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Método de inhibición inmunoturbidimétrica para la de-terminación cuantitativa de HbA1c

HbA1c

SIGNIFICACION CLINICALa diabetes mellitus es una enfermedad crónica, que com-prende un conjunto de desórdenes del metabolismo de loshidratos de carbono que cursan con una manifestación co-mún: la hiperglicemia.El control glicémico periódico permite prevenir los trastornosagudos y reducir el riesgo de las complicaciones tardías de laenfermedad (retinopatía, nefropatía, neuropatía y enfermeda-des cardiovasculares).La relación entre el desarrollo y progresión de las complica-ciones microvasculares y el control glicémico ha sido debati-da por muchos años, en parte debido a los métodos inade-cuados para realizar un control glicémico retrospectivo. Losmétodos tradicionales de medición de glucosa en sangre yorina tienen un valor limitado para este propósito, y sólo fuecon el desarrollo de determinaciones para proteínas glicosila-das o glicadas, que se ha logrado un conocimiento exacto yobjetivo del estado glicémico a largo plazo.Las glicohemoglobinas, también llamadas hemoglobinas gli-cosiladas o glicadas, fueron descritas por primera vez en 1968por Rahbar como "hemoglobinas diabéticas". Su produccióndepende de la concentración de glucosa y ocurre a través deun proceso no enzimático post-traduccional llamado glicación,donde el azúcar es unido a los grupos amino de las molécu-las de hemoglobina (Hb). La glicación de los aminoácidos N-terminales de las cadenas α y β como así también los gruposε-amino de los residuos de lisina en la molécula de hemoglo-bina, resultan en una variedad de hemoglobinas glicadas, in-cluyendo HbA1c, que es la especie glicosilada en la valina N-terminal de la cadena β.Los niveles de %HbA1c son proporcionales a la concentra-ción de glucosa en sangre durante las últimas 6-8 semanas.Así, la determinación de %HbA1c provee un parámetro inte-gral para monitorear el curso del control de glucosa a largoplazo.

FUNDAMENTOS DEL METODOHbA1c Turbitest AA es un método de inhibición inmunoturbi-dimétrica para determinar la concentración de hemoglobinaA1c (HbA1c) como un porcentaje de la hemoglobina total ensangre entera humana (%HbA1c). Para ello, es necesario li-berar la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos, me-diante la hemólisis de la muestra. La sangre del paciente sepone en contacto con el Reactivo Hemolizante que contie-ne un detergente (bromuro de tetradeciltrimetilamonio - TTAB)que lisa los glóbulos rojos específicamente. A partir del hemo-lizado obtenido, se determina mediante dos reacciones inde-pendientes, el nivel de HbA1c y Hb de la muestra.

HbA1cDurante la primera fase de la reacción, la HbA1c de la mues-tra reacciona con el anticuerpo específico anti-HbA1c (Reac-tivo A1), formando complejos solubles. Dado que la moléculade HbA1c posee un solo epitope por β-globina para la fijacióndel anticuerpo específico, no pueden formarse redes de inmu-nocomplejos.Con la adición del polihapteno (Reactivo A2), que posee nu-merosos epitopes por molécula, se produce la reacción dedichas moléculas con el exceso de anticuerpo específico dela primera reacción, dando lugar a inmunocomplejos insolu-bles que pueden ser medidos turbidimétricamente a 340 nm.De esta manera, cuanto mayor es el contenido de HbA1c dela muestra, menor es la formación de inmunocomplejos inso-lubles y menor la señal turbidimétrica obtenida.

HbLa hemoglobina liberada al hemolizar la muestra, es converti-da en un derivado que puede ser medido espectrofotométrica-mente (Reactivo B).

Este método es capaz de detectar todas las variantes de he-moglobina glicadas en la porción N-terminal de la cadena β,cuya región reconocida por el anticuerpo es idéntica a laHbA1c. De esta manera permite controlar el estado metabóli-co del diabético con hemoglobinopatías y uremia.

REACTIVOS PROVISTOSHbA1c:A1. Reactivo A1: anticuerpos monoespecíficos anti-HbA1c enbuffer pH 6,2.A2. Reactivo A2: polihapteno-HbA1c en buffer pH 6,2.

