a brief introduction to molecular systematics
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A Brief Introduction to Molecular Systematics. David S. Horner Dip. Scienze Biomolecolari e Biotecnologie [email protected]. Letteratura consigliata. Phylogenetic analyses: a brief introduction to methods and their application David S Horner and Graziano Pesole † - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
A Brief Introduction to Molecular Systematics
David S. Horner
Dip. Scienze Biomolecolari e Biotecnologie
Letteratura consigliataPhylogenetic analyses: a brief introduction to methods and their applicationDavid S Horner and Graziano Pesole†Expert Rev. Mol. Diagn. 4(3), 339–350 (2004)
Phylogeny for the faint of heart:a tutorialSandra L. Baldauf TRENDS in Genetics Vol.19 No.6 June 2003
Computers are like air-conditioning …
They stop working if you open Windows
ATTENZIONE
“In Biologia Nulla Ha Senso Se Non è Visto da una Prospettiva Evolutiva”
Theodosius Dobzhansky (1900-1975)
(“senza questa prospettiva [la biologia] diventa semplicemente un cumulo di fatti scollegati: alcuni sono interessanti, ma non dipingono insieme un quadro coerente”)
Questa scuola tradizionale era dominante fino agli anni ‘60. È basata sull’assunzione che il modo migliore di ricostruire le relazioni di un gruppo è di studiarlo per tutta la vita.Poi, lo specialista pubblica una filogenesi basata sulle sue impressioni
Ha il vantaggio che genera esperti bravi.Ma ha anche lo svantaggio che non è per niente un approccio oggettivo
I risultati sono poco riproducibili.
Tassonomia evolutiva
Molecole come documenti della storia evolutiva
• “Ci possiamo chiedere dove, nella vita, c’è la quantità più alta di informazione rispetto al passato, e come possiamo estrarla?”
• “Forse nei vari tipi di macromolecole (sequenze) che portano l’informazione genetica”
Emile Zuckerkandl – Linus Pauling
Evoluzione Molecolare• TUTTI le sequenze molecolari (naturali)
sono prodotti di processi evolutivi• Possiamo usare sequenze per inferire
rapporti evolutivi tra sequenze (e tra organismi)
• Se riusciamo capire come costretti selettivi influenzano l’evoluzione di diversi tipi di sequenze (geni codificanti, regione promotrice, “junk DNA” etc), magari potremmo PREDIRE il ruolo svolto da sequenze sotto esame.
Perche ci interessa l’evoluzione molecolare?
• Per capire la storia naturale di organismi e ambienti
• Per identificare e classificare nuove specie• Per capire processi evolutivi• Per la predizione e modificazione di funzione/
specificità di geni/enzimi. • Studi basasti sull’evoluzione molecolare può
aiutarci ad associare i cambiamenti funzionali con le sostituzioni responsabili.
• Sviluppo di medicine/vaccini (selezione)• Biomonitoraggio (ecologia molecolare)
Quale è il più stretto parente dei
“baci di dama” ?
UFO
Gioiellometallaro
Fragola vampira
Space alien
L’omologia è…..
• Omologia: similarita risultando da eredita da un genitore stessa. L’identificazione e l’analisi di omologia sono fundamentale nella sistematica filogenetica.
• 70% homology?
Typical Eukaryote Gene Structure
Eredita dei geni
• Geni vengono ereditati dai genitori• La loro sequenza puo cambiare con tempo
(mutazione)• Cambiamementi possono essere ereditati• A volte, geni vengono DUPLICATI opure PERSI• Nel arco del tempo evolutivo, solo sequenze
“importanti” vengono conservate
• Possiamo applicare il concetto di omologia a geni
• Mutations are random events: their occurrence is independent of their selective value - i.e., they do not occur when they are needed any more often than they would otherwise.
• Mutations at any single locus are rare events: mutation rates at a typical locus are about 1 in 106 gametes.
Some types of mutations.• Substitution: one nucleotide is substituted for
another, frequently this causes no change in the resulting organism, sometimes the change can be dramatic.
• Insertion: DNA is inserted into a gene, either one nucleotide or many. Sometimes, entire genes are inserted by viruses and transposable elements.
• Deletion: DNA bases are removed.• Small insertions and deletions can inactivate large
stretches of a gene, by causing a frame shift that renders a gene meaningless.
• Duplication: an entire gene is duplicated. • Transposition: DNA is moved to a new place in
the genome, frequently this happens because of errors in meiosis or transposable elements.
