ฝาย 91.0 เนื้อไม 40.0-45.0 กระดาษหนังสือพิมพ 40.0-48.0 วัสดุเหลือใชจาก furfural process 40.0 ฟางขาว - ขาวสาลี 30.5 - ขาวจาว 32.1 - ขาวบารเลย 40.0 - ขาวโอต 42.8 ชานออย 46.0 ที่มา : พิทยากร (2531) 2.3.1 การยอยสลายเซลลูโลส (cellulose hydrolysis)

เซลลูโลสเปนสารประกอบที่มีโครงสรางเปนผลึกหรือเปน linear homopolymer ของกลูโคสที่จับกันดวย β-1, 4-glucosidic linkage ซ่ึงยากตอการยอยสลาย นอกจากนี้โดยธรรมชาติของเซลลูโลสจะมี lignin จับอยู ซ่ึงเปนตัวขัดขวางปฏิกิริยาการยอยสลายการยอยสลายเซลลูโลสทําได 2 วิธี (ศศิธร, 2552) คือ

2.3.1.1 วิธีการทางเคมหีรือการยอยสลายดวยกรดเขมขนหรือกรดเจือจาง (acid hydrolysis)เชน กรดซัลฟูริก และกรดไฮโดรคลอริก ซ่ึงตองทําภายใตอุณหภูมิสูง วิธีนี้มีขอจํากัด คือใหปริมาณกลูโคสต่ํา และเกิดผลิตภัณฑที่ไมตองการดวย

2.3.1.2 วิธีการทางชีวภาพหรือการยอยสลายดวยเอนไซม (enzyme hydrolysis) ที่ไดจากจุลินทรีย เชน เชื้อรา แบคทีเรีย โดยเอนไซมจากจุลินทรียจะทําใหปฏิกิริยาการยอยเกิดภายใต

23  

สภาวะที่ไมรุนแรง คือที่อุณหภูมิประมาณ 50 °C ความดันบรรยากาศ เพราะเอนไซมมีความจําเพาะเจาะจงตอสารประกอบเซลลูโลสมาก ทําใหไมสูญเสียกลูโคสระหวางเกิดปฏิกิริยาและไมเกิดผลิตภัณฑที่ไมตองการ

2.4 แบคทีเรียท่ียอยเซลลูโลส ตัวอยางของแบคทีเรียที่สามารถยอยเซลลูโลสมีดังนี้ 2.4.1 แบคทีเรียในกระเพาะอาหารของสัตวกินพืช เชน ววั ควาย ในดิน เชน Bacillus sp.และ ในทะเล เชน Cytophaga sp. (อรรถ, 2550) 2.4.2 แบคทีเรียที่ เจริญไดในสภาพทั้งที่มีออกซิ เจนและไมมีออกซิ เจน (facultative anaerobe) เชน Cellvibrio sp. และ Cellulomonas sp. เปนตน 2.4.3 แบคทีเรียที่เจริญไดในสภาวะไมมีออกซิเจน เชน Clostridium thermophilum และRuminococcus albus เปนตน 2.4.4 Myxobacteria เชน Sporocytophaga sp. 2.4.5 จุลินทรียที่เปนปรสิตในพืช มีทั้งพวกยอยเซลลูโลสอยางเดียว หรือกอโรคในพืชดวย เชน Pseudomonas solanacearum (ปจจุบันคือ Ralstonia solanacearum) ทําใหเกิดโรคเหี่ยวในพืชจุลินทรียยอยไม ไดแก แอคติโนไมซีท เปนตน (Xiao et al., 2008) แบคทีเรียที่ตองการออกซิเจนจะยอยเซลลูโลสไดผลิตภัณฑหลัก 2 ชนิด คือ CO2 และสารอินทรียที่เปนองคประกอบของเซลล สวนราและแอคติโนไมซีท จะได CO2 เปนผลิตภัณฑหลักและเกิดกรดอินทรียในปริมาณนอย อัตราการยอยเร่ิมตนจะถูกจํากัดดวยกระบวนการ oxidation ของคารโบไฮเดรต เพื่อไมใหเกิดการสะสมของสารตัวกลาง ซ่ึงจะเกิดขึ้นขณะมีการใชน้ําตาล สวนmesophilic และ thermophilic anaerobe ไมสามารถยอยสารตั้งตนอยางสมบูรณไดสารอินทรียหลายชนิดจึงถูกขับออกมาเปนผลิตภัณฑสุดทาย ในสภาวะที่มีออกซิเจนจะเกิดการสะสมของ CO2, H2, ethanol และกรดอินทรีย เชน acetic acid, lactic acid และ succinic acid เปนตน (สายพิณ, 2550)

24  

2.5 บทบาทและความสําคัญของแอคติโนมัยซีท บทบาทสวนใหญของแอคติโนมัยซีทมักเกิดจากเชื้อในสกุล Streptomyces เนื่องจากเปน

กลุมที่เจริญเติบโตไดรวดเร็ว และมีปริมาณมากในธรรมชาติ แตอยางไรก็ตามแอคติโนมัยซีทที่หายากก็ยังเปนกลุมที่นาสนใจ เนื่องจากเปนกลุมที่ความสามารถหลากหลาย สําหรับบทบาทของ แอคติโนมัยซีทมี (ศรีสกุล, 2552) ดังนี้

2.5.1 การยอยสลายอินทรียวัตถุ เชื้อแอคติโนมัยซีทในธรรมชาติซ่ึงสวนใหญมีถ่ินที่อยูอาศัยในดินมีความสามารถในการยอยสลายองคประกอบของอินทรียวัตถุ โดยเฉพาะอยางยิ่งสวนประกอบของพืชและสัตวทนทานตอการยอยสลาย ในชวงที่มีอินทรียวัตถุในดินมากจะมีพวกแบคทีเรีย และเชื้อราอยูมาก สวนแอคติโนมัยซีทจะเจริญตามมาภายหลัง เพราะเชื้อแอคติโนมัยซีทจะเจริญเติบโตไดชา และเจริญเติบโตไดดีก็ตอเมื่อจุลินทรียที่เปนคูแขงไดลดปริมาณลงแลว คือในชวงที่มีสารประกอบที่มีโมเลกุลขนาดใหญที่ทนทานตอการยอยสลายอยูมาก แอคติโนมัยซีท ที่มีหลายชนิดและหลายสายพันธุจะชวยยอยสลายสารพวก กรดอินทรีย น้ําตาลชนิดตางๆ แปง ไขมัน และโปรตีน (Alexander, 1977)

2.5.2 การยอยสลายเซลลูโลส องคประกอบสวนใหญของพืชที่มีโครงสรางเปนน้ําตาลกลูโคสที่เรียงตอกันเปนสายยาวดวยพันธะ β-1,4-glucosidiclinkages ภายในสายประกอบดวยน้ําตาลกลูโคสตั้งแต 1,400 จนถึง 10,000 โมเลกุลแลวแตชนิดของพืชเชื้อแอคติโนมัยซีทที่สามารถยอยสลายเซลลูโลสพบเปนเชื้อในสกุล Streptomyces มากที่สุด และเชื้อแอคติโนมัยซีทชนิดอื่นๆ ไดแก Micromonospora, Streptosporangium, Nocardia และ Microbispora นอกจากนี้ยังมีเชื้อ แอคติ โนมั ย ซีทที่ ส ามารถย อยสลาย เซลลู โลสไดดีที่ อุณหภูมิ สู ง ได แก เ ชื้ อ ในสกุ ล Thermomonospora และ Streptomycetes ที่เจริญที่อุณหภูมิสูง (กนกกร, 2548)

2.5.3 การยอยสลายเฮมิเซลลูโลส เฮมิเซลลูโลสเปนองคประกอบหลักอีกอยางหนึ่งของพืช โดยสามารถแบงประเภทไดตามชนิดของน้ําตาล แอคติโนมัยซีทที่ยอยสลายเฮมิเซลลูโลสมีดวยกันหลายชนิด แตชนิดที่มีบทบาทมากที่ สุด คือ ในสกุล Streptomyces ไดแก Micromonospora, Streptosporangium, Nocardia และ Microbispora เปนตน (Alexander, 1977)

2.5.4 การยอยสลายลิกนิน เปนองคประกอบของผนังเซลลพืช โดยตออยูกับสายของน้ําตาลทําใหผนังเซลลของพืชแข็งแรงทนทานตอการยอยสลายการยอยสลายลิกนินในธรรมชาติสวนใหญเปนกิจกรรมของเชื้อราโดยเฉพาะเห็ดชนิดตางๆแตก็มีเชื้อแอคติโนมัยซีทบางชนิด ไดแก สกุล Streptomyces และ Micromonospora (มัลลิกา, 2550)

25  

2.5.5 การยอยสลายไคติน เปนสารอินทรียที่พบไดทั่วไป โครงสรางประกอบดวย N-acetylglucosamine ตอกันเปนสายยาว ในธรรมชาติพบวา 90% ของไคติน จะถูกยอยสลายโดยเแอคติโนมัยซีท ที่มีบทบาทในการยอยสลายไคตินมากที่สุด คือ เชื้อในสกุล Streptomyces และ Micromonospora ตามลําดับ และความสามารถในการยอยสลายไคตินของเชื้อแอคติโนมัยซีทนี้ยังถูกนํามาใชในการควบคุมเชื้อราที่เปนสาเหตุของโรคพืชอีกดวย (กนกกร, 2548)

2.5.6 การยอยสลายแปง เปนองคประกอบที่พบไดทั่วไปในพืช โครงสรางของแปงประกอบไปดวยน้ําตาลกลูโคสที่ตอกันเปนสายยาวดวยพันธะ α-1,4-glucosidic linkages และ α-1,6-glucosidic linkages เชื้อแอคติโนมัยซีทสวนใหญสามารถใชแปงเปนแหลงคารบอนไดโดยเชื้อแอคติโนมัยซีทที่พบวาสามารถยอยสลายแปงไดดี ไดแก Streptomyces, Nocardia และ Micromonospora เปนตน (ศรีสกุล, 2552)

2.5.7 การยอยสลายโปรตีน เปนโครงสรางหลักของสัตวและพืชโครงสรางของโปรตีนประกอบดวย กรดอะมิโนเรียงตอกันเปนสายยาว จุลินทรียสวนใหญสามารถยอยสลายโปรตีนเพื่อใชเปนแหลงไนโตรเจนได รวมทั้งเชื้อแอคติโนมัยซีทดวย โดยเฉพาะเชื้อ Streptomyces สวนการยอยสลายสารอินทรียชนิดอื่นๆ ไดแก พาราฟน ฟนอล สเตอรอยส และไพริมีดีน พบวาเปนกิ จกรรมของ เชื้ อแอคติ โนมั ย ซีทในสกุล Nocardia มากกว าชนิ ดอื่ นๆ ส วน เชื้ อสกุ ล Micromonospora มีบทบาทในการยอยสลาย ไคติน เซลลูโลส กลูโคไซส เพ็นโตแซน และลิกนิน (จีรพรรณ, 2550) 2.5.8 ความสามารถผลิตเอนไซมที่มีความสําคัญในอุตสาหกรรม แอคติโนมัยซีทสามารถผลิตเอนไซมที่ยอยสลายสารอินทรียโมเลกุลขนาดใหญที่มีความสําคัญทางอุตสาหกรรมเชื้อท่ีสรางเอนไซมยอยสลายเซลลูโลส และไซแลน คือ Streptomyces และ Thermomospora สวนเชื้อที่สราง เอนไซมในการยอยสลายไคติน ไดแก S.griseus, S.antibioticus และ Amycolatopces orientalis (นฤมล, 2550) 2.5.9 ความสามารถในการตรึงไนโตรเจนและฟอสเฟตในรูปที่พืชสามารถนําไปใช แอคติโนมัยซีทบางชนิดสามารถตรึงไนโตรเจนในอากาศได เชน สกุล Nocardia และยังมี แอคติโนมัยซีทที่อาศัยอยูรวมกับพืชแลวสามารถตรึงไนโตรเจนในอากาศได คือ Frankia นอกจากนี้ยังมีรายงานถึงความสามารถของ Streptosporangium ที่แยกไดจากดินที่เปนกรดในการละลายหินฟอสเฟตใหอยูในรูปที่พืชสามารถนําไปใชได โดยเชื้อในกลุมนี้สามารถผลิตกรดโดยการยอยสลายเซลลูโลส ซ่ึงสามารถสลายหินฟอสเฟตได (ชนิกานต, 2544)

