6.crecimiento microbiano

Unidad 3. Nutrición, metabolismo, crecimiento y control de microorganismos

Objetivos• Conocer

-Las características de los principales grupos nutricionales de microorganismos, su crecimiento y control-Las diferentes aplicaciones de la microbiología

-Las peculiaridades metabólicas de los microorganismos y su diversidad

-Las pautas del crecimiento microbiano y los factores que lo influyen

-Los agentes antimicrobianos más comunes y sus mecanismos de acción• Asimilar

-El mantenimiento adecuado de cultivos puros de microorganismos solo es posible con la práctica de técnicas asépticas

-El metabolismo microbiano es enormemente versátil y plástico• Capacidad

-Prepara cultivos y manejar varias técnicas de esterilización

-Realizar técnicas básicas de recuento de bacterias

-Aislar microorganismos

-Actualizar su formación y necesidades en microbiología a través del manejo herramientas bioinformáticas

Modelos basado en datos aéreos indican que si la pandemia de gripe que surgió en Hong Kong en 1968 apareciese en el año 2000, daría la vuelta al globo mucho antes. Una vacuna tarda en prepararse unos 9 meses si se incuba en huevos.

Science, Vol 306, Issue 5695, 392-394 , 15 October 2004

Unidad 3. Nutrición, metabolismo, crecimiento y control de microorganismos

Capítulo 6. Crecimiento microbiano: La curva de crecimiento, parámetros de crecimiento, determinación del crecimiento. Cultivos continuos. Influencia de los factores ambientales (solutos, pH, temperatura, O2, presión y radiación). Crecimientos de los microorganismos en ambientes naturales

El crecimiento microbiano se define como un aumento de los constituyentes celulares que puede dar como resultado:-un aumento en el número de células

ej.: cuando el microorganismos de reproduce por gemación o fisión binaria-aumento en el tamaño de la célula

ej.: los microorganismos cenocíticos llevan a cabo divisiones del núcleo que no van acompañadas de división celular

En microbiología se estudia frecuentemente el crecimiento de la población en lugar del crecimiento de células individuales

se observa cuando los microorganismos son cultivados en un medio discontinuo (batch) (o sistema cerrado: cultivo en un recipiente cerrado en el que no se regenera el medio)

generalmente se representa como el logaritmo del número de células frente al tiempo

se diferencian cuatro fases distintas

La curva de crecimiento

no aumenta

velocidad máxima de división y crecimiento de la población

cesa el crecimiento de la población

disminuye el tamaño de la población

Fase lag

Fase exponencial (log)

Fase estacionaria

Fase de muerte


Crecimiento equilibrado• los componentes celulares se sintetizan a una velocidad constante unos con

respecto a otros

– ej.: durante la fase exponencial de crecimiento

Crecimiento no equilibrado• la velocidad de síntesis de los componentes celulares varia de forma relativa (unos

componentes respecto a otros)

• tiene lugar en una gran variedad de condiciones ej.: modificaciones en los niveles de nutrientes (de un medio pobre a un medio rico o de un medio rico a uno pobre) o cambios en las condiciones ambientales

Efecto de la concentración de nutrientes en el crecimiento


Fase Lag• las células sintetizan nuevos componentes

– ej.: material ya presente que se deba reponer o aumentar en concentración– ej.: material, no existente anteriormente, empleado para adaptarse al medio o

nuevas condiciones de crecimiento• duración variable: en algunos casos es muy corta y en otros está ausente

Fase exponencial (ó logarítmica)

las células se dividen y doblan su número a intervalos regulares


Ejemplo de crecimiento exponencial

• la velocidad de crecimiento es constante

• en esta fase la población es más uniforme desde el punto de vista químico y propiedades físicas

Fase estacionaria• el número total de células viables permanece constante

– puede ser que células metabólicamente activas dejen de reproducirse– puede ser que la velocidad de división sea la misma que la de muertePosibles razones que determinan la entrada a la fase estacionaria• limitación, carencia, de nutrientes