Meccanismi dell’evoluzione
sostituzioni puntiformi
A
G
T
C
Purine Pirimidine
Tran
sizi
oni
Tran
sizioni
Transversioni
Transizioni vs Transversioni
Le transizioni sono più frequenti delle trasversioni. La frequenza delle mutazioni puntiformi (1 per 10-9 - 10-10 bases incorporate) è molto inferiore di quanto atteso (circa 10-6) a causa dei sistemi di riparazione.
Meccanismi dell’evoluzione
Soppressione di “CpG”
Modificazione “epigenetica” (metilazione) di residui “C” nella dinucleotide “CG” e diffusa in tanti organismi
Il C metilato e sensibile a un processo di “diaminazione” che cambia C>T (U).
Dopo replicazione, se l’errore no e messo a posto da proofreading, succede una transizione in una delle eliche prodotte.
Mutazioni PUNTIFORMI: conseguenze
Dipendono da:1) Regione del gene che viene colpita
(promotore, regioni trascritte non tradotte, regione codificante…)
2) natura della mutazione3) Selezione Naturale
Mutazione e Fissazione
Per essere geneticamente rilevante una mutazione deve essere ereditata, cioè deve avvenire nella linea germinale e diffondersi in una proporzione significativa della popolazione (fissazione).
Nella filogenesi molecolare studiamo mutazioni fissi.
Meccanismi dell’evoluzione
• Mutazione sinonima
• Mutazione missenso (nonsinonima)
• Mutazione nonsenso (nonsinonima)
Indel nella seq. codificante per una proteina
• Mutazione frameshift
La teoria neutrale di Kimura (1968)
• Geni sono stati, in qualche senso, gia “ottimizzati” dal processo evolutivo
• La maggior parte delle nuove mutazioni sono deleterie o neutrale.
• La maggior parte della variazione osservata è neutrale, poichè le mutazioni deleterie vengono rapidamente eliminate.
• Orologio molecolare
• Tomoko Ohta 1973: ha introdotto il concetto di “nearly neutral evolution” (evoluzione quasi neutrale) (mutazioni poco deleterie possono essere fissate nella popolazione).
• Saul G. Needleman – Christian D. Wunsch 1970 Allineamento ottimale di due sequenze omologhe.
• Anni ‘70 - Biologia molecolare “moderna”– Clonaggio di DNA– Sequenziamento di DNA
• Anni ‘80– PCR– micro computer– Primi “Tree of life”
DNA vs Proteins
… Ser Gly Arg His Lys … UCU GGU CGU CAU AAA UCC GGC CGC CAC AAG UCG GGG CGG UCA GGA CGA AGU AGC
Tante sequenze nucleotidiche diverse possono codificare la stessa sequenza proteica
Selezione al livello di DNA.Una stima semplice per sequenze codificante
Per 2 sequenze:
Ka è la proporzione di siti non-sinonimi dove c’e’ stato un sostituzione.
Ks è la proporzione di siti sinonimi dove c’e’ stato un sostituzione.
Se: Ks / Ka >1 ci sono costretti che preventano sostituzioni aminoacidici
Ks / Ka =1 non c’e’ selezione
Ks / Ka <1 c’e’ slezione positiva (cambiamenti vengono seletti)
DNA vs Proteins(A)
GAP of: h2a_hum.seq x h2a_mus.seq February 6, 19102 20:25 ..
Percent Similarity: 86.768 Percent Identity: 86.768
. . . . . 1 ATGTCTGGACGTGGTAAGCAAGGAGGCAAAGCTCGCGCCAAAGCGAAATC 50 ||||| || ||||| |||||||||||||| || |||||||| || || || 1 ATGTCCGGTCGTGGCAAGCAAGGAGGCAAGGCCCGCGCCAAGGCCAAGTC 50 . . . . . 51 CCGCTCTTCTCGCGCTGGTCTCCAGTTCCCGGTGGGCCGAGTGCACCGCC 100 || ||||| || || || || |||||||||||||| || |||||||| | 51 GCGGTCTTCCCGGGCCGGGCTACAGTTCCCGGTGGGGCGTGTGCACCGGC 100 . . . . . 101 TGCTCCGTAAAGGCAACTACGCAGAGCGGGTTGGGGCAGGCGCGCCGGTG 150 |||| || || ||||||||||| ||||| || || || ||||||||||| 101 TGCTGCGGAAGGGCAACTACGCGGAGCGCGTGGGCGCCGGCGCGCCGGTA 150 . . . . . 151 TACCTGGCGGCGGTGTTAGAGTACCTGACCGCCGAGATCCTGGAGCTGGC 200 ||| ||||||||||| | |||||||| || |||||||||||||||||||| 151 TACATGGCGGCGGTGCTGGAGTACCTAACGGCCGAGATCCTGGAGCTGGC 200 . . . . . 201 CGGCAACGCGGCTCGCGACAACAAGAAGACTCGCATCATCCCGCGCCACT 250 ||||||||||| ||||||||||||||||| |||||||||||||||||| 201 GGGCAACGCGGCCCGCGACAACAAGAAGACGCGCATCATCCCGCGCCACC 250 . . . . . 251 TGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGCTCAACAAACTGCTAGGCCGG 300 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| ||| 251 TGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGCTCAACAAGCTGCTGGGCAAA 300 . . . . . 301 GTGACCATTGCTCAGGGCGGCGTCCTTCCTAACATCCAGGCCGTGCTTCT 350 ||||| || || |||||||||||||| || ||||||||||||||||| || 301 GTGACGATCGCGCAGGGCGGCGTCCTGCCCAACATCCAGGCCGTGCTGCT 350 . . . . 351 GCCTAAGAAGACCGAGAGTCACCACAAGGCCAAGGGCAAGTGA 393 ||| |||||||| ||||| ||||| ||||| |||||||||||| 351 GCCCAAGAAGACGGAGAGCCACCATAAGGCGAAGGGCAAGTGA 393
(B)
GAP of: h2a_hum.pep x h2a_mus.pep February 6, 19102 20:25 ..