26  

2.5.10 ความสามารถในการผลิตสารปฏิชีวนะการสราง Secondary metabolite ที่สําคัญของแอคติโนมัยซีท คือ สารปฏิชีวนะ พบวาเชื้อมีการสรางสารขึ้นในชวง Stationary phase ของการเจริญ โดยสารที่สรางขึ้นนี้ไมมีบทบาทตอการเจริญของเซลล จัดเปนสารที่มีคุณสมบัติพิเศษจําเพาะตอเชื้อบางชนิดเทานั้น ดังนั้นจึงพบวามีเชื้อบางกลุมเทานั้นที่สามารถสรางสารปฏิชีวนะไดโดยมักจะสรางในรูปแบบของสารประกอบที่มีลักษณะคลายคลึงกัน สามารถจัดจําแนกเปนกลุมตามลักษณะที่คลายกันออกเปน Family หรือ Species ในการเลี้ยงเชื้อเพื่อสรางสารปฏิชีวนะนั้นสามารถเล้ียงไดทั้งในอาหารเหลวและอาหารแข็ง โดยสารปฏิชีวนะที่สรางขึ้นอาจมีคุณสมบัติสามารถละลายน้ําได (Water soluble antibiotic) หรืออาจละลายน้ําไมได (Water soluble antibiotic) เชน สารปฏิชีวนะในกลุม Serine จัดเปน Water soluble antibiotic โดยมักพบในรูปของผลึกสะสมที่บริเวณผิวของเซลลหรือในอาหารเลี้ยงเชื้อ คุณสมบัติที่ปรากฏมักขึ้นอยูกับชนิดของเชื้อ และสภาพแวดลอมที่เชื้อเจริญ สําหรับบทบาทและหนาที่ที่แทจริงของสารปฏิชีวนะยังไมเปนที่เขาใจอยางแนชัด มีขอเสนอมากมายเกี่ยวกับบทบาท และหนาที่ของสารปฏิชีวนะ (สายพิณ, 2550) 2.6 งานวิจัยท่ีเก่ียวของ

วิธีการแยกแอคติโนมัยซีทจากแหลงธรรมชาติสวนใหญพบวามักจะนิยมแยกเชื้อจากดินเพราะวาในดินมีจุลินทรียเปนจํานวนมากทั้งชนิดและปริมาณจะตองเลือกแหลงดินที่มีแนวโนมวานาจะมีจุลินทรียที่ตองการในปริมาณสูง จากนั้นก็นํามาแยกเชื้อดวยวิธีการที่เหมาะสมเนื่องจากในดินมีจุลินทรียเจริญอยูหลายชนิดจึงจําเปนตองกําจัดหรือลดปริมาณเชื้อชนิดที่ไมตองการลงบางเพื่อใหการแยกเชื้อสามารถทําไดงายขึ้นซึ่งวิธีการที่ใชตลอดจนอาหารที่ใชแยกเชื้อจะมีความแตกตางกันไปทั้งนี้มักขึ้นอยูกับชนิดของเชื้อที่ตองการแยกเปนสําคัญดังรายงานวิจัยตอไปนี้

จีรพรรณ (2550) คัดแยกแอคติโนมัยซีทจากตัวอยางดินดวยวิธี Dilution plate method โดยทํา Serial dilution ตัวอยางดิน 10 กรัม เพาะเลี้ยงบน Sodium caseinate Agar ที่ประกอบดวย Sodium caseinate 0.2 เปอรเซ็นต บมเพาะเชื้อท่ีอุณหภูมิหองเปนเวลา 2-5 วันสามารถแยกเชื้อแอค-ติโนมัยซีทได 137 ไอโซเลต จากตัวอยางดินทั้งหมด 20 ตัวอยาง

ชาญวิทย (2546) ไดทําการศึกษาการคัดแยกเชื้อแอคติโนมัยซีทที่หายากในพื้นที่สงวน ชีวมณฑลสะแกราชและสถานีวิจัยพืชไรสุวรรณวาจกกสิกิจโดยทําการตรวจนับและคัดแยก แอคติโนมัยซีทใน Humic acid vitamin agar ที่เติม Cycloheximide 50 มิลลิกรัมตอลิตร เมื่อแยกและเลือกแอคติโนมัยซีทที่หายากดวยวิธีตางๆ 4 วิธีจากดินและเศษใบไมไดเชื้อจํานวน 91 และ 29

27  

ไอโซเลต ตามลําดับ พื้นที่สงวนในเขตชีวมณฑลสะแกราชพบ 14 สกุล ยกตัวอยาง เชน Actinomadura, Actinoplanes, Microbispora, Micromonospora, Microtetraspora, Nocardia, และยังมีอีก 8 ไอโซเลต ที่ไมสามารถจัดจําแนกไดสวนพื้นที่สถานีวิจัยพืชไรสุวรรณวาจกกสิกิจพบวามี 8 สกุลซ่ึง ไดแก Actinomadura, Actinoplanes, Microbispora, Micromonospora, Nocardia, Pseudonocardia, Saccharopolyspora และยังมีอีก 1 ไอโซเลต ท่ีไมสามารถจัดจําแนกไดเมื่อทดสอบความสามารถของแอคติโนมัยซีทที่แยกไดในการยอยสลายสารอินทรียพอลิเมอร พบวามี 103 ไอโซเลต ที่ยอยไซแลน 58 ไอโซเลต ที่ยอยคารบอกซิเมทิลเซลลูโลส 4 ไอโซเลต ที่ยอยลิกนิน 50 ไอโซเลต ที่ยอยไคติน 99 ไอโซเลต ที่ยอยแปงและ 84 ไอโซเลต ที่ยอยโปรตีน สกุล Actinomadura, Actinoplanes, Herbidospora, Microbispora, Micromonospora เปนสกุลท่ีมีความหลากหลายสูงในการยอยสลายสารอินทรียพอลิเมอร

ดาริกาและคณะ (2552) ไดทําการศึกษาการสํารวจความหลากหลายของแบคทีเรียและ แอคติโนมัยซีทในปุยอินทรียอัดเม็ดของโรงงานผลิตปุยชีวภาพองคการบริหารสวน ตําบลทาขามอําเภอหาดใหญ จังหวัดสงขลา ผลการศึกษาดวยเทคนิคการเพาะเลี้ยงเชื้อพบวาแบคทีเรียสวนใหญมีลักษณะเปนรูปทอนติดสีแกรมบวกและแอคติโนมัยซีทเปนกลุมที่ทนหรือชอบความรอน (thermoduric หรือ thermophile) ผลการศึกษาดวยเทคนิค 16S rRNA clone library analysis พบวาโครงสรางชุมชนแบคทีเรียและแอคติโนมัยสีทสวนใหญเปนกลุมที่ชอบความเค็ม (halophile) คือแบคทีเรียที่อยูในกลุมใกลเคียงกับสกุล Halomonas และแอคติโนมัยซีทที่อยูในกลุมใกลเคียงกับสกุล Dietzia คิดเปนรอยละ 64 และ 71 ของจํานวนโคลนทั้งหมดและผลที่ไดจากการศึกษาจะเปนขอมูลพื้นฐานดานความหลากหลายทางชีวภาพของแบคทีเรียและแอคติโนมัยซีทในกระบวนการผลิตปุยอินทรียและการนําไปใชพัฒนากระบวนการผลิตปุยอินทรียชีวภาพตอไป

เนาวรัตนและคณะ (2553) ไดทําการศึกษาการสํารวจจุลินทรียที่อยูในทองถ่ินจากพื้นที่เกษตรกรรมของจังหวัดอางทองโดยสํารวจและเก็บตัวอยางในชวงเดือนมกราคม 2553 จากพื้นที่เกษตรกรรมของจังหวัดอางทอง 6 อําเภอ คือ ไชโย ปาโมก โพธ์ิทอง อางทอง วิเศษชัยชาญ และสามโก จุลินทรียที่พบมากที่สุดจากแปลงปลูกขาว คือยีสตเทากับรอยละ 54.3 รองลงมา คือราแบคทีเรียและแอคติโนไมซีท เทากับ รอยละ 22.8, 14.3 และ 8.6 ตามลําดับ จุลินทรียที่พบมากที่สุดจากแปลงปลูกผักและไมผล คือ รา รองลงมา คือ ยีสต แบคทีเรียและแอคติโนไมซีท ตามลําดับสําหรับจุลินทรียที่พบมากที่สุดจากสภาพปาปลูก คือยีสตเทากับรอยละ 35.7 รองลงมา คือรา แอคติโนไมซีทและแบคทีเรียเทากับรอยละ 30.9, 21.5 และ 11.9 ตามลําดับ

28  

พิทยากร (2531) การคัดเลือกเชื้อราและแอคติโนมัยซิทที่มีความสามารถสูงในการผลิตเอนไซมเซลลูเลสที่ยอยสลายกระดาษกรอง CMC และ avicel ไดแกเชื้อรา 4 สายพันธุคือ MCM 059, MBK 336, MRY 586 และ MCT 794 และเชื้อแอคติโนมัยซิท 3 สายพันธุ คือ ACT 034, ABK 372 และ APK 425 ซ่ึงเมื่อนํามาศึกษาอัตราการเจริญที่อุณหภูมิระดับตางๆ พบวาเจริญไดดี ที่อุณหภูมิ 40-45 องศาเซลเซียส และยังคงเจริญไดที่อุณหภูมิ 30 และ 50 องศาเซลเซียส การศึกษาผลของมูลสัตวและยูเรียตอการยอยสลายฟางขาวในหองปฏิบัติการที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส โดยศึกษาการเปลี่ยนแปลงปริมาณและอัตราการปลอดปลอยกาช CO2 พบวาการใชมูลสัตวหรือยูเรียชวยสงเสริมอัตราการยอยสลาย อัตรามูลสัตวที่เหมาะสมคือ 20 เปอรเซ็นตโดยน้ําหนัก สวน ยูเรีย ทําหนาที่เปนแหลงของไนโตรเจน และอัตราที่เหมาะสมคือ 1.0 เปอรเซ็นตโดยน้ําหนัก จากการใชเชื้อราที่คัดเลือก 4 สายพันธุพบวาเชื้อรา MCT 794 มีความสามารถในการยอยสลายฟางขาวดีที่สุด รองลงมาไดแก MRY 586, MBK 336 และ MCM 059 ตามลําดับ สวนเชื้อแอคติโนมัยซิทที่คัดเลือก 3 สายพันธุพบวาเชื้อแอคติโนมัยซิท ABK 372 มีประสิทธิภาพดีที่สุด รองลงมาไดแก APK 425 และ ACT 034 ตามลําดับ

ยุพา (2552) จากการแยกเชื้อแอคติโนมัยซีทเอนโดไฟทจาก ใบ กิ่ง และราก ของสมพันธุสายน้ําผ้ึงที่ปลูกในพื้นที่ ที่กําลังปรับเปล่ียนเปนระบบเกษตรอินทรีย 3 พื้นที่ ในเขตอําเภอฝาง จังหวัดเชียงใหม สามารถแยกเชื้อไดทั้งหมด 101 ไอโซเลต โดยแยกไดจากใบ 25 ไอโซเลต จากกิ่ง 33 ไอโซเลต และ จากราก 43 ไอโซเลต มีลักษณะทางสัณฐานวิทยา และลักษณะทางเคมี อยูใน 7 จีนัสไดแก Streptomyces, Spirillospora, Nocardia, Nocardioides, Nocardiopsis, Microbispora, และ Micromonospora และทดสอบความสามารถในการผลิตเอนไซมเซลลูเลส ที่ใชในการยอยละลายเซลลูโลส โดยเลี้ยงเชื้อในอาหารที่มีเซลลูโลสเปนสวนประกอบ (CMC) พบเชื้อที่สามารถสรางเอนไซมเซลลูเลสไดทั้งหมด 81.13 เปอรเซ็นต จีนัส Microbispora ไอโซเลต TGsR-01-08 มีคา clear zone ratioเทากับ 6.13 ซ่ึงมีคาสูงที่สุด และจากการนําเชื้อทั้งหมด 56 ไอโซเลต มาทดสอบการเขาอาศัยในกลาสม พบวาเชื้อเอนโดไฟททุกไอโซเลต สามารถเขาอาศัยในเนื้อเยื่อของรากสมได และจากนั้นคัดเลือกเชื้อสอง ไอโซเลต คือ ไอโซเลต TGsR-02-01 และ ไอโซเลต TGsL-02-05 มาทดสอบศักยภาพในกลาสม พบวา ทําใหกลาสมเจริญเติบโตในดานความสูง น้ําหนักสด และน้ําหนักแหงไดมากกวาตนกลาที่ไมไดใสเช้ือเอนโดไฟทอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ (P≤0.05)

