5skyrius223-308psl

5. FUNKCINĖ GENOMO SANDARA IR GENŲ RAIŠKOS VALDYMAS. TRANSKRIPCIJOS KODAS

AUGALŲ GENETIKA | 223

I I I D A L I S 5. Funkcinė genomo sandara ir genų raiškos valdymas.

Transkripcijos kodas

PAGRINDINĖS SĄVOKOS – žodynėlis

Operonas – sutelktų vienoje vietoje struktūrinių genų grupė, kuri turi bendras val-dymo sekas ir nuo kurių nurašoma viena bendra pre-RNR.

Regulonas – retokai vartojamas terminas apibūdinti priešingą operonui genų val-dymo būdą: genai išsibarstę po chromosomas, bet turi tapačius cis elementus ir valdomi tų pačių transkripcijos veiksnių. • cis-veiksnys (elementas) – DNR nukleotidų seka, kuri valdo geno

raišką tik būdama cis padėtyje (toje pačioje chromosomoje). • trans-veiksnys (baltymas, RNR) – difuzinis veiksnys, kuris reguliuo-

ja geno veiklą, jį koduojantis genas nesusietas su cis padėtimi, ga-li būti bet kurioje chromosomoje.

Transkripcijos veiksnys – baltymas, kuris reguliuoja geno raišką, atpažindamas ir jungdamasis su savitais cis elementais.

Promotorius – reguliacinė geno dalis, nuo kurios priklauso, kada, kuriose ląstelėse ir kuriomis aplinkybėmis veikti genui, pagrindinė cis elementų susitel-kimo vieta. – promotoriaus šerdis (iki „─“50−100 bp nuo transkripcijos starto

vietos „+1“) – sritis, prie kurios jungiasi transkripcijos pradžios kompleksas ir per jį RNR polimerazė.

– savitas promotorius − būdingas žinomiems genams, ląstelėms, au-diniams ir pan.

Konstitucinis genas – pastoviai veikia visose augalo ląstelėse.

Adaptacinis genas – jo raišką sužadina įvairūs vidiniai ir išorės veiksniai.

Savitas audiniams – jis pasireiškia tik tam tikrose ląstelėse, augalo audiniuose: – organų tapatumo genas – lemiantis organo raidą; – pagrindinis kontrolės (master) genas – kontroliuoja dideles genų grupes; – miR genas – koduoja mikro RNR (miRNR), kurios kaip ir transk-

ripcijos veiksniai valdo genus, bet po geno transkripcijos.

Reporteris – genas, kurio koduojamą produktą lengva aptikti ląstelėje; paprastai jo koduojanti dalis prijungiama prie savito promotoriaus, taip nusta-toma geno raiškos vieta ir laikas.

224 |

Ortologai – genai, kurie lemia tą pačią funkciją ir yra kilę iš vieno bendro protėvio.

Paralogai – genai, atsiradę dėl duplikacijų, bet įgiję funkcinio savitumo to paties augalo genome, sudaro šeimas pagal bendrą kilmę, DNR homologi-ją ir koduojamus baltymo domenus, kartotines aminorūgščių sekas.

Raidos (organų tapatumo) genai – reguliuoja konkrečius raidos etapus ir organus: • ABCDE – genų klasės ir tvarka, kuria pasireiškia žiedo ir sėklap-

radžio organų tapatumo genai; • Žydėjimo pradžios genai skirstomi į genus, kurie kontroliuoja skir-

tingus žydėjimo pradžios kelius: autonominio kelio genai – suderina visų žydėjimo kelių genų

raišką, žiedo meristemos raidą, žiedo organų raidos pra-džią;

fotoperiodizmo genai – priklauso nuo periodinių apšvietimo sąlygų kitimų – diena/naktis trukmės ir atitinkamo ilgio di-enų skaičiaus;

vernalizacijos genai – tokia pati priklausomybė nuo šaltų die-nų skaičiaus;

giberelino kelio genai – reguliuojami giberelinų ir auksinų, pri-klauso nuo bendros organizmo fiziologinės būsenos ir tin-kamų žydėjimui aplinkos sąlygų.

Cirkadinio ritmo genai – susieti su diena/naktis cirkadiniu ritmu, gali būti iki trečda-lio augalo genų: – šviesos jutiklių (fotoreceptorių) genai – koduoja fitochromus (Phy),

kriptochromus (Cry), fototropinus (Pho) ir kt., jais priimami švie-sos signalai.

Centrinis osciliatorius – savitų genų reguliuojama kilpa (ratas), nuo kurios priklauso visi kiti cirkadinio ritmo genai, tarp jų ir fotosintezės, žydėjimo pra-džios, yra keletas papildomų kilpų, kuriomis įnešamos pataisos dėl temperatūros, šviesos intensyvumo ir kt.

Signalo molekulių genai − koduoja signalo molekules, kuriomis signalai plazmodezmo-mis (ląstelės sienelės kanalėliais) ir indų sistema (karniena ir mediena) išnešiojami po visą augalą arba į tam tikrą augalo dalį, pvz., augimo kūgelį. Genai koduoja hormonus, signalo polipeptidus, transkripci-jos veiksnius ir kitus baltymus, miRNR: • florigenas – pernešamas žydėjimo pradžios signalas (ne genas, o

baltymas arba RNR), pasigamina lapuose, pernešamas į augimo kūgelį, kad ten susidarytų žiedyno/žiedo meristemos;

• sisteminis (bendrasis) atsakas nulemiamas genų, kurių koduojamos signalo molekulės išplatinamos po visą augalą;



sisteminis įgytas atsparumas (SAR) – augalo atsakas į patogeno invaziją, kurį lemia PR-genai, signalas apie patogeną per-duodamas bent trim keliais: salicilo rūgšties, jazminų rūgš-ties/etileno ir signalinių lipidų;

hiperjautrus atsakas (HR) – lokalus atsakas į patogeno invazi-ją, numatytos ląstelių žūties (apoptozės) forma, signalas iš-platinamas tik nedidelėje ląstelių grupėje, signalą perduoda R-baltymai, HR trukdo patogenui plisti po augalą.

R-genai – koduoja apsauginius/signalo baltymus, kurie lemia atsparumą (avirulen-ciją, avr) patogeno rasei, dažniausiai turi LRR ir proteinkinazės do-menus, sąveikauja su WRKY šeimos transkripcijos veiksniais.

PR-genai – koduoja augalo apsauginius baltymus nuo patogeno ir įvairių stresus sukeliančių veiksnių, labai mišri grupė.

Elicitorius – patogeno kilmės medžiaga (membranos dalis, baltymas ir kt.), suke-lianti augalo atsaką į patogeną: juo paveikus, galima tirti augalo reak-ciją į patogeną, nekrečiant pačiu patogenu.

Transkriptas – nuorašas nuo geno transkribuojamosios dalies: – pre-RNR – pirminė RNR, kurios nukleotidų seka atitinka geno

transkribuojamosios dalies nukleotidų seką, – subrendusi RNR – galutinė RNR po visų modifikavimų.

RNR redagavimas – potranskripcinis RNR modifikavimas, kai įterpiami arba paša-linami pavieniai nukleotidai arba jų sekos.

Splaisingas – vienas pagrindinių geno raiškos reguliavimo būdų po transkripcijos: iš pre-RNR pašalinami intronai, o egzonai sujungiami į vieną ben-drą grandinę: – alternatyvusis splaisingas – skirtingų RNR susidarymas iš pre-RNR:

nepašalinami intronai(as) arba pašalinami egzonai(as); – trans-splaisingas – hibridinių RNR susidarymas, kai susijungia eg-

zonai iš skirtingų transkriptų. Splaisingo mutacijos – mutacijos, keičiančios splaisingo eigą

– intronų mutacijos – mutacijos intronuose, gali pasireikšti ir stam-biais fenotipo pokyčiais, jeigu tai mutacijos svarbių splaisingui sekų arba reguliacinių elementų, kurie yra intronuose.

SR-baltymai – vieni pagrindinių splaisingo ir augalų potranskripcinės genų raiškos reguliavimo baltymų (turi motyvą, kuriame gausu serino ir arginino).

RNR kodas (RNR operonas) – visuma RNR ir baltymų sąveikų su RNR, kurios val-do geno raišką po transkripcijos. Panašiai kaip transkripcijos veiks-niai jungiasi su savitomis DNR nukleotidų sekomis, taip yra balty-mai, kurie jungiasi su savitomis RNR sekomis.

226 |

Heterogeninė branduolio RNR – bendra RNR masė, kurią sintetina RNR II polime-razė, tik nedidelė jos dalis virsta realiai veikiančia subrendusia RNR (iš čia RNR operonas).

Egzonas – RNR seka, kuri paprastai lieka subrendusioje RNR po splaisingo, išim-tys dėl mutacijų ir alternatyviojo splaisingo.

Intronas – RNR seka, kuri pašalinama iš pre-RNR vykstant splaisingui, introno ri-bas žymi dinukleotidai 5´-GU- ...−AG-3´, išimtys dėl tų pačių prie-žasčių kaip egzono.

Splaisosoma – mažųjų branduolio RNR (U1-6) ir baltymų kompleksas, kuris vykdo splaisingą.

Egzosoma – baltymų kompleksas, kuris suskaido nekokybiškas ar nereikalingas RNR – branduolyje arba citoplazmoje.

Proteosoma – baltymų kompleksas, kuris suskaido nekokybiškus arba nereikalingus baltymus. Jeigu tai buvo baltymai-represoriai, aktyvinami visi jų nu-slopinti genai.

Kodai: • Genetinis kodas – koduoja aminorūgščių vietą ir seką polipeptide; • RNR kodas – koduoja geno ir genų visumos raišką po transkrip-

cijos (žr. aukščiau); • Histonų (chromatino) kodas – savitas histonų ir DNR modifikavi-

mas, nuo kurio priklauso chromatino sandara ir aktyvumas lo-kuse, vienas iš būdų reguliuoti geno raišką laike, erdvėje ir genų orkestre.

Transkripcijos kodas – suderinta genų raiška transkripcijos metu, transkripcijos vietos, laiko ir trukmės nustatymas. Platesne prasme vienija visus būdus regu-liuoti geno raiškos vietą, laiką ir trukmę, derinius su kitais genais.

5.1. Genai erdvėje ir laike

Kelias į transkripcijos kodą. Kaip ne kartą jau minėta, „namų ūkio, apyvokos“ genai pasireiškia visą laiką, o „prabangos“ genai − tik tam tikru laiku. Kaip valdoma genų veikla erdvėje ir laike, yra viena sudėtingiausių genetikos problemų. Šis klausimas ypač svarbus daugialąsčiams sudėtingos sandaros organizmams, kokie yra augalai. Daug kartų įsitikinta, kad net tuose pačiuose augalo audiniuose skirtingu metu veikia skirtingos genų grupės, kad ir endosperme vieni genai veikia visą laiką, kiti, pvz., PHERES ar DEMETER, labai trumpai.

Pagal pasireiškimo pobūdį genai skirstomi į dvi (ar net tris) grupes. • Konstituciniai genai veikia pastoviai, visą laiką. Tai ląstelės ir augalo gyvybines

funkcijas, pvz., kvėpavimą nulemiantys genai. Tad, kaip minėta, ši grupė dar vadinama „namų ūkio, apyvokos“ genais.

Ne visą laiką veikiantys, „prabangos“ genai yra dvejopi.



• Adaptaciniai genai lemia prisitaikymą prie aplinkos veiksnių. Dažniausiai jie pasireiškia tik tol, kol veikia juos sužadinęs aplinkos veiksnys. Augalui, kurio visas gyve-nimas glaudžiai susietas su aplinkos veiksniais, tai labai svarbu, todėl intensyviai tiriama genų grupė. Augalas negali nei palaikyti pastovios vidinės aplinkos, nei ,,pabėgti“ nuo nepalankių aplinkos ir biotinių veiksnių. Paprastai aplinkos veiksnys sužadina tam tikrą, savitą genų grupę, koduojančią atsaką į biotinį ar abiotinį aplinkos veiksnį. Dėl šios prie-žasties dažniausiai genai/baltymai įvardijami atsaką sukėlusio veiksnio vardu: šiluminio šoko, sausros, abscizo rūgšties ar auksino ir pan. atsako genai/baltymai.

• Saviti audiniams genai pasireiškia tik konkrečiuose audiniuose arba organuo-se, lemia ląstelių diferenciaciją ir audinių/organų raidą. Tai genai, kurių raiška būdinga tik toms ląstelėms, kurios yra specializuotos, diferencijuotos savitai sandarai ar funkcijai. Augalų diferencijuotos ląstelės, o kartu ir jų genomas dažniausiai išsaugo visą pradinę genetinę informaciją, yra totipotencinės (genetiškai visavertės). Tokios ląstelės gali dedife-rencijuotis ir įgyti naują raidos programą. Ir šiems įvykiams turi būti saviti genai. Prisi-minkime somatinę embriogenezę (3.2; 3.3.2 sk.), androgenezę (3.3.3 sk.) ar apomiksę (žr. 3.6 sk.).

Kaip somatinė ląstelė sugeba keisti somatinės ląstelės genetinę programą į gemalo raidos programą yra vienas labiausiai intriguojančių klausimų. Pagal žurnalą „Science“, tai viena svarbiausių mokslo problemų apskritai, kuri turėtų būti išspręsta XXI amžiuje.

Kas yra normalusis (laukinis) tipas? Genų skirstymo į konstitucinius ir adap-tacinius – savitus audiniams sąlygotumas. Dar Žakobas (F. Jacob) ir Mono (J. Monod), kurie pirmieji įvedė genų skirstymą į konstitucinius ir adaptacinius, nustatė, kad šias geno savybes gali keisti mutacijos, ir adaptaciniai genai dėl mutacijų gali virsti pastoviai veikiančiais, konstituciniais.

Gana dažnai atranka mutacijas „įteisina“ kaip normalųjį-laukinį tipą. Jos tampa tak-sono skiriamuoju požymiu. Prisiminkime:

– sudėtingus zigomorfinius didžiojo žioveinio (Antirrhinum majus) žiedus. Paaiškėjo, kad jie atsiradę dėl dviejų dominuojančiųjų genų Cyc ir Dich, paprastam žiedui at-sirasti būtinos recesyviosios šių genų mutacijos (dvigubas mutantas);

– gametofito ir gemalo maišelių įvairovę; – skirtingas dviejų vairenio rūšių Arabidopsis thaliana ir A. lyrata dauginimosi siste-

mas: savidulke A. thaliana tapo dėl mutacijos SRK (S-receptorinės proteinkina-zės) gene;

– įvairius apomiksės tipus; – greitą nereikalaujančią vernalizacijos vairenio Columbia (Col) ir Landsberg erecta

(Ler) raidą, atsiradusią dėl dviejų genų mutacijų, dėl ko šie ekotipai taip populia-rūs mokslo laboratorijose.

Keliais režimais veikiantys genai. Daug genų veikia ne vienu, o dviem ar daugiau režimų: kaip konstituciniai (dažniausiai silpniau) ir indukuoti įvairių veiksnių: aplinkos (kaip atsakas) ir vidinių (kitų genų produktų, pvz., transkripcijos veiksnių). Ke-liuose genų orkestruose genas dalyvauja ir kokiu būdu jis pasireiškia yra istorinė geno ypatybė, atsiradusi dėl mutacijų ir rekombinacijos. Individualus ir geno įsitraukimo į or-kestrą laikas. Bet visa tai yra suderinta. Yra ir dirigentai. Kas ,,diriguoja“ genams, kaip priimamos komandos, vienas svarbiausių šios knygos dalies klausimų.

228 |

5.2. Funkcinės genų grupės. Struktūriniai ir valdymo genai. Valdymo sekos

5.2.1. Operonas. Branduolėlio organizatorius ir rrn operonai, nuo kurių nurašomas didžiausias RNR skaičius ląstelėje

Pagal pasireiškimą suskirstėme genus į visą laiką veikiančius konstitucinius ir adapta-cinius – savitus audiniams. Pastarųjų raiškos laikas ribojamas arba aplinkybių, arba vidi-nės raidos programos.

Skiriamos ir kitu principu sudarytos funkcinės genų grupės. Pagal valdymo pobūdį skiriamos dvi genų grupės: operonas ir regulonas. Operonai augalų, kaip ir gyvūnų ge-nome, yra retas reiškinys. Tenka įrodinėti, kad apskritai yra. Pagrindinis „krūvis“ tenka regulonui, ne taip kaip bakterijų, kuriose operonai sudaro ženklią genomo dalį.

Operoną atrado Žakobas ir Mono, jo pagrindu sukurdami genų valdymo pradmenis apskritai. Jie ištyrė bakterijos Escherichia coli prisitaikymą (adaptaciją) skaidyti disacharidą laktozę į monosacharidus. Paaiškėjo, kad genai, kurie koduoja tris baltymus, būtinus disa-charido metabolizmui, yra vienas šalia kito. Be to, nuo jų yra nurašoma viena bendra mRNR. Tik dėl specialių ženklų (pradžios ir pabaigos kodonų) nuo tokios mRNR sinte-tinami atskiri skirtingi baltymai.

Tačiau šalia šių genų visai gretimai buvo aptikta DNR seka (kaip iš pradžių manyta, genas), kurios mutacijos visą genų valdymą gali apversti aukštyn kojomis: iš adaptacinių-genų, kokie ir buvo tiriami, gali padaryti konstituciniu būdu veikiančius arba ir visai ne-veiksnius. Ir svarbiausia, kad šios DNR sekos mutacijos vienu metu keičia visų baltymus koduojančių genų raiškos pobūdį.

Kitas panašaus pasireiškimo (jau iš tiesų) genas, nuo kurio priklauso viso operono veikla, buvo aptiktas atokiai. Tai specialios paskirties reguliacinis genas. Jo funkcija valdy-ti kitus genus. Jo mutacijos irgi keitė iš karto visos genų grupės veiklą: arba genai, kurie koduoja baltymus, dėl mutacijos tapdavo nevaldomi ir veikė visą laiką konstituciniu reži-mu, arba nutildavo visam laikui, bet visi trys kartu.

Akivaizdu, kad šie genai sudaro vieną bendrą valdomų genų grupę, kurią Žakobas ir Mono pavadino operonu, o genus, kurie koduoja baltymus, struktūriniais. Vėliau ši grupė buvo papildyta ir genais, kurie koduoja struktūrines RNR (rRNR, tRNR), o šalia šių struktūrinių genų yra valdymo seka, operono atradėjų pavadinta operatoriumi. Dabar ši geno arba operono dalis yra vadinama promotoriumi, nes jame yra įvairios reikšmingos valdymui sekos, tarp jų ir tos, kurios būtinos prisijungti RNR polimerazei.