Hb:B. Reactivo B: buffer fosfato pH 7,4.

Calibradores 1, 2, 3 y 4: hemoglobina humana liofilizada con-teniendo TTAB 9 g/l con distintos niveles de glicación: nivel 1(Calibr. 1), nivel 2 (Calibr. 2), nivel 3 (Calibr. 3) y nivel 4 (Calibr.4). La concentración (variable lote a lote) figura en el rótulo.

REACTIVOS NO PROVISTOS- Reactivo Hemolizante, de Wiener lab.- Agua desmineralizada.- Solución fisiológica.

INSTRUCCIONES PARA SU USOReactivos A1, A2 y B: listos para usar.Reactivo Hemolizante: listo para usar.Calibradores 1, 2, 3 y 4: abrir los viales retirando el tapón de

LINEA TURBITEST AA

C

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goma lentamente para evitar pérdida del material liofilizado.Agregar la cantidad de agua desmineralizada indicada en elrótulo, tapar y mezclar por inversión suave, evitando la forma-ción de espuma. Dejar reposar 30 minutos antes de usar.Los Calibradores no requieren tratamiento previo con el Reac-tivo Hemolizante.

PRECAUCIONESLos Reactivos Provistos son para uso diagnóstico "in vitro".El detergente TTAB es irritante. R36/38: irrita los ojos y lapiel. S24/25: evítese el contacto con los ojos y la piel. S37/39: usar guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.Los Calibradores han sido preparados a partir de material noreactivo para HBsAg, HCV y HIV. Sin embargo, los Calibrado-res y todas las muestras deben manipularse como si se tra-tara de material infectivo.Utilizar los reactivos guardando las precauciones habitualesde trabajo en el laboratorio de química clínica.Todos los reactivos y las muestras deben descartarse deacuerdo a la normativa local vigente.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOLos Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC)hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No conge-lar.Reactivos A1, A2 y B: una vez abiertos se recomienda con-servar los reactivos en refrigerador (2-10oC) bien cerrados. Nocongelar.Calibradores 1, 2, 3 y 4: una vez reconstituidos son esta-bles 8 horas a temperatura ambiente (15-25oC), 2 días refrige-rados (2-10oC) o 3 meses congelados (-20oC). Se recomiendaque los calibradores sean alicuotados y congelados inmedia-tamente después de su reconstitución.Reactivo Hemolizante: estable en refrigerador (2-10oC) has-ta la fecha de vencimiento indicada en él rótulo. Evitar conta-minaciones (no introducir pipetas u otros elementos en suinterior) y cerrar el frasco luego de su uso.

MUESTRASangre entera anticoaguladaa) Recolección: obtener la muestra de la manera usual.b) Aditivos: se recomienda el uso de heparina o EDTA (Anti-coagulante W de Wiener lab) como anticoagulante.c) Sustancias interferentes conocidas: no se observan interfe-rencias por bilirrubina (conjugada y no conjugada) hasta 40 mg/dl,triglicéridos hasta 13 g/l, ácido ascórbico hasta 50 mg/dl y fac-tor reumatoideo hasta 500 U/ml.Deberán interpretarse con cuidado los valores de %HbA1cobtenidos en aquellas patologías o situaciones que alteran lavida media de los eritrocitos, como anemias hemolíticas, ane-mias ferropénicas, transfusiones, pérdidas de sangre, etc.Referirse a las bibliografías de Young para los efectos de lasdrogas y las enfermedades en el presente método.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: lamuestra es estable 3 días a temperatura ambiente (15-25oC),7 días refrigerada (2-10oC) o 6 meses congelada (-20oC). Sólopuede ser descongelada una vez.

PREPARACION DE LA MUESTRAPermitir que el Reactivo Hemolizante tome temperaturaambiente antes de usar. Homogeneizar la muestra de san-gre por inversión repetida, evitando la formación de espu-ma. En un tubo de Kahn o hemólisis, agregar:

Reactivo Hemolizante 1000 ul

Muestra 10 ul

Mezclar, agitando por inversión repetida o bien emplearvortex. Evitar la formación de espuma. Después del cam-bio de color rojo a marrón verdoso (1-2 minutos), la mues-tra hemolizada podrá ser empleada.