29  

ศิราภรณ (2551) คัดแยกแอคติโนมัยซีทไดทั้งหมด 115 สายพันธุจากตัวอยางดิน 36 ตัวอยางที่สุมเก็บตัวอยางจาก11จังหวัดในประเทศไทย เมื่อนํามาทดสอบความสามารถในการสรางเซลลู เลสเบื้องตนบนอาหารแข็งคารบอกซี เมทิลเซลลูโลส และวัดอัตราสวนของเสนผาศูนยกลางบริเวณใสตอเสนผานศูนยกลางโคโลนีที่เวลา 7 วันพบวามีแอคติโนมัยซีทที่สามารถสรางเซลลูเลสไดจํานวน 71.30 เปอรเซ็นต โดยแอคติโนมัยซีทสายพันธุ NKP3-2 ที่แยกไดจากดินใน อําเภอโกรกพระ จังหวัดนครสวรรคมีประสิทธิภาพสูงสุด คือ 4.3 เซนติเมตรสายพันธุ NV1-4 ที่แยกไดจากดินในอําเภอเวียงสา จังหวัดนาน และสายพันธุ LK3-10 ที่แยกไดจากดินใน อําเภอเกาะคา จังหวัดลําปางมีคาเทากับ 3.8 และ 2.9 เซนติเมตร ตามลําดับ ไดทําการศึกษา เซลลูเลสแอกติวิตีของ สายพันธุ NKP3-2 พบวามีเซลลูเลสแอกติวิตีสูงสุด เทากับ 390.38 mU/ml จากการศึกษาทาง สัณฐานวิทยาและการศึกษาทางอณูพันธุศาสตรพบวาลําดับเบส 16S rRNA ของแอคติโนมัยซีท สายพันธุ NKP3-2 มีความคลายกับ Streptomyces sp. 1A01654 มากที่สุด ที่ระดับ 98 เปอรเซ็นต

ศศิธร (2552) แบคทีเรีย 142 ไอโซเลต แยกจากตัวอยางดิน มูลสัตว ขอนไมผุ และปุยหมัก

ภายในภาคเหนือตอนบน จํานวน 40 ตัวอยาง โดยการเพาะเลี้ยงบนอาหาร carboxymethyl cellulose

(CMC Agar) บมที่อุณหภูมิ 45, 50 และ 55 ºC เปนเวลา 24 ช่ัวโมง เมื่อทดสอบดวยวิธี congo red

พบวามี 68 ไอโซเลต ที่ทําใหเกิดบริเวณใสรอบรอยเจริญของเชื้อ ซ่ึงเมื่อทดสอบความสามารถใน

การผลิตเอนไซมเซลลูเลสโดยเพาะเลี้ยงใน CMC Broth พบวาไอโซเลต CM12 ใหคา enzyme

activity และspecific activity สูงที่สุด โดยมีสภาวะที่เหมาะสมตอการผลิตเอนไซมเซลลูเลส

อุณหภูมิ 45 ºC ในอาหารที่มี pH 6.5 มี CMC 1% เปนแหลงคารบอน และ yeast extract 3%เปน

แหลงไนโตรเจน บมเปนเวลา 48 ชั่วโมง วัดคา enzyme activity และคา specific activity ไดเทากับ

194.80 ± 2.05 U/ml และ 0.11 ± 0.01 U/μg protein ตามลําดับ

Czoch and Mordarski (2009) ไดทําการศกึษาแอคติโนมัยซีทที่สามารถยอยสลายเซลลูโลส พบวา แอคติโนมัยซีทที่สามารถยอยสลายเซลลูโลสไดดีที่อุณหภูมิสูง คือแอคติโนมัยซีทในสกุล Thermomonospora และ Streptomyces

Hamaki et al. (2010) แยกเชื้อแอคติโนมัยซีทจากตัวอยางวัสดุเหลือท้ิงทางการเกษตรและดิน 333 ตัวอยางในประเทศไนจีเรีย สามารถแยกแอคติโนมัยซีทไดทั้งหมด 163 สายพันธุ โดยสวนใหญพบ Thermoactinomyce vulgaris ประมาณ 32 เปอรเซ็นตรองลงมาเปน Thermoactinomyces

30  

thalpophilus ประมาณ 20.1 เปอรเซ็นตนอกจากนี้ยังพบวาในฟางขาวจะพบเชื้อ T.thalpophilus และT.Vulgaris เปนสวนใหญในขณะที่หญาแหงจะพบเชื้อ T.vulgaris, T.thalpophilus และS.rectivirgula

Lacey (2009) ไดทําการศึกษาการคัดแยกเชื้อจุลินทรียและแอคติโนมัยซีทจากดินเค็มและพบวาแอคติโนมัยซีทที่พบสวนใหญอยูในสกุล Streptomyces โดยคาความเปนกรด-ดางที่เหมาะสมตอการเจริญของเชื้อแอคติโนมัยซีท คือ 8

Wang et al. (2009) ไดทําการคัดแยกแอคติโนมัยซีทจากดินในประเทศสิงคโปร พบวามี Streptomyces, Micromonospora, Actinoplanes, Actinomadura, Nocardia, Nonomuraea และ Streptosporangium มาก ซ่ึงนับวามีความหลากหลายสูง

Xiao et al. (2008) ทําการแยกเชื้อแอคติโนมัยซีทที่เจริญได ณ ที่อุณหภูมิสูง จากกองปุยหมั กและปุ ย คอกได จํ านวน 30 สายพัน ธุ สามารถจั ดจํ า แนก เปนสกุ ลต า งๆ ได แก Thermomonospora, Saccharomonospora, Microbispora, Streptomyces และ Actinomadura

 

บทที่3

อุปกรณและวิธีการทดลอง

อุปกรณ

1. กระดาษกรอง Whatman No.1 (Merck, Germany) 2. กลองจุลทรรศนเลนสประกอบ (Compound Microscopes) (OLYMPUS CX 21) 3. กลองถายรูปดิจิตอล (Samsung) 4. เครื่องไมโครเวฟ (Microwave) (LG MS2127CW) 5. เครื่องวัดคาความเปนกรด-ดาง (pH meter) (EUTECH pH 510) 6. ตูบมควบคุมอุณหภูมิ (Incubator) (VELP SCIENTIFICA FOC 225I) 7. ตูแชเย็น (Refrigerate) (March cool) 8. ตูดูดควัน (Fume hood) (Official) 9. ตูถายเชื้อ (Microbiological safety cabinets) (HOLTEN HB 2436) 10. ตูอบฆาเชื้อ (Hot air oven) (CONTHERM THERMOTEC 2000) 11. เตาใหความรอน (Hot plate)(PMC 502 SERIES) 12. เทอรโมมิเตอร (Thermometer) 13. หมอนึ่งความดันไอน้ํา (Autoclave ) (Systec VX - 95) 14. อุปกรณและเครื่องแกวสําหรับหองปฏิบัติการพื้นฐานทางดานจุลชีววิทยา 15. Micropipettes (SOCOREXACURA 835 autoclavable) ขนาด 0.1 - 1 มิลลิลิตร

สารเคมี

1. Acetate buffer 0.2 M 2. Congo red 3. Crystal violet 4. 0.1% Dinitrosalicylic acid (DNS) 5. 70% Ethyl alcohol 6. Hydrochloric acid (HCl)

32  

7. Glucose 8. Iodine solution 9. Safranin O 10. Sodium Chloride (NaCl) 11. Sodium Hydroxide (NaOH)

อาหารเลี้ยงเชือ้

1. Carboxymethyl cellulose Agar (CMC Agar) 2. Carboxymethyl cellulose Broth (CMC Broth) 3. International Streptomyces Project Agar (ISP Agar) 4. Mannitol Mungbean Agar (MBA)

วิธีการทดลอง

3.1 การเก็บตัวอยางและการคัดแยกแอคติโนมัยซีท

เ ก็ บตั วอย า งจ ากมู ล สัตว 3 ชนิด ได แก มูลวั ว มู ลแพะ และมู ลม า จากคณะ

เทคโนโลยีการเกษตร วิทยาเขตเมืองเอก มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี จ.ปทุมธานี

จากนั้นนํามาบดใหมีขนาดเล็กและเก็บใสถุงพลาสติก (เก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส)

(1) (2) (3)

ภาพที ่ 13 ตัวอยางมูลสัตวทีน่ํามาคัดแยกแอคติโนมัยซีท (1) มูลวัว (2) มลูแพะ (3) มลูมา

33  

3.1.1 การคัดแยกแอคติมัยซีทโดยวิธี Streak plate ใชลวดเขี่ยเชื้อแตะตัวอยางมูลสัตวแตละชนิดนํามาขีด (Streak) ลงบนอาหาร Carboxymethyl cellulose Agar (CMC Agar) บมเล้ียงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3-7 วัน นําโคโลนีเดี่ยวที่เจริญบนอาหารมาขีดลงบนอาหาร CMC Agar ใหไดเชื้อบริสุทธิ์ 3.1.2 การคัดแยกแอคติโนมยัซีทโดยวิธี Spread plate ช่ังตัวอยางมูลสัตวแตละชนิด 25 กรัม นํามาเจือจางดวย 0.85 % NaCl ใหไดความเจือจางอยูในชวง 10-1-10-8 ปเปตตสารละลายในแตละความเจือจางปริมาตร 0.1 มิลลิลิตรลงบนอาหาร CMC Agar เกลี่ย (Spread) ตัวอยางใหกระจายทัว่ผิวหนาอาหารจนแหง บมจานเพาะเชื้ออุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3-7 วัน นําโคโลนีเดี่ยวที่เจรญิบนอาหารมาขีดลงบนอาหาร CMC Agar ใหไดเชื้อบริสุทธิ์ 3.1.3 การคัดแยกแอคติโนมยัซีทบนกระดาษกรอง นําตัวอยางมูลสัตวแตละชนิด น้ําหนัก 0.5 กรัม โรยใหกระจายบนจานเพาะเชื้อท่ีผานการฆาเชื้อจนทั่ว นํากระดาษกรอง Whatman No.1 วางทับบนมูลสัตว จากนั้นปเปตตอาหาร Carboxymethyl cellulose Broth (CMC Broth) ปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร เติมลงใหทั่วกระดาษกรอง บมเล้ียงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3-7 วัน (ศรีสกุล, 2552) นําโคโลนีเดี่ยวที่เจริญบนอาหารมาขีดลงบนอาหาร CMC Agar ใหไดเชื้อบริสุทธิ์ 3.2 การศึกษาสัณฐานวิทยาของแอคติโนมยัซีทท่ีคัดแยกได นําแอคติโนมัยซีทบริสุทธ์ิทุกไอโซเลตที่คัดแยกไดจากขั้นตอน 3.1 มาขีดบนอาหาร Carboxymethyl cellulose Agar (ดัดแปลงจาก จีรพรรณ, 2550) จากนั้นใชกระจกปดสไลดที่ฆาเชื้อ (Sterile cover glass) วางบนบริเวณที่ขีดเชื้อ บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน นํากระจกปดสไลดมายอมสีแกรม เพื่อศึกษาลักษณะรูปรางและขนาดของเซลลแอคติโนมัยซีทภายใตกลองจุลทรรศนเลนสประกอบ กําลังขยาย 1,000 เทา (100X)