Pasitelkę mutacijas Žakobas ir Mono sukūrė laikinas bakterijų heterozigotas ir įrodė, kad valdymo sekos, esančios šalia struktūrinių genų privalo būti cis padėtyje, t. y. tik šalia jų. Genas-reguliatorius, kuris yra atokiai, vienodai gali būti ir vienoje, ir kitoje homologi-nes chromosomas atitinkančiose DNR atkarpose, trans padėtyje valdomų genų atžvilgiu.

Taip atsirado valdymo sekų skirstymas į cis ir trans veikiančias. Operono sandara. Išsiaiškinome, kad operoną sudaro struktūriniai genai su šalia,

cis padėtyje, esančiomis valdymo sekomis. Dar dvi ypatybės yra labai svarbios operonui: – nuo operono nurašoma viena bendra mRNR, vėliau tokios RNR buvo pavadin-

tos policistroninėmis;



– susintetintos mRNR yra trumpalaikės. Tai būdinga adaptaciniams genams. Kai nėra poreikio baltymams, juos koduojančios mRNR yra suskaidomos.

Operonai augalų genomuose. Daugiskaita čia pavartota neatsitiktinai. Augalai be branduolio, turi dar du genomus: mitochondrijų ir plastidžių (chloroplastų). Šie du ge-nomai atsiradę dėl simbiozės su bakterijomis, todėl išsaugoję daug bakterijų genomams ir genams būdingų savybių, tarp jų ir ženklią dalį į operonus organizuotų genų grupių.

Vienas operonas, būtent rrn (tik įvairiais pavadinimais), yra bendras visiems savaran-kišką baltymų sintezę vykdantiems organizmams ir struktūroms – nuo bakterijų iki žmo-gaus. Šis operonas yra ne tik augalų branduolio genome, bet ir minėtuose mitochondrijų ir plastidžių genomuose. Jis netgi gali būti žymuo, kad ląstelės struktūra savarankiškai sintetina baltymus.

rrn operonai ir jų sankaupos augalų branduolio genome. Neginčijamai rrn ati-tinka visas operono ypatybes:

– genai sutelkti vienoje vietoje ir šalia turi bendras cis valdymo sekas; – nuo rrn nurašoma viena bendra pre-rRNR. Tiesa, skirtingai nuo genų, kurie ko-

duoja laktozės metabolizmo ar panašius adaptacinius baltymus, ši pre-rRNR, kai transkriptas bręsta, suskaidoma į atskiras rRNR.

Stebina labai didelis rrn konservatyvumas įvairių organizmų genomuose. Skirtumai yra, pvz., bakterijų rrn koduoja ir 5S rRNR, taip pat kai kurias tRNR, o visiškai neturi 5,8S rRNR geno.

Eukariotų, ypač branduolio, rrn konservatyvumas dar didesnis (5.1 pav., A). Ope-ronai skiriasi tik subrendusių rRNR dydžiu, pvz., įvairių augalų stambiausios rRNR dydis

5.1 pav. Ribosominių RNR rrn operonas: A – gyvūnų ir augalo (pomidoro) rrn palyginimas: ETS – išorinis transkribuojamasis tarpiklis (External Transcribed Spacer); ITS (Internal TS) – vidinis transkribuojamasis tarpiklis; NTS (Non TS) - netranskri-buojamasis tarpiklis; tarpikliai skiria vieną geną nuo kito; B – sanklotinio plastidžių 23S rRNR geno palyginimas.

230 |

yra nuo 23 iki 28 S. Augalų branduolio genome ji dažniausiai būna 26S. Kai kurių augalų (samanų, taip pat dumblių) plastidžių genome šią 23S rRNR koduojantis genas yra san-klotinis. Jame telpa dar 1−2 mažųjų branduolėlio RNR genai (5.1 pav., B).

Nuo rrn, kaip minėta, nurašoma viena bendra 40-45S pre-rRNR, kurioje yra ir tran-skribuojamieji tarpikliai. Jie skiria vieną rRNR nuo kitos. Kai pre-rRNR bręsta, ir nuora-šas yra sukarpomas, šie transkribuojamieji tarpikliai (ITS1 ir ITS2) yra pašalinami. Pačios rRNR labai konservatyvios, bet ITS1 ir ITS2, atvirkščiai, labai polimorfiniai. Dėl šios priežasties jie naudojami tirti DNR įvairovę ir giminystės ryšius.

Dar viena rrn ypatybė: ląstelei reikia labai daug rRNR, iš kurių dar branduolyje susi-daro ribosomos subvienetai, todėl branduolio genome rrn yra netgi ne šimtai, o tūkstan-čiai. Paprastai augalų genome jų yra 1400−2700, bet pasitaiko per 5000, o ypatingais atve-jais gali būti dar daugiau. Šis skaičius yra kintantis dydis. Priklauso nuo baltymų sintezės intensyvumo ląstelėje.

Branduolėlio organizatorius – rrn sankaupos chromosomoje vieta. Kai kurios chromosomos turi vadinamuosius palydovus (satelitus). Tokios, pvz., yra 2-oji ir 4-oji vairenio chromosomos. Palydovą nuo pagrindinės chromosomos dalies skiria antrinė sąsmauka (pirminė yra centromeros vieta). Dažniausiai (bet ne visada) antrinėje sąsmau-koje sukaupti kartotiniai rrn. Chromatinas šioje vietoje yra ypatingos sandaros, labai akty-vus, netgi aktyviausias. Tuo galima įsitikinti elektroniniu mikroskopu. Matyti vadinamoji „kalėdų eglutė“ – nuo iniciacijos vietos vis ilgesnės ir ilgesnės pre-rRNR. Labai intensy-viai įjungiamas radioaktyviuoju izotopu žymėtas uridinas. Antrinėje sąsmaukoje susidaro branduolėlis, todėl šis chromosomos rajonas pavadintas branduolėlio organizatoriumi (santrumpa NOR-nuo Nucleolus Organiser Region) (5.2 pav.). Sąsmauka susidaro todėl, kad šioje vietoje yra ypatingi tik NOR būdingi histonų variantai.

Atsargiai rRNR genai heterochromatine

Branduolėlis interfazėje

NOR

NORpalydovas Chromosomos petys

Centromera

rRNR genai

Koduojanti sekaTarpgeninis tarpiklis

PromotoriusKartotinė DNR 18S 5.8S 25S

5.2 pav. NOR (branduolėlio organizatoriaus rajonas) palydovinėje chromosomoje (viršuje), rrn santalka (viduryje) ir rrn operonas (apačioje). Branduolėlio dominavimas – epigenetinis reiškinys, rRNR genai/NOR niekur neišnyksta, virsta heterochromatinu. (pagal C. S. Pikaard. Arabidopsis Book. 2002)



NOR ir branduolėlis – tai pre-rRNR sintezės ir brendimo, ribosomų subvienetų susi-darymo centras. Čia sintetinama daugiau kaip pusė visų ląstelės RNR.

Branduolėlis „pučiasi“ dar ir todėl, kad į jį gabenami baltymai, reikalingi rRNR sintezei, brendimui ir ribosomų subvienetams. Normaliai ląstelėje pagaminama apie 1000 riboso-mų per minutę.

Branduolėlio proteomikos tyrimais nustatyta, kad jame sukaupiama kur kas dau-giau skirtingų baltymų, negu tikėtasi – per 500. Augalų kol kas aptikta apie 220 baltymų. Be to, aptinkami ir tokie baltymai, kurie neturi tiesioginio ryšio su rRNR sinteze ir ribo-somomis. Pvz., aptinkami baltymai, kurie kontroliuoja ląstelės ciklą. Spėjama, kad bran-duolėlis gali būti laikina jų saugojimo vieta. Tačiau branduolėlis yra labai dinamiška struk-tūra, ir jos ryšys (kitimas) su ląstelės ciklu yra labai akivaizdus. Prisiminkime mitozės pro-fazę, kurios pabaigoje išnyksta ne tik branduolio apvalkalėlis, bet ir branduolėlis(-iai). Paprastai jų būna vienas. Chromatino sandara branduolėlio viduje tiesiogiai priklauso nuo ląstelės ciklo (5.3 pav.).

Ankstyvoji G1 stadija Ankstyvoji S stadija G2 stadija

FC SFC rDNR

SAR/MAR 5.3 pav. NOR ir rrn kitimai ląstelės ciklo interfazėje – nuo ankstyvosios G1 iki G2 stadijos su padvigubėjusia DNR: G1, S, G2 – interfazės stadijos, kai veikia rrn genai; FC – fibrilių (skaidulų) centrai; SFC – sutankėjusių skaidulų centrai; SAR/MAR – vietos, kur jungiasi matrikso baltymai. Labiausiai kondensuotas NOR yra ankstyvojoje G1, o S ir G2 stadijose yra didelės rrn sritys, laisvos nuo nukleosomų, todėl labai akty-vios (pagal H. R. Junera et al. Journal of Cell Science. 1995, Vol. 108, P. 3427−3441). Branduolėlio ir NOR veiklos reguliacija. Intensyvi NOR veikla labai priklauso nuo

chromatino sandaros, kuri reguliuojama epigenetiniu būdu. Šiuo būdu reguliuojamas ir akty-vių rrn skaičius. Seniai žinoma, kad šalia NOR yra vieta, kur sutelktas konstitucinis (pasto-vus) heterochromatinas (5.2 pav.). Iš tiesų tai heterochromatinu paversta dalis rrn, kurie yra rezervas ir gali būti panaudotas ypatingais atvejais, kai ląstelėje labai padidėja poreikis nau-joms ribosomoms, pvz., veikiant destruktyviems stresams. Hibriduose vienos augalų rūšies NOR gali visai „išnykti“. Pasireiškia vadinamasis branduolėlio dominavimas, beveik pagal Mendelį: hibriduose vienos augalų rūšies branduolėlis (ir palydovinė chromosoma) išlieka, kitos rūšies − išnyksta. Iš tiesų NOR niekur neišnyko, virto heterochromatinu.

Reguliuojamas ne tik NOR lokusas, bet ir branduolėlio veikla. Apie ją galima spręsti netgi pagal branduo-lėlio dydį. Vienas tokių reguliatorių yra genas Sfp1, kurio koduojamas transkripcijos veiksnys valdo bent 60 genų, sukuriančiųjų ribosomų ansamblį. Svarbus vaidmuo tenka mažosioms branduolėlio RNR (angl.

232 |

santrumpa snoRNA). Pačios rRNR irgi yra modifikuojamos. Apie 100 vietų rRNR metilinamos savitos metiltransferazės, pavadintos fibrilarinu, taip pat yra redaguojamos: uridinas paverčiamas pseudouridinu.

Dar viena rRNR yra 5S, būdinga visiems organizmams, kurie sintetina baltymus. Ge-nų, kurie koduoja 5S rRNR, nepalyginamai daugiau negu rrn. Be to, jų skaičius skiriasi netgi to paties augalo skirtingose veislėse, pvz., linų veislėse jų gali būti nuo 50000 iki 120000. Įdomu ir tai, kad to paties augalo genome gali būti skirtingo dydžio 5S rRNR genai, pvz., kviečių yra du variantai − 410 ir 500 bp, o linų, nors ir nelabai skiriasi, bet irgi du nevienodo dydžio genai – 340 ir 360 bp. Be to, jų koduojančiajai daliai tenka tik 118 bp.

Multigeniniai lokusai. Genų perteklius. Augalų genome daug genų yra pertekliniai. Jų daugiau, negu reikėtų normaliai funkcijai. Pertekliniai genai daugiau parodo, kad šių genų augalo genome, matyt, yra tiek, kad būtų rezervas. Jie atsiradę dėl dviejų tipų duplikacijų: viso genomo (auto ir alopoliploidijos) ir pavienių lokusų duplikacijų, todėl yra paralogai. Sudaro daugybinių (multigeninių) genų šeimas, nes dėl mutacijų ir rekombinacijos geno vi-duje šie genai daugiau ar mažiau skiriasi, pvz., sėklos atsarginių baltymų (žr. 4.2.2 sk.).

Genų perteklius augalui svarbus dėl daugelio priežasčių, tarp jų išskirtume tris: • stipriau pasireiškia genų koduojamas požymis, o dozės kompensavimo mecha-

nizmais galima reguliuoti genų pasireiškimą priklausomai nuo ekologinių veiksnių. Auga-lui, kurio gyvavimas glaudžiai susietas su aplinka, tai labai svarbi aplinkybė.

• nedaug vienas nuo kito pagal pasireiškimą besiskiriantys genai sukuria augalų įvairovę rūšies-populiacijos viduje. Ji gali tapti privaloma sąlyga normaliai proceso ar reiš-kinio eigai, pvz., pasireikšti S-nesuderinamumui (žr. 2.4.2 sk.).

• kai atsiranda vieno svarbaus geno nul mutacija, ir tai gresia augalo išlikimui, para-logai bent iš dalies gelbsti padėtį, neleisdami pasireikšti mutacijai fenotipe. Dėl šios prie-žasties labai silpnai pasireiškia ir labai svarbių genų nul(loss-of-function, knock-out) mutacijos, nors pagal geno svarbą mutacija turėtų būti mirtina. Tai gerokai apsunkina ir geno ko-duojamo požymio tyrimus. Nėra reta padėtis, kai nustatomas geno buvimas, jo sandara (nukleotidų sekos, net ir koduojami baltymo domenai), bet nežinoma jo koduojamo bal-tymo konkreti paskirtis, fenotipinis pasireiškimas.

Jeigu paralogai atsiranda ne dėl poliploidijos, jie turėtų būti sutelkti vienoje vietoje, kaip artimus baltymus koduojantys genai Pto lokuse (5.1 intarpas). Dėl translokacijų dup-likuoti genai gana dažnai yra išsklaidyti po visą genomą, bet jeigu tai naudinga ir reikalin-ga. Duplikuotų genų sutelkimas vienoje vietoje gali būti naudingas.

Geriau organizuoti sutelktų genų raišką. Duplikuotame rajone sutelkiami visi reikiami šių genų raiškai veiksniai ir ištekliai. Puiki proga tuo įsitikinti buvo NOR ir branduolėlis. Daugiau turėtų dominti tie rrn, kurie atsiduria už NOR ribų − kam tai reikalinga, nes įsitikinta, kad net tokiose pavienėse vietose su-sikuria minibranduolėlis. Jeigu nebūtų priežasties, tokie pavieniai rrn būtų per didelė prabanga.

Duplikuotus genus/paralogus santalkos vietoje yra lengviau valdyti. Paralogai turi išsaugoję daug tapačių valdymo sekų, ypač kai genai susieti dar ir koduo-jamos funkcijos bendrumu. Tačiau tai ne operonas, ir Pto lokusas greičiau yra lokuso funkcinės evoliucijos pavyzdys. Pto lokuse atsiduria ir susieti funkcija, bet ne struktūra, genai, pvz., Prf genas, kuris koduoja ne proteinkinazės do-meną turinčius baltymus, o LZ-NB-LRR baltymą (5.1 intarpas). Lygiai tas pat



S-nesuderinamumo lokusuose, kuriuose sutelkti genai koduoja vyriškąjį ir moteriškąjį determinantus ir signalo molekules, „pranešančias žinią“ apie S-suderinamumą ar nesuderinamumą (žr. 2.4.2.2 sk.). Genai, kurie yra šiame S-lokuse (determinantai), pasireiškia skirtingose, be to, erdviškai atribotose ląstelėse (žiedadulkėje ir piestelės audiniuose). Vadinasi, gali būti naudinga sutelkti vienoje vietoje netgi ne paralogus. Jeigu vyko viso geno duplikacija, atsiradę duplikuoti genai išsaugoja ne tik koduojančias, bet ir reguliacines se-kas, todėl vienu metu juos gali valdyti tie patys arba artimi transkripcijos veiksniai.

5.1 intarpas. Ar pomidorų Pto lokusas, kuris koduoja R-baltymą, yra operonas? Pomidorų Pto lokusas koduoja R-baltymą, kuris nulemia atsparumą toms bakterijos Pseudomonas syringe pv. tomato rasėms, kurios turi avrPto veiksnį. Tai vadinamoji avr−R (genas prieš geną) imuniteto sistema. Patogenas tampa nepavojingas, avirulentiškas. R-baltymas yra signalas auga-lo apsauginėms reakcijoms, tarp jų savitam apoptozės tipui, kuris vadinamas hiperjautriu atsa-ku. Infekcijos vietoje ląstelės žūva ir taip neleidžiama patogenui plisti po visą augalą. Jeigu Pto lokusas yra iš tiesų operonas, tai jis gana didelis – 60 kb ir jį sudaro septyni genai. Pth4 Prf Fen Pth3 Pth2 Pto Pth5

Pto geno koduojamas baltymas visiškai atitinka signalinės molekulės paskirtį – tai citoplazminė receptorinė proteinkinazė. Pto proteinkinazė aktyvina transkripcijos veiksnius Pti (Pth 2-5), o šie jungiasi su genų, kurie koduoja PR-baltymus (nuo Pathogenesis Related), promotoriais. Pto proteinkinazė veikia ne viena, o kartu su dviem labai artimos sandaros proteinkinazėmis Pti1 ir Fen. Pastarąją irgi koduoja genas Fen, kuris yra Pto lokuse. Jo pavadinimas atsiradęs nuo jo le-miamo augalų atsparumo insekticidui fentionui. Pto ir Fen proteinkinazės veikdamos kartu yra signalas hiperjautriam atsakui. Dėl mutacijų Pto gene Pto proteinkinazė gali sukelti hiperjautrų atsaką ir nesant patogenui. Įdomu ir tai, kad homologinius proteinkinazės aktyvumo domenus turi ne tik genų Pto, Pti1 ir Fen koduojamos proteinkinazės, bet ir vairenio ERECTA geno koduojamas baltymas:

(pagal G. Sessa et al. Europian Journal of Biochemistry, 2000, Vol. 267, P. 171−178) Mutacija erecta vairenio Landsberg ekotipe lemia vieną iš Landsberg erecta privalumų: mažą ūgį, dėl kurio šie augalai užima labai nedaug vietos ir telpa mėgintuvėliuose.