Percent Similarity: 100.000 Percent Identity: 98.473 . . . . . 1 MSGRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYAERVGAGAPV 50 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 1 MSGRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYAERVGAGAPV 50 . . . . . 51 YLAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGR 100 |:|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||: 51 YMAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGK 100 . . . 101 VTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTESHHKAKGK* 131 ||||||||||||||||||||||||||||||| 101 VTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTESHHKAKGK* 131
DNA : 52 cambiamenti
Protein : 2 cambiamenti
Spinach and Azotobacter ferredoxins
Protein sequence vs structure
1 .AFVVTDNCIKCKYTDCVEV.CPVDCFYEGPNFLVIHPDECID...CALC 45 |: || .. |: ||. || |.: :| .:|.|| :. . 1 XAYKVT....LVTPTGNVEFQCPDDVY.....ILDAAEEEGIDLPYSCRA 41 . . . . . 46 EPECPAQAIFSEDEVPEDMQEFIQLNAELAEVWPNITEKKDPLPDAEDWD 95 :. :...: :..:.: :| |.|:: :.::.|.|. :| |:.|.. . 42 GSCSSCAGKLKTGSLNQDDQSFLD.DDQIDEGWV.LTCAAYPVSDVTIET 89 . 96 GVKGKLQHLER 106 |:.| 90 HKKEELTA... 97
Il grado di conservazione segua l’ordine:
DNA < Sequenze Proteiche
< Struttura Secondaria Proteica
< Struttura Tridimensionale Proteica
DNA vs Proteine
Esiste un orologio molecolare?
• L’idea di orologio molecolare fu inizialmente suggerita da Zuckerkandl e Pauling nel 1962
• Era basata sull’osservazione che i tassi di sostituzione aminoacidica nelle emoglobine animali erano approssimativamente proporzionali alle distanze temporali - stimate dai reperti fossili
• *Stolen from a great site nitro.biosci.arizona.edu/.../Lecture47.html • Although its importance, relative to Darwininan evolution, is debated, this theory is farily well supported by now.
• Rates of molecular evolution vary among proteins, and among organisms. Some proteins allow much less neutral variation, and evolve more slowly.
• Interestingly, population size is not that important for rates of molecular evolution (it cancels out in the math, small populations drift faster, but have fewer mutants per generation)
Non esiste un orologio molecolare universale
• La proposta iniziale vedeva l’orologio come un processo di tipo Poisson con un tasso costante
• Ora si sa che è più complesso. Differenze nel tasso di sostituzione esistono per:– Differenti siti di una stessa molecola – Differenti geni– Differenti regioni dei genomi– Differenti genomi entro una stessa cellula – Differenti gruppi tassonomici analizzati per lo
stesso gene
• Non esiste un orologio molecolare universale
Multi-gene families: Evolution by gene duplication
• Gene duplication is the most important mechanism for generating new genes and new biochemical processes.
This mechanism has facilitated the evolution of complex organisms:
• In the genomes of eukaryotes, internal duplications of gene segments have occurred frequently. Many complex genes might have evolved from small primordial genes through internal duplication and subsequent modification.
• Vertebrate genomes contain many gene families absent in invertebrates.
• Many gene duplications have occurred in the early evolution of animals (“Biology’s Big Bang”, “Cambrian explosion”, ~570-505 million year ago).
