CORSO DI BIOCHIMICA PER C T F Programma aa 2006/2007Prof.ssa Eufemi Margherita

CONCETTI GENERALILa cellula e le sue parti. Liquidi biologici :composizione e caratteristiche chimiche, pH e sistemi tampone del sangue. Pressione osmotica.

STRUTTURA DELLE PROTEINEPanoramica sulle funzioni delle proteine. Gli amminoacidi delle proteine: struttura, simbologia, proprietà generali, proprietà acido-base, pKa dei gruppi ionizzabili, pI, chiralità degli aminoacidi, proprietà chimiche delle catene laterali degli aminoacidi. Reazioni caratteristiche degli aminoacidi. Metodi di separazione e di analisi degli aminoacidi. Struttura primaria delle proteine. Il gruppo peptidico: legame peptidico e conformazioni dello scheletro polipeptidico, angoli di torsione φ e ψ. Diagramma di Ramachandran. Strutture secondarie: α elica e foglietto β (parallelo e antiparallelo), regioni loop. Motivi strutturali (strutture supersecondarie): elica-loop-elica, forcina b, motivo a chiave greca, motivo α-β-α, dito di Zn, cerniera di leucine. Le proteine fibrose: α-cheratina, fibroina dela seta, collagene, elastina. Struttura terziaria e struttura quaternaria. Proteine del sangue: Immunoglobuline classificazione e struttura. Proteine globulari: I domini delle proteine globulari. Interazioni stabilizzanti e destabilizzanti nelle proteine: tipi di interazioni e residui amminoacidici coinvolti. Effetto idrofobico. I ponti disolfuro. Il folding delle proteine: denaturazione, agenti denaturanti e rinaturazione, il paradosso di Levinthol e concetto di disordine intrinseco come domino di identificazione proteica. Il folding in vivo: chaperon molecolari. Tipi di chaperonine. Metodi di analisi e purificazione delle proteine: tecniche cromatografiche ed elettroforetiche, metodi di determinazione del peso molecolare. Idrolisi enzimatica e chimica per la determinazione della struttura primaria. Modificazioni post-traduzionali delle proteine.

LE PROTEINE CHE TRASPORTANO L'OSSIGENOII gruppo eme. Ruolo fisiologico dell’ Emoglobina e Mioglobina, struttura e funzione. Curve di dissociazione dell'ossigeno: confronto tra mioglobina ed emoglobina. Emoglobina: affinità per l'ossigeno e per il CO. Cooperatività del legame con l'ossigeno e regolazione allosterica. Effetto Bohr. Effetto del 2,3-bisfosfoglicerato. Emoglobina fetale. Metaemoglobina. Trasporto della CO2. Emoglobine patologiche.

GLUCIDIFunzioni dei glucidi. Classificazione. Monosaccaridi: configurazione e conformazione. Derivati ossidati degli aldosi (acidi aldarici, uronici  e onici -acido ascorbico-). Amminozuccheri, acido sialico e sialoglicoproteine. Disaccaridi riducenti e non riducenti. Il legame glucosidico. Forme attivate dei monosaccaridi. Polisaccaridi: cellulosa, chitina, amido, glicogeno. Mucopolisaccaridi e mucopolisaccaridosi, eparina. Glicoproteine. Proteoglicani. Glicolipidi. I carboidrati come marcatori di superficie e recettori di segnali molecolari.

LIPIDI E MEMBRANE BIOLOGICHERuoli biologici dei lipidi: ruoli strutturali, ruoli energetici, ruoli funzionali (precursori di ormoni, tensioattivi, secondi messaggeri). Classificazione dei lipidi. Cere, triacilgliceroli, acidi grassi saturi e insaturi, glicerofosfolipidi, sfingolipidi, terpeni (steroli e colesterolo), altri derivati dell'unità isoprenica attivata (Vitamine A, D, E, K, ubichinone, dolicoli). I lipidi come segnali intracellulari (diacilglicerolo e ceramide) ed extracellulari (eicosanoidi). Architettura delle membrane biologiche: il modello a mosaico fluido e (lipid rafts). Fluidità delle membrane biologiche: effetto dei doppi legami e del colesterolo. Proteine di membrana: integrali, periferiche, proteine GPI modificate.