60 kb

234 |

Neminėjome Prf geno. Jis iš tiesų indukuoja R baltymą, kuris sudarytas iš tipiškų jam domenų LZ-NB-LRR, tačiau be Pto, Pti, Fen jo signalai neperduodami į branduolį ir nesukelia atsakų į patogeną. Tai ir buvo priežastis manyti, kad Pto lokusas yra operonas, nes visi genai jame veikia suderin-tai, tačiau trūksta bendrų visam operonui būdingų valdymo sekų. Kita vertus, dėl duplikacijų atsiradę genai paralogai yra iš bendro kamieno. Kiekvienas jų indi-vidualiai gali būti išsaugoję tapačias reguliacines sekas. Likti tokiems genams viename lokuse yra net privalumas: jie turėtų būti lengviau pasiekiami erdviškai tų pačių juos kontroliuojančių tran-skripcijos veiksnių.

5.2.2. Funkcinė geno sandara ir genų raiškos valdymas

Regulonas ir cis-trans veikiantys veiksniai. Vėl teks prisiminti Žakobo ir Mono darbus. Jie veiksnius, kurie valdo genų raišką, suskirstė į cis ir trans veikiančius. Pritaikius tai eukariotams, cis veiksniai turi būti vienoje DNR molekulėje (chromosomoje) kaip ir valdomos koduojančios sekos, o trans veiksniai gali būti kitoje homologinėje chromoso-moje ar netgi (dažniausiai) nehomologinėse chromosomose.

Pats svarbiausias principinis visai biologijai Žakobo ir Mono laimėjimas: jiems pavy-ko įtikinamai pagrįsti, kad yra baltymai, kurie atpažįsta būdingas DNR nukleotidų sekas ir su jomis jungiasi. Taip valdomi genai. Tokiomis savybėmis pasižymintys bal-tymai pavadinti transkripcijos veiksniais. Juos koduoja saviti, tik valdymui skirti genai. Priklausomai nuo valdymo pobūdžio, jie gali sąveikauti ne su viena DNR cis seka, su ki-tais baltymais, su hormonais, metabolitais, aplinkos veiksniais.

Pagal valdymo pobūdį transkripcijos veiksniai skirstomi į aktyvatorius ir represorius. Vieni aktyvina, kiti slopina geno raišką. Pasitaiko dvigubo veikimo transkripcijos veiks-nių, kurie (dažniausiai priklausomai nuo sąveikų su kitais veiksniais) veikia ir kaip aktyva-toriai, ir kaip represoriai.

Eukariotų genų valdymas labai sudėtingas. Genui tenka klausyti komandų ne vieno, o kelių, ar net (neatmetama tokia galimybė) dešimčių įvairių reguliatorių, nes reguliatorių gretas papildė ne tik įvairūs baltymai, bet ir reguliacinės baltymų nekoduojančios RNR.

Tad į funkcines grupes genai jungiami kitu pagrindu negu operonas. Pagal cis sekas, vadinamas elementais, ir jas atpažistančius transkripcijos veiksnius. Ir tai dar ne viskas. Geno raiška valdoma įvairiais etapais: transkripcijos metu, po transkripcijos, transliacijos metu, po transliacijos. Taigi yra veiksniai, kurie reguliuoja geną atitinkamame jo pasireiš-kimo etape, ir tai gali būti veiksniai, kurie atpažįsta būdingas ne DNR, o RNR nukleotidų ar baltymo aminorūgščių sekas. Prisiminkime potransliacinį sėklos atsarginių baltymų brendimą ir pernašą į jų saugojimo struktūras baltymų kūnelius arba saugojimo vakuoles.

Pagal pasireiškimą arba pagal veiksnį, kuris genus reguliuoja vienydamas į reguloną, genai sudaro grupes, vadinamas reguliuojančio veiksnio arba genų raiškos pokyčius sukė-lusio veiksnio vardu. Dažniausiai genų raiška yra atsakas į veiksnį: gibereliną, auksiną, šiluminį šoką, šaltį, sausrą ir pan.

Nors „namų ūkio/apyvokos“ genai yra konstituciniai, ypatingomis sąlygomis jie gali būti išjungti (pvz., badaujant). Be to, kaip minėta, jie gali veikti ne tik konstituciniu reži-mu (pastoviai), bet ir indukuotu. Paprastai tada po indukcijos jų raiška labai padidėja.



Funkcinė augalų geno sandara nuo kitų eukariotų genų labai nesiskiria. Genai, kurie koduoja baltymus, yra iš dviejų dalių: promotoriaus ir transkribuojamosios dalies. Nuo šios nurašoma pre-mRNR. Skiriamoji riba tarp šių dalių − transkripcijos pradžios (starto) vieta. Ji žymima ┌→ ir „+1“. Transkripcijos kryptimi, kaip minėta, visi nukleoti-dai žymimi ;;+“ (pliuso) ženklu ir skaičiumi didėjančia tvarka („pasroviui“). Nuo starto vietos visi nukleotidai priešinga kryptimi žymimi „−“ (minuso) ženklu irgi didėjančia tvarka („prieš srovę“).

Genus vieną nuo kito skiria tarpikliai, bet funkcinis tarpiklis yra specialus. Tai insu-latorius, nedidelės (ne daugiau kaip 42 bp), bet savitos nukleotidų sekos.

Transkribuojamoji geno dalis ne visa yra koduojanti aminorūgščių seką baltymo mole-kulėje. Abejuose šios geno dalies galuose yra UTR (nuo UnTranslated Region) sekos žymimos atitinkamai 5′-UTR ir 3′-UTR. Jos sekos reikalingos valdyti RNR ir baltymo brendimą, tran-sliaciją, baltymo įsijungimą į ląstelės struktūras. Prisiminkime sėklos atsarginių baltymų sinte-zę, brendimą ir pernašą į saugojimo struktūras baltymų kūnelius ar vakuoles.

Intronai iš pirminio transkripto pašalinami, ir tai yra būdas valdyti geno raišką tam tikroje vietoje ir tam tikru laiku, o alternatyvusis splaisingas, be to, sukuria transkriptų ir jų koduojamų baltymų įvairovę (žr. 5.5 sk.). Tačiau apie 30 % visų augalų genų intronų neturi, pvz., atsarginių baltymų prolaminų genai.

5.3. Promotoriai : cis elementai

Promotorius (žr. taip pat 1.9 intarpą) yra netranskribuojamoji geno dalis prieš srovę nuo „+1“ transkripcijos starto vietos. Tai pagrindinė geno transkripcijos reguliavimo vieta. Būtent prie jos jungiasi dauguma transkripcijos veiksnių ir netiesiogiai RNR poli-merazės,. nes kaip ir kiti eukariotai, genų transkripcijai augalas turi tris skirtingas RNR polimerazes. Yra dar kitos RNR polimerazės, bet jos sintetina RNR nuo RNR matricos ir jų paskirtis kita – nekoduojančių RNR sintezė.

Trys RNR polimerazės, kurios sintetina RNR nuo DNR matricos, iš karto suskirsto genus į tris gerai žinomas grupes:

• I RNR polimerazė sintetina rRNR nuo rrn operonų; • II RNR polimerazė labiausiai dominanti, nes ji transkribuoja visus genus, kurie

koduoja baltymus ir daugumą branduolio mažųjų RNR; • III RNR polimerazei tenka visokios smulkios RNR, pvz., 5S rRNR, mažosios

branduolėlio RNR, bet miRNR genus irgi transkribuoja II RNR polimerazė. Dvi promotoriaus dalys. Baltymus koduojančių genų promotorius yra iš dviejų

griežtai vienas nuo kito neatskirtų, netgi sanklotinių dalių: • pagrindinio (bazinio arba šerdies) promotoriaus – su juo sąveikauja pagrindiniai

(baziniai) transkripcijos veiksniai, o per juos atitinkama RNR polimerazė, jo ribos nevirši-ja -100bp (nuo starto vietos);

su kuria iš RNR polimerazių sąveikauja TF (transkripcijos faktorius), galima spręsti iš jo santrumpos romėniško skaičiaus, pvz., TF II sąveikauja su II RNR polimeraze,

• neįvardijama promotoriaus dalis (kartais vadinama. ,, esanti prieš srovę“ nuo pa-grindinio promotoriaus), kurioje yra konkrečiam genui būdingi cis elementai.

236 |

5.3.1. Pagrindinis promotorius

Pagrindinis promotorius (šerdis) yra nedidelis (gana dažnai jo riba nurodoma tik -40 bp), tačiau be jo transkripcija nevyksta. Tai viena konservatyviausių geno dalių. Dau-gelio augalų genų, kaip ir kitų organizmų, netgi bakterijų, promotoriuje yra TATA ele-mentas. Augalų genuose ši 7 nukleotidų seka yra apie -25 bp nuo transkripcijos pradžios vietos „+1“, o jos konsensusas yra TATAAAA. Būtent prie jos jungiasi didelis, apie 50 skirtingų baltymų transkripcijos pradžios kompleksas, tarp kitų:

• TFIID (transkripcijos faktorius/veiksnys II D) – tai irgi yra baltymų kompleksas: TATA−jungiančio baltymo TBP (nuo TATA-box Binding Protein), kuris pir-

masis atpažįsta TATA seką; 14 kitų baltymų, kurie jungiasi su TBP ir vienas su kitu, bet ne su DNR

• TFIIB, kuris jungiasi su DNR ir su II RNR polimeraze; • Kai II RNR polimerazė fosforilinama, visas sudėtingas iniciacijos kompleksas at-

siskiria ir prasideda elongacijos etapas – RNR polimerazė toliau sintetina RNR. Pagrindiniame promotoriuje yra ir daugiau cis elementų: CAAT (dažniausiai apie

-80 bp nuo,,+1“), GC elementas ir kt. Nuo šių elementų priklauso promotoriaus stipru-mas ir didesnis savitumas. Pagrindinį promotorių turi visi baltymus koduojantys augalų genai, bet ir tarp jų yra įvairovė, ne tik pagal minėtus CAAT ar GC elementus, bet netgi pagal TATA seką:

• dauguma genų turi TATA seką: TATA • dalies genų starto vieta nėra griežtai apibrėžta, jos vietoje yra gausi pirimidino

liekanomis seka, apibūdinama kaip Inr (iniciatorius); transkripcija prasideda kažkur jos viduje: TATA Inr

• kai kurie genai, įdomiausia, kad tarp jų dauguma fotosintezės genų, neturi TATA sekos:

Inr

I dauguma tilakoidų membranų baltymus koduojančių genų neturi nei TATA,

nei Inr: Labai didelė augalų genų įvairovė ir pagal TATA bei Inr skaičių. Abu šie elementai

dažnai atsikartoja daugiau kaip vieną kartą. TBP griežtai jungiasi tik su vienu TATA ele-mentu. Tačiau augalai pateikė dar vieną netikėtumą: sojos vieno iš tubulinų genų promo-toriuje TBP jungiasi dvejose vietose, ir, svarbiausia, kad nuo to priklauso augalo prisitai-kymas prie apšvietimo sąlygų.

Taip pat įsitikinta, kad nuo cis elementų TATA arba/ir Inr skaičiaus pagrindiniame promotoriuje priklauso kiekybiniai genų raiškos skirtumai. Pvz., daržinės pupelės



(Phaseolus vulgaris) atsarginio globulino β-fazeolino geno Phas pagrindiniame promotoriuje yra trys TATA ir keletas spėjamų Inr motyvų (5.4 pav., A). Fazeolino, kaip ir kitų sėklos atsarginius baltymus koduojančių genų, raiška labai griežtai kontroliuojama laike (kai sėk-la pasiekia brandos vidurį) ir erdvėje (tik būdingose sėklaskilčių ląstelėse, žr. 4.2.3 sk.). Įvairių nukleotidų mutacijos skirtinguose TATA elementuose svarbios Phas geno raiškos stiprumui, bet ne pasireiškimui laike ir erdvėje. Tai lemia kiti cis elementai, prieš srovę nuo pagrindinio promotoriaus esančioje dalyje (5.4 pav., B). Prie šių cis elementų jungiasi transkripcijos veiksniai, kurie slopina Phas geno raišką kitose augalo dalyse. Atkreipkite dėmesį, kad nors šių transkripcijos veiksnių pasireiškimas yra vienodas – jie slopina Phas, tad yra represoriai, tačiau įvairiuose augalo organuose su Phas geno promotoriumi jungia-si skirtingi transkripcijos veiksniai, be to, prie skirtingų cis elementų. Tai irgi vienas iš transkripcijos kodo pasireiškimų: skirtingi organai, skirtingos ląstelės ir tą patį geną „do-roja“ skirtingų genų produktai.

5.4 pav. Atsarginio sėklos baltymo fazeolino geno Phas promotoriaus funkcinė sandara ir Phas geno reguliavimas erdvėje ir laike: A. Trys TATA motyvai pagrindiniame promotoriuje. Skirtinga jų funkcinė svarba įrodyta mutacijų me-todu. Delecijos (∆) žymimos ,,-‘‘, įterptosios sekos − mažosiomis raidėmis. TATA elementai pajuodin-ti, o T1, T2, T3 − jų vieta promotoriuje; UTR − netransliuojamoji mRNR dalis. Alelių raiškos vieta nu-statyta prie Phas promotoriaus prijungiant reporterį geną gus (pagal M. L. Grace et al. Journal of Biolo-gical Chemistry. 2004, Vol. 279, P. 8102−8110). B. phas promotoriaus elementai, kurie reguliuoja Phas geno raišką skirtinguose organuose ir skirtingu laiku (pagal M. D. Burow et al. Plant Journal. 1992, Vol. 2, P. 537−548). Pagrindinis promotorius dažniausiai inicijuoja silpną raišką tų genų, kurie yra adap-

taciniai, bet yra ir labai stiprių promotorių. Kita vertus, nors pagrindinį geno raiškos savi-tumą sukuria toliau esantys cis elementai, žinoma keletas audinių specifinių pagrindinio promotoriaus formų.

A B

238 |

5.3.2. Savita promotoriaus dalis ir saviti cis elementai. Cis elementai intronuose

„Prieš srovę“ esančioje promotoriaus dalyje daugiausia yra tie cis elementai, nuo kurių priklauso kada ir kuriose ląstelėse veikti genui, kokiam regulonui turėtų priklausyti genas. Augalo „pririšimas“prie aplinkos atsispindi šioje promotoriaus dalyje. Joje yra cis elementai, prie kurių jungiasi transkripcijos veiksniai, saviti konkretiems atsakams (šalčio, druskingumo, sausros, konkrečių hormonų ir pan.) arba vidinius procesus ir raidą kon-troliuojantiems genams. Dažnai pagal tai yra ir šių cis elementų pavadinimai (5.1 lentelė). Jie aptinkami, kai apibendrintai ištiriamas pakankamai didelis skaičius viena kryptimi vei-kiančių genų, o nustačius cis elementus vieno augalo genome galima nustatyti tokia pačia kryptimi veikiančius genus ir kitų augalų genomuose.

5.1 lentelė. Cis sekos augalų įvairių genų promotoriuose

Elementas

Santrumpa Visas pavadinimas

Nukleotidų seka(os) Genai arba genų grupės TV

Atsarginių baltymų, sėklų raidos, brendimo ir dygimo genai PB-300 E-box HMG-GATA GARE GLM G/C ir A/G N RY

Proline Box, E motif Endosperme Box GATA core (pagal n.s.)

Gibberellin Acid Responsive Element GCN4-like Motif G/C and A/G hybrid box Nuo N (azoto) RY motif, repeat

TGTAAAG/CTTT CACGTG, CANNTG TATC/GATA-TATCCAC AACA/TA TAACARA, TAACAAAA CTTTT ATGAG/CTCAT (G/A)TGA(G/C)TCA(T/C) GCCACGT(c/a)AG TGACATGTAAAGTGAACATGCATGT

Prolaminų, endosper-mo raidos Endospermo raidos, įvairūs bHLH Desikacijos/brendimo Dygimas/giberelinų atsakas Atsarginiai baltymai, dygimas Globulinų genai N valdomi genai Pupinių š. atsarginių baltymų

DOF, SAD bHLH, MYC GL3, TT8 SHAQKYF 1R MYB, Itr1 bZIP, SPA, BLZ1-2 b ZIP, REB bZIP, Sph, Osem, Em

Atsakas į abscizo rūgštį (brendimas-desikacija, stresai) BRE, ACGT-box CE3 ABRE/G-box ASCF

AB Responsive Element, ACGT (pagal n.s.) Nonperfect ABRE Coupling Element ABA-inducible sph-containing element

ACGT(GG/TC), CGCGTG ir kt. įvairūs tame pačiame g. GCGT, GTGTC, CCGAC CACGTG CATGCATG

Slopina dygimą, desi-kacijos genai, šalčio, sausros ir kt. stresai ABR atsakas '' ABR atsakas Fotosintezė, fotoperiodas

bZIP, VP1, ABI5 bZIP, HVA1 bHLH bZIP, GBF Rbcs, PIF3, HY5



5.1 lentelės tęsinys

Elementas

Santrumpa Visas pavadinimas

Nukleotidų seka(os) Genai arba genų grupės TV

Auksino (indolilacto rūgšties) atsakas – morfogenas AuxRE TGA∗

Auxin-Responsive Element Pagal n.s.

TGTCCCAT, TGTCTC arba inversija GAGACA TGACGTAA, TGACGCAGTGACGTGG

Augimo reguliacija, gemalo raida ir kt. Augimo reguliacija

ARF, AP2/ARF, AUX/IAA

Įvairūs stresai DRE GRA, GC HSE LTRE

Drought Responsive Element GC-rich rab activator, GC-element Heat Schock Element

Low Temperature Responsive Element

TACCGACAT, ACGTGTCTGGCCGAA CACTGGCCGCCC NGAANTTCNNGAAN A/GCCGAC

Dehidratacijos seka Šalčio promotoriuose Įvairūs stresai Šiluminio šoko atsako Atsakas į žemą to

AP2/EREBP RAB

Anaerobinės sąlygos, hipoksija ARE GT-m. GC-m. ARE1 ARE2

Anaerobic Responsive Element, GT motyvas GC motyvas CCATAG GAGAATA

GTTTT GCCCC

Hipoksija dėl vandens pertekliaus dirvoje, mangrovių augalai, šaltis

MYB2 ADH

Biotiniai stresai (patogenai), atsakas į ksenobiotikus TGA∗ W-box

Pagal pirmąsias n.s. Nuo WRKY

TGA... (C/T)TGAC(C/T), TTGACTATGGAAA(T)TGAC(C/T)

Atsakai į patogenus, cukrų sintezės genus Atsakai į patogenus ir į hipoksiją

bZIP, TGA,CREB, NPR1, SUC WRKY ZIP

Cirkadiniai reiškiniai, diena/naktis EE CBS ME

Evening Element CCA1 Binding Site

Morning Element

AAAATATCT ↓ AAAAAATCT (trumpas CBS)AAAAAAATCT (ilgas CBS) AACCACGAAAAT

Vakaro genai Dienos genai Ryto genai

PPRG, CCR2 CCA1, LHY

Raidos genai CCA/TGG CArG

CCA (TGG kartotinės sekos)

CCA/TTG CC (A/T)6GG

Prokambio genas, Osho×1 turi 13 CCA / TTG kartot. sekų. Žiedo organų raida

Osho×1, HD-ZIP MADS

Sekos yra santykinės, gali skirtis įvairiuose genuose ir augaluose, pateikiami konsensusai, sekos šerdis (daž-niausiai konservatyvi) pajuodinta; R, Pu – A arba G; Y, Py – T arba C; N – bet kuris nukleotidas; g. – genas, b – baltymas; n.s. – pagal nukleo-tidų seką; mažosiomis raidėmis nurodyti nukleotidai, kurių dažnis užimamoje padėtyje neviršija 53 %; / – šioje padėtyje gali būti vienas ar kitas nurodytų nukleotidų; TGA∗ – ta pati cis seka gali būti skirtingos paskirties genuose.