A duplication may involve
• a single gene (complete gene duplication)
• part of a gene (internal or partial gene duplication)
• part of a chromosome (partial polysomy)
• an entire chromosome (aneuploidy or polysomy)
• the whole genome (polyploidy)
Types of duplication events
Duplicazioni Geniche
Subito dopo una duplicazione genica, c’e’ una coppia di geni identici….
Cosa può succedere?
Destini dei geni duplicati
• Possono mantenere la stessa funzione e pattern di espressione
• Possono accumulare mutazioni (nella regione codificante o nel promotore) e diventare pseudogeni
Origine di pseudogeni
• Tanti geni duplicati diventano PSEUDOGENI e a volte vengono persi dal genoma.
• PSEUDOGENE : una sequenza di DNA non-funzionale, derivata da un gene funzionale.
• Alcuni pseudogeni hanno una funzione e altri vengono riabilitate.
Origine di subfunzioni:
• I geni derivati dalla duplicazione assumono diversi aspetti della funzione del gene ancestrale
• Tali cambiamenti succedono spesso rapidamente dopo la duplicazione.
Origine di neofunzioni
Cambiamenti funzionali della proteina risultano da sostituzioni nella regione codificante
Pattern diversi dell‘esspresione (diversi tissuti/tempi durante lo sviluppo) risultano da sostituzioni nelle regioni regulatrici.
Ortologhi e paraloghi
a Ab c BC
Gene ancestrale
Duplicazione ci da 2 copie = paraloghi nello stesso genoma
ortologhiortologhi
paraloghi
hanno entrambe l’implicazione di omologia
Ortologia vs Paralogia
Ortologia Sequenze derivate da un gene ancestrale comune dopo un evento di SPECIAZIONE
Paralogia Sequenze derivate da un gene ancestrale comune dopo un evento di DUPLICAZIONE GENICA
Ruolo delle duplicazioni geniche nell‘evoluzione dell‘organismo
• generano nuovo materiale genetico per l‘evoluzione di nuove funzioni/complessità
• duplicazioni specie-specifiche possono permettere l‘evoluzione di funzioni specie-specifiche che possono facilitare l‘adattamento all‘ambiente
• Duplicazioni e generazione di pseudogeni popolazione-specifica contribuiscono all‘isolamento riproduttivo (speciazione)
AGGGCCCTTGAGGGTCCTTGThis is the FIRST substitution eventAGGGCCCTTGAGGGTCCTTGThe SECOND event has a 1/20 chance (in this case), of
occurring at the SAME positionAGGGCCCTTGAGGGGCCTTG
After a Duplication/Speciation
• La saturazione è dovuta a cambiamenti multipli dello stesso sito durante la divergenza (dopo una ramificazione)
• La maggior parte dei dati contiene alcuni siti che evolvono rapidamente e che sono potenzialmente saturati (es. Nelle sequenze codificanti per proteine la terza posizione dei codoni)
• Nei casi più eclatanti i dati diventano essenzialmente casuali e non è possibile rintracciare informazioni circa le relazioni evolutive
Saturazione nei dati di sequenza:
Cambiamenti multipli a un singolo sito - cambiamenti nascosti
G CA G T G
2
3
1
pos 1
pos 2
Numero di cambiamenti
Seq 1 AGCGAGSeq 2 GCCGAC
pos 3C A C
Distanza Genetica
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 0,5 1 1,5 2
Time
Geneti
c D
ista
nce
expected difference
observed difference
La proporzione osservata di cambiamenti non riflette bene il reale numero di cambiamenti evolutivi quando il livello di divergenza è alto.
Saturation
Correction
Introduzione agli alberi filogenetici
Phylogenetic systematics
• Omologia: si riferisce all’evidenza di un progenitore comune (common descent)
• Usa alberi per indicare relazione
• Gruppi monofiletici (clades) - contengono organismi (o sequenze) che sono più strettamente imparentate fra di loro di quanto siano imparentate con altre organismi (o sequenze) al di fuori del gruppo.
Terminologia I
• Node/nodo: un punto di ramificazione su un albero filogenetico
E. coli
Arabidopsis
Riso
Danio
Uomo
Topo
Ratto
Ramo
Nodo
Terminologia II• Taxon: Un livello di classificazione,
una specie, un genere, una famiglia. Usato nella filogenesi molecolare anche per descrivere un OTU.
• OTU (Operational Taxonomic Unit), una “foglia” di un albero filogenetico, può essere una specie oppure una sequenza
E. coli
Arabidopsis
Riso
Danio
Uomo
Topo
Ratto
Ramo
Nodo
Taxon/OTU
Taxon
• Clade/Gruppo monofiletico: un gruppo che contiene tutti gli OTU che sono discesi da un nodo.