ENZIMI - PRINCIPI DI CATALISITermodinamica delle reazioni: variazione di energia libera e costante di equilibrio. Velocità di reazione e stato di transizione (equazione di Arrhenius: ΔG di attivazione).  Classificazione degli enzimi. Catalisi non covalente: generale acido-base, elettrostatica, per solvatazione, da ione metallico (carbossipeptidasi A). Catalisi covalente elettrofila (base di Schiff ed enzimi TPP) e nucleofila. Modelli: chiave-serratura, adattamento indotto, legame non produttivo, trappola entropica, tensione e distorsione, stato di transizione. Proteasi: classi ed esempi. Le proteasi a serina: esempi, meccanismo di reazione, specificità, attivazione degli zimogeni. Anticorpi catalitici. Ribozimi.

ENZIMI - CINETICA ENZIMATICA - LE EQUAZIONI FONDAMENTALITerminologia: velocità di reazione (v), velocità iniziale (v0), costanti di velocità (k), costanti di equilibrio (K, di dissociazione e di associazione), dimensioni delle costanti, attività enzimatica e velocità, attività enzimatica specifica. La base sperimentale dell'equazione di Michaelis-Menten: variazione di v0 rispetto alla concentrazione dell'enzima, variazione di v0 rispetto alla concentrazione di substrato. Cinetica di saturazione: equazione e grafico. I modelli interpretativi dell’equazione sperimentale: il modello di Michaelis-Menten. Significato dei parametri cinetici: KM, Vmax e kcat. Effetto del pH sull'attività enzimatica. Effetto della temperatura. Rappresentazione grafica dei dati e determinazione dei parametri cinetici: equazione e grafico di Lineweaver-Burk.

ENZIMI - INIBITORI E REGOLAZIONEInibitori reversibili: competitivi, acompetitivi, misti e non competitivi. Determinazione grafica del tipo di inibizione e della Ki. Esempi di inibitori competitivi: metotrexato, statine, prodotti di reazione. Inibitori irreversibili (inattivatori): inibitori diretti al sito e inibitori suicidi. Esempi di inibitori irreversibili: 5-F-uracile, inibitori dei gruppi tiolici (sonde catalitiche). Controllo della quantità e dell’attività degli enzimi. Tipi di regolazione enzimatica. Regolazione allosterica. Cooperatività: modello concertato e modello sequenziale. Attivatori e inibitori allosterici.

INTRODUZIONE AL METABOLISMOGeneralità sul metabolismo. Vie cataboliche, anaboliche e anfiboliche. Stato stazionario e stato di equilibrio. Reazioni limitanti e velocità complessiva di una via metabolica: tappe controllate dal substrato e tappe controllate dall’enzima. Criteri di spontaneità delle reazioni (ΔG = ΔH - TΔS). Processi catabolici e processi biosintetici. Additività delle ΔG e accoppiamento delle reazioni. ATP: struttura, proprietà, tipo di reazioni ATP-dipendenti. Carica energetica della cellula. Metastabilità dell'ATP. Le vie di sintesi dell’ATP: fosforilazione ossidativa e fosforilazione a livello del substrato. Composti ad elevato potenziale di trasferimento del fosfato. Composti ad "alta energia". Vitamine idrosolubili e liposolubili. Coenzimi e vitamine. Coenzima A, reattività dei tioesteri. NADH: reazioni "solite" (deidrogenazioni) e "insolite" (adenilazioni, ADP-ribosilazioni). NADPH: ruolo, distribuzione cellulare, confronto con il NADH. FAD, FMN e flavoproteine. Altri coenzimi derivanti da vitamine: lipoammide, piridossal fosfato, S-adenosil-metionina, tetraidrofolato, biotina, tiamina pirofosfato, coenzima B12, metil-cobalamina. Acido ascorbico.

GLICOLISIReazioni ed enzimi della glicolisi. Meccanismo di reazione della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi. Regolazione della glicolisi: enzimi regolatori e loro modulatori. Il fruttoso-2,6-bisfosfato e l'enzima tandem chinasi-fosfatasi. Sintesi del 2,3-bisfosfoglicerato. Fosforilazioni a livello del substrato. Destino del piruvato. Fermentazione lattica e alcolica. Metabolismo degli esosi diversi dal glucosio: fruttosio e galattosio.