34  

ภาพที่ 14 วิธีการศึกษาสัณฐานวิทยาของแอคติโนมัยซีท 3.3 การศึกษาการสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทท่ีคัดแยกได นําแอคติโนมัยซีทบริสุทธิ์ทุกไอโซเลตที่คัดแยกได มาเลี้ยงบนอาหาร Mannitol Mungbean Agar (MBA) (บุณฑริก, 2548) บมเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน ตัดชิ้นวุนที่มี แอคติโนมัยซีทขนาดเสนผาศูนยกลาง 5 มิลลิเมตร จากอาหาร MBA นํามาวางลงบนผิวหนาอาหาร CMC Agar บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน จากนั้นทดสอบการสรางเอนไซม เซลลูเลสโดยการปเปตตสีคองโกเรด ปริมาตร 5 มิลลิลิตร ลงบนอาหาร CMC Agar หมุนจานเพาะเชื้อเพื่อใหสีคองโกเรดกระจายทั่ว ทิ้งไว 15 นาที แลวเทสีออก ลางดวยน้ํากลั่น จากนั้นปเปตตสารละลายโซเดียมคลอไรด (1 M NaCl) ปริมาตร 5 มิลลิลิตร หมุนจานเพาะเชื้อเพื่อใหสารละลายโซเดียมคลอไรดกระจายทั่ว ทิ้งไว 15 นาที แลวเทสารละลายทิ้ง ตรวจสอบบริเวณใส (Clear zone หรือ CMC hydrolysis zone) วัดเสนผาศูนยกลางบริเวณใสตอเสนผาศูนยกลาง (Diameter) โคโลนีของแอคติโนมัยซีทที่เจริญบน CMC Agar 3.4 การศึกษากิจกรรมเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทท่ีคัดแยกได การเตรียมหัวเชื้อ (Seed inoculum) โดยนําแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกไดมาขีดลงบนอาหาร CMC Agar บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน จากนั้นใช Cork borer ที่ผานการฆาเชื้อขนาดเสนผาศูนยกลาง 5 มิลลิเมตร และเจาะลงบนโคโลนีของแอคติโนมัยซีทที่เจริญอยูบนอาหาร CMC Agar 3 ชิ้น ถายลงในขวดรูปชมพู (Erlenmayer flask) ขนาด 250 มิลลิลิตร ที่บรรจุอาหารเล้ียงเชื้อ 0.5% CMC Broth ปริมาตร 50 มิลลิลิตร เขยาดวยเครื่องเขยาควบคุมอุณหภูมิ (Incubator shaker) ที่ความเร็ว 200 รอบตอนาที อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3 วัน วิเคราะหกิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลสโดยวิธี Somogyi-Nelson อางโดย ศิราภรณ (2550) (ภาคผนวก ฉ)

อาหาร CMC

กระจกปดสไลด แอคติโนมัยซีท

35  

3.5 การศึกษาการเจริญของแอคติโนมัยซีทท่ีอุณหภูมิตางๆ นําแอคติโนมยัซีททุกไอโซเลตที่คัดแยกไดมาขีด (Cross streak) ลงบนอาหาร CMC Agar ไอโซเลตละ 2 จาน บมเล้ียงที่อุณหภูมิแตกตางกัน คือ 37, 45, 55 และ 60 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน ตรวจสอบการเจริญของแอคติโนมัยซีทที่อุณหภูมิตางๆ   3.6 การศึกษาประสิทธิภาพการยอยวัสดุทางการเกษตรโดยแอคตโินมยัซีทท่ีคัดแยกได นําเศษวัสดุทางการเกษตร ไดแก ฟางขาว ผักตบชวา ขุยมะพราว มาตัดเปนชิ้นผสมให เขากัน จากนั้นบรรจุวัสดุทางการเกษตรที่ผานการผสมแลว ซ่ึงมีน้ําหนักรวม 2,000 กรัม ใสลงในถังพลาสติก โดยแบงการทดลองดังตอไปนี้ ชุดควบคุม คือ วัสดุทางการเกษตรที่ผานการฆาเชื้อและไมเติมแอคติโนมัยซีท ชุดทดลองที่ 1 คือ วัสดุทางการเกษตรที่ไมผานการฆาเชื้อและไมเติมแอคติโนมัยซีท ชุดทดลองที่ 2 คือ วัสดุทางการเกษตรที่ผานการฆาเชื้อและเติมแอคติโนมัยซีท ชุดทดลองที่ 3 คือ วัสดุทางการเกษตรที่ไมผานการฆาเชื้อและเติมแอคติโนมัยซีท (ทั้งชุดควบคุมและชุดทดลอง ทําการทดลอง 3 ซํ้า) การเตรียมเชื้อเร่ิมตนสําหรับเติมลงในถังของชุดทดลองที่ 1 และชุดทดลองที่ 3 ทําไดโดยการนําแอคติโนมัยซีทไอโซเลตที่มีกิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลสสูงที่สุด มาเพาะเลี้ยงในอาหาร CMC Agar บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3 วัน จากนั้นใช Cork borer ที่ผานการฆาเชื้อ ขนาดเสนผาศูนยกลาง 5 มิลลิเมตร เจาะโคโลนีของแอคติโนมัยซีทที่เจริญบน CMC Agar เติมลงในถังของชุดทดลองที่ 1 และชุดทดลองที่ 3 ถังละ 10 ชิ้น คลุกเคลาแอคติโนมัยซีทและวัสดุทางการเกษตรใหเขากัน เติมน้ํากลั่นปริมาตร 500 มิลลิลิตร จากนั้นปดปากถังดวยพลาสติกใสและเจาะรู ใหมีการระบายอากาศ (เติมน้ํากลั่นและกลับกองวัสดุทางการเกษตรในถังทุก 3 วัน) และตรวจวิเคราะหปจจัยทางกายภาพที่เกิดขึ้นในถังทุก 3 วัน ไดแก คาความเปนกรดดาง อุณหภูมิ ความชื้นและน้ําหนักของวัสดุทางการเกษตร รวมทั้งเก็บตัวอยางวัสดุทางการเกษตรน้ําหนัก 25 กรัม นํามา เจือจางใหไดระดับความเจือจางในชวง 10-1-10-8 นําสารละลายที่เจือจางมาตรวจหาปริมาณ แอคติโนมัยซีทที่เจริญระหวางการศึกษาการยอยวัสดุทางการเกษตร โดยวิธี Spread plate บนอาหาร CMC Agar ทุก 7 วัน

36  

(ก) (ข)

(ค)

ภาพที ่ 15 การเตรียมตัวอยางเศษวัสดุลงในถังพลาสติก

(ก) การตัดเศษวัสดุทางการเกษตร

(ข) วัสดุทางการเกษตรที่ผานการฆาเชื้อ

(ค) ถังพลาสติกมีพลาสติกใสปดปากถัง

3.7 สถานที่ทําการทดลอง

หองปฏิบัติการจุลชีววิทยา สาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี

มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี

บทที่ 4 ผลการทดลอง

4.1 การคัดแยกแอคติโนมัยซีท จากการคัดแยกแอคติโนมัยซีทจากมูลสัตว ซ่ึงมูลวัว มีลักษณะจับตัวกันเปนกอนสีน้ําตาลเหนียวและแข็ง มีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ความเปนกรดดาง 7.22 มูลแพะ มีลักษณะจับตัวเปนกอนแข็ง เปนเม็ดกลม สีดําคล้ํา มีอุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส ความเปนกรดดาง 6.91 และมูลมา มีลักษณะจับตัวกันเปนกอน สีเขียวเขม เปนกอนกลม มีอุณหภูมิ 36 องศาเซลเซียส ความเปนกรดดาง 6.73 เมื่อนํามูลสัตวทั้ง 3 ชนิด มาคัดแยกแอคติโนมัยซีทบนอาหาร CMC Agar และบนกระดาษกรอง สามารถแยกแอคติโนมัยซีทที่มีลักษณะโคโลนีแตกตางกันได 6 ไอโซเลต คือ คัดแยกจากมูลมาได 1 ไอโซเลต กําหนดใหเปน JJN-1255 คัดแยกจากมูลวัวได 2 ไอโซเลต กําหนดใหเปน JJN-1300 และ JJN-1500 คัดแยกจากมูลแพะได 3 ไอโซเลต กําหนดใหเปน JJN-1501, JJN-1700 และ JNN-1816 ผลการทดลอง แสดงดังตารางที่ 2 และภาพที่ 16 ตารางที่ 2 ลักษณะโคโลนีของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได ตัวอยาง ไอโซเลต ลักษณะโคโลนี

มูลมา

JJN-1255

สีขาวขุน คลายแปง กลางโคโลนีนูน

มูลวัว JJN-1300 JJN-1500

สีขาวผิวนูนกลางโคโลนีสีดํา สีเทาฟูคลายแปง ผิวนูน

มูลแพะ JJN-1501 JJN-1700 JJN-1816

สีขาว เปนปุยรอบโคโลนีกลางโคโลนีสีน้ําตาล เหนียว ผิวนูน สีสมฟูคลายแปง ผิวนูน สีขาว เปนปุยรอบโคโลนี กลางโคโลนีสีสม เหนยีว ผิวนนู

38  

(ก) (ข)

(ค) (ง)

   

(จ) (ฉ)

ภาพที่ 16 ลักษณะโคโลนีของแอคติโนมยัซีทที่คัดแยกได (ก) JJN-1255 (ข) JJN-1300 (ค) JJN-1500 (ง) JJN-1501 (จ) JJN-1700 (ฉ) JJN-1816

39  

4.2 การศึกษาสัณฐานวิทยาของแอคติโนมยัซีทท่ีแยกได หลังจากนําแอคติโนมัยซีทบริสุทธิ์ทุกไอโซเลตที่คัดแยกไดมาเพาะเลี้ยงบนอาหาร CMC Agar จากนั้นศึกษาลักษณะ รูปรางเซลล และการติดสียอมแกรม ภายใตกลองจุลทรรศน ผลการทดลอง แสดงดังภาพที่ 17

ไอโซเลต รูปราง สัณฐานวิทยาของไอโซเลตที่คัดแยกได(100X) การติดสีแกรม

JJN-1255

เสนใยยาว

บวก

JJN-1300

เสนใยสั้น

บวก

JJN-1500

สายยาว

บวก

40  

ไอโซเลต รูปราง สัณฐานวิทยาของไอโซเลตที่คัดแยกได(100X) การติดสีแกรม

JJN-1501

เสนใยยาว

บวก

JJN-1700

เสนใยยาว

บวก

JJN-1816

เสนใยยาว

บวก

ภาพที่ 17 สัณฐานวิทยาและการติดสียอมแกรมของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได

41  

ลักษณะโคโลนี สัณฐานวิทยาของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได มีลักษณะเปนเสนสายยาว ส้ัน ทอน และ ติดสีแกรมบวก สอดคลองกับรัตนาภรณ (2548) ที่กลาววา แอคติโนมัยซีทเปนแบคทีเรียมีลักษณะโคโลนีขนาดคอนขางใหญและมีลักษณะผิวที่หยาบ รูปรางแบบฟลาเมนทที่ ตอเปนสายยาว มีลักษณะคลายเชื้อรา แตมีขนาดเสนผาศูนยกลางเล็กกวาเชื้อรา ประมาณ 0.5-1.2 ไมโครเมตร และ ผนังเซลลมีลักษณะคลายแบคทีเรียแกรมบวก 4.3 การศึกษาการสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทท่ีคัดแยกได การสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกไดมาเล้ียงในอาหาร CMC Agarจากน้ันคํานวณอัตราสวนเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสตอขนาดเสนผาศูนยกลางโคโลนีของ แอคติโนมัยซีท (Ratio of CMC hydrolysis zone to colony diameter) ผลการทดลอง แสดงดัง ตารางที่ 3 และตัวอย างการทดสอบความสามารถในการสร าง เอนไซม เซลลู เลสของ แอคติโนมัยซีท ดังตารางที่ 3 ภาพที่ 18 ตารางที่ 3 อัตราสวนเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสตอโคโลนีของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได

ไอโซเลต

อัตราสวนเสนผาศูนยกลางของ บริเวณใส/โคโลนี (เซนติเมตร)

JJN-1255

1.70

JJN-1300 - JJN-1500 5.30 JJN-1501 6.20 JJN-1700 - JJN-1816 3.20

42  

ภาพที ่ 18 การทดสอบความสามารถในการสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทไอโซเลต JJN-1501

จากการทดสอบความสามารถในการสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทที่แยกได พบวา มีแอคติโนมัยซีท 4 ไอโซเลต คือ JJN-1255, JJN-1500, JJN-1501 และ JJN-1816 ที่สามารถสรางเอนไซมเซลลูเลส และอัตราสวนเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสตอขนาดเสนผาศูนยกลางโคโลนีของแอคติโนมัยซีทสูงที่สุด คือ JJN-1501 ซ่ึงสอดคลองกับศิราภรณ (2550) ที่การคัดแยก แอคติโนมัยซีทจากตัวอยางดิน 36 ตัวอยาง ที่สุมเก็บตัวอยางจาก 11 จังหวัดในประเทศไทย เมื่อนําแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกไดมาทดสอบความสามารถในการสรางเซลลูเลสเบื้องตนบนอาหาร CMC Agar และวัดอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางบริเวณใสตอเสนผาศูนยกลางโคโลนีที่เวลา 7 วัน พบวามีแอคติโนมัยซีทที่สามารถสรางเซลลูเลสไดจํานวน 71.30% และจากรายงานของ ชาญวิทย (2546) ที่ทําการศึกษาแอคติโนมัยซีทที่หายากในดินจากพื้นที่สงวนชีวมณฑลสะแกราช และสถานีวิจัยพืชไรสุวรรณวาจกกสิกิจ จังหวัดนครราชสีมา จากนั้นทําการทดสอบความสามารถของแอคติโนมัยซีทที่แยกไดในการยอยคารบอกซิเมทิลเซลลูโลส พบวา มี 58 ไอโซเลตที่สามารถยอยคารบอกซิเมทิลเซลลูโลส

43  

4.4 ผลการศึกษากิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทท่ีคดัแยกได นําแอคติโนมัยซีทของไอโซเลต JJN-1255, JJN-1501, JJN-1500 และ JJN-1816 ที่มี

ความสามารถในการสรางเอนไซมเซลลูเลส มาศึกษากิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลสในอาหารเหลวที่มีแหลงคารบอน 0.5% CMC และวิเคราะหปริมาณน้ําตาลรีดิวซ ตามวิธีของ Somogyi-Nelson ผลการทดลองแสดงดังภาพที่ 19

0 2 4 6 8

.12

.14

.16

.18

.20

.22

.24

ภาพที่ 19 กิจกรรมเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได

การศึกษากิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกไดโดยการวิเคราะหปริมาณน้ําตาลรีดิวซ ตามวิธี Somogyi-nelson พบวา แอคติโนมัยซีทไอโซเลต JJN-1501 สามารถผลิตเอนไซมเซลลูเลสไดสูงที่สุด ตรวจวัดกิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลสไดเทากับ 0.217 U/ml. ในวันที่ 1 ของการเพาะเลี้ยง ซ่ึงการผลิตเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทขึ้นกับปจจัยตางๆ ไดแก ปริมาณเชื้อ แหลงคารบอน คาความเปนกรดดาง อุณหภูมิ การมีตัวชักนํา (inducer) คือ แหลงคารบอน ตัวยับยั้ง (inhibitor) คือ กลูโคส สอดคลองกับพรทิพย (2550) ที่กลาววา การศึกษาความสามารถในการสรางเอนไซมเซลลูเลส พบวาพวก Cellulolytic fungi และ Cellulolytic actinomycetes สามารถเจริญไดดีในอาหารเลี้ยงเชื้อทั่วไป เมื่อสรางเอนไซมแลวจะปลอยลง สูอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยเฉพาะอยางยิ่งเชื้อแอคติโนมัยซีทมีหลายชนิดที่สามารถเจริญและสรางเอนไซม Cellulases ที่อุณหภูมิสูง

วันที ่

 

Cellulase U/ml.

JJN-1255 JJN-1500 JJN-1501 JJN-1816

44  

4.5 การศึกษาการเจริญของแอคติโนมัยซีทท่ีอุณหภูมิตางๆ หลังจากนําแอคติโนมัยซีททั้ง 4 ไอโซเลต มาเล้ียงบนอาหาร CMC Agar ที่อุณหภูมิ 37, 45, 55, 60 และ 65 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน เพื่อนํามาทดสอบความสามารถในการเจริญของ แอคติโนมัยซีทที่อุณหภูมิสูง ผลการทดลองแสดงดังตารางที่ 4 และภาพที่ 20 ตารางที่ 4 การทดสอบการทนความรอนของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได

หมายเหตุ – ไมมีการเจริญของแอคติโนมัยซีท + มีการเจริญของแอคติโนมัยซีท

อุณหภูมิ (°C )

ไอโซเลต

JJN-1255 JJN-1500 JJN-1501

JJN-1816

37

+

+

+

+

45

+ + + +

55

- - + -

60

- - - -

65

- - - -

45  

ภาพที่ 20 ลักษณะโคโลนีของ JJN-1501 บนอาหาร CMC Agar ที่อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส

การศึกษาการเจริญของแอคติโนมัยซีทที่อุณหภูมิตางๆ พบวา แอคติโนมัยซีท ไอโซเลต

JJN-1501 สามารถเจริญไดดีที่ อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส สอดคลองกับนฤมล (2550) ที่กลาววา แอคติโนมัยซีทสามารถทนอุณหภูมิสูงได โดยเจริญไดที่อุณหภูมิ 45-65 องศาเซลเซียส และ แอคติโนมัยซีทสวนใหญคอนขางทนตอความแหงแลง จึงสามารถรอดชีวิตอยูไดในสภาวะที่แหงแลงมาก เชน ดินในทะเลทราย ในโคลนผิวดิน นอกจากพบแอคติโนมัยซีทในสภาพธรรมชาติแลวยังสามารถพบแอคติโนมัยซีทไดในกองปุยหมักที่มีอุณหภูมิสูงมาก เนื่องจากแอคติโนมัยซีทมีความสามารถในการยอยสลายสารประกอบที่ยอยสลายยาก จึงมักพบการเจริญของแอคติโนมัยซีทหลังการเจริญของจุลินทรียชนิดอื่น

4.6 การศึกษาประสิทธิภาพการยอยวัสดุทางการเกษตรโดยแอคตโินมยัซีทท่ีคัดแยกได

จากการนําวัสดุทางการเกษตร ไดแก ฟางขาว ผักตบชวา ขุยมะพราว มาผสมใหเขากันและทดสอบการยอยสลายในถังพลาสติกโดยแอคติโนมัยที่มีกิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลสสูงที่สุด คือ JNN-1501 ตรวจวิเคราะหปจจัยทางกายภาพ ไดแก คาความเปนกรดดาง อุณหภูมิ ความชื้น ผลการทดลองแสดงดังภาพที่ 21, 22, 23 และ 24 ตามลําดับ สวนน้ําหนักของวัสดุทางการเกษตรและการ ยอยสลายวัสดุทางการเกษตรโดยแอคติโนมัยซีท JJN-1501 แสดงดังภาพที่ 25

46  

ภาพที่ 21 คาความเปนกรด-ดางระหวางการทดสอบการยอยสลายวัสดทุางการเกษตรเบื้องตน

ภาพที่ 22 อุณหภูมิระหวางการทดสอบการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตน 

47  

ภาพที ่ 23 ความชื้นระหวางการทดสอบการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตน

ภาพที่ 24 น้ําหนักของวัสดทุางการเกษตรระหวางการทดสอบการยอยสลายเบื้องตน

48  

ชุดการทดลอง สัปดาหที่ 1 สัปดาหที ่4 ชุดควบคุม

ชุดทดลองที่ 1

ชุดทดลองที่ 2

ชุดทดลองที่ 3

ภาพที่ 25 การทดสอบการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตนในชุดการทดลองตางๆ

49  

จากการศึกษาประสิทธิภาพการยอยวัสดุทางการเกษตรโดยแอคติโนมัยที่คัดแยกไดมาตรวจวิเคราะหปจจัยทางกายภาพ คือ ความเปนกรดดางอยูในชวง 6.29-7.77 คาความเปนกรดดางของการยอยวัสดุทางการเกษตรทุกชุดการทดลอง มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญที่ระดับความเชื่อมั่น 99 % อุณหภูมิอยูในชวง 31-42 องศาเซลเซียส คาอุณหภูมิของการยอยวัสดุทางการเกษตรทุกชุดการทดลอง มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญที่ระดับความเชื่อมั่น 99 % ความชื้นอยูในชวง 60-89 % คาความชื้นของการยอยวัสดุทางการเกษตรทุกชุดการทดลอง มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญที่ระดับความเชื่อมั่น 99 %และมีน้ําหนักของวัสดุทางการเกษตรระหวางการทดสอบการยอยสลายลดลงจากปริมาณ 2 กิโลกรัม ดังนี้ ชุดควบคุม เทากับ 1.5 กิโลกรัมชุดทดลองที่ 1 เทากับ 1.3 กิโลกรัม ชุดทดลองที่ 2 เทากับ 1.0 กิโลกรัม ชุดทดลองที่ 3 เทากับ 0.9 กิโลกรัม ตามลําดับ การยอยสลายวัสดุทางการเกษตรทุกชุดการทดลอง มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญที่ระดับความเชื่อมั่น 99 % โดยในชุดการทดลองที่ 2 และชุดการทดลองที่ 3 มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญที่ระดับความเชื่อมั่น 99 % ในการยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตรอยางมีประสิทธิภาพ จะมีการระบายอากาศ โดยการกลับเศษวัสดุทางการเกษตรใหทั่ว เพื่อชวยใหเกิดการยอยสลายที่เร็วข้ึน สอดคลองกับ ศิราภรณ (2550) โดยใชวัสดุเหลือทิ้งทางการเกษตร ที่มีคาความเปนกรดดางอยูในชวงกลางหรือกรดเล็กนอย 2-3 วันแรกสามารถยอยสลายวัสดุทางการเกษตรอยางรวดเร็ว มีผลทําใหคาความเปนกรดดางสูงขึ้นเล็กนอยและจะรักษาระดบัคาความเปนกรดดางอยูในชวงระหวาง 7.5-8.5 สวนอุณหภูมิเรงกระบวนการเปลี่ยนแปลงในกองปุยหมักเปนตัวบงชี้กิจกรรมของจุลินทรีย หลังกองปุยหมัก 2-4 วัน อุณหภูมิจะสูงอยางรวดเร็วจนถึง 50-60 องศาเซลเซียส เนื่องจากความรอนจากกระบวนการยอยสลายจะถูกปลดปลอยสูอินทรียวัตถุ ทําใหความรอนสามารถแพรกระจายออกจากกองปุยหมักไดนอย อุณหภูมิภายในกองปุยหมักแบงเปน 2 ระยะ คือ ความรอนปานกลางอยูในชวงไมเกิน 45 องศาเซลเซียส และ ความรอนสูงอยูในชวงไมเกิน 45-60 องศาเซลเซียส ระดับความชื้นในกองปุยหมักที่เหมาะสมตอการยอยสลายประมาณ 60-50 % โดยน้ําหนัก ถาความชื้นนอยกวา 40 % การยอยสลายจะเกิดขึ้นอยางชาๆ แตถาความชื้นสงูกวา 80 % กองปุยหมักจะแฉะเกินไป ซ่ึงเกิดจากสารอินทรียระเหยจําพวกมีเทน และไฮโดรเจนซัลไฟด โดยกลุมจุลินทรียที่ไมตองการอากาศและทําใหสูญเสียธาตุอาหารดวย เชน ไนโตรเจนจะเปลี่ยนรูปเปนแอมโมเนีย

50  

สําหรับการศึกษาปริมาณแอคติโนมัยซีทที่เจริญระหวางการยอยวัสดุทางการเกษตรโดยวิธี Spread plate บนอาหาร CMC Agar ผลการทดลองแสดงดังตารางที่ 5 ตารางที่ 5 การเจริญของแอคติโนมัยซีทระหวางการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร

สัปดาห

การเจริญของแอคติโนมัยซีทระหวางการยอยสลายวัสดทุางการเกษตร ชุดควบคุม ชุดทดลองที่ 1 ชุดทดลองที่ 2 ชุดทดลองที่ 3

1 2 3 4

- - - +

+ + +

++

++ ++

+++ +++

++ +++

++++ ++++

หมายเหตุ - ไมพบการเจริญ + พบการเจริญนอย ++ พบการเจริญปานกลาง +++ พบการเจริญมาก ++++ พบการเจริญมากที่สุด