240 |

Dažnai promotoriuje yra ne vienas tapatus cis elementas su nedidelėmis nukleotidų sekų variacijomis, pa-našiai kaip TATA elementas fazeolino geno pagrindiniame promotoriuje (žr. 5.4 pav., A). Kita vertus, tam pačiam atsakui ar procesui griežčiau kontroliuoti promotoriuje gali būti skirtingi cis elementai, kaip tai yra kai kurių genų, kuriuos reguliuoja abscizo rūgštis, promotoriuose. Juose, be ABRE, dar yra CE (Coupling Element) elementas, kuris sustiprina ir sugriežtina jį turinčio ABR atsako geno raišką ( žr. 3 intarpą ir 5.1 lentelę) ir kiti cis elementai. Reguloną sudarančių genų raiškos stiprumui labai svarbi, bet ir įvairi, atitinka-mų cis elementų padėtis nuo transkripcijos pradžios vietos „+1“. Iš pradžių buvo didelė naujiena, o dabar įprastas dalykas yra cis elementai, nutolę nuo geno ribų į 5′ ar 3′ pusę per tūkstančius ar dešimtis tūkstančių bp. Šie elementai gali skatinti (enhanceriai) arba slopinti (sailenseriai) geno raišką, bet reikia, kad kontro-liuojantys trans veiksniai juos priartintų prie pagrindinio promotoriaus ar labiau nutolusių promotoriaus vietų. Susidaro kilpa, bet ji būdinga netgi pagrindiniam promotoriui ir jį supantiems baltymams (5.5 pav.). Šių nutolusių cis elementų poveikis geno raiškai yra papildomas saugiklis, kad genas nepradėtų veikti ne laiku ir ne vietoje. Priartinimui yra specialūs trans veikiantys baltymai.

A

B

Promotorius cis regionas Transkribuojamoji dalis

Modulis Pagrindinis promotorius

Egzonas Intronas

UTR

Chromatinio remodeliavimokompleksas

TV kofaktorius TV

Pol II holofermentas

Transkripcijos starto vieta

Moduliai Chromatinas Chromatinas

TATA boxTATA jung. baltymas Kilpą sudarantys veiksniai

5.5 pav. Promotoriaus sandara (A) ir funkcionavimas (B) (pagal G.A. Wray et al. Molecular Biology and Evolution. 2003, Vol. 20, N9, P. 1377−1419). Naujas požiūris į intronų reikšmę – cis sekos intronuose. Iš „ne vietoje“ esan-

čių cis elementų didelio susidomėjimo sulaukė cis elementai, esantys intronuose. Augalų genomuose tokie cis elementai aptikti labai svarbių organų identiteto genų intronuose.

Vairenio AGAMOUS geno 2-ojo introno tyrimai apskritai yra unikalūs genetikoje. Tai pripažintas žiedo lytinių organų: kuokelių ir piestelės identiteto genas. Be jo aktyvių alelių šie organai neišsivysto. AG genas koduoja MADS superšeimos transkripcijos veiks-nį. Kita vertus, AG genas irgi kontroliuojamas kitų genų, tarp jų dviejų žiedo meristemos genų LEAFY (LFY) ir WUSCHEL (WUS). AG geno antrajame introne yra kelios LFY ir WUS koduojamų transkripcijos veiksnių prisijungimo vietos. Šiame introne yra ir daugiau cis elementų, su kuriais jungiasi kiti TV. Svarbiausia, kad šis transkripcijos veiksnių deri-nys keičiasi su žiedo raida (5.6 pav.). Tai dar vienas žingsnis į transkripcijos kodą, tik šį kartą netikėtas per intronus.

Homologiniai AG cis elementai (tik įvairiais deriniais) aptikti ir kitų tirtų Brasicaceae šeimos augalų 2-ajame AG geno ortologų introne (tarp jų keturių Arabidopsis genties rū-šių), taip pat kai kurių kitų tirtų augalų, priklausančių kitoms augalų šeimoms, AGAMOUS geno ortologuose: agurkų CUM1, tuopos PTAG1 ir PTAG2, žioveinio PLE ir TAR, petuni-jos PMADS3, pomidorų TAG1 (5.7 pav.). Tad bent tarp dviskilčių augalų cis elementai šio geno introne yra konservatyvus reiškinys.



5.6 pav. Ūglio (SAM)/žiedo meristemų santykio kitimai, priklausomai nuo vairenio AGAMOUS geno reguliavimo, kurį atlieka cis elementai 2-ajame introne (pagal R. L. Hong et al. Plant Cell. 2003, Vol. 15, P. 1296−1309).

5.7 pav. Įvairių augalų palyginimas pagal spėjamą cis sekų padėtį AGAMOUS geno homolo-giniuose intronuose: rodykle parodyta Tam3 transpozono įsiterpimo vieta, dėl kurios atsiranda PLE geno ovulata mutacija, LBS – vietos, prie kurių jungiasi LEAFY transkripcijos vaiksnys (žr. 5.5.2.3 sk.) (pagal R. L. Hong et al. Plant Cell. 2003, Vol. 15, P. 1296–1309).

242 |

Gali būti, kad intronuose esančios cis sekos apskritai kontroliuoja žiedo raidą. Tuo įsiti-kinta ištyrus miežių dominuojančią homeozinę mutaciją Hooded. Mutacija atsiradusi dėl gan didelės 305 bp DNR segmento duplikacijos miežių HD superšeimos (žr. 3.3 intarpą) Kn3 (Knox) geno ketvirtajame introne. Dėl mutacijos varpos akuotas virtęs papildomu žiedu, be to, invertuotu (apverstu 180˚), todėl tai atrodo kaip kepurėlės. Iš čia ir mutacijos pavadini-mas. Įdomu ir tai, kad įvairūs Hooded aleliai pasireiškia labai skirtingai: kai kurių ne visas akuotas virtęs papildomu žiedu, o papildomas žiedas yra ant akuoto (5.8 pav.).

5.8 pav. Miežių mutantų Hooded įvairovė: nors visi jie turi stambią 305 bp duplikaciją IV-ajame introne, mutantai pastebimai skiriasi, pvz., 4-ojo iš kairės papildomas žiedas („kepurėlė“) yra ant akuoto, kitų − visas akuotas tapo papildomu invertuotu žiedu − ,,kepurėle“;kairėje- WT( normalusis tipas)

Istorija su cis elementais intronuose tik prasideda. Intronai, turintys įtakos geno raiškai transkripcijos metu arba po transkripcijos, pavadinti IME (nuo Intron-Mediated Enhancement). Jie aptikti įvairių augalų ir įvai-riuose genuose: Alcohol dehydrogenase1, Bronze1, Shrunken1, Phosphoribosylanthranilate transferase1, SUVH3 ir kt. Pastarasis genas yra chromatino remodialiavimo (žr. 3. 5. 2 sk.). Turi du intronus 5′-UTR dalyje ir pir-masis jų yra IME. Jis nulemia stiprią ir konstitutyvią SUVH3 geno raišką. Tad ir epigenetinius reiškinius, chromatino funkcinę sandarą gali valdyti cis sekos intronuose. Bioinformatikos (sekų analizės) metodais intronuose ieškoma ir aptikta daug konservatyvių nekoduojan-čių sekų, kurių paskirtis kol kas neaiški. Akivaizdu, kad jos ten neatsitiktinės. Pvz.,, net 5-ių tirtų Poaceae šeimos augalų (kukurūzo, ryžio, bambuko, šerytės, Arundo) lg1 (liguleless 1) geno 1-ajame introne nustatyta ne tik didelė šių konservatyvių (vadinamųjų. CNS) sekų homologija, bet sutapo netgi jų tarpusavio išsidės-tymas tirtų augalų introne.

5.3.3. Saviti promotoriai ir genų promotorių konstravimas

Saviti promotoriai. Geno raiškos vieta ir laikas nustatomi įvairiais metodais. Vie-tai nustatyti prie promotoriaus prijungiama koduojanti geno reporterio (žr. 2.2 intarpą) dalis. Jo koduojamą baltymą dažniausiai lengva aptikti pagal būdingą spalvą (5.2 intarpas). Naudojami įvairūs reporteriai: β-gliukuronidazės (GUS), luciferazės (luc, luxA) arba žaliai fluorescuojančio baltymo (GFP) genai. Prie reporterio prijungus tiriamojo geno promoto-rių transgenas įvedamas į augalo ląstelę. Geno produktas gali būti aptinkamas ir imuno-



liuminescentiniu būdu, kai tiriamasis baltymas „pagaunamas“ ir surišamas antikūnais su prijungtu fluorochromu.

Pagal susikaupusio baltymo kiekį, o tiksliau pagal spalvą, sprendžiama apie tiriamojo geno raiškos stiprumą. Taip buvo, pvz., įvertinti mutantiniai β-fazeolino promotoriai (5.4 pav.)

Savitų promotorių prijungimas GMO tikslais. Savitą promotorių prijungiant prie geno, kuris paprastai augalo ląstelėse netranskribuojamas, galima gauti įvairių me-džiagų producentus. Prisiminkime, kad ir sėklos atsarginių baltymų sintezės ar pernašos į baltymų kūnelius ir saugojimo vakuoles genus (žr. 4.2.3 sk.). Kai prijungiamas atitinkamas promotorius, svetimas rekombinantinis baltymas sintetinamas konkrečiame organe (gumbuose, lapuose ar sėklose ir pan.). Kita vertus, prijungus savitą promotorių prie ge-no, kuris paprastai pasireiškia kitose ląstelėse, tiriama ektopinė (ne vietoje) geno raiška, jos pasekmės. Tai padeda nustatyti geno vietą genų ansamblyje.

Genetinė ablacija ir saviti promotoriai. Tai daugiau jau nagrinėto klausimo pri-minimas (žr. 2.4 intarpą). Ląstelė arba jos organelė sunaikinama ir tiriamos to pasekmės. Taip nustatoma jų reikšmė ir funkcijos. Tikslingai ląstelė arba jos struktūros sunaikina-mos lazeriu, bet žūtį galima užprogramuoti genetiškai. Tam tikslui prie savito promoto-riaus, kuris pasireiškia tik sunaikinti numatytose ląstelėse, prijungiama geno dalis, koduo-janti toksiną. Dažniausiai naudojamas difterijos toksino genas. Taip, pvz., buvo ištirta aleurono ląstelių paskirtis ir įrodyta krakmolingojo endospermo ląstelių transdeterminaci-ja į aleurono ląsteles, kai šios yra sunaikinamos (žr. 3.4.2 sk.).

Labai sėkmingai genetinė ablacija pritaikyta gauti įvairių augalų vyriškąjį sterilumą. Dažniausiai prie dulkinės tapeto ląstelėms savito promotoriaus prijungiamas bakterijų toksinę RNazę barnazę koduojantis genas. Sunaikinamos tapeto ląstelės, o kartu nesivys-to ir žiedadulkės. Tuo pačiu išaiškinta ir tapeto reikšmė vyriškojo gametofito raidai (žr. 2.3.5 sk.).

5.2 intarpas. Matomi genų reporterių produktai, naudojami tirti augalų genų raišką Svarbu, kad būtų galima aptikti reporterio koduojamą produktą pagal spalvą. • β-gliukuronidazės (GUS) genas uidA iš Eschericia coli yra vienas iš dažniausiai naudojamų

tirti augalų genus, jo produktas aptinkamas histocheminiu būdu pagal netirpias mėlynas nuo-sėdas.

• Luciferazės genai iš įvairių naktį šviečiančių organizmų. Pirmasis buvo luc genas iš vabzdžio Photinus pyralis. Naudojami alternatyvūs genai iš kitų organizmų, kurie švyti skirtingomis spalvomis, tarp jų augalų transgenams konstruoti luxA genas iš bakterijų.

• Žaliai fluorescuojančio baltymo (GFP) genas iš medūzos Aequorea victoria. Naudojami įvai-rūs variantai, pvz., mutantinė forma geltonai fluorescuojantis baltymas iš Anthozoa. Todėl galima iš karto žymėti du genus ir tirti jų suderintą pasireiškimą. Patogu tirti ir baltymų per-našą iš vienų organelių į kitas, tarp jų transkripcijos veiksnių judėjimą iš vienos ląstelės į kitą arba dideliais atstumais karniena. Nereikalauja substrato, kuris būtinas luciferazei, todėl at-spindi realų geno raiškos laiką. Augaluose teko įveikti neteisingo splaisingo problemas (turi slaptą splaisingo vietą).

Stiprių promotorių paieškos ir prijungimas. Pripažintas stiprus promotorius yra konstitutyvusis žiedinio kopūsto mozaikos viruso promotorius CaMV 35S (nuo Cauliflo-wer Mosaic Virus). Dažnai jis tiesiog nurodomas kaip 35S promotorius. Geno raiškai dar labiau sustiprinti gali būti prijungiamas ne vienas, o du CaMV 35S (35S·S) promotoriai.

244 |

Tačiau pasitaiko ir nemalonių staigmenų, kai per didelis geno raiškos stiprinimas atneša ne naudą, o žalą. Prisiminkime tą nesėkmę, kuri ištiko, kai prie vairenio sėklapradžio geno ANT (AINTEGUMENTA) koduojančiosios dalies buvo prijungti du 35S promotoriai. ANT genas reguliuoja ląstelių dalijimąsi ir augalai, prie kurių ANT prijungtas 35S promo-torius, yra stambesni. Tikėtasi, kad kur du stos, daugiau padarys. Tačiau prijungus du 35S promotorius, augalai tapo moteriškai sterilūs. Branduolo ir chalazos ląstelės tiek suvešėjo, kad nustelbė gemalo maišelį.

35S·S :: ANT fenotipas atitinka hipermorfinę, arba kitaip − gain-of- function (pertekli-nę) ANT geno mutaciją. Dažnai tokių genų valdymas sutrinka, ir genas pasireiškia ne vietoje, pvz., prijungus prie genų CPS (CAPRISE) arba TRY (TRIPTYCHON) stiprų pro-motorių, plaukeliai atsirado ant sėklaskilčių, kur paprastai jų nebūna. Plaukeliai būdingi tik tikrajam lapui (žr. 3.1 intarpą). Taip pavyko išaiškinti ne tik genų CPC ir TRY koduo-jamų baltymų funkciją, bet ir valdymą. Ektopiškai pasireiškiantys genai dažniausiai kon-struojami prie geno promotoriaus, savito ląstelei, prijungiant koduojančią dalį geno, savi-to kitoms ląstelėms ar net organizmams.

Sustiprėjusi geno raiška gali duoti netikėtą rezultatą, ne tik plaukelius ant skilčialapių, sustiprinus vairenio žydėjimo laiką reguliuojančio FLC (FLOWERING LOCUS C) geno raišką papildoma transgeninio FLC geno doze, vairenis iš vienmečio augalo virto dvime-čiu. FLC genas slopina žydėjimą, todėl padidėjęs FLC baltymo kiekis veikė kaip reostatas: dar labiau uždelsė žiedo meristemos susidarymą (5.8 pav.).

flc/FLC FLC/FLC

papildomos FLC kopijos

flc/flc vienmetis dvimetis

FLC didėjimas

5.9 pav. FLC geno ,,reostatas“: kai padidinus FLC (transgenais) genų skaičių genome vaire-nis iš vienmečio virto dvimečiu (pagal S.D. Michaels, R.M. Amasino. Plant, Cell and Environment. 2000, Vol. 23, P. 1145-1153; J.Z. Zhang. Current Opinion in Plant,z Biology. 2003, Vol. 6, P. 430-440). Stiprių promotorių paieškos tęsiamos toliau, ypač vienaskilčių augalų, nes manoma,

kad CaMV 35S promotorius tinkamesnis dviskilčiams augalams. Surastas kukurūzų ubik-vitino geno promotorius žymimas kaip Ubi-promotorius, kuris stiprumu apie 10 kartų lenkia CaMV35S promotorių. Dar stipresnį, patį stipriausią, iš žinomų promotorių, pavy-ko rasti žirnių plastocianino gene PetE. Šio geno koduojamas baltymas yra elektrono ne-šiklis. Stiprumu PetE geno promotorius kelias dešimtis kartų viršija CaMV 35S promoto-



rių. Tai suteikia naujas galimybes augalų genų inžinerijai. PetE geno promotoriaus stip-rumas siejamas su A/T poromis gausiu promotoriaus rajonu tarp -176 -444 (vadinamuo-ju. P 268). Jame gausu vietų, prie kurių jungiasi HMG (nuo High Mobility Group) baltymai (6 vietos HMG1 ir 8 vietos – HMG-I/Y baltymams). Šioje vietoje sukuriama savita erd-vinė DNR sandara (juostos), kuri skatina kitų baltymų prisijungimą.

Dirbtiniai promotoriai vis dažniau naudojami įvairiais tikslais. Vienas iš galimų jų pritaikymų paversti geną kontroliuojamai indukuojamu. Dirbtiniuose promotoriuose įvairiais deriniais jungiami žinomi, gerai ištirti cis elementai. Taip sukonstruojamas chime-rinis promotorius arba genas. Pvz., chimerinis LEAFY genas paverstas kontroliuojamu, prie jo promotoriaus prijungus DNR seką, kurią atpažįsta gliukokortikoido receptorius. Teko sukonstruoti ir atitinkamą transkripcijos veiksnį, turintį domeną, kuris jungiasi prie šios DNR sekos. Augalai neturi tokio hormono, tad reikiamas konstravimui sekas teko „pasiskolinti“ iš žinduolių.

LEAFY genas paprastai kontroliuojamas žydėjimo laiko genų. Nagrinėtoje dirbtinai sukurtoje promotoriaus/TV sistemoje LEAFY genas tampa valdomas gliukokortikoido. Paprastai šiam tikslui naudojamas sintetinis hormono analogas deksametazonas.