CICLO DELL'ACIDO CITRICO

II complesso della piruvato deidrogenasi: reazioni, enzimi e coenzimi. Fonti e destini metabolici di acetil CoA. Reazioni ed enzimi del ciclo. Sintesi del GTP: una mini-fosforilazione ossidativa . Termodinamica ed enzimi regolatori regolazione. Ruolo catabolico e biosintetico del ciclo di Krebs. Reazioni anaplerotiche. Collegamento tra il ciclo di Krebs e le altre vie metaboliche. Il ciclo del gliossilato.

TRASPORTO DEGLI ELETTRONI E FOSFORILAZIONE OSSIDATIVAPotenziali redox e termodinamica delle reazioni di ossidoriduzione. I quattro complessi della catena respiratoria e i siti di accoppiamento. Ubichinone, citocromo c e altri citocromi, centri FeS, coenzimi flavinici. I fornitori di elettroni all'ubichinone. NADH-coenzima Q reduttasi (complesso I), succinato-coenzima Q reduttasi (complesso II), coenzima Q-citocromo c reduttasi (complesso III) e ciclo Q, citocromo c ossidasi (complesso IV). Sintesi dell'ATP: ipotesi chemiosmotica. Cicli redox e pompe protoniche. Struttura e funzione dell'ATP sintasi. Accoppiamento tra flusso degli elettroni e fosforilazione ossidativa. Il disaccoppiamento. Inibitori della catena respiratoria. Sistemi navetta per il trasporto degli elettroni del NADH citosolico. Citocromo c  e apoptosi.

VIA DEI PENTOSO FOSFATIGeneralità e confronto con la glicolisi. Corredo enzimatico della via dei pentoso fosfati: fase ossidativa e fase non ossidativa. Transchetolasi e transaldolasi. Fonti di NADPH alternative alla via dei pentosi: enzima malico. NADPH e glutatione reduttasi. Favismo e altre carenze di glucoso-6-fosfato deidrogenasi.

METABOLISMO DEL GLICOGENOStruttura e funzione del glicogeno. Demolizione del glicogeno: scissione fosforolitica, enzimi deramificanti. Fosfoglucomutasi e destino del glucoso-6-fosfato. Sintesi del glicogeno da UDP-glucoso. Sintesi dell'UDP-glucoso: ruolo della pirofosfatasi inorganica. Enzima ramificante. Il glicogeno come forma vantaggiosa di immagazzinamento del glucosio. Regolazione del metabolismo del glicogeno: fosforilazione/defosforilazione e modulazione allosterica della glicogeno fosforilasi e della glicogeno sintasi. Cascata di reazioni mediata dall'AMP ciclico (AMPc). Struttura e funzioni della fosforilasi chinasi. Il calcio e la calmodulina. Esempi di integrazione tra modulazione allosterica e modulazione per fosforilazione/defosforilazione.

GLUCONEOGENESI II glucosio da precursori non glicidici. Confronto tra glicolisi e gluconeogenesi. La piruvato carbossilasi (biotin-enzima): localizzazione, meccanismo di reazione e regolazione da acetil-CoA. Trasporto dell'ossalacetato dal mitocondrio al citosol. Gli enzimi "peculiari" della gluconeogenesi: PEP-carbossichinasi, fruttoso-l,6-bisfosfatasi e glucoso-6-fosfatasi. Il ciclo di Cori.

METABOLISMO LIPIDICO - GLI ACIDI GRASSIDegradazione e sintesi dei triacilgliceroli nel duodeno, negli adipociti e nel fegato. Destino metabolico di glicerolo e acidi grassi. Degradazione degli acidi grassi. Attivazione degli acidi grassi e trasferimento nella matrice mitocondriale (struttura e ruolo della carnitina). La β-ossidazione: reazioni, enzimi e coenzimi. Ossidazione degli acidi grassi a catena dispari di atomi di carbonio: la carbossilasi biotina-dipendente e la mutasi coenzima B12-dipendente. Degradazione degli acidi grassi in gliossisomi e perossisomi. I corpi chetonici: funzione, biosintesi e degradazione.Sintesi degli acidi grassi: confronto con la β-ossidazione. Trasporto di equivalenti di acetil-CoA dal mitocondrio al citosol: ruolo del citrato e dell'enzima malico. La acetil-CoA carbossilasi: confronto con altri biotin-enzimi. Reazioni della sintesi degli acidi grassi. Organizzazione strutturale della acido grasso sintasi animale. Allungamento della catena degli acidi grassi. Desaturazione degli acidi grassi. Le prostaglandine. Regolazione della sintesi degli acidi grassi: da disponibilità di metabolici, allosterica, ormonale. Fosfosforilazione e defosforilazione dell'acetil-CoA carbossilasi.