• Gruppo parafiletico: un gruppo tassonomico che NON contiene tutti gli OTU che sono discesi da un nodo.
E. coli
Arabidopsis
Riso
Danio
Uomo
Topo
Ratto
Nodo Ancestrale
Clade/Gruppo
monofiletico
I rettili non costituiscono un gruppo strettamente monofiletico. sono PARAFILETICI
Arabidopsis
Topo
Homo
Gecco
Dinosauro
Falcone
Passero Clade?…..SI
Cladogrammi Cladogrammi mostrano l’ordine delle ramificazioni, lunghezze dei rami non significano niente
E. coli
Arabidopsis
Riso
Danio
Uomo
Topo
Ratto
E. coli
Arabidopsis
Riso
Danio
Uomo
Topo Ratto
Filogrammi le lunghezze dei rami indicano il grado di divergenza
E. coli
Arabidopsis
Riso
Danio
Uomo
Topo Ratto
Filogrammi
ACCTC ACGTC
ACGTC ?
G>C?
Difficile sapere la direzione
ACCTC ACGTC
ACCTC ?
C>G ?
OUTGROUP (Scelta)
Una divergenza BASALE al INGROUP
Non TROPPO lontano/divergente
Meglio provare con piu di un outgroup
Alberi e Radici
Riso
Arabdopsis
E. coli
Danio
Ratto
Topo
Homo
Albero non radicato
E.coli OUTGROUP
radice
Danio
Topo
Ratto
Homo
Arabidopsis
RisoGruppo monofiletico
Gruppo monofiletico
Radicato da un“outgroup”
Alberi e Radici
Alberi e Radici
Riso
Arabdopsis
E. coli
Danio
Ratto
Topo
Homo
Albero non radicato
Danio
radice
E. coli
Topo
Ratto
Homo
Arabidopsis
RisoGruppo monofiletico
Gruppo monofiletico
Alberi e Radici
Alberi di geni e alberi di specie
Facciamo spesso l’assunzione che sono la stessa cosa…..
a
b
c
A
B
CAlbero di geni
Albero di specie
Ortologhi and paraloghi
a Ab c BC
Gene ancestrale
Duplicazione ci da 2 copie = paraloghi nello stesso genoma
ortologhiortologhi
paraloghi
Ortologhi and paraloghi
ChimpA* HomoA TopoA
Gene ancestrale
Duplicazione ci da 2 copie = paraloghi nello stesso genoma
ortologhiortologhi
paraloghi
ChimpB HomoB*TopoB*
Ortologhi and paraloghi
ChimpA* HomoA TopoA
Gene ancestraleDuplicazione ci da 2 copie = paraloghi nello stesso genoma
ortologhiortologhi
paraloghi
ChimpB HomoB*TopoB*
Pesce
Ortologhi e paraloghi
UomoTopoChimp
Un albero che contiene una selezione non completa di paraloghi e ortologhi
Pesce
hanno entrambe l’implicazione di omologia
Ortologia vs Paralogia
Ortologia Sequenze derivate da un gene ancestrale comune dopo un evento di SPECIAZIONE
Paralogia Sequenze derivate da un gene ancestrale comune dopo un evento di DUPLICAZIONE GENICA
L’albero filogenetico questo gene contiene un misto di ortologhi e
paraloghi
Salmonella
Danio 1
Ratto 1
Topo 1
Homo 1
Topo 2
Ratto 2
Homo 2
E.coli
Solanum tuberosum
Brassica
Riso
Gene duplication
POLITOMIA
L’albero filogenetico di questo gene contiene un misto di ortologhi e
paraloghi
Salmonella
Danio 1
Ratto 1
Topo 1
Homo 1
Topo 2
Ratto 2
Homo 2
E.coli
Solanum tuberosum
Brassica
Riso
Gene duplication
Danio 2?
Numero di alberi distinti in funzione del numero di
taxa
10 2*106
22 3*1023
50 3*1074
100 2*10182
1000 2*102860
N taxa N trees
Phylogenetic systematics
• Omologia: si riferisce all’evidenza di un progenitore comune (common descent)
• Usa alberi per indicare relazione• Gruppi monofiletici (clades) - contengono
organismi (o sequenze) che sono più strettamente imparentate fra di loro di quanto siano imparentate con altre organismi (o sequenze) al di fuori del gruppo.
Newick Format((A,B),(C,D));
A
B
C
D
A B C D
Multifurcazioni
((A,B,C),(D,E));
DCA BE
Lunghezza di Rami
((A:1,B:1):2,(C:2,D:1):3):0;=
A B
C
D
1 1
23
12