Chimeriniai promotoriai sukuriami ir grynai dirbtinai sujungiant įvairius žinomus cis elementus. Kaip bazinis (pagrindinis) promotorius, šioje konstrukcijoje vartojamas CaMV 35 S, o geno indukcijai – saviti cis elementai.

Patraukliausia ir iš tiesų, matyt, yra perspektyviausia sukonstruoti tokį promotorių, kuris pasižymėtų itin stipriu atsaku į konkrečius aplinkos veiksnius. Taip tikimasi padidinti augalų atsparumą nepalankiems biotiniams (pvz., patogenams, augalus graužiantiems vabzdžiams ir pan.) ar abiotiniams (sausra, šaltis, sunkieji metalai ir kt.) veiksniams. Teigiamų rezultatų jau yra, pvz., pavyko sukonstruoti chimerinį promotorių, kuris stipriau reaguoja į jazminų rūgštį ir patogeno išskiriamą medžiagą, kuri sukelia augalo apsauginę reakciją. Tokia medžia-ga vadinama elicitoriumi. Ją naudojant nebūtina augalą užkrėsti patogenu. Augalo reakcija būtų lyg jam užsikrėtus patogenu. Promotoriui konstruoti panaudoti du cis elementai. Vienas jų aptinkamas atsako į patogenus promotoriuje − tai cis elementas AGACCGCC. Viename promotoriuje jis sujungtas su W-box elementu (žr. 3.1 lentelę) ir TTGACC, kuris jungiasi su WRKY transkripcijos veiksniais. Šie irgi itin svarbūs atsakui į patogeną. Kaip pagrindinis promotorius, naudotas CaMV 35S. Konstrukcija (G st 1-box):

TTCT AGCCACC AGAT TTGACC AAAC lenkė promotorius su vienu kuriuo iš naudotų konstravimui cis elementų .

Slaptieji (kriptiniai) reguliaciniai elementai yra aptikti tabako ir kitų augalų ge-nomuose, naudojant kaip vektorių T-DNR iš Agrobacterium tumefaciens. Tai įprastinis auga-lų genų inžinerijos vektorius, tik GUS-nos genas neturėjo promotoriaus. Staiga atsirado kas jį pakeičia.

Slaptieji reguliaciniai elementai gali veikti kaip promotoriai, transkripcijos ar translia-cijos enhanceriai, slaptos poliadenilinimo ar splaisingo vietos. Jie turi pakeisti vietą, nes įprastoje vietoje dažniausiai jie yra neaktyvūs. Slaptai reguliacinei nukleotidų sekai pradėti veikti gali pakakti ir mutacijos nukleotidų sekoje: vienos nukleotidų poros pakaitos į kitą arba nukleotidų poros iškritos.

Slaptieji promotoriai labai panašūs į chimerinius promotorius, kurie sukonstruojami dirbtinai. Pvz., tabako slaptasis, be to, veikiantis konstituciniu būdu, promotorius tCUP (nuo tabacco Constitutive Promoter) sudary-tas iš pagrindinio promotoriaus elementų, transkripcijos enhancerių ir dalies 5-UTR. Tabako genome taip pat aptikti slaptieji reguliacijos elementai sudaryti iš kartotinių sekų TGTTGA(T/C)ACCCATTTT(T/C).

246 |

Bendras jų dydis mažiausiai 5 kb, o homologija siekia 80−90 %. Neištyrus tokios sekos funkcinio pasireiš-kimo, sunku įsivaizduoti, kad tai reguliacinė seka.

5.3.4. Elementai, enhanceriai ar moduliai? Promotorių duomenų bazės

Sekoskaita ir cis elementų nustatymas. Sėkmė nustatyti svarbias genų raiškai DNR sekas, tarp jų ir cis elementus, labai priklauso nuo genomų ir genų sekoskaitos rezultatų. Tad neturėtų stebinti faktas, kad vis gausėjant organizmų, tarp jų ir augalų, kurių sekvenuotas ne visas genomas, o bent jo dalis, „kaip iš gausybės rago liejasi“ naujų cis elementų skaičius. Kuo daugiau yra sekvenuota viena kryptimi veikiančių genų, tuo detalesnė promotoriaus ir kitų geno dalių funkcinė sandara ir didesnė tikimybė aptikti cis elementus. Pvz., visų atsargi-nius baltymus prolaminus koduojančių genų promotoriuose yra nustatyta bendra nukleotidų seka TGTAAAG, kuri taip ir pavadinta PB (nuo Prolamin Box) arba pagal atstumą nuo „+1“ starto taško − „-300 elementu“ (žr. 5.1 lentelę), nors šio elemento atstumas nuo transkripci-jos pradžios vietos įvairių augalų ir jų prolaminų genų promotoriuose gerokai skiriasi (5.10 pav.). TCTAAAG seka sudaro PB elemento šerdį. Reikšmingos ir apie ją esančios sekos. Manoma, kad jos lemia prolaminų genų savitumą, nes skiriasi viena nuo kitos dar labiau negu elemento šerdis, kuri yra palyginti labai konservatyvi.

Augalas/genas PROLAMIN BOX seka Vieta Kukurūzai 22-kDa zeinas 19-kDa zeinas 15-kDa zeinas 27-kDa zeinas 10-kDa zeinas Miežiai B-hordeinas C-hordeinas γ-hordeinas D-hordeinas

Kviečiai α-gliadinas LMW-gluteninas HMW-gluteninasRugiai ω-sekalinas

5.10 pav. PB (Prolamin Box) elementas miglinių augalų genų, kurie koduoja atsarginius grū-do baltymus, promotoriuose (pagal J. Vicente-Carbajosa et al. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1997, Vol. 94, P. 7685−7690). Dažnai tas pat elementas, netgi tame pačiame gene, atkartojamas su variacijomis

kaip motyvas. Dar kartą prisiminkime pupelių β-fazeolino geną (žr. 5.4 pav.) ar vairenio AP3 (APETALA3). Pastarasis genas koduoja žiedo vainiklapių raidą (yra B klasės genas). Jo promotoriuje yra trys CArG elementai. Jie būdingi genams, kuriuos valdo MADS TV (5.1 lentelė). Palyginamieji šio geno tyrimai augaluose atskleidė įdomius dėsningumus:



– vienas CArG elementas yra konservatyvus (žr. 5.3 intarpą) visiems tirtiems AP3 genams;

– kiti CArG pastebimai skiriasi. Be to, visi trys elementai atlieka skirtingą reguliaci-nį vaidmenį (5.11 pav.).

5.11 pav. Vairenio APETALA3 (AP3) geno promotoriaus funkcinė sandara: Prie CArG(1, 2, 3) elementų jungiasi transkripcijos veiksniai, kurie yra aktyvikliai ir slopikliai (žr. tekstą; pagal J. J. Tilly et al. Development. 1998, Vol. 125, P. 1647−1657).

5.3 intarpas. Kodėl nukleotidai gali būti užrašomi mažosiomis raidėmis? Būtina atkreipti dėmesį, kad visų PB (Prolamin Box) elementų šerdis yra labai konservatyvi (pa-stovi). Kiekvienoje jos padėtyje nukleotidai 100 % sutampa. Dažniau susiduriame su elemento variacijomis, o seka nurodoma kaip konsensusas, pagal tai, koks nukleotidas kiekvienoje padė-tyje yra vyraujantis. Tačiau kaip patikimas priimamas nukleotidas, kurio dažnis atitinkamoje pa-dėtyje viršija 54 %. Mažesnio dažnio, bet vyraujantis nukleotidas nurodomas mažąja raide, o jeigu dviejų nukleotidų pasiskirstymas atitinkamoje sekos padėtyje yra maždaug vienodas, nu-rodomi abu nukleotidai (pvz., A/T, T/C ir pan.). Gali būti, kad konkrečioje padėtyje nėra vy-raujančio nukleotido, tokią padėtį žymi N. Kuo daugiau organizmų, kuriems galioja nustatyto elemento ar apskritai geno homologija, tuo didesnis elemento ar geno konservatyvumas, tuo gilesnės jo kilmės šaknys. Pvz., TATA ele-mentas aptinkamas visų tirtų organizmų genuose, bet įsitikinome, kad ne visuose genuose. Ne-daug, bet varijuoja ir nukleotidų sekos pačiame TATA elemente. Vis tik pripažįstamas didelis, vienas iš didžiausių, jo konservatyvumas. Jeigu seka kartojasi įvairiuose organizmuose ar funk-cija susietų genų grupėje, sprendžiama apie jos svarbą. Kai seka toje pačioje geno dalyje karto-jasi su variacijomis, ji vadinama motyvu. Tie patys statistinės sekų analizės principai vienodai taikomi visoms nukleotidų sekoms, tarp jų genams, judriesiems genomo elementams ir netgi genomams. Suprantama, atpažinti atsikarto-jančias, reikšmingas sekas, nustatyti jų konsensusą, konservatyvumą ir evoliucinius ryšius be kompiuterinių programų ir turtingų duomenų bazių, neįmanoma. Tačiau būtinos ir geros ži-nios, įgūdžiai ir analitiko gebėjimai. Daug atradimų dabar daroma „in silico,“ t. y. kietajame dis-ke. Taip, pvz., atrasta keletas judriųjų genomo elementų, apie kuriuos iki tol nebuvo žinoma, tačiau jų gebėjimą judėti teko įrodyti genetiniais metodais. Kompiuterinės analizės metodais pagal homologiją nustatomi įvairūs elementai ir genai, jų skaičius genome. Apie jų koduojamų

248 |

produktų paskirtį irgi sprendžiama iš homologijos ir analogijos su žinomais elementais ar ge-nais. Taip galima nustatyti, kiek vairenio genome yra MYB ar MADS šeimų genų, o pagal ati-tinkamų elementų buvimą, pvz., ABRE (5′-CCACGTGG-3) geno promotoriuje, kad jis valdo-mas hormono abscizo rūgšties, ar pan. Tačiau konkreti funkcinė geno ar elemento reikšmė, vie-ta ir pasireiškimo laikas nustatomi kitais metodais.

Modulinė promotoriaus sandara. Sukurtos specialios kompiuterinės programos aptikti cis reguliacinius elementus: MEME, CONSESUS, DRAGON MOTIF BUILDER (DMB) ir kt. Duomenys apie promotorius kaupiami duomenų bazėse: Athena, Plant CARE, Plant Prom ir kt. Athena bazėje 2005 m. jau buvo 30067 vairenio promotorių.

Bioinformatikai nurodo, kad promotoriuje vidutiniškai turėtų būti 15−16, o kitais duomenimis – net iki 30 reikšmingų cis elementų. Kita vertus, gausėjant žinių apie cis elementus, išnyksta ribos tarp cis elementų, kurie yra pačiame promotoriuje ir už jo ribų, taip pat tarp cis elementų, kurių paskirtis − skatinti geno raišką (enhancerio), ir cis sekų, dėl kurių geno raiška silpnėja (sailenserių). To paties cis elemento reikšmė gali būti skir-tinga, kaip tai yra jau minėtų TATA elementų β-fazeolino gene arba CArG elementų AP3 gene.

Funkcinius cis elementų skirtumus nulemia įvairios priežastys: • kaip ir kur išsidėstę cis elementai promotoriuje ir už jo ribų; • koks TV jungiasi prie cis sekos: ar represorius, ar aktyvatorius; • kokiais tarpusavio deriniais jungiasi TV ir kiti trans veikiantys veiksniai; • ar susidaręs kompleksas sąveikauja tik su vienu ar daugiau kaip vienu cis elemen-

tu. Labai daug žinių apie promotoriaus funkcinę sandarą teikia genų ortologų iš skirtin-

gų augalų ir genų paralogų palyginimas to paties augalo genome. Prisiminkime, kad orto-logas yra tapatus (homologinis) genas įvairiuose organizmuose. Daugiau ar mažiau gali skirtis jo nukleotidų sekos, bet pakankamai didelė yra ir jų homologija. Paralogai yra dup-likuoti genai tame pačiame genome, dažnai dėl mutacijų įgiję skirtingą funkcinę reikšmę.

Palyginkime du ortologus genus ADH1, vieną kukurūzų, o kitą vairenio (5.12 pav., A). ADH1 genas koduoja augalui labai svarbų fermentą alkoholdehidrogenazę, skaidantį alkoholį, kuris dažniausiai susidaro esant hipoksijai, kai trūksta deguonies. Nors abu genai koduoja tą patį fermentą ir jų promotoriuose yra tokių pačių cis elementų GC ir GT, jų išsidėstymas, atstumas ir netgi kryptis nedidelėje 40−70 bp atkarpoje skiriasi: vairenio atsiranda papildomas G-elementas, kurio neturi kukurūzų ADH1 geno promotorius. Ir dar būtina atkreipti dėmesį į du elementus (5.12 pav., A), pažymėtus kaip MBS-1 ir MBS-2. Tai cis elementai, prie kurių jungiasi MYB šeimos transkripcijos veiksniai. Jie iš esmės skiriasi: MBS2 yra dimeras, sudarytas iš 2-jų cis elementų, o MBS1 – tik iš vieno elemento. Matyt, tai nulemia skirtingų TV prisijungimą, kai veikia skirtingi stresą sukeliantys aplin-kos veiksniai (žr. toliau).

Panašūs skirtumai nustatomi ir tarp kitų genų ortologų ar netgi paralogų. Tuo gali-me įsitikinti dar kartą pažvelgę į 5.6 ir 5.7 paveikslus. AGAMOUS geno 2-ajame introne esantys CArG ir kiti elementai taip pat derinasi įvairiais deriniais ir atstumais kaip modu-liai. Taip sukuriama unikali promotoriaus funkcinė sandara, būdinga konkrečiam genui, nors šis koduoja tą patį arba beveik tą patį baltymą.



5.12 pav. Vairenio ir kukurūzo alkoholdehidrogenazės ADH1 ortologų promotorių palygi-nimas (A) ir vairenio ADH1 geno raiškos reguliavimo pobūdis, kai kinta aplinkos veiksniai (B): rodyklėmis parodytas cis elemento aktyvumas: − aktyvus; − slopinamas; kuo daugiau rodyklių, tuo didesnis cis elemento aktyvumas arba, atvirkščiai, slopinimas; didžiausias reguliavimo pasireiškimas, kai trys rodyklės (A pagal F. U. Hoeren et al. Genetics. 1998. Vol. 149, P. 479−490; B pagal R. Dolferus et al. Plant Physiology. 1994, Vol. 105, P. 1075−1087). Kaip galėjome įsitikinti, modulinė sandara būdinga ir reguliaciniams elementams,

esantiems už promotoriaus ribų, kitose geno dalyse, kaip tai yra 2-ajame AGAMOUS geno introne.

Modulinė reguliacinių struktūrų sandara yra būdas sukurti geno unikalumą genomo sistemoje. Moduliai išsidėsto įvairia tvarka, atstumais, įvairiose vietose ir įvairiomis kryptimis. Skiriasi ir jų skaičius promotoriuje ir kitose reguliacinės paskirties struktūro-se, tarp jų ir tose, kurios kontroliuoja geno raišką po transkripcijos.

A

B

250 |

Sait-specifinė mutagenezė − cis sekų funkcinės analizės metodas. Sait-specifinė mutagenezė yra puikus būdas nustatyti bet kurios nukleotidų sekos, kad ir pro-motoriaus cis elementų funkcinę reikšmę. Tai kryptingai valdomas mutacijų gavimo bū-das. Tiriamoje nukleotidų sekoje gali būti padaryti įvairūs pakeitimai:

• viena nukleotidų pora (ar visa seka) pakeista kita = pakaita, • nukleotidų pora (ar visa dominanti seka) pašalinta = iškrita (delecija), • įterpta nukleotidų pora arba ištisa nukleotidų seka = intarpas (insercija). Kaip pavyzdį vėl pasitelkime vairenio ADH1 geną (5.12 pav., B). Jo valdymas yra

daugiaplanis. Jį sužadina abscizo rūgštis ir paprasčiausias mechaninis augalo pažeidimas, šaltis, dehidratacija ir, atvirkščiai, padidintas vandens kiekis, ypač dirvoje. Genas pasireiš-kia ir be sužadinimo (indukcijos). Bet svarbiausias veiksnys yra hipoksija – deguonies stoka. Kiti aplinkos veiksniai irgi gali, kad ir netiesiogiai, sukelti hipoksiją, pvz., padidintas vandens kiekis dirvoje augalo šaknų ląstelėms. Tai dar viena šio geno pasireiškimo ypaty-bė: genas sužadinamas ne visuose augalo audiniuose iš karto, o matyt, tik tuose, kurie tiesiogiai kenčia nuo minėtų stresą sukeliančių veiksnių, kaip augalo šaknys nuo deguo-nies stokos dėl suplūktos ar per daug įlietos dirvos. Visa tai atsispindi geno promotoriaus sandaroje, kuri buvo nustatyta sait-specifinės mutagenezės būdu. Remiantis juo ADH1 promotorius buvo padalintas į keturis regionus (5.12 pav., B), kurių svarba geno atsakui į įvairius aplinkos veiksnius nevienoda. Tai vėl nustatyta sait-specifinės mutagenezės būdu. Kryptingos mutacijos padarytos įvairiuose regionuose ir net jų vietose (III ir IV regionų), ir stebėta, kokios įtakos tai turės, kai yra skirtingos aplinkos sąlygos: šaltis, dehidracija, deguonies stoka ir pagaliau, kai genas veikia konstituciniu būdu (be indukcijos).

Mutacijos I ar II regionuose geno raiškai tirtomis sąlygomis neturėjo didelės įtakos. Ypatinga svarba nustatyta III ir IV regionų. Paaiškėjo, kad IV regionas apskritai labai svar-bus geno raiškai bet kokiomis aplinkybėmis, o III regione esantys du G-elementai savitai reguliuoja geno raišką, kai yra skirtingos aplinkos ir geno veikimo sąlygos. Konkrečiai muta-cijos G1 ir G2 elementuose šiek tiek padidino geno raišką, kai stokojama deguonies, bet labai padidėjo geno raiška be sužadinimo, jeigu mutacijos įvykę G2 elemente. Galima many-ti, kad G1 ir ypač G2 elementai neleidžia genui pereiti į sužadintą režimą. Mutacijos G1 ele-mente šiek tiek padidino geno raišką, kai buvo dehidratacija, bet visiškai nekeitė geno akty-vumo esant šalčiui. Kas kita, mutacijos G2 elemente. Jos labai stipriai slopino ADH1 geno raišką, kai buvo dehidratacija ir ypač, kai buvo šalta (5.12 pav., B). Vėl galima daryti išvadą, kad G2 elementas kontroliuoja ADH1 geno atsaką į dehidrataciją ir šaltį.