แอคติโนมัยซีทจะทําหนาที่ เปนผูยอยสสลายอินทรียวัตถุในดินโดยผลิตเอนไซม กลุมไฮโดรเลส ซ่ึงประกอบดวยเอนไซมที่สําคัญ คือ เซลลูเลส และมีความสามารถในการยอยสลายสารที่มีโครงสรางซับซอน สารไบโอโพลิเมอร ตางๆ เชน เซลลูโลส เคราติน เพคตินและไคติน (ยุวดี, 2546) ซ่ึงจากผลการทดลองแสดงใหเห็นวา แอคติโนมัยซีท JJN-1501 มีประสิทธิภาพในการยอยสลายอินทรียวัตถุตางๆ เชน ฟางขาว มีปริมาณเซลลูโลส 30.5% เนื้อไมมีปริมาณเซลลูโลส 40.0-45.0% (ศิราภรณ, 2550) การยอยสลายวัสุทางทางเกษตรของจุลินทรียอยูในกลุมของแบคทีเรียเชื้อรา และแอคติโนมัยซีท ในระยะแรกมีเชื้อราเจริญมากและแบคทีเรียเปนผูยอยสลายตอ ตอมาแบคทีเรียและเชื้อราหยุดการเจริญเติบโต เนื่องจากอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้น จากนั้นแอคติโนมัยซีทจะมีบทบาทสําคัญในการยอยสลายอินทรียสารตอไป (ธีระพงษ, 2551) จากการทดลองพบวาปจจัยที่มีผลตอการควบคุมปริมาณของแอคติโนมัยซีท คือ ปริมาณอินทรียวัตถุ ความเปนกรดดาง ระดับความชื้น อุณหภูมิ แอคติโนมัยซีตพบไดในชวงสุดทายของกระบวนการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร เมื่ออุณหภูมิสูงขึ้นพบแอคติโนมัยซีตเจริญเปนสวนใหญ ซ่ึงสังเกตไดจากบนเศษวัสดุ มีสีขาวของกลุมโคโลนีแอคติโนมัยซีท

บทที่ 5 สรุปผลการทดลอง

จากการศึกษาการคัดแยกแอคติโนมัยซีทจากมูลสัตวเนื่องจากมูลสัตวที่นํามาศึกษาเปนสัตว

กินพืชจึงมีสารประกอบเซลลูโลสที่แอคติโนมัยซีทสามารถยอยสลายได โดยตัวอยางที่นํามาใชในการคัดแยก ไดเก มูลวัวแหง มูลมา มูลแพะ มีอุณหภูมิอยูในชวง 35-38 องศาเซลเซียสและคาความเปนกรด-ดางอยูในชวง 6.73-7.22 โคโลนีของเชื้อแอคติโนมัยซีทมีลักษณะเปนฝุนผงคลายแปง มีลักษณะพื้นผิวของโคโลนีมีลักษณะเรียบ สีเทา สีขาว โคโลนีมีลักษณะเหนียวและดานมีลักษณะนูนการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเชื้อจุลินทรียที่คัดแยกไดพบวาลักษณะทางสัณฐานวทิยาของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกไดมีลักษณะผอมยาวคลายเสนดาย และมีขนาดเสนผาศูนยกลางเล็ก และยอมติดสีแกรมบวก

ทดสอบการสรางเอนไซมเซลลูเลสบนอาหาร Carboxymethyl cellulose Agar สามารถ คัดแยกแอคติโนมัยซีทไดทั้งหมด 6 ไอโซเลต คือ JJN-1255, JJN-1300, JJN-1500, JJN-1501, JJN-1816 และ JJN-1700 โดย JJN-1501 มีอัตราสวนเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสตอโคโลนีสูงที่สุดเทากับ 6.2 เซนติเมตร รองลงมาคือ JJN-1500, JJN-1816, JJN-1255 โดยมีอัตราสวนเทากับ 5.3, 3.2 และ 1.7 เซนติเมตร ตามลําดับสวน JJN-1300, JJN-1700 ไมสามารถสรางบริเวณใสได

การศึกษากิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทที่ เพาะเลี้ยงใน 0.5% Carboxymethyl cellulose Broth พบวา JJN-1501 มีกิจกรรมของเอนไซมสูงสุด ในวันที่ 1 มีคาเทากับ 0.2170 U/ml. รองลงมาคือ JJN-1255, JJN-1500 และ JJN-1816 ซ่ึงมีกิจกรรมของเอนไซม เซลลูเลสเทากับ 0.165 U/ml., 0.156 U/ml. และ 0.151 U/ml. ในวันที่ 5 ตามลําดับ

การศึกษาการทนความรอนของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได พบวา JJN-1501 ทนอุณหภูมิไดสูงสุดที่ 55 องศาเซลเซียส รองลงมา คือ JJN-1500, JJN-1255 และ JJN-1816 สามารถทนความรอนได 45 องศาเซลเซียส

ผลการทดสอบประสิทธิภาพการยอยวัสดุทางการเกษตรพบวาไดคัดเลือกแอคติโนมัยซีทไอโซเลต JJN-1501 ที่มีความสามารถในการสรางเอนไซมเซลลูเลสสูง มาใชในกระบวนการศึกษาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตน มีน้ําหนักเริ่มตนในแตละชุดการทดลองปริมาณเทากับ 2 กิโลกรัม พบวาชุดทดลองที่ 3 ยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตรไดดีที่สุดเมื่อเทียบจากปริมาณน้ําหนักที่ลดลงจากน้ําหนักเริ่มตนเทากับ 0.9 กิโลกรัม รองลงมา คือ ชุดทดลองที่ 2 เทากับ

52  

1 กิโลกรัม ชุดทดลองที่ 1 เทากับ 1.3 กิโลกรัม และชุดควบคุม เทากับ 1.5 กิโลกรัม การยอยสลายวัสดุทางการเกษตรทุกชุดการทดลอง มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญที่ระดับความเชื่อมั่น 99 %โดยในชุดการทดลองที่ 2 และชุดการทดลองที่ 3 มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญที่ระดับความเชื่อมั่น 99 %

จากการทดสอบระหวางการยอยสลายตรวจวัดคาความเปนกรดดางไดในชวง 6.29-7.77 ความเปนกรดดางของการยอยวัสดุทางการเกษตรทุกชุดการทดลอง มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญที่ระดับความเชื่อมั่น 99 % อุณหภูมิอยูในชวง 31-42 องศาเซลเซียส อุณหภูมิของการยอยวัสดุทางการเกษตรทุกชดุการทดลอง มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญที่ระดับความเชื่อมั่น 99 % ความชื้นอยูในชวง 58-89 % ความชื้นของการยอยวัสดุทางการเกษตรทุกชุดการทดลอง มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญที่ระดับความเชื่อมั่น 99 % และการเจริญของแอคติโนมัยซีทระหวางการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรตรวจพบไดมากที่สุดในชวงสัปดาหที่ 3-4 ของการทดลอง ขอเสนอแนะ

1. ควรมีการทดสอบความเปนพิษของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกไดกอนนําไปใชประโยชน 2. ในการศึกษาเรื่องการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรเบื้องตนควรมีการศึกษาเพิ่มเติมใน

การตรวจวัดคามาตรฐาน C:N ที่มีการเปลี่ยนแปลงในระหวางการหมักเพื่อนําขอมูลที่ไดมาพิจารณาถึงความเหมาะสม สําหรับการนําวัสดุทางการเกษตรที่มีการยอยสลายเบื้องตนไปทําปุยหมักได

เอกสารอางอิง กนกกร สินมา. 2548. การศึกษาความสัมพันธทางสายวิวัฒนาการของเชื้อแอคติโนมัยซีทที่แยกได จากลําไสปลวกซึ่งยอยสลายสารประกอบลิกโนเซลลูโลสและออกซิไดซกรดยูริก. วิ ท ย านิ พนธ วิ ท ย า ศ าสตรมห าบั ณฑิ ต ภ าค วิ ช า ชี ว วิ ท ย า คณะวิ ท ย า ศ า ต ร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร. กรุงเทพฯ. จีรพรรณ ใจอินผล. 2550. การแยกและคัดเลือกแอคติโนมัยซีทจากดินในถ้ําน้ําลอดที่สามารถผลิต สารปฏิชีวนะยับยั้งการเจริญของฟงไจ. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาจุล ชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเชียงใหม. เชียงใหม. ชาญวิทย สุริยฉัตรกุล. 2546. แอคติโนมัยซีทที่หายากในดิน จากพื้นที่สงวนชีวมณฑลสะแกราช และสถานีวิจัยพืชไรสุวรรณวาจกกสิกิจ.วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต ภาควิชา ชีววิทยา คณะวิทยาศาตรและเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร. นครราชสีมา. ชนิกานต คุมนก. 2544. การแยกและคัดเลือกแอคติโนมัยซีทที่สรางสารปฏิชีวนะ. วิทยานิพนธ วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาชีววิทยาประยุกต คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี. ราชภัฏ พิบูลสงคราม. พิษณุโลก. ณัฐวรรณ พิทักษศิริพรรณ. 2548. การแยกและการคัดเลือกจุลินทรียที่มีประสิทธิภาพในการยอย สลายขยะมูลฝอยทางชีวภาพ. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาตร. มหาวิทยาลัยเชียงใหม. เชียงใหม. ดาริกา วสุนธรากุล สมภพ อินทสุวรรณ และนุกูล อินทระสังขา. 2552. การสํารวจความหลากหลาย กลุมของแบคทีเรียและแอคติโนมัยซีทในปุยอินทรียอัดเม็ด. วิทยานิพนธวิทยาศาสตร มหาบัณฑิต สาขาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร. มหาวิทยาลัยทักษิณ. สงขลา. ธงชัย คัมภีร พรทิพย ตัณทเจริญรัตน และสาวิตรี ล่ิมทอง. 2550. การผลิตเอนไซมเซลลูเลสโดยใช เชื้อแอคติโนมัยซีทซ่ึงเจริญ ณ อุณหภูมิสูง. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต ภาควิชา จุลชีววิทยา คณะวิทยาศาตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร. กรุงเทพฯ. ธีระพงษ สวางปญญางกูร. 2551. คูมือการผลิตปุยอินทรีย. พิมพครั้งที่ 6. มหาวิทยาลัยแมโจ, แพร. 350 หนา.

54  

พิทยากร ล่ิมทอง. 2531. อิทธิพลของจุลินทรียที่ยอยสลายเซลลูโลสตอการผลิตปุยหมักจากฟางขาว. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร.กรุงเทพฯ. พรทิพย ตัณฑเจริญรัตน. 2550. การผลิตเอนไซมเซลลูเลส โดยเชื้อแอคติโนมัยสีท รหัส 24402. วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาจุลชีววทิยา ภาควิชาจุลชีววิทยา มหาวิทยาลัยเกษตรศาตร. คณะวิทยาศาสตร. กรุงเทพฯ. นฤมล เถ่ือนกูล. 2550. การศึกษาการใชสารสีจากแอคติโนมัยซีทเพื่อเปนสียอมในหองปฏิบัติการ ชีววิทยา. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและ เทคโนโลยี. มหาวิทยาลัยราชภัฏพิบูลสงคราม. พิษณุโลก. เนาวรัตน ประดับเพ็ชร สุวิทย เฑียรทอง ศานิต สวัสดิกาญจน และคณะ. 2553. การสํารวจจุลินทรีย ทองถ่ินจากพื้นที่เกษตรกรรมของจังหวัดอางทอง. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี. พระนครศรีอยุธยา. มัลลิกา หมูแกว. 2550. การประเมินความสามารถของเชื้อแอคติโนมัยซีทในการควบคุมโรคเนาคอ ดินของพริก. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาจุลชีววิทยา คณะวิทยาศาตร. มหาวิทยาลัยเชียงใหม. เชียงใหม. ยุพา จอมแกว. 2552. การจัดจําแนกลักษณะทางฟโนไทปและจีโนไทปของเชื้อแอคติโนมัยซีท เอนโดไฟทที่แยกไดจากสมและศักยภาพในการสงเสริมการเจริญเติบโตของสม . วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาปฐพีศาสตร คณะ วิทยาศาตร. มหาวิทยาลัยเชียงใหม. เชียงใหม. รัตนาภรณ ศรีวิบูลย. 2548. การเก็บรวบรวมและการตรวจหา Actinomycetes จากดินปาชายเลนที่ สามารถสรางสารยับยั้งจุลชีพ.วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี. มหาวิทยาลัยราชภัฏพระนครศรีอยุธยา. อยุธยา. วราภรณ บัลลังกนาค. 2551. การคัดแยกและการคัดเลือกเชื้อแอคติโนมัยซีทที่สามารถผลิตสาร ปฏิชีวนะยับยั้งแบคทีเรียดื้อยา.วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต. สาขาวิชาจลุชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร. มหาวิทยาลัยนเรศวร. พิษณุโลก. ศรีสกุล ชนะพันธ. 2552. การแยกและการคัดเลือกแอคติโนมัยซีทในดินที่สามารถสรางสารตาน การเจริญของเชื้อจุลินทรียทดสอบ .วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต ภาควิชา จุลชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร. มหาวิทยาลัยศิลปากร. นครปฐม.