• disponibilidad de oxígeno limitada

• acumulación de productos tóxicos

• densidad poblacional crítica

Respuesta de los microorganismos a las carencias de nutrientes• cambios morfológicos. Ej.: formación de endosporas• disminución del tamaño, contracción del protoplasto y condensación del nucleoide• producción de proteínas específicas de situaciones de carencia. Ej.: Factores sigma• supervivencia alargo plazo• aumento de la virulencia

Fase de muerte• La muerte celular se define como la pérdida irreversible de la capacidad de dividirse

• las células se mueren exponencialmente

• el algunos casos la velocidad de muerte es lenta debido a la acumulación de células resistentes


Parámetros de crecimiento• La fase lag y la fase estacionaria se caracterizan por su duración que se calcula a través de la intersección con la otras fases

Parámetros del crecimiento

Duración de la fase lag

• La estimación de la fase lag es muy importante en microbiología de alimentos ya que puede determinar el tiempo de caducidad de un producto

Duración de la fase lag


La fase exponencial se caracteriza por:

• su duración

• el tiempo medio de generación o duplicación (g)

– tiempo necesario para que la población doble su tamaño

• la velocidad específica máxima de crecimiento ó constante de velocidad de crecimiento ó constante de crecimiento (abreviada como k ó µ)

– proporción en la que aumenta la población por unidad de tiempo

• frecuentemente también se expresa el crecimiento como generaciones por hora

Durante el crecimiento exponencial las células se dividen y doblan su número a intervalos regulares

Durante el crecimiento exponencial la velocidad de crecimiento (dN/dt) es constante a los largo del tiempo:


ln Nt- ln N0 =k.t y ln Nt= ln N0 +k.t

dN/dt=k.NIntegrando esta función obtenemos

Como el número de células en un tiempo t es:

Nt = N0 ek.t

La constante de crecimiento “k” se puede estimar de la pendiente que se obtiene al representar el logaritmo natural (ln) del número de células frente al tiempo. Si se emplea logaritmo en base 10 (log10) en lugar de ln, la pendiente es 2.3 veces más pequeña que la constante de crecimiento real)

El tiempo de duplicación o generación “g” es cuando Nt= 2N0, entonces:

2 N0 = N0 ek.g g = ln2/k= 0.69/k

Nota: El contenido del Prescott puede llevar a error ya que define la constante de crecimiento o velocidad media de crecimiento como el número de generaciones por unidad de tiempo, es decir, el inverso del tiempo de generación. En la representación logarítmica en base 10 que se muestra arriba, logN = N0+k.t. Como la derivada de logN es (dN/N).loge, la de la constante es cero y la de “t” es “dt” estonces (dN/N).loge= k.dt y la velocidad de crecimiento (dN/dt) es:dN/dt= k.t/log e por eso la pendiente es 2.3 veces más pequeña que la constante de crecimiento real

Durante el crecimiento exponencial la representación del ln del número de células frente al tiempo da lugar a una recta. Por consiguiente:


ln Nt=a+k.t

dN/dt=k.N

Derivando esta función obtenemos la función que define las variaciones infinitesimales del número de células a lo largo del tiempo

O lo que es lo mismo

Siendo “a” y “k” constantes

El tiempo de duplicación o generación “g” es cuando Nt= 2N0, entonces:

2 N0 = N0 ek.g g = ln2/k= 0.69/k

dN/N=k.dtDefinimos dN/dt como la velocidad de crecimiento.k es la constante de crecimiento y representa la proporción más probable a la que se incrementa la población por unidad de tiempo

En la ecuación original (ln Nt=a+k.t ) se observa que cuando el tiempo es cero a=lnN0. Por lo tanto podemos reescribir la ecuación como

ln Nt=lnN0+k.t, siendo N0 el número inicial de células. La misma ecuación se puede reescribir como Nt = N0 ek.t. Con ella es sencillo calcular el tiempo de generación (g), tiempo al cual la población se incrementa de N0 a 2N0.