ADH1 genas tik vienas iš daugelio, kurio funkcinei struktūrai tirti panaudotas sait-specifinės mutagenezės metodas. Pateiktas pavyzdys parodo, kaip jis taikomas.

5.4. Transkripcijos veiksniai ir augalo evoliucija

5.4.1. Bendras apibūdinimas ir transkripcijos veiksnių šeimos

Modulinė sandara būdinga daugeliui transkripcijos veiksnių (TV), kurie sudaryti iš domenų, arba daugybines funkcijas atlieka trans-veikiančių baltymų kompleksas. Pagrin-diniai yra du domenai:

• DB (arba DBD) (nuo DNA Binding Domain), kuriuo TV atpažįsta būdingą cis elementą (nukleotidų seką) ir su ja jungiasi;



• AD (Activation Domain), kuriuo palaikomas ryšys su transkripcijos iniciacijos kompleksu ir RNR polimeraze.

Tipiškas „visavertis“ TV sudarytas iš kelių domenų. Be jau minėtų DB ir AD, jame dar yra:

• signalinių molekulių prisijungimo vietos/domenas, būdingas tiems TV, ku-rių veikla sužadinama signalinių molekulių (hormonų) ir aplinkos veiksnių;

• oligomerizacijos domenas(-ai), būdingas tiems TV, kurie veikia ne kaip mono-meras, o sudaro kompleksus su kitais trans-veikiančiais veiksniais, tarp jų ir su kitais TV, pagal tai skiriami

homo- ir heterodimerai, tetramerai = homo- ir hetero- oligomerai; homo – sudaryti iš tapačių baltymų, o hetero – iš skirtingų, pvz., žiedo organų raidą kontroliuojantis „kvartetas“ sudarytas iš 2−3-ų skirtingų baltymų;

• NLS (nuo Nuclear Location Signal) – tai aminorūgščių sekos, kurios reguliuoja jau subrendusio baltymo pernašą į branduolį. Prisiminkime, visi baltymai sintetinami citop-lazmoje ir visi branduolio baltymai turi būti gabenami į branduolį. Be to, jie turi būti pa-talpinti reikiamoje vietoje, tam tikroje branduolio srityje. Augalų tai kol kas mažai ištirta.

TV koduojantys genai irgi yra valdomi. Susidaro TV kaskada: aukščiau esantis (prieš srovę) genas valdo žemiau kaskadoje esančius genus (pasroviui). Gana dažnai prie juos koduojančio geno jungiasi netgi tokios pat šeimos TV. Kaip ir kiti genai, TV genai val-domi visais lygmenimis: transkripcijos, transkripto brendimo, pernašos į citoplazmą ir kt. būdais. Patys TV gali būti modifikuojami, dažniausiai – fosforilinami. Pvz., kukurūzų (miglinių) Opaque 2 TV jungiasi su DNR tik nefosforilintas. Įdomiausia tai, kad Q2 fos-forilinimas sustiprėja dieną, o susilpnėja naktį. Tad atsarginių grūdo baltymų sintezė stip-riau vyksta naktį. Daug baltymų yra pernešami į branduolį tik tada, kai yra modifikuoti. Branduolio porų kompleksas atlieka sieto vaidmenį du kartus:

– reguliuoja transkripto išėjimą į citoplazmą; – baltymo patekimą į branduolį. Daug TV turi ne vieną, o du ir daugiau NLS. Pvz., kukurūzų HD šeimos TV

Hox2a ir 2b turi net 8 NLS. Jie išsirikiavę į vieną grandinę šių TV N-gale. Kai kurie TV, tarp jų kviečių KNOTTED1 ir kukurūzų Opaque 2, turi du skirtingos funkcijos NLS. Taip kontroliuojamas šių TV patekimas į branduolį.

NLS nepriklauso nuo DB domeno. Maži baltymai gali neturėti NLS ar kitų modulių, tada šią funkciją atlieka kiti baltymai. Tai irgi papildomas būdas „laike ir vietoje“ reguliuo-ti geno pasireiškimą. Pasitaiko ir sudėtingesnių atvejų. Kai kurie TV nepraleidžiami į branduolį tol, kol nesusidaro dimeras ar oligomeras arba, atvirkščiai, kol nuo TV neatsi-skiria prisijungęs kofaktorius. Taip vadinami visi veiksniai, kurie tiesiogiai nesijungia su DNR, bet veikia TV pasireiškimą. Pvz., du MADS šeimos TV APETALA ir PISTILLATA, kurie priklauso žiedo organų raidos vad. B klasei (įtakoja vainiklapių ir kuokelių raidą) sudaro heterodimerą dar citoplazmoje, ir kol to neatsitinka, jie į branduolį nepatenka.

TV oligomerizacija, kofaktoriai, modulių derinys nulemia atskirų TV išskirtinumą, individualų pasireiškimą, nors palyginti yra mažas sudedamųjų dalių skaičius.

252 |

Kofaktoriai dažniausiai neturi DB domeno, bet turi domenus sąveikai „baltymas-baltymas“. Jie irgi priklauso trans veikiančių veiksnių grupei. Kaip pirminis metodas aptikti kofaktorius ir pačius TV, dažniausiai naudojama mielių dihibridinė sistema (5.4 intarpas).

5.4 intarpas. Trans –veikiančių veiksnių tyrimas mielių dihibridine sistema ir jos modifikacijomis

Dauguma trans-veikiančių veiksnių (ne tik TV, bet ir įvairių kitų baltymų) yra sudaryti iš modu-lių (domenų). Tuo pagrįsta mielių Saccharomyces cerevisiae dihibridinė sistema ir jos modifikacijos. Tai priklauso, kokio „grobio“ tikimasi: • dihibridinė sistema (pagrindinė). Tiriama sąveika „baltymas-baltymas“, nustatomi baltymai, ku-

rie sąveikauja vienas su kitu (pvz., vienas TV, o kitas aktyvatorius-tarpininkas tarp TV ir RNR polimerazės);

• monohibridine sistema „pagaunamas“ baltymas, kuris jungiasi su DNR (yra TV); • trihibridine sistema tiriama sąveika „RNR-baltymas“, t. y. „pagaunami“ baltymai, kurie turi

RDB domeną ir jungiasi su RNR. Pirmajai mielių dihibridinei sistemai sukurti pasinaudota GAL4 geno koduojamu baltymu; jis turi du domenus: BD − juo baltymas jungiasi su DNR, o taip pat aktyvacijos domeną AD. Juo baltymas jungiasi su II RNR polimeraze (sąveika „baltymas-baltymas“). BD funkcijai užtenka 65−100 aminorūgščių. GAL-4 baltymo N gale. Kaip reporteris, dažnai naudojamas lacZ genas, kuris koduoja β-galaktozidazę. Ji aptinkama pa-gal spalvinę reakciją. Sistemoje GAL4 geno koduojanti dalis padalinama į dvi dalis:

– vienoje lieka BD; – kitoje – AD domenus koduojančios sekos. Toks padalintas genas neveiksnus, ir atskirai

paimtos GAL4 TV dalys neaktyvina reporterio geno. X Y

AD BD Plazmidė „grobis“

Plazmidė „jaukas“

Y

Transkripcijos sistema

AD BD X

XBD

Y AD

Genas reporteris

Konstruojamos dvi hibridinės plaz-midės:

– vienoje jų įterpta GAL4 geno dalis, koduojanti BD. Ji suliejama su tiria-mojo baltymo koduojančia geno dali-mi, vadinamuoju „jauku“ (angl. „bait“) (X). Jo sąveiką su kitais balty-mais ir norima ištirti;

– kitoje plazmidėje yra GAL4 geno AD dalis, sulieta su genu, kuris koduoja baltymą – laukiamą „grobį“ (angl. „prey“) (Y), bet gali būti vadinamas ir „žuvimi“ (angl. fish) (irgi užkimba ant ,,jauko).“

Abu hibridiniai baltymai ekspresuojami vienoje ląstelėje, ir „grobis“ paklius tik tada, jeigu X jungsis su Y ( pasireikš sąveika „baltymas-baltymas“) ir tuo pačiu susijungs BD ir AD. Tik esant tokiai sąlygai pasireiškia reporteris. Arba kitaip, reporterio raiška parodo, kad tiriamieji baltymai jungiasi vienas su kitu. Paprastai „grobis“ būna ne toks jau didelis, nors pasiruošiama ir bandoma daug hibridinių genų su GAL4 geno AD dalimi. Šiuo metodu nustatoma ne tik sąveika „baltymas-baltymas“ tarp to paties genomo trans – vei-kiančių veiksnių, bet ir funkciniai ortologai kituose genomuose. Vairenio „jaukas“ gali tikti „grobiui“ iš kitų augalų. Šiuo būdu išaiškinti baltymai (ir juos koduojantys genai), kurie sąvei-



kauja su AP3 baltymu petunijos (Petunia) arba žioveinio (Antirrhinum) genomuose. Kai „grobiu“ yra baltymas, kuris jungiasi su DNR, atpažindamas cis sekas, „jaukas“ yra atitin-kamas promotorius su cis elementu, o „grobis“ – baltymas, kuris jungiasi su šiuo elementu. Tad konstruoti tenka tik vieną chimerinį geną. Metodas ne visiems baltymams pritaikomas, gali gau-tis neteisingi rezultatai. Į tai atsižvelgiama, todėl taikomi ir kiti metodai sąveikoms „DNR- bal-tymas“, „RNR-baltymas“ ir „baltymas-baltymas“ tirti. (Pagal B. Causller. Mass Spectrometry Reviews. 2003, Vol. 23, P. 350−367).

DB domenai. TV šeimos. Daug DB domenų yra labai konservatyvūs, todėl ben-dri visiems eukariotams (5.2 lentelė), tačiau, kaip pastebėjote, yra tik augalams būdingų TV šeimų.

5.2 lentelė. Kai kurių transkripcijos veiksnių skaičiaus¹ palyginimas įvairių organizmų ge-nomuose

Transkripcijos veiksnių šeima

Saccharomyces cerevisiae

Caenorhabditiselegans

Drosophila melanogaster

Homo sapiens

Arabidopsis thaliana

HD (homeodomeno) MYB bZIP Zn ,,pirštelių“ ² bHLH MADS AP2/EREBP NAC

9 15 71 121 8 4 0 0

109 17 25 148 41 2 0 0

148 18 81 297 84 2 0 0

267 32 131

- 131

- 0 0

127 243 157

281-353² 153 116 155 108

¹ – Skaičiai yra gana santykiniai, remiantis keliais šaltiniais [J. L. Riechmann et al. Science. 2000. Vol. 290, P. 2105−2110; G. A. Wray et al. Molecular Biology and Evoliution. 2003, Vol..20, P. 1377−1419; K. Iida et al. DNA Research. 2005, Vol. 12, P. 247−256; G. Toledo-Ortiz et al. Plant Cell. 2003, Vol. 15, P. 1749−1770], ne visiškai sutampantys, keičiasi su išsamesniais genomų tyrimais; ² – ypač nepatikimi skaičiai, nes Zn ,,pirštelių“šeima dalijasi į keletą smulkesnių šeimų (žr. 5.3 lentelę)

Komentarai: a − akivaizdus skirtumas tarp vienaląsčių mielių ir daugialąsčių organizmų; b − suklestėjusios MADS, MYB, AP2/EREBP, NAC šeimos augalų genome; c − apskritai didesnis transkripcijos veiksnių skaičius augalo genome.

Transkripcijos veiksniai skirstomi pagal tai, kaip jie jungiasi su DNR, kokius cis ele-

mentus atpažįsta jų DB domenas ir kokias genų grupes jie kontroliuoja. Pagal sąveiką su DNR ir erdvinę DB sandarą skiriami keli TV tipai, tarp jų dažniausi (5.13 pav.):

• Spiralė-posūkis-spiralė, arba kitaip HTH (nuo Helix-Turn-Helix) šiam tipui priklauso ir HD šeima su keliais pošeimiais (žr. 3.3 intarpą).

• Cinko „pirštelių“ motyvas – su DNR sąveikaujama cinko „piršteliais“, sudaro keletą šeimų, kurios skiriasi pagal „pirštelių“ skaičių, sandarą ir papildomas aminorūgščių sekas, pvz., WRKY (5.3 lentelė). Kai kurios šeimos unikalios, būdingos tik augalams, pvz., DOF (nuo DNA-binding with One Finger) – tik su vienu Zn „piršteliu“. Tačiau yra didelė grupė baltymų, kuriems būdinga cinko „pirštelių“ sandara, o paskirtis kita - sąveika „bal-tymas-baltymas“, tarp jų daug baltymų, kurie yra E3 ubikvitinligazės komplekso dalis, tarp jų RING domeną turintys baltymai (žr. 2.7 intarpą).

254 |

5.13 pav. Įvairūs transkripcijos veiksniai ir jų sąveikos su DNR modeliai: L – leucinas. • Leucino „užtrauktuko“ motyvas, arba kitaip bZIP (nuo basic leucine-rich ZIpper-like

Protein), yra iš dviejų lygiagrečių polipeptidų, kurių kiekviename reguliariai išsidėstę Leu liekanos sudaro tarp polipeptidų darinį, panašų į užtrauktuką, o bazinis domenas būtinas polipeptidų dimerizacijai.

• Spiralė-kilpa-spiralė arba kitaip bHLH (nuo Helix-Loop-Helix) − domene skiriamos dvi dalys N-galu jungiamasi su DNR, o C-galas yra dimerizacijos, viso apie 60 amino-rūgščių, pošeimiai skiriasi jungimusi prie skirtingų cis elementų (G-box, E-box, N-box, non-E-box).

• MYB, arba kitaip HHTH, turi 51−52 aminorūgščių ilgio kartotinį domeną (žr. 3.4 intarpą), kurio sandara „spiralė-spiralė-posūkis-spiralė“. Skiriasi pagal kartotinių MYB sekų skaičių: nuo 3-ų (kaip gyvūnų), augalų dažniausiai – 2, bet būna ir vienas. Labai su-vešėjusi augalų genomuose superšeima (5.2 lentelė).

• MADS TV − dar viena suvešėjusi augalų genome TV superšeima (5.2 lentelė). Domenas sudarytas iš vienos ilgos α-spiralės ir 2-ų β-grandinių. Sąveikauja su vadina-muoju. CArG elementu, dažniausiai CC(A/T)6 GG (5.5 intarpas), keičia DNR erdvinę sandarą (juostas).

–OOC

–OOC



5.3 lentelė. TV plėtra magnolijūnų genome lyginant su žaliadumbliais (pagal D. M. Riano-Pachon, I. Dreyer, S Ruzicic, B. M. Mueller-Roeber: diriano, dreyer,

ruzic, bmr@uni- potsdam.de)

TV šeima O. tauri C. reinhardtii A. thaliana P. trichocarpa O. sativa ABI3/VP1 AP2/EREBP ARF bHLH bZIP

0 8 0 1 8

1 10 0 4 7

59 155 31 153 88

85 207 37 165 83

57 172 36 163 102

C2C2-Co like C2C2-Dof C2C2-GATA C2C2-YABBY C2C2 C3H WRKY

1 1 3 0 4 19 3

1 1 7 0 4 14 1

19 42 30 5

104 71 82

15 41 39 12 134 98 101

21 33 33 11 109 90 109

GRAS ND zf-HD MADS

0 6 0 1

0 1 0 2

34 94 16 116

99 126 23 101

54 112 15 80

MYB MYB-related NAC Trihelix TUB

11 15 0 0 1

11 14 0 0 2

156 81 108 26 12

195 106 163 43 11

125 94 139 21 17

Fone – įvairios Zn „pirštelių“ šeimos; ABI3 – abscizo rūgšties atsako; ARF – auksino atsako; TUB – citoske-leto transkripcijos veiksniai. Genomai: žaliadumblių Ostreococcus tauri ir Chlamydomonas reinhardtii; vairenio (Arabidopsis thaliana), trivaisės tuopos (Populus trichocarpa); sėjamojo ryžio (Oryza sativa). Visų augalų genomai sekvenuoti.

• AP2/EREBP domeną turintys TV. Domenas (68 aminorūgščių) sudaro amfifili-

nę α-spiralę (viena dalis yra hidrofilinė, o kita – hidrofobinė).

5.5 intarpas. MADS transkripcijos veiksniai valdo ne tik žiedo organų raidą Iš tiesų MADS domeną turintys transkripcijos veiksniai (TV) valdo ne tik ABCDE funkcijas, bet ir kitus svarbius augalo raidos įvykius: • -žiedyno ir žiedo meristemų susidarymą,

APETALA1, CAULIFLOWER, FRUITFULL genai kontroliuoja žiedyno sandarą regu-liuodami du ne-MADS genus LEAFY ir TERMINAL FLOWER;

• SOC1 (SUPPRESSION OF OVER-EXPRESSION OF CONSTANS, arba AGL20), regu-liuoja žydėjimo pradžios/fotoperiodizmo ir cirkadinį (diena-naktis) geną CONSTANS;

• ląstelių tipo specifikaciją: SHATTERPROOF 1 ir 2 koduoja veiksnį, kuris nulemia vaisių atsiskyrimo zonos ląsteles, FRUITFULL yra būtinas ląstelių dalijimuisi, ekspansijai ir diferenciacijai lapuose ir žiedy-ne;

• žydėjimo pradžią reguliuoja FLC (FLOWERING C) genas; • keletas genų kontroliuoja šaknų raidą,

ANR1 – šoninių šaknų susidarymą kaip atsaką į N (azotą) ir kt. MADS TV koduojantys genai pagal skaičių vairenio genome yra vieni iš gausiausių. Šį domeną

256 |

koduojančias nukleotidų sekas turi per 100 vairenio genų. MADS pavadinimas kilęs iš 4-rių genų (be to, iš skirtingų organizmų) pirmųjų raidžių

– MCM1 – mielių Minichromosome Maintenance1 = feromonų atsako/ląstelių ciklo genas; – AG – vairenio AGAMOUS = lytinių organų identiteto; – DEF – žioveinio (Antirrhinum majus) DEFICIENS = ortologas AP3 genui; – SRF – žinduolių Serum Response Factor = kraujo serumo (cirkadinio ritmo) veiksnio ge-

nas. Labai akivaizdi intensyvi MADS domeną turinčių genų evoliucija augalų genomuose. Ne tik pagal didelį genų skaičių (žr. 4.2 lentelę), bet ir pagal TV sandarą. Augalų MADS TV skirstomi į du tipus:

– II tipo MADS baltymai N-gale turi MADS domeną ir I rajoną, taip pat K-box, baigiasi C-domenu, todėl šio tipo genai/baltymai dar vadinami MIKS-MADS: I – yra tarpinin-kas (Intermediate) ir K yra panašus į gyvūnų citoskeleto baltymą keratiną. Abu šie do-menai reikalingi sąveikai „baltymas-baltymas“, nes MADS TV sudaro multimerinius kompleksus. C-gale yra transaktyvinimo domenas. Jis nėra toks konservatyvus kaip kiti domenai;

– I tipo MADS baltymai neturi I ir K rajonų. Augaluose šio tipo MADS funkcijos aptiktos visai neseniai. Įdomu tai, kad II tipo MADS baltymai yra išimtinai augalų genome:

SRF (gyvūnai ir grybai)

I tipas (augalai)

II tipas (augalai)

MEF2 (gyvūnai ir grybai)

MADS SAM

MADS

MADS

MADS

MEF2

I K C čia MEF2 (Myocite enhancer factor 2); SRF – žiūr. aukščiau.