Estabilidad de muestras hemolizadas: estables 4 ho-ras a temperatura ambiente (15-25oC), 24 horas refrigera-das (2-10oC) o 6 meses congeladas (-20oC). Sólo puedenser descongeladas una vez.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Analizador automático.- Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.- Tubos de Kahn o hemólisis.

CONDICIONES DE REACCIONParámetros generales para analizadores automáticos:

Nombre del test HbA1c

Tipo de reacción punto finalLong. de onda primaria 340 nmTemperatura 37oCVolumen de muestra 10 ulVolumen de Reactivo A1 250 ulVolumen de Reactivo A2 50 ulIncubación de Reactivo A1 300''Incubación de Reactivo A2 300”Calibración 5 puntosCalibradores 0*, 1, 2, 3 y 4

Nombre del test Hb

Tipo de reacción punto finalLong. de onda primaria 570 nmLong. de onda secundaria 660 nmTemperatura 37oCVolumen de muestra 20 ulVolumen de Reactivo B 230 ulIncubación de Reactivo B 300''Calibración 2 puntosCalibradores 0* y 1

*Como "0" (Calibrador cero) puede utilizarse solución fisioló-gica o Reactivo Hemolizante.Los volúmenes de muestra y reactivos pueden variarse pro-porcionalmente, sin que se alteren los factores de cálculo.Solicitar adaptaciones para los analizadores comercializadospor Wiener lab. Las adaptaciones no provistas por Wienerlab. deben ser validadas.

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CALCULO DE LOS RESULTADOSEl %HbA1c puede ser calculado a través de dos procedimien-tos distintos:1) Según IFCC:

HbA1c (g/dl)%HbA1c = x 100

Hb (g/dl)

2) Según DCCT/NGSP:

HbA1c (g/dl)%HbA1c = 91,5 x + 2,15

Hb (g/dl)

METODO DE CONTROL DE CALIDADHbA1c Control normal-patológico Turbitest AA.Los controles no requieren tratamiento previo con el ReactivoHemolizante.

VALORES DE REFERENCIAPersonas con metabolismo sano:1- Según IFCC: 2,9-4,2% de HbA1c2- Según DCCT/NGSP: 4,8-5,9% de HbA1cEn base a los estudios de DCCT y UKPDS se considera queniveles mayores a 7% de HbA1c se asocian a mayor riesgode complicaciones crónicas.En general se recomienda que cada laboratorio establezcasus propios intervalos de referencia, dentro de su poblaciónde pacientes.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.Los componentes del kit HbA1c Turbitest AA son lote-espe-cíficos por lo que no pueden intercambiarse con otros lotes.Se recomienda realizar una recalibración completa, cuandose cambia de lote de reactivo o cuando el control de calidadasí lo determina.Este método fue diseñado para informar %HbA1c, por lo que nodeben ser informados por separado los valores de HbA1c y Hb.Para preservar la integridad de los reactivos debe evitarse todotipo de contaminaciones, empleando para la medición única-mente micropipetas perfectamente limpias y secas.

PERFORMANCEa) Reproducibilidad: fue evaluada a través del protocolo EP5-A de CLSI. Para ello se procesaron en Konelab 60i, 3 mues-tras con niveles diferentes de HbA1c, obteniéndose los si-guientes resultados:

Precisión intraensayo

HbNivel D.S. C.V.

12,1 g/dl 0,10 g/dl 0,9 %13,6 g/dl 0,07 g/dl 0,5 %12,1 g/dl 0,06 g/dl 0,5 %

HbA1c0,40 g/dl 0,011 g/dl 2,8 %0,86 g/dl 0,016 g/dl 1,9 %1,25 g/dl 0,016 g/dl 1,3 %

%HbA1c5,2 g/dl 0,09 g/dl 1,7 %7,9 g/dl 0,11 g/dl 1,4 %11,6 g/dl 0,13 g/dl 1,2 %

Precisión total

HbNivel D.S. C.V.