Y si en lugar de representar lnN vs. t representamos lgN vs. t, ¿qué pasaría?

dN/(N.ln10)=k.dt

dN/dt= k.ln10.N

lg Nt=a+k.t

k ya no representa la proporción más probable a la que se incrementa la población por unidad de tiempo. El incremento de población es k.ln10.


El tiempo de generación varía mucho de unas especie a otras

Determinación del crecimiento microbiano

Determinación del número de células (recuento)• Recuento directo de células

– cámaras de recuento• fácil, barato y rápido• sirve para eucariotas y procariotas• no diferencia células vivas y muertas

– contadores electrónicosUna suspensión de microorganismos se pasa por un pequeño orificio a través del cual circula una corriente eléctrica que es interrumpida a medida que pasan los organismos

• no diferencia vivas de muertas

• rápido y fácil• útil con grandes microorganismos (no procariotas)

– sobre filtros de membrana• se filtran las células sobre una membrana y se tiñen con fluorescencia• útil para contar bacterias

• con algunos marcadores pueden diferenciarse células vivas de muertas

Determinación del crecimiento

Cámaras de recuento

• puede ser medido como el cambio en el número de individuos de una población, recuento de células

• o como los cambios en la masa de una población

• Recuento directo de células (continúa)

– Citometría de flujoLas células se tiñen con un marcador fluorescente (salvo que

tengan fluorescencia intrínseca) y se pasan por un capilar muy fino sobre el que inciden dos haces de luz láser uno de ellos permitirá medir la dispersión de luz (relacionada con el tamaño de las partículas) y otra excitará el marcador fluorescente

– es caro– puede diferenciar especies y células vivas y muertas– puede diferenciar células vivas y muertas

Ej.: el análisis combinado de la luz dispersada y la emisión natural de fluorescencia de los pigmentos fotosintéticos del fitoplacton permite diferencias a Synechococcus (puntos verdes) Prochlorococcus (puntos rojos) y algas eucariotas (puntos azules). Los puntos fucsia son marcadores de tamaño.


Recuento de células viables•recuento en placa

• permite medir el número de células viables en un medio determinado

• el tamaño de la población se expresa como unidades formadoras de colonias (CFU)

• simple y sensible

• ampliamente usado en el recuento de microorganismos viables en alimentos agua y suelo

• los resultados pueden ser imprecisos si las células se agregan o agrupan (en filamentos, por ejemplo) y varias células dan lugar a una colonia


se siembran diluciones (en profundidad o por extensión) en un medio sólido adecuado

se incuba y se cuenta el número de colonias

se calcula el número de células en la población

Recuento de células viables (Continúa)

•Método de filtración en membrana:•concentra las células•mide el número de células viables•elimina inhibidores presentes en el medio en el que están suspendidas•muy útil para analizar muestras acuáticas


Determinación de la masa de la población• Peso seco

– laborioso y no muy sensible

• Cuantificación de un componente o sustancia celular

– ej.:, proteína, DNA, ATP o clorofila

– útil si la cantidad de componente o sustancia en cada célula es constante

• determinación turbidométrica (dispersión de luz)

– rápida, fácil y sensible

más células

más luz dispersada

menos luz detectada


En un intervalo* se cumple la ley de Lambert-Beer

A=ε•c•l

* Según los espectrofotómetros, el intervalo de absorbancia en el que la relación es lineal varía de 0,2 -0,6 a 0,1-0,9. Fuera de ese intervalo es conveniente diluir la muestra

Cultivo continuo de microorganismos• crecimiento en un sistema abierto

– se realiza un suministro constante de nutrientes

– se realiza una eliminación continua de residuos

• mantiene las células en fase logarítmica/exponencial a una concentración constante de biomasa durante largos periodos de tiempo