Žiedo tapatumo genai (ABCE klasių) koduoja antrojo tipo MADS TV. Augalų MADS TV, kaip ir gyvūnų ar grybų, jungiasi prie DNR nukleotidų sekos, kurios kon-sensusas yra CC(A/T)6GG, vadinamas CArG-box(cis) elementu. Tai tik konsensusas. Įvairių TV MADS domenas atpažįsta gerokai besiskiriančias sekas. Ši seka iš įvairių augalų ir genų šiek tiek skiriasi. Antai vaisių ir gametofito raidą reguliuojantis TV AGL15 (AGAMOUS-LIKE15) atpažįsta DNR sekas TAGCTATATAATGTTG arba TATCTATTTATTGATT, arba CCTCCAAATGTGGCAA . Ypač pastebimai skiriasi kaimyninės CArG elementui sekos. Gali būti, kad kaip tik jos nulemia skirtumus tarp augalo ekotipų, to paties geno pasireiškimą skirtingu laiku ir skirtingoje vietoje. Dar viena šių TV savito pasireiškimo priežastis yra baltymų dimerizacija ir oligomerizacija. MADS domeną turintys TV sudaro dimerinius ir multimerinius kompleksus. Tyrimais nustaty-ta, kad gali būti bent 269 dimerų dariniai, o žiedo organų identitetą lemia kvartetai: keturių bal-tymų kompleksai. Sąveikos su valdomais genais savitumą nulemia ir kompleksai su kitais, ne MADS TV tipo, veiksniais. Vien tik AGAMOUS tiesiogiai arba netiesiogiai valdo bent 200 genų. Tai genai, kurie koduoja signalų perdavimo baltymus, kitus TV, struktūrinius baltymus, α ir β-tubulinus. Įdomu tai, kad



– MADS TV gali sąveikauti su juos pačius koduojančių genų promotoriais. Tokia savire-guliacija nustatyta, pvz., B grupės MADS genams GLOBOSA, DEFCIENS žioveinio (A. majus) genome; savireguliacija nustatyta ir AGL15 genui;

– vienų MADS TV taikiniu yra kiti MADS TV koduojantys genai, kad ir daug kartų minė-tas genas SPOROCYTELESS. Jis lemia gametogenezę ir yra AGAMOUS MADS TV taikinys. AG TV taip pat jungiasi su kitų MADS TV koduojančių genų SEPALLATA 3 (SEP 3), AP3 (APETALA3), PISTILLATA (PI) promotoriais.

Daugelis tik augalams būdingų TV yra atsiradę iš bendrų DB (HTH, ZIP, HLH) tik su papildomomis sekomis, pvz., SHAQK(Y/F)F ar WRKY, arba MYB su skirtingu kartotinių domenų skaičiumi ir pan.Vienas TV gali turėti ne vieną DB domeną.

Gausios NAC superšeimos (5.2 lentelė) TV gali atpažinti ne vieną cis elementą, tarp jų CATGTG seką, būdingą atsakų į abiotinius stresus genams. Tačiau NAC TV kontro-liuoja labai skirtingus procesus ir reiškinius. Tai parodo net šeimos pavadinimo kilmė. Ji iš 3-ų skirtingus procesus kontroliuojančių genų: N −iš geno NO APICAL MERIS-TEM(NAM), mutantas nam yra letalus, visiškai nesusidaro viršūninė meristema; A − iš ATAF1-2 (streso atsako) genų, o C − iš CUC2 (CUP-SHAPED COTYLEDON2). Mutantų cuc2 skilčialapiai panašūs į puodelį. NAC genai kontroliuoja žydėjimo genus. Tokia kon-troliuojamų genų įvairovė yra todėl, kad NAC šeimos TV yra dimeras ir gali susidaryti homo- ar heterodimerai. Padidėja galimybės atpažinti cis elementus. DB pagrindą sudaro apie 60 aminorūgščių HTH, bet visas DB yra apie 160 aminorūgščių ir dalijasi į 5 sub-domenus. Dimerą sudaro monomerai su antiparalelinėmis grandinėmis, viena – ilgesnė, kita – trumpesnė. Taip sukuriama unikali NAC DB sandara. Dar vienas šios šeimos kai kurių TV ypatumas: apie 10 % NAC TV susieti su membrana. Tai jų aktyvinimo būdas (žr. toliau).

Gausią cinko „pirštelių“ TV šeimų (C2H2, CBH, WRKY) grupę skiria įvairi cinko pirštelių sandara. Be to, kaip minėta,WRKY šeimos TV turi būdingą aminorūgščių seką WRKYGQK, nuo kurios pirmųjų aminorūgščių kilę šeimos (5.3 lentelė) ir W-box cis ele-mento (5.1 lentelė), kurį atpažįsta WRKY šeimos TV, pavadinimai.

Ne tokia unikali, kaip anksčiau manyta, bet irgi gausi augalų genomuose yra AP2/EREBP šeima (5.2 lentelė). Jos neaptikta nei mielių, nei gyvūnų ląstelėse, tačiau sėkmė prklauso, kur ieškoti. Šios šeimos TV aptikta pirmuonių, tarp jų itin gerai ištirtos Tetrahymena termophila, melsvabakterijų (pvz., Trichodesmium erythraeum), virusų (Bacteriophage Felix 01) genomuose. Spėjama, kad į augalų genomus šiuos TV koduojantys genai pakliu-vo horizontaliosios rekombinacijos būdu, t. y. pernešti iš vieno genomo į kitą. Gana daug šios TV šeimos genų yra tirtų žaliadumblių genomuose (5.3 lentelė), iš kurių kildinami augalai. Tad horizontaliosios rekombinacijos įvykis turėjo būti prie pačių augalų kilmės ištakų.

Kai kurias TV šeimas, kurios unikalios arba labai suvešėjusios augalo genome, be-veik tiesiogiai galima susieti su konkrečiu reiškiniu ar procesu. Taip MADS TV dažniau-siai kontroliuoja augalo organų raidą. Tada suprantamas ir šios šeimos suvešėjimas: auga-lo organai visiškai skiriasi nuo kitų organizmų (gyvūnų) organų. Jų raidai kontroliuoti HD TV, kurie būdingi gyvūnų organų raidai, augalams netiko.

Savitas krūvis augalo gyvenime tenka ir AP2/EREBP šeimos TV. Kaip rodo antroji pavadinimo dalis, šios šeimos TV kontroliuoja atsaką į hormoną etileną: EREBP (nuo

258 |

Ethylene REsponsive Binding Protein). Etilenas kontroliuoja augalo vaisių brendimą, atsakus į biotinius (vadinamąjį jazminų rūgšties/etileno kelią) ir abiotinius stresus. Nuo jų augalo gyvenimas labai priklausomas.

Iš viso augalo genome aptikta per 30 TV šeimų ir vis dar atrandamos naujos TV šeimos. Ne visos jų vienodai gausios. Tarp neseniai atrastų yra ir GRAS šeima. Šeimos pavadinimas kilęs iš trijų pirmųjų genų, kuriuose buvo aptiktas GRAS DB domenas (GAI, RGA, SCR), pirmųjų raidžių. GRAS genai kontroliuoja augalo-bakterijos simbiozę pupinių (Fabaceae) šeimos augaluose, šaknų gumbelių genus NOD, tačiau visiškai nese-niai GRAS TV aptikti ir ne pupinių š. augaluose. GRAS TV kontroliuoja šaknų ląstelių raidą.

TV duomenų bazės. Kaip ir cis elementams, yra centrai, kurie kaupia žinias apie augalų TV. Dažniausiai duomenų bazės yra bendros TV ir cis elementams, ir tai supran-tama. Tokios bazės yra Plant CARE, PLACE, TRANSFAC. Yra ir tik vieno augalo TV duomenų bazės, pvz., vairenio AGRIS (http://Arabidopsis.med.ohio-state.edu), ryžių RARTF (http://rarge.gsc.riken.jp/rartf) ir kt. Ryžių atskirai sekvenuoti porūšiai (Oryza sativa subsp. japonica ir O. sativa subsp. indica) ir kaupiamos atskiros jų duomenų bazės.

TV genų ekspansija (plėtra) augalo genome. Į šią augalų genomo ypatybę jau buvo atkreiptas dėmesys. Iš dalies (per atskirų TV šeimų suvešėjimą) aptartos ir to priežastys. Vie-na jų - visiškai neturintys analogų augalų organai. Kas kita tokios gyvybinės funkcijos kaip DNR, RNR, baltymų ir netgi daugelio nepolimerinių junginių sintezė, ląstelės kvėpavimas ir pan. Jos daugiau ar mažiau bendros visiems ląstelinės sandaros organizmams, todėl apie 45 % visų vairenio TV koduojančių genų turi ortologus gyvūnų genomuose.

Kita vertus, bendra TV koduojančių genų dalis augalo (vairenio, ryžio ar tuopos) genomuose yra pastebimai didesnė negu gyvūnų genomuose. Pagal jau palyginti senokai (2000 m.) paskelbtą, bet dar dažnai cituojamą kaip bazinį vairenio genomui J. L. Riech-mann et al. straipsnį, vairenio genome yra per 1500 TV koduojančių genų, ir jų dalis tarp baltymus koduojančių genų sudaro 4,5 %, o žmogaus ir nematodo Caenorhabditis elegans – 3,5 %. Pagal vieną paskutinio meto tyrimų (K. Iida et al., 2005), vairenio genome yra bent 1968 TV genai, o jų dalis yra 7,4 % baltymus koduojančių genų. Įdomu tai, kad mielių Saccharomyces cerevisiae, kurios pasirenkamos kaip išeitinės eukariotų genomo evoliucijai, TV koduojantys genai sudaro 7,5%. Tačiau augalai kildinami iš žaliadumblių, o šių geno-me TV genai tarp baltymus koduojančių genų sudaro nežymią dalį. TV sudaro tik apie 1 % Ostreococcus tauri arba 1,5 % – Chlamydomonas reinhardtii proteomų (baltymų visumos; 5.14 pav.) Labai akivaizdūs skirtumai tarp žolinių augalų vairenio arba ryžio proteomų ir medžio plaukuotvaisės tuopos (Populus trichocarpa) proteomo. Medžio gyvenimas kur kas sudėtingesnis: bent jau lapus keičia ir žiedus krauna kasmet. Taip pat kasmet keičiasi ge-nų, kurie reguliuoja augimą, bendrą metabolizmą raiška. Tad šios tuopos proteome nusta-tyti net 2467 TV, bet jie sudaro tik 4,3 % nuo bendro baltymų skaičiaus, nes ir bendras baltymų skaičius kur kas didesnis – 58036 (palyginti. su 30690 baltymų vairenio proteo-me). Sėjamojo ryžio proteome TV dalis dar mažesnė – tik 3,4%. Keista, bet ryžio prote-ome nustatyti net 62827 skirtingi baltymai. Labai akivaizdu, kad augalų genomas ir prote-omas toli pažengę nuo dumblių, kurių genomuose (5.14 pav.) iš viso nustatyti tik 122−158 TV (1,5−1,04%).



Proteomas TV sk. TV %

5.14 pav. Transkripcijos veiksnių (TV) bendrojo skaičiaus palyginimas įvairių augalų ir ža-liadumblių proteomuose: Proteomas − bendras koduojamų baltymų skaičius; TV sk. ir TV % − transkripcijos veiksnių skaičius ir procentas. Tirti organizmai (iš kairės į dešinę): dumbliai Ostreococcus tauri ir Chlamydomonas reinhardtii; au-galai vairenis (Arabidopsis thaliana), plaukuotvaisė tuopa (Populus trichocarpa) ir ryžis (Oryza sativa) (pagal D.M.Riano-Pachon et al. Plant Transcription Factors @uni-potsdam.de). TV koduojančių genų plėtros priežastys augalo genome. Priežasčių plėtrai yra

labai daug, netgi savitų konkretaus geno evoliucijai, tarp jų: • augalo morfogenezė nesibaigia gemalo raida kaip žinduolių, be to, poembrioninė

augalo raida priklauso nuo daugybės aplinkos signalų: šviesos (fotomorfogenezė ir foto-periodizmas), temperatūros (vernalizacija) ir kitų − jų valdomiems genams yra saviti TV;

• daug TV reikia meristemų raidai, diferenciacijai, pvz., žiedyno, žiedo, lateralinės, ūglio ir šaknų viršūninės, kita vertus, būtinas šių meristemų išsaugojimas – gyvūnų ge-nome tokių problemų nėra;

• kaip minėta, visiškai skirtingi augalo organai; tarp jų daugybė atsikartojančių šo-ninių (lateralinių − šakų, lapų, šaknų) ir viršūninių (apikalinių − žiedyno dalių, žiedų, netgi apikalinės meristemos ūglio viršūnėje) organų ir struktūrų; šie genų pasireiškimai vėl sie-jasi su sezoniniais įvykiais: medžių lapkritys rudenį ir atgijęs augimas pavasarį – visa tai kontroliuojama TV;

• daugybei atsakų į įvairius aplinkos veiksnius reikalinga sudėtinga geno promoto-riaus modulinė sandara ir gausybė atsakus kontroliuojančių TV;

• komplikuota viso augalo (sisteminė) procesų, atsakų kontrolė ir signalų perdavi-mo sistema, tam reikalinga papildomų genų ir kas juos reguliuoja – TV.

5.4.3. Transkripcijos veiksniai ir augalo evoliucija. Dirbtiniai transkripcijos veiksniai

Žemės ūkio augalai dėl trumpos jų istorijos (civilizacijos pradžios prieš 15000−10000 metų) yra puikus modelis tirti rūšies ir atskirų genų, kurie skiria žemės ūkio augalą nuo jo laukinių giminaičių, atsiradimo mechanizmus. Tuo jau galėjome įsitikinti palyginę atsarginius baltymus koduojančių genų evoliuciją su kviečių rūšių evoliucija (žr. 4.2.2 sk., ir 4.4 pav.).

Naujai atsiradusi mutacija (nukleotidų pakaita, iškrita ar intarpas) arba rekombinacija geno viduje yra tik naujo geno istorijos pradžia. Naujas genas turi „įsirašyti“ į jau egzis-

260 |

tuojančių genų sistemą, ir, jeigu tai vyksta sėkmingai, gene ta pačia kryptimi kaupiasi nau-jos mutacijos, nes dažnai genas nuo savo pirmtakų yra nutolęs anaiptol ne pagal vieną nukleotidų porą.

Šiuo metu pakankamai pagrįstai įrodyta, kad postūmis daugeliui genomo pertvarkos įvykių ir naujų genų atsiradimui, yra transkripcijos veiksnių konfliktas, kuris atsiranda tolimuosiuose hibriduose, naujuose poliploiduose ar įvykus taškinei mutacijai.

Reguliacinės geno dalies evoliucija. Doublio rūšių atsiradimo teorija. Amino-rūgščių seka baltyme, o tuo pačiu ją koduojanti geno dalis, kinta labai lėtai. Baltymo evoliuci-ja matuojama evoliucijos periodo vienetais (EPV). Tai laiko tarpsnis per kurį baltymo aminorūgščių sudėtis pasikeičia 1 %. Tai tiek lėtas reiškinys, kad jis išreiškiamas milijonais metų. Visai kas kita DNR sekų kitimai, bet jie arba „neutralūs“ – kodono trečiajame nukleo-tide, arba nekoduojančiose aminorūgščių geno dalyse (reguliacinėje, intronuose, UTR).

Doublis (J. Dobley) įtikinamai įrodė, kad naujai rūšiai ar porūšiui atsirasti visiškai nebūtini dideli viso genomo pokyčiai, kokie vyko dėl kviečių tolimosios hibridizaci-jos/poliploidijos. Užtenka pasikeisti 5−7 pagrindiniams kontrolės (master) genams, kurie kontroliuoja augalo raidą. Doublio idėjos perėjo ir į kitų organizmų evoliucinę genetiką. Jos leidžia paaiškinti netgi tą padėtį, kuri atsirado, kai buvo nustatyta, kad žmogaus DNR nuo šimpanzės skiriasi tik 1 %, o morfologijos ir ypač nervinės veiklos/proto skirtumai tarp jų yra didžiuliai. Ši padėtis atrodo kurioziškai, kai net dviejų varlės Xenopus rūšių X.laevis ir X. borealis DNR skiriasi 15−20 %.

Iš ko kilęs kukurūzas? Bent kukurūzams Doublis ir jo bendradarbiai įrodė, kad skirtumus tarp teosinte ir kukurūzo lemia 5-7 pagrindiniai (master) genai, ir kad didžiausi pokyčiai įvykę šių genų reguliacinėje dalyje. Kukurūzas kilęs neseniai, prieš 10000 (o kai kurie tyrinėtojai teigia, kad tik prieš 5000 metų) iš laukinių pirmtakų, kuriuos Meksikos indėnai vadina teosinte. Apie kukurūzo evoliucijos tempus galima spręsti ir iš archeologi-nių tyrimų. Zea parviglumis, iš kurios kildinamas kukurūzas, turi tik 2 cm ilgio burbuoles, bet prieš 5000 metų jau aptiktos kukurūzo burbuolės 7 cm ilgio, o per pastaruosius 3000 metų burbuolių ilgis padidėjo 50 kartų. Botanikai dėl kukurūzo kilmės nėra vieningi. Vie-ni mano, kad Zea mays L. yra vienintelė rūšis Zea gentyje, o teosinte skiria į atskirą gentį Euchlaena, kiti – į atskiras Zea rūšis, bet ne dvi, o daugiau. Pagal H. H. Iltis ir J. Dobley (2003) teosinte yra Z. mays porūšiai (iš viso jų bent 4), nors ir labai skiriasi nuo kukurūzo. Kiti porūšiai lengvai kryžminasi su Z. mays ssp. mays (5.15 pav.) Tai ir yra svarbiausias argumentas skirti teosinte į Z. mays porūšius. Manoma, kad kukurūzas kilęs iš Z. mays ssp. parviglumis, kuris iki šiol auga kalnuotoje Meksikos vietovėje MeTeosinte (iš čia kilęs teosinte pavadinimas).