55  

ศิราภรณ สุขวโรทัย. 2550. การคัดแยกแอคติโนมัยซีทที่สามารถผลิตเซลลูเลสและสารปฏิชีวนะ. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาจุลชีววิทยาอุสาหกรรม ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะวิทยาศาตร. จุฬาลงกรณมหาวิทยาลัย. กรุงเทพฯ. ศศิธร ไกรฤทธิชัย. 2552. การแยกและการคัดกรองแบคทีเรียที่สามารถผลิตเอนไซมเซลลูเลสเพื่อ การย อ ยสลายใบไม .วิ ทย านิพนธ วิ ท ย าศ าสตรมหาบัณฑิ ต ภาควิ ช าชี วิ ท ย า คณะวิทยาศาสตร. เชียงใหม. สุบัณฑิต นิ่มรัตน. 2550. จุลชีววิทยาทางดิน. พิมพครั้งที่ 4. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ. 350 หนา สายพิณ ไชนันท. 2550. จลิุนทรียดิน. พิมพครั้งที่ 3. มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกลาธนบุรี, ปราจีนบุรี. 480 หนา อรรถ บุญนิธิ. 2550. จุลชีววิทยาสิ่งแวดลอม. พิมพคร้ังที่ 6. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ. 300 หนา วราภรณ บัลลังกนาค. 2551. การคัดแยกและการคัดเลือกเชื้อแอคติโนมัยซีทที่สามารถผลิตสาร ปฏิชีวนะยับยั้งแบคทีเรียดื้อยา. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต. สาขาวิชาจุลชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร. มหาวิทยาลัยนเรศวร. พิษณุโลก. ศรีสกุล ชนะพันธ. 2552. การคัดเลือกแอคติโนมัยซีทในดินที่สามารถสรางสารตานการเจริญของ เชื้อจุลินทรียทดสอบ.วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะ วิทยาศาสตร. มหาวิทยาลัยศิลปากร. นครปฐม. ศิราภรณ สุขวโรทัย. 2550. การคัดแยกแอคติโนมัยซีทที่สามารถผลิตเซลลูเลสและสารปฏิชีวนะ. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต ภาควิชาจุล ชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร . จุฬาลงกรณมหาวิทยาลัย. สุบัณฑิต นิ่มรัตน. 2550. จุลชีววิทยาทางดิน. พิมพครั้งที่ 4. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ. 350 หนา สายพิณ ไชนันท. 2550. จุลินทรียดิน. พิมพครั้งที่ 3. มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกลาธนบุรี, ปราจีนบุรี. 480 หนา อรรถ บุญนิธิ. 2550. จุลชีววิทยาสิ่งแวดลอม. พิมพคร้ังที่ 6. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ. 300 หนา

56  

Alexander, M. 1967. Introduction to soil microbiology. Toppan Printing Co(S) Pte. Ltd. Singapore 200 : 169-181. Alexander, M. 1977. Introduction to soil microbiology. John Wiley & Sons, Inc., New York. Beguin, P. 1990. Molecular biology of cellulose degradation. Annual Review of Microbiology. 250 : 219-248. Czoch, W. P. and Mordarski. M. 2009. Actinomycete Enzymes. In M. Goodfellow,

S. T. Williams and M. Mordarski, eds. Actinomycetes in Biotechnology. Academic Press, San Diego. 5 : 219 –224.

Hamaki, T., Suzuki, M., Fudou, R., Jojima, Y., Kajiura, T., Tabuchi, A., 2010. Isolation of novel bacterial and actinomycetes using soil-extract agar medium. Journal of Bioscience and Bioengineering. Academic Press, San Diego. 5: 485 – 492.

Haward, G. T. and Elliott, L. G. 1988. Effects of cellulolytic ruminal bacteria and cell extracts on germination of Euonymus americanus L. seeds. Applied and EnvironmentMicrobiology. Lacey, J. 2009. Actinomycetes in Composts. Annual Agriculture and Environments. Academic Press, San Diego. 2 : 50 –58. Nishida, Y. 2007. Isolation and primary structure of a cellulase from the Japanese sea urchin Strongylocentrotus nudus. Graduate School of Fisheries Sciences. Hokkaido University. Hokkaido. Prasertsri, A., Kitpreechavanich, V., Sirisansaneeyakul, S., Chettanachit, C. and Lotong, N. 2000. Solid state fermentation of Humicolala nuginosa (griffon and maublance) bunce for cellulase-free beta-xylanase production. Proceedings of the 38th Kasetsart University Annual Conference: Fisheries and Science. 279-294. Wang, Y. Ruan, J. S. and Zhang Z. S. 2009. High actinomycetes diversity in the tropical

rainforests of Singapore. Symposium on Microbial Diversity: The Asian Scene. February 22 - 24, 2009. Singapore National University of Singapore.

Xiao, J., Xu, J., Xie, S., Zhang, X., Yu, Z., and Xu, J. 2008. Isolation of mangrove Actinomycetes and their antagonistic activities. 14: 244 – 248.

57  

[online ]:Available: http://www. ku.ac.th/e-magazine/march47/agri/puy.html. [online ]:Available: http://www. http://www.vcharkarn.com/varticle/38803. [online ]:Available: http://www. greenpeace.org/seasia/th/getinvolved/green-tips/compost. [online ]:Available: http://www. vcharkarn.com/varticle/38803.  

ภาคผนวก ก อาหารเลี้ยงเชื้อ

59  

Carboxymethyl cellulose Agar (CMC Agar) Carboxylmethyl cellulose 5 กรัม Yeast Extract 1 กรัม K2HPO4 0.7 กรัม KH2HPO4 0.3 กรัม MgSO4.7H2O 0.5 กรัม FeSO4.7H2O 0.01 กรัม ZnSO4 0.001 กรัม Agar 15.0 กรัม น้ํากลั่น 1,000 มิลลิลิตร ปรับคาความเปนกรด - ดางเทากับ 7.0 นึ่งฆาเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15 นาที Carboxymethyl cellulose Broth (CMC Broth) Carboxylmethyl cellulose 5 กรัม Yeast Extract 1 กรัม K2HPO4 0.7 กรัม KH2HPO4 0.3 กรัม MgSO4.7H2O 0.5 กรัม FeSO4.7H2O 0.01 กรัม ZnSO4 0.001 กรัม น้ํากลั่น 1,000 มิลลิลิตร ปรับคาความเปนกรด - ดาง เทากับ 7.0 นึ่งฆาเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15 นาที

60  

International Streptomyces Project Agar (ISP Agar) Yeast Extract 4 กรัม Malt Extract 10 กรัม Glucose 4 กรัม Agar 15 กรัม น้ํากลั่น 1,000 มิลลิลิตร ปรับคาความเปนกรด - ดาง เทากับ 7.0 นึ่งฆาเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15 นาที Mannitol Mungbean Agar (MBA)

ถ่ัวเขียวบด 20 กรัม น้ําตาลแมนนิทอล (D-mannitol) 20 กรัม Agar 18.0 กรัม น้ําประปา 500 มิลลิลิตร น้ํากลั่น 500 มิลลิลิตร ตมถ่ัวเขียวบดกับน้ําประปาจนเดือด กรองเอาถั่วเขียวออก จากนั้นเติมน้ําตาลแมนนทิอลและน้ํากลัน่ ปรับคาความเปนกรด - ดาง เทากับ 7.0 เติมวุนผง (Agar) ตมจนเดือด แลวนําไปนึ่งฆาเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15 นาที   

ภาคผนวก ข

ผลการการทดสอบความสามารถใน การสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีทบนอาหารวุน

62  

ภาพที่ 26 ผลการทดสอบการสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN-1255 บนอาหารวุน

ไอโซเลตของ แอคติโนมัยซีท ที่คัดแยกได

ลักษณะบริเวณใสที ่เกิดจากการยอยสลายเซลลูโลส

อัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของ

บริเวณใส : โคโลนี (cm.)

JJN - 1255

1.5

1.9

1.8

  

63  

ภาพที่ 27 ผลการทดสอบการสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN-1500 บนอาหารวุน

ไอโซเลตของ แอคติโนมัยซีท ที่คัดแยกได

ลักษณะบริเวณใสที ่เกิดจากการยอยสลายเซลลูโลส

อัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของ

บริเวณใส : โคโลนี (cm.)

JJN– 1500

5.2

5.5 5.3

 

ภาพที่ 28 ผล

ไอโซเลแอคติโนที่คัดแย

JJN–1

ลการทดสอบ

ลตของ นมัยซีท ยกได

1501

บการสรางเอน

ลเกิดจา

64

นไซมเซลลูเลส

ลักษณะบริเวากการยอยสล

สของแอคตโิ

ณใสที ่ายเซลลูโลส

โนมัยซีท JJN-

เสบรเิ

-1501 บนอาห

อัตราสวนระสนผาศูนยกลเวณใส : โคโล

6.0

6.5

6.1

หารวุน

หวางางของ ลนี (cm.)

65  

ภาพที ่ 29 ผลการทดสอบการสรางเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN-1816 บนอาหารวุน

ไอโซเลตของ แอคติโนมัยซีท ที่คัดแยกได

ลักษณะบริเวณใสที ่เกิดจากการยอยสลายเซลลูโลส

อัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของ

บริเวณใส : โคโลนี (cm.)