• esto se logra empleando un sistema de cultivo continuo– Quimiostatos– Turbidostatos

El quimiostato

• la velocidad a la que se añade el medio fresco al cultivo es igual que la velocidad a la que se elimina el medio del cultivo

• un nutriente esencial está en cantidades limitantes

Cultivos continuos

Velocidad de dilución y crecimiento microbianovelocidad de dilución – velocidad a la que el medio fresco fluye hacia el cultivo (mL/h) relativa al volumen del cultivo (mL)

Observa que: •la densidad celular se mantiene en un amplio intervalo de velocidades de dilución •el quimiostato funciona mejor a bajas velocidades de dilución

Cultivos continuos

Velocidad de dilución

Val

or m

edid

o

No olvidéis

El turbidostato

• regula el flujo de medio de cultivo fresco al recipiente del cultivo de forma que se mantiene una turbidez o densidad celular constante

• la velocidad de dilución es variable

• no hay nutrientes limitantes

• el turbidostato funciona mejor a elevadas velocidades de dilución

Importancia de los métodos de cultivo continuos

• se puede obtener un suministro constante de células creciendo en fase exponencial a una velocidad conocida

• se puede estudia el crecimiento de microorganismos a muy baja concentración de nutrientes, próxima a la encontrada en ambientes naturales

• se puede estudiar la interacción de microorganismos bajo condiciones parecidas a las encontradas en medios acuáticos

• fundamentales en biotecnología y microbiología industrial y de los alimentos

Cultivos continuos Turbidostato

Influencia de los factores ambientales en el crecimiento• la mayor parte de los microorganismos crecen bajo condiciones ambientales moderadas

• algunos microorganismos son extremófilos: crecen en condiciones que serían letales para la mayoría del resto de los microorganismos

Solutoscantidad de agua disponible para los organismos

disminuye por la interacción con moléculas de soluto (efecto osmótico)

a mayor [soluto] menor aw

disminuye por la adsorción a superficies (efecto matriz)

Influencia de los factores ambientales (solutos, pH, temperatura, O2, presión y radiación)

Actividad del agua (aw)

Límites inferiores de actividad del agua para el crecimiento microbiano

Organismos osmotolerantes

• crecen en un amplio intervalo de actividades de agua• muchos emplean solutos compatibles para aumentar su concentración

osmótica interna– solutos que son compatibles con el metabolismo y el crecimiento

• algunos contienen proteínas y membranas que requieren una concentración de solutos elevada para su estabilidad y actividad

• Organismos halófilos ej.: Halobacterium– requiere elevados niveles de NaCl para crecer

Salinas con un afloramiento (bloom) de Halobacterium. El color se debe a la bacteriorodopsina


pH

• logaritmo negativo de la concentración de H+

• acidófilos

– crecimiento óptimo entre pH 0 y pH 5.5

• neutrófilos

– crecimiento óptimo entre pH 5.5 y pH 7

• alcalófilos

– crecimiento óptimo entre pH8.5 y pH 11.5


• la mayoría de los acidófilos y alcalófilos mantienen un pH interno próximo a la neutralidad– para ello, algunos organismos emplean mecanismos de intercambio de

protones/iones• algunos sintetizan proteínas de protección

– ej.: proteínas de estrés ácido (acid-shock proteins)• algunos microorganismos modifican el pH de su hábitat produciendo productos de

desecho ácidos o básicos– la mayoría de los medios contienen tampones para evitar la inhibición del crecimiento

Temperatura• Los microorganismos muestran temperaturas de crecimiento mínimas, máximas y óptimas• Según la temperatura óptima los microorganismos se clasifican en psicrofilos, psicrotrofos, mesófilos, termófilos e hipertermófilos