12,1 g/dl 0,15 g/dl 1,2 %13,6 g/dl 0,13 g/dl 1,0 %12,1 g/dl 0,16 g/dl 1,3 %

HbA1c0,40 g/dl 0,022 g/dl 5,5 %0,86 g/dl 0,023 g/dl 2,7 %1,25 g/dl 0,033 g/dl 2,7 %

%HbA1c5,2 g/dl 0,17 g/dl 3,4 %7,9 g/dl 0,16 g/dl 2,1 %11,6 g/dl 0,27 g/dl 2,3 %

b) Límite de detección: es la mínima cantidad del analitocapaz de ser detectada como una muestra distinta de cero.HbA1c: 0,1 g/dlHb: 0,1 g/dlc) Rango de medición de HbA1c: se pueden obtener valo-res de HbA1c entre 0,3 g/dl y la concentración del calibradormás alta, que corresponde a un rango dinámico aproximadode 2 a 16% de %HbA1c según IFCC y de 4 a 17% segúnDCCT/NGSP, considerando un nivel de Hb normal (15 g/dl).Si la concentración de HbA1c es menor a 0,3 g/dl, se aconsejahemolizar la muestra original 1 + 50 (ej. 10 ul + 500 ul) con elReactivo Hemolizante y repetir las determinaciones de HbA1cy Hb, no requiriendo corrección de los resultados obtenidos.Si la concentración de HbA1c es mayor a la concentracióndel calibrador más alta, se aconseja diluir el hemolizado1+1 o hemolizar la muestra original 1 + 200 con el ReactivoHemolizante y repetir las determinaciones de HbA1c y Hb,no requiriendo corrección de los resultados obtenidos.d) Rango de medición de Hb: 6 a 30 g/dl.

PRESENTACION1 x 50 ml Reactivo A1

1 x 10 ml Reactivo A2

1 x 50 ml Reactivo B4 viales Calibradores (1-4) x 2 ml(Cód. 1999700)







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Wiener lab. provee separadamente:Reactivo Hemolizante: 1 x 500 ml (Cód.1999701)

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Group - N. Engl. J. Med. 329:977 (1993).- UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group - Lancet

352:837 (1998).- Sacks, D. et al - Clin. Chem. 48:436 (2002).- Weykamp C.W. et al - Clin. Chem. 41:82 (1995).- Sacks, D. - Clin. Chem. 49:1245 (2003).- Martina, W. et al - Clin. Chem. 39:2259 (1993).- Karl, J. et al - Klin. Lab. 39:991 (1993).- American Diabetes Association - Diabetes Care [Supl] 24/1

(2001).- John, G. - Clin. Chem. Lab. Med. 41:1199 (2003).- Jeppsson, J. et al - Clin. Chem. Lab. Med. 40:78 (2002).- Jarausch, J. et al - Clin. Chem. 42:116 (Abstract 094) (1996).- Junge, W. et al - Poster presentation 18th International Dia-

betes Federation Congress, Paris 2003.- Tietz Textbook of Clinical Chemistry - Burtis, C.; Ashwood,

E. (5ª Ed.) WB Saunders, 2001.- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests",

AACC Press, 5th ed., 2000.- Young D.S. - "Effects of Disease on Clinical Laboratory

Tests", AACC Press, 4th ed., 2001.- CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute (ex-NCCLS)

- Protocols EP5-A, 1999 / EP17-A, 2004.

2000 Rosario - Argentina

Wiener lab.M Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Autorizado A.N.M.A.T.Cert. Nº: 5302/05

SIMBOLOSLos siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reac-tivos para diagnóstico de Wiener lab.

CEste producto cumple con los requerimientos previs-tos por la Directiva Europea 98/79 CE de productossanitarios para el diagnóstico "in vitro"

P Representante autorizado en la Comunidad Europea

V Uso diagnóstico "in vitro"

X Contenido suficiente para <n> ensayos

H Fecha de caducidad

l Límite de temperatura (conservar a)

No congelar

F Riesgo biológico

Volumen después de la reconstitución

Contenido Cont.

g Número de lote

M Elaborado por:

NocivoXn

Corrosivo / Caústico

IrritanteXi

i Consultar instrucciones de uso

CalibradorCalibr.

Controlb

b Control Positivo

c Control Negativo

h Número de catálogo

�

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