JJN–1816

3.7

2.7

            

3.2

 

ภาคผนวก ค ขอมูลผลการทดลองการวิเคราะหเอนไซมเซลลูเลส

67  

ตารางที่ 6 คาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 550 นาโนเมตร ของสารละลายกลูโคสมาตรฐาน

ความเขมขนของ สารละลายกลูโคส

(มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร)

คาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 550 นาโนเมตร คาเฉลี่ย

คร้ังที่ 1 คร้ังที่ 2

0.2 0.083 0.087 0.085 0.4 0.166 0.168 0.167 0.6 0.285 0.298 0.292 0.8 0.389 0.405 0.397 1.0 0.514 0.517 0.516

ภาพที่ 30 กราฟมาตรฐานของสารละลายกลูโคส

68  

ตารางที่ 7 กจิกรรมเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN- 1255ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 7 วัน

วันที ่ กิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลส (U/ml) คาเฉลี่ย

0 0.153 0.138 0.1455 1 0.155 0.150 0.1525 2 0.132 0.133 0.1325 3 0.132 0.129 0.1305 4 0.137 0.133 0.1350 5 0.161 0.169 0.1650 6 0.136 0.138 0.1370 7 0.140 0.135 0.1375

  

ตารางที่ 8 กจิกรรมเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN- 1500 ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 7 วัน

วันที ่ กิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลส (U/ml) คาเฉลี่ย 0 0.131 0.142 0.1365 1 0.145 0.139 0.1420 2 0.137 0.131 0.1340 3 0.137 0.131 0.1340 4 0.149 0.143 0.1460 5 0.153 0.16 0.1565 6 0.151 0.149 0.1500 7 0.134 0.134 0.1340

69  

ตารางที่ 9 กจิกรรมเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN - 1501 ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 7 วัน

วันที ่ กิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลส (U/ml) คาเฉลี่ย

0 0.131 0.155 0.1430 1 0.201 0.233 0.2170 2 0.178 0.160 0.1690 3 0.153 0.142 0.1475 4 0.143 0.145 0.1440 5 0.153 0.160 0.1565 6 0.151 0.147 0.1490 7 0.134 0.133 0.1335

ตารางที่ 10 กจิกรรมเอนไซมเซลลูเลสของแอคติโนมัยซีท JJN - 1816 ที่อุณหภูม3ิ7 องศาเซลเซียส นาน 7 วัน

วันที ่ กิจกรรมของเอนไซมเซลลูเลส (U/ml) คาเฉลี่ย

0 0.157 0.135 0.1460 1 0.151 0.153 0.1520 2 0.127 0.132 0.1295 3 0.137 0.135 0.1360 4 0.144 0.136 0.1400 5 0.149 0.153 0.1510 6 0.148 0.146 0.1470 7 0.137 0.136 0.1365

ภาคผนวก ง ขอมูลผลการทดลองการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร

โดยใชเชื้อแอคติโนมยัซีทไอโซเลต JJN-1501

  

71

คาความเปนกรด-ดาง (pH) ตารางที่ 11 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดควบคุม  วันที ่

คาความเปนกรด-ดาง (pH) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

6.25 7.74 7.84 7.57 7.73 7.64 7.59 7.41 7.58 7.41 7.41

6.33 7.35 7.66 7.64 7.61 7.59 7.62 7.69 7.69 7.69 7.66

6.3 7.31 7.74 7.76 7.73 7.61 7.64 7.54 7.72 7.54 7.68

6.29 7.46 7.74 7.65 7.69 7.61 7.61 7.54 7.66 7.54 7.58

72

ตารางที่ 12 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่1  วันที ่

คาความเปนกรด-ดาง (pH) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

6.63 7.80 7.52 7.66 7.6 7.61 7.65 7.44 7.80 7.44 7.82

6.51 7.77 7.44 7.56 7.54 7.60 7.61 6.98 7.65 7.98 7.63

6.58 7.74 7.25 7.64 7.66 7.66 7.68 7.40 7.68 7.40 7.80

6.57 7.77 7.40 7.62 7.6

7.62 7.64 7.27 7.71 7.60 7.75

 

73

ตารางที่ 13 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 2 วันที ่

คาความเปนกรด-ดาง (pH) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

6.48 7.44 7.80 7.69 7.62 7.84 7.64 7.27 7.62 7.27 7.68

6.40 7.87 7.83 7.85 7.81 7.66 7.69 7.40 7.58 7.40 7.64

6.45 7.88 7.69 7.76 7.72 7.67 7.60 7.53 7.66 7.35 7.50

6.44 7.73 7.77 7.76 7.71 7.72 7.64 7.40 7.62 7.34 7.60  

 

 

74

ตารางที่ 14 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 3 วันที ่

คาความเปนกรด-ดาง (pH) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

6.48 7.44 7.80 7.69 7.62 7.84 7.64 7.27 7.69 7.68 7.28

6.40 7.87 7.83 7.85 7.81 7.66 7.69 7.40 7.84 7.63 7.35

6.45 7.88 7.69 7.76 7.72 7.67 7.60 7.53 7.78 7.66 7.54

6.44 7.73 7.77 7.76 7.71 7.72 7.64 7.40 7.77 765 7.39

75

คาอุณหภูมิ (°C) ตารางที่ 15 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดควบคุม

วันที ่

คาอุณหภูมิ (°C) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

34 32 35 36 34 35 40 40 42 40 42

35 31 35 36 34 36 41 41 41 41 42

34 31 36 35 36 36 40 39 41 39 42

34 31 35 35 34 35 40 40 41 40 42

76

ตารางที่ 16 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่1 วันที ่

คาอุณหภูมิ (°C) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

34 32 35 36 34 36 39 39 40 39 40

35 32 36 35 35 35 39 39 41 39 41

34 32 36 36 34 35 40 40 41 40 42

34 32 35 35 34 35 39 39 41 39 41

77

ตารางที่ 17 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 2 วันที ่

คาอุณหภูมิ (°C) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

35 32 36 36 36 36 40 39 42 39 41

34 32 35 36 35 36 39 38 41 38 41

34 31 36 35 35 35 39 40 41 40 40

34 31 35 35 35 35 39 39 41 39 40

78

ตารางที่ 18 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 3 วันที ่

คาอุณหภูมิ (°C) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

34 32 36 35 35 35 41 40 40 40 42

34 32 35 35 36 34 39 40 42 40 41

34 31 35 35 35 35 39 39 41 39 40

34 31 35 35 35 34 40 40 41 40 41

79

การวัดคาความชื้น (Aw)

ตารางที่ 19 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดควบคุม

วันที ่

คาความชื้น (Aw) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

76 88 78 77 78 69 65 67 60 67 61

77 88 79 76 77 68 66 66 61 66 60

77 89 80 76 77 69 66 68 60 68 60

76 88 79 76 77 68 65 67 60 67 60

80

ตารางที่ 20 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 1 วันที ่

คาความชื้น (Aw) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

81 88 82 78 79 68 69 67 63 67 62

85 88 82 79 79 69 65 66 62 66 60

83 89 83 78 77 68 66 67 62 67 60

83 88 82 78 78 68 66 66 62 67 61

81

ตารางที่ 21 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 2 วันที ่

คาความชื้น (Aw) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

77 90 78 76 76 70 65 67 60 67 63

76 89 78 76 76 72 67 68 61 68 61

77 90 79 77 77 71 66 66 61 66 62

76 89 78 76 76 71 66 67 60 67 61

82

ตารางที่ 22 คาการยอยสลายวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 3 วันที ่

คาความชื้น (Aw) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

85 89 82 78 77 69 65 66 62 66 62

84 90 82 79 76 68 66 65 63 65 63

81 89 80 80 76 70 66 65 61 65 62

83 89 81 79 76 69 65 65 62 65 62

  

ภาคภนวก จ

การศึกษาการยอยสลายวัสดทุางการเกษตร

84  

ผลการศึกษาการยอยสลายวสัดุทางการเกษตรของแอคติโนมัยซีทที่คัดแยกได โดยทดสอบการยอยสลายวัสดุทางการเกษตรโดยการชัง่น้ําหนกั

ตารางที่ 23 การยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตร ชุดควบคุม 

วันที ่

น้ําหนกั (กิโลกรัม) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 7 14 23 30

2.0 1.8 1.8 1.7 1.5

2.0 1.7 1.6 1.6 1.6

2.0 1.7 1.5 1.6 1.5

2.0 1.7 1.6 1.6 1.5

ตารางที่ 24 การยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 1

วันที ่

น้ําหนกั (กิโลกรัม) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 7 14 23 30

2.0 1.6 1.6 1.5 1.2

2.0 1.6 1.4 1.3 1.3

2.0 1.7 1.5 1.3 1.3

2.0 1.6 1.5 1.4 1.3

85  

ตารางที่ 25 การยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 2

วันที ่

น้ําหนกั (กิโลกรัม) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 7 14 23 30

2.0 1.7 1.6 1.3 1.0

2.0 1.6 1.4 1.2 1.0

2.0 1.8 1.5 1.3 0.9

2.0 1.7 1.5 1.2 1.0

ตารางที่ 26 การยอยสลายเศษวัสดุทางการเกษตร ชุดทดลองที่ 3 

วันที ่

น้ําหนกั (กิโลกรัม) คาเฉลี่ย ถังหมักที่ 1 ถังหมักที่ 2 ถังหมักที่ 3

0 7 14 23 30

2.0 1.6 1.4 1.3 0.9

2.0 1.7 1.4 1.2 0.9

2.0 1.7 1.5 1.2 0.9

2.0 1.6 1.4 1.2 0.9

ภาคผนวก ฉ การวิเคราะหปริมาณน้าํตาลรีดิวซ ตามวธีิของ Somogyi-Nelson

87  

การเตรียมหัวเชื้อ โดยการนําแอคติโนมัยซีทที่ผานการคัดเลือกขั้นแรกมาเลี้ยงบนอาหาร CMC Agar บมที่ 37 องศาเซลเซียส เมื่อเชื้อเจริญเต็มที่ ใช Cork borer เสนผาศูนยกลาง 5 มิลลิเมตร ฆาเชื้อโดยใชเปลวไฟ เจาะลงโคโลนีของแอคติโนมัยซีทที่เจริญอยูบนอาหาร CMC Agar ถายชิ้นวุนลงในขวดรูปชมพู ขนาด 250 มิลลิลิตร ที่บรรจุอาหารเลี้ยงเช้ือเหลว 0.5% CMC Broth ปริมาตร 5 มิลลิลิตร บมที่อุณหภูมิ37 องศาเซลเซียส บนเครื่องเขยาความเร็ว 200 รอบตอนาทีวันเปนเวลา 3 วัน ใสกลาเชื้อที่เตรียมไว 15 มิลลิลิตร ลงใน 0.5% CMC Broth ปริมาตร 150 มิลลิลิตร สําหรับวัดแอคติวิตีของเอนไซมเซลลูเลสที่ยอยสลาย CMC บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส บนเครื่องเขยาความเร็ว 200 รอบตอนาทีเก็บตัวอยางของสารละลายอาหารเลี้ยงเชื้อทุกวันเปนเวลา 1 สัปดาหไวใชวัดแอคติวิตีของเอนไซมเซลลูเลส การเตรียม Crude enzyme โดยเก็บตวัอยางของสารละลายอาหารเลี้ยง1 มิลลิลิตร มาปนเหวี่ยงแยกตะกอนเซลล ดวยเครื่องปนเหวีย่งความเรว็สูง 4,000 รอบตอ 15 นาที เกบ็สารละลายใส 0.5 มิลลิลิตร ซ่ึงประกอบดวย Crude enzyme ไวใชวัดแอคติวิตีของเอนไซมเซลลูเลส โดยการวิเคราะหปริมาณ น้ําตาลรีดิวซ การวัดแอคติวิตีของเอนไซมเซลลูเลสท่ียอยสลาย CMC (CMCase activity) โดยผสมและบมสารละลายของ Crude enzyme 0.5 มิลลิลิตร กับ 0.5 มิลลิลิตร ของสารละลาย 0.1% CMC ใน 0.2 M acetate buffer บมที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส เปนเวลา 30 นาที หยุดปฏิกิริยาโดยการตมใหเดือด 10 นาที และแชน้ําเย็นจัด 5 นาที และเติมน้ํากลั่น 5 มิลลิลิตรวิเคราะหปริมาณน้ําตาลรีดิวซ โดยการคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 550 นาโนเมตร

88  

ประวัติผูดําเนนิการทดลอง

ชื่อ จามจุรี เกตุบวัขาว วัน เดือน ปเกดิ 12 มีนาคม 2532 ประวัติการศึกษา สําเร็จการศึกษามัธยมศึกษาตอนปลาย โรงเรียนบึงสามพันวิทยาคม ปการศึกษา 2550 สถานที่ที่สามารถติดตอได 3 หมู 5 ตําบลกันจุ อําเภอบึงสามพัน จังหวดัเพชรบรูณ 67160 โทร 089-381425 E-mali address : jamju_ree@hotmail.com ชื่อ ณิชาภา ชมภู วัน เดือน ปเกดิ 5 มีนาคม 2533 ประวัติการศึกษา สําเร็จการศึกษามัธยมศึกษาตอนปลาย โรงเรียนองครักษ ปการศกึษา 2550 สถานที่ที่สามารถติดตอได 26 หมู 1 ตําบลโพธ์ิแทน อําเภอองครักษ จังหวดันครนายก 26120 โทร 082-4682917 E-mali address : jan_tingtong@hotmail.com ชื่อ สุพัตรา ชาวสวน วัน เดือน ปเกดิ 3 มกราคม 2533 ประวัติการศึกษา สําเร็จการศึกษามัธยมศึกษาตอนปลาย โรงเรียนศรีวิชยัวิทยา ปการศกึษา 2550 สถานที่ที่สามารถติดตอได 6 หมู 9 ตําบลทัพหลวง อําเภอเมือง จังหวดันครปฐม 73000 โทร 089-2563278 E-mali address : voicelove_nim@hotmail.com