Concentración de oxígeno

Fundamento de la respuesta diferencial al oxígeno


O2, crecimiento microbiano y su relación con las actividades enzimáticas superóxido dismutasa (SOD) y catalasa

• El O2 se reduce fácilmente a productos tóxicos– Radical superóxido (O2+ 1e–O2• –)– Peróxido de hidrógeno (O2 •–+1e–+2H+H2O2)– Radical hidroxilo (H2O2+ 1e–+1H+H2O+OH •)

• Los organismos aerobios sintetizan enzimas protectores

– superoxido dismutasa (SOD)

2O2 •–+2HO2+H2O2

– catalasa2H2O22H2O + O2

Positiva NegativaPrefiere O2 Indiferente al O2 El O2 es tóxico < 2 – 10% O2Necesita O2

Una vez preparado, en el agar tioglicolato se desarrolla un gradiente estable de oxígeno, con una alta concentración de oxígeno en la superficie y ausencia de oxígeno en la base. Los microorganismos desarrollan diferentes pautas de crecimiento según su relación con el oxígeno. Los aerobios estrictos solo crecen en la superficie del agar (Af, Alcaligenes faecalis; Pf, Pseudomonas fluorescens). Los anaerobios aerotolerantes crecen a igual velocidad a lo largo del tubo (Lp. Lactobacillus plantarum). Los anaerobios facultativos crecen en todo el tubo pero más junto a la superficie (Se, Staphylococcus epidermidis; Ea, Enterobacter aerogenes). Los anaerobios estrictos crecen solo en el fondo del tubo.


Qué relación tienen estos microorganismos con el oxígeno


Presión• organismos barotolerantes

– un aumento de presión les afecta negativamente pero no tanto como a los no tolerantes

• organismos barofílicos

– necesita o crece más rápidamente en presencia de altas presiones


RadiaciónDaños por radiación

• radiación ionizante

– Rayos X y rayos gamma

– provocan mutaciones muerte

– rompe la estructura química de muchas moléculas incluyendo el DNA

• el daño puede ser reparado mediante mecanismos de reparación de ADN

• radiación ultravioleta (UV)

– provocan mutaciones muerte

– provoca la formación de dímeros de timina en el DNA

– El DNA dañado puede ser reparado según dos mecanismos

• fotorreactivación – los dímeros se rompen en presencia de luz

• reactivación en oscuridad – los dímeros se rompen y reparan en ausencia de luz

• luz visible

– altas intensidades generan oxígeno singlete (1O2) (agentes oxidantes muy potentes

– pigmentos carotenoides

• protege a numerosos microorganismos de la fotooxidación


Crecimientos de los microorganismos en ambientes naturales

• los ambientes microbianos son complejos, constantemente cambiantes y puede exponer un microorganismo a gradientes solapados de nutrientes y factores ambientales

Factores limitantes del crecimiento

• Ley del mínimo de Leibig

– la biomasa total está determinada por el nutriente presente a menor concentración

• Ley de la tolerancia de Shelford

– por encima o debajo de algunos límites ambientales, un microorganismo no crecerá, independientemente del nutriente suministrado

Recuento de microorganismos viables pero no cultivables• en condiciones de estrés los microorganismos pueden perder temporalmente la

capacidad de crecer en medios de cultivo normales

• el 90 % de los microorganismos no crecen en medios de cultivo normales (comerciales)

• se han desarrollado métodos microscópicos e isotópicos para el recuento de organismos viables no cultivables

Crecimientos de los microorganismos en ambientes naturales

• quorum sensing

– promueve la comunicación microbiana, la cooperación y sincronización

– implica la secreción y detección de señales químicas

Sensación de Quorum (Quorum Sensing) y las poblaciones microbianasCrecimientos de los microorganismos en ambientes naturales

Luminiscencia de Vibrio fischeri

Erwinia carotovora

Agrobacterium tumefaciens

Pseudomonas aeruginosa

Vibrio fischeri

6.crecimiento microbiano

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