METABOLISMO LIPIDICO - I LIPIDI DI MEMBRANA E IL COLESTEROLOBiosintesi di fosfolipidi e triacilgliceroli da acidi grassi, glicerolo e diidrossiacetonfosfato. Ruolo dei CDP-derivati. Sintesi degli sfingolipidi. Le lipoproteine. Colesterolo e suoi derivati: ormoni steroidei (glucocorticoidi, mineralcorticoidi, sessuali), acidi biliari, vitamina D3. Meccanismo d'azione degli ormoni steroidei. La prenilazione delle proteine: le Ras-farnesil transferasi.

METABOLISMO DEGLI AMMINOACIDIDestino metabolico degli amminoacidi: amminoacidi glucogenici e chetogenici. Deamminazione per transamminazione: meccanismo catalitico. Altre reazioni PLP-dipendenti. Deamminazione ossidativa: la glutamico deidrogenasi. Ruolo catalitico dell'α-chetoglutarato. Eliminazione dell'azoto: organismi ammoniotelici, uricotelici e ureotelici. Ciclo dell'urea: reazioni ed enzimi. Sintesi mitocondriale del carbammilfosfato: meccanismo, ruolo dell'ATP. Sintesi dell'argininsuccinato: meccanismo, ruolo dell'ATP. Collegameno tra il ciclo dell'urea e il ciclo di Krebs. Compartimentazione cellulare e regolazione del ciclo. Biogenesi dell'azoto organico: glutammato deidrogenasi, glutammina sintetasi. Amminoacidi essenziali e non essenziali. Il metabolismo delle unità monocarboniose: i derivati del tetraidrofolato e la S-adenosil metionina. La metilcobalamina. Schema generale del metabolismo delle unità monocarboniose. Biosintesi della tirosina dalla fenilalanina: ruolo della biopterina. Fenilchetonuria e alcaptonuria. Sintesi delle catecolammine.Biomolecole da amminoacidi (strutture, funzioni e aspetti biosintetici comuni): glutatione, istamina, serotonina, GABA, catecolammine, ormoni della tiroide, forma poliglutammica dell'acido folico.

METABOLISMO DEI NUCLEOTIDIFunzioni dei nucleotidi. Struttura di nucleotidi, nucleosidi, basi puriniche e pirimidiniche. Aspetti generali del metabolismo dei nucleotidi: vie de novo e vie di recupero. Il 5-fosforibosilpirofosfato (PRPP), metabolita chiave delle vie biosintetiche dei nucleotidi. Confronto tra le vie biosintetiche dei nucleotidi purinici e pirimidinici. Origine degli atomi degli anelli purinico e pirimidinico. AMP e GMP da IMP. Formazione dei deossiribonucleotidi: la ribonucleotide reduttasi. Timidilato sintasi: meccanismo di reazione, inibitori, associazione funzionale con la diidrofolato reduttasi.

VIE DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE Segnali molecolari e sistemi interpretativie: generalità, recettori di membrana e recettori nucleari. Proteine G: proprietà generali e classi. Proteine Ras. Proteine G eterotrimeriche:  struttura, classi, ciclo funzionale, cascate inibitorie e stimolatorie dell'AMPc, adenilato ciclasi, fosfodiesterasi, proteina chinasi A, tossine. Cascata del PIP2. Recettori-enzimi. Guanilato ciclasi di membrana e solubile. RTKs (receptors tyrosine kinases). Recettore dell'insulina e simili. Gli oncogèni e gli oncosoppressori.

STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICIBasi puriniche e pirimidiniche di DNA e RNA: forme tautomeriche e loro attitudine alla formazione di legami H. Differenze "chimiche" tra DNA e RNA. Basi modificate. La struttura a doppia elica del DNA. Regola di Chargaff. Appaiamenti standard tra le basi, appaiamenti fra tautomeri rari, impilamento delle basi, solchi maggiore e minore. DNA B, A e Z. Forze che stabilizzano la doppia elica del DNA. Denaturazione del DNA. Temperatura di fusione: dipendenza dalla percentuale di G--C.