Genų, kurie lemia skirtumus tarp teosinte ir kukurūzo, aminorūgštis koduojanti dalis beveik nesiskiria. Iš esmės šie genai skiriasi tik reguliacine dalimi (5.15 pav.).

Duplikacijos ir genų evoliucija. Pripažintas mechanizmas atsirasti naujiems ge-nams, tarp jų ir koduojantiems TV, yra duplikacijos. Dėl jų atsiranda paralogai, todėl apie duplikacijas, kaip priežastį atsirasti TV, sprendžiama iš genų paralogų skaičiaus. Pagal S-H. Shin et al. (2005), iš 582 tirtų TV genų paralogus turėjo 25 % vairenio ir 27 % ryžio genų. Visi konkrečią TV šeimą koduojantys genai yra paralogai, kilę dėl poliploidijos (viso genomo duplikacijos) arba pavienių lokusų duplikacijų. Pastarosios sukuria sąlygas keistis genetine medžiaga (DNR) lokuse, netolygiam krosingoveriui.



5.15 pav. Kukurūzo ir teosinte varpos (burbuolės, A) ir geno Teosinte Branched (B) palygini-mas: A. − Kukurūzo stambi burbuolė, o teosinte šakotas stiebas ir ant žiedstiebių daug smulkių varpučių. Stiebo šakojimąsi lemia Teosinte Branched1 (TB1) genas. B. − Palyginti teosinte ir kukurūzo TB1 genai. Koduojančioje jų dalyje panašumas siekia 70 %, o reguliacinėje – tik 2 %; 5‘-NTR – netranskribuoja-moji geno dalis (pagal J. Dobley. Annual Review of Genetics. 2004. Vol. 38, P. 37−59) Genų/modulių ir jų dalių suliejimas – dar vienas būdas atsirasti naujiems TV.

Manoma, kad taip atsirado trihelix TV šeima. Viename jos domenų yra susijungę į vieną trys spiralės. Spėjama, kad vyko viena paskui kitą dvi duplikacijos, o paskui susiliejimo vietoje prarastas antrasis intronas (5.16 pav.). Papildomai vyko 5′- ir 3′-galų divergencija.

5.16 pav. Naujų transkripcijos veiksnių evoliucija. Trihelix atsiradimas susiliejant geno dalims, kurios koduoja H1-H2-H3 spirales (pagal J. Smalle et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1998, Vol. 95, P. 3318−3322)

B A

262 |

Intronų praradimas, atskirų geno dalių susiliejimas yra gana dažni būdai atsirasti nau-jiems genams, tarp jų ir koduojantiems TV.

Dirbtiniai TV. Jeigu gamta sujungė ZIP domeną su HD domenu ir atsirado HD-ZIP TV šeima arba prie HD „prijungė“ Zn ,,pirštelių“ domeną ir atsirado HD-„piršto“ (PHD finger) šeima (žr. 3.3 intarpą), tai kodėl žmogui, perpratusiam galingas genų inžine-rijos priemones, nepabandžius konstruoti naujus TV.

Dažniausiai prijungiama geno dalis, koduojanti TV sąveiką su specifiniu ligandu ar-ba savitas sąveikas lemiantį aktyvacijos domeną. Hormono signalą paprastai priima spe-cialūs baltymai-receptoriai. Tam tikslui jie turi savitą domeną. Jeigu šį domeną koduojanti geno dalis prijungiama prie kurio nors TV geno, jo koduojamas rekombinantinis balty-mas jungsis su hormonu (ligandu) ir bus jo aktyvinamas. Taip galima kontroliuoti gautą chimerinio TV geno raišką. Tokį domeną koduojanti dalis buvo „pasiskolinta“ iš gyvulių gliukokortikoidinį hormoną jungiančio receptoriaus geno. Kol nėra ligando, chimerinis TV netgi nepatenka į branduolį. Po sąveikos su hormonu baltymas aktyvinamas, pakliūna į branduolį ir jungiasi su valdomų genų cis elementais. Pats chimerinio baltymo sužadini-mas sukeliamas dirbtiniu junginiu deksametazonu.

Koks šio chimerinio TV privalumas? Galima valdyti laiką, kada pasireikšti TV, išsi-aiškinti jo valdomų genų kaskadą. Pvz., sužadinus šiuo būdu žydėjimo laiko kontrolės geną CONSTANS, augalas pražydo anksčiau ir transgenas pasireikšdavo iš karto. Žiedo meristemos genai LEAFY ir TERMINAL FLOWER pasireiškė tik 24 val. po CO geno sužadinimo. Tai rodo, kad šie du genai yra CO geno reguliuojami, veikia ,,pasroviui.“

Dirbtiniai TV padeda išaiškinti TV tarpusavio ryšius. Tai dar vienas žingsnis į transkripcijos kodą.

Siekant ištirti augalų TV funkciją pasinaudojama ir drozofilos HD TV šeimai priklausančiu Engrailed (EN) genu, kuris koduoja dominuojantįjį aktyvųjį represorių. Kai prie įvairių TV genų prijungiama šį domeną koduojanti seka, gaunamas šių TV genų loss-of-function mutacijų fenokopijos. Taip ištirtos sąveikos tarp įvairių TV koduojančių genų, pvz., SHOOTMERISTMLESS, APETALA3, PISTILLATA, KNAT1. Kai papildomai prijungiama gliukokortikoido receptoriaus domeną koduojanti DNR seka, galima valdyti tokio chimerinio geno raiškos laiką. Taip įsitikinta, kad dėl TV genų paralogų, augalo genome mutantinis feno-tipas dažnai gaunamas tik tada, kai slopinamas ne vienas TV genas. Vienas paralogas gali „gelbėti“ kito mutantinio paralogo fenotipą. Kita vertus, kai nuslopinamas genas, kuris koduoja represorių, pasireiškia iki tol represoriaus slopinti genai. Taip, pvz., atsitinka, kai nuslopinami genai, kurie koduoja DELLA do-meną turintį baltymą. Šie baltymai yra augalo slopikliai, ir nutrūkus jų veiklai augalas pradeda intensyviai augti. Dažnai represoriai neleidžia pasireikšti genams ne vietoje (ektopiniu būdu). Kai nuslopinamas toks represorius, jo slopinamas genas pasireiškia ne vietoje, gali atsirasti geno produkto perteklius, atitinkantis gain-of-function mutacijos fenotipą. Paprastai sukuriama chimerinio geno konstravimo sistema su paruoštais atskirais tarpiniais konstravimo elementais. Tokia sistema naudojama konstruoti įvairius chimerinius TV. Tokios sistemos turi netgi savo pavadini-mus. Minėta sistema, kurioje panaudotas EN aktyvacijos domenas, pavadinta CHRIS (Chimeric Repressor Interference System). Šios sistemos privalumas yra, kad EN aktyvacijos domeną koduojanti seka yra N-gale, todėl ją lengviau prijungti ar pašalinti. Konstravimui naudojamos ir kitų genų aktyvacijos domenus koduojančios nukleotidų sekos: Herpes sim-plex viruso p16 baltymo ir ypač mielių Gal4 geno. Jos veiklios ir augalų chimeriniuose genuose, nes ne visi chimeriniai genai pasireiškia.



5.5. Genų raiškos reguliavimas po transkripcijos. Splaisingas ir jo mutacijos

5.5.1. Branduolio ir citoplazmos RNR

Tarp transkripto sintezės, ypač mRNR, ir galutinio geno pasireiškimo yra ilgas ir gausus įvykiais kelias. Galima išskirti tris ryškius etapus po transkripcijos, nuo kurių pri-klauso geno raiška:

• transkripto brendimo, pernašos į citoplazmą ir ribosomas, o kai kurių transkripcijos veiksnių pernašos iš vienų ląstelių į kitas ar netgi iš vienų organų į kitus;

• transliacijos; • baltymo brendimo ir įsijungimo į ląstelės struktūras. Pastarojo etapo sudėtingumu jau

turėjome galimybę įsitikinti iš sėklos atsarginių baltymų brendimo ir pernašos į baltymų kūnelius arba baltymų saugojimo vakuoles (žr. 4.2.3 sk.).

Vis dar atrandami nauji genų potranskripcinės kontrolės būdai, jeigu ne bendro po-būdžio, tai bent konkrečių genų. Įsidėmėtini įvykiai, kurie vyksta branduolyje po mRNR transkripcijos, nes pagal Bartoną (J. L.Barton, 2006) tik 30−50 % RNR nuo bendro mRNR kiekio pasiekia citoplazmą. Galutinį mRNR kiekį branduolyje ir citoplazmoje veikia daugybė įvykių (5.17 pav.).

5.17 pav. mRNR apykaita nuo sintezės iki suskaidymo egzosomoje (pagal M. C. Barton. Biochemica et Biophysica Acta. 2006, Vol. 1759, P. 385−387) Pirmiausia bendro pobūdžio pre-mRNR modifikavimas: prie 5′-galo prijungiama

„kepurė“ –invertuotas ir metilintas m7G5′ppp5′Nmp, o iš kito - 3′- galo prijungiama „uo-dega“ – poli-A. Abu šie įvykiai stabilizuoja transkriptą. Geno raiškos reguliavimui itin svarbus poli-A prijungimas. Jis gali kontroliuoti kitą svarbų įvykį − splaisingą.

Daugelis augalų (kaip ir kitų eukariotų) genų transkribuojamoje dalyje sudaryti iš eg-zonų ir intronų. Iš pre-mRNR intronai yra pašalinami, iškerpami, o egzonai sujungiami į vieną grandinę. Iš čia kilo ir pats įvykio pavadinimas. Tai jūreivių, vėliau ir cirko artistų triukas karpyti virvę, nepaliekant sukarpytų galų. Be to, RNR redaguojama: vieni nukleo-tidai pakeičiami kitais. Ir splaisingo, ir redagavimo tikslas bendras:

• sukurti transkriptų įvairovę nuo vieno geno.

264 |

Nors įvykių didelė gausa, bet jie puikiai suderinti. Kepurės prijungimas prie 5′-galo ir splaisingas vyksta suderintai su transkripto elongacija. Sąveikauja RNR polimerazės CTD (Carboxyl-Terminal Domain), elongacijos veiksniai ir baltymai, kurie brandina mRNR (5.17 pav.). Čia pat vyksta ir susintetintos RNR kokybės kontrolė. Panašiai kaip proteo-somoje suskaidomi nereikalingi ar nekokybiški baltymai, egzosomoje suskaidomos ne-kokybiškos ar atidirbę RNR (5.6 intarpas). Vadinasi, vėl prireikia kontrolierių, kurie visus šiuos įvykius suderintai valdytų.

Tad yra saviti trans veikiantys branduolio baltymai, kurie reguliuoja branduolyje vykstantį pre-mRNR modifikavimą. Jie patys irgi pasiskirsto ne bet kaip, o sudaro balty-mų kompleksus (splaisosomą, egzosomą), talpinami į Kajalo kūnelius, granules ar taške-lius. Tvarkingai pasiskirsto po branduolio skyrius. Tas pat galioja ir chromosomoms, kurių kiekviena turi savo vadinamąją teritoriją.

Branduolio porų kompleksas yra vienas iš veiksmingų RNR pernašos į citoplaz-mą, ir atvirkščiai, baltymų pernašos į branduolį reguliatorių, nes kaip žinoma, RNR sinte-zė vyksta branduolyje, o baltymų – citoplazmoje. Branduolio porų kompleksui skiriamas atskiras reguliacinis vaidmuo: mRNR gali būti paprasčiausiai neišleidžiamos iš branduo-lio, nors ir turi reikiamą eksporto iš branduolio signalą, vadinamąjį NES (nuo Nuclear Export Sequence). Porų kompleksas neišleidžia iš branduolio mRNR, iš kurių nepašalinti intronai. Dėl to kyla ir papildomų klausimų:

• kaip yra su alternatyviojo splaisingo nepašalintais intronais (pagal įvykių dažnį tai dažniausiai atsitinkantis augalų alternatyviojo splaisingo įvykis);

• kaip per branduolio porų kompleksą pereina mRNR po splaisingo arba intronų mutacijų, kurios sukelia labai panašius į alternatyvųjį splaisingą pokyčius.

Branduolyje vyksta: • DNR sintezė; • mRNR ar kitų RNR tarnskripcija ir transkripto modifikavimas; • mRNR stabilizuojama; • atliekama pre-mRNR kokybės kontrolė; • integruojamos į reikiamas struktūras tos RNR, kurios lieka branduolyje, o liku-

siųjų vyksta pernaša į citoplazmą; • rRNR sintezė ir ribosomų subvienetų susidarymas.

Transkriptas iki reikiamo momento gali būti susijungęs su branduolio matrikso bal-tymais. Tai irgi genų potranskripcinio valdymo būdas. Deja, kol kas įtikinamai nustatytas tik gyvūnams, bet labai tikėtinas ir augalams.

Dalis RNR apskritai nepajuda iš branduolio, lieka jame, kaip antai mažosios bran-duolio RNR (sn RNR) arba mažosios branduolėlio RNR (snoRNR).

Ne visos ir į citoplazmą patekę mRNR išlieka nesuskaidytos iki transliacijos. Suskai-domos tos RNR, kurių koduojančioje dalyje yra nonsens kodonų arba kurias pažymi su-skaidymui mi/siRNR. Tai vėl vienas iš potranskripcinio genų valdymo būdų. Augalų miRNR dažniau skatina pažymėtų mRNR skaidymą, rečiau − keičia transliaciją.

Kiekvienas šių procesų yra kontroliuojamas savitų baltymų. Taigi yra trans-veikiantys veiksniai, kurie nesijungia su DNR, bet turi sekas, kuriomis jie jungiasi su RNR. Tokios sekos yra kelių tipų, tarp jų RRM (nuo RNA Recognition Motif), arba kitaip RBD (RNA



Binding Domain), ir KH (lizino, kuris žymimas K raide, Homologijos) domenai (5.6 intar-pas). Vairenio genome RRM koduoja 196 genai, o KH baltymus – 26 genai.

5.6 intarpas. Nuo „gimimo“ iki „mirties“ – mRNR po transkripcijos „Į duris beldžiasi“ dar vienas kodas – baltymų sąveikos su RNR. Baltymai „lydi“ RNR nuo „gimimo“/sintezės iki atidirbusios, tapusios nereikalinga RNR suskaidymo – „mirties“. Balty-mai, jungdamiesi su būdingomis RNR sekomis, panašiai kaip TV, irgi reguliuoja geno raišką. Šis kodas šiuo metu vadinamas potranskripciniu operonu. Pavadinimas atsiradęs todėl, kad branduolyje vienu metu sintetinama daug RNR Jų masė vadinama heterogenine branduolio RNR (angl. hnRNA). Ji labai nestabili ir tik nedidelė jos dalis subręsta iki funkcionalių RNR. Tai valdomi procesai, priklausantys nuo baltymų, kurie sąveikauja su pre-RNR, turi atitinkamus motyvus. Manoma, kad branduolyje iš viso yra apie 106 hnRNR. RNR operono sutrikimai, ypač TV mRNR, gali būti esminių augalo raidos nukrypimų priežastis. Nukrypimai irgi dvejopos kilmės:

– mutacijos, paveldimi; – nepaveldimi funkciniai sutrikimai.

Baltymai, sąveikaujantys su RNR, turi domeną arba domenus, kuriais atpažįstamos RNR sekos, panašiai kaip savo DB domenu TV atpažįsta cis sekas geno promotoriuje. Domenai, kuriais bal-tymai jungiasi prie RNR, dažniausiai yra dviejų tipų: KH ir RBD. Pastarasis dažnai sudarytas iš 2−3-ų RRM motyvų. Baltymai, kurie jungiasi su RNR, dalyvauja įvairiuose procesuose: prade-dant RNR sinteze ir jos reguliavimu, RNR brendimo reiškiniuose, pernašoje į citoplazmą, regu-liuoja transliaciją, pagaliau, panašiai kaip E3 ubikvitinligazės pristato baltymus suskaidyti prote-osomai, taip baltymai, kurie jungiasi su RNR, pristato baltymus suskaidyti egzosomai. Iš tiesų baltymai lydi RNR nuo „gimimo“ iki „mirties.“ Egzosomų vieta yra skirtinga: vienos jų yra branduolyje, kitos – citoplazmoje. Suprantama, kad įvairiais momentais jungiasi skirtingi baltymai, ir jie atpažįsta skirtingas RNR sekas. Tačiau šių sekų tyrimai kol kas nėra taip toli pažengę, kaip cis elementų geno promoto-riuje ar už jo ribų. Tai kol kas neišspręstas klausimas, nors jau žinoma, kad taip gali būti regu-liuojami atsakai į hormonus ir abiotinius veiksnius, cirkadiniai reiškiniai. Augaluose aptiktos streso granulės, kuriose yra mRNR. Jos atsiranda po šiluminio šoko arba kitų baltymus dena-tūruojančių veiksnių poveikio. Bet streso granulės geriau ištirtos mielių ar žinduolių ląstelėse dėl jų panašumo į prionus. Mielėse Schizosaccharomyces pombe aptikta apie 520 skirtingų baltymų, kurie jungiasi su RNR. Žinduolių genome aptikta bent 500 genų, koduojančių baltymus, ku-riems būdingas RRM motyvas. Vairenio kol kas aptikta per 200 RBD domeną turinčių baltymų. Dažniausiai baltymai grupuojami pagal RNR vietą, su kuria jungiasi RBD ar KH domenus tu-rintys baltymai. PABP (nuo Poly-A Binding Protein) jungiasi su mRNR uodega poli-A. Kiti bal-tymai jungiasi prie kepurės. Toks yra vairenio baltymas ABH1, kuris yra CB80 homologas, bet jo pavadinimas kilęs nuo abscizo rūgšties (Abscisic Hypersensitive1). Baltymai, su kuriais jungiasi mRNR, aptinkami įvairiais būdais, tarp kitų metodų yra trihibridinė mielių sistema (žr. 5.4 intarpą). Bioinformatikos metodais augaluose aptikta TIA-1/TIAR bal-tymai. Kaip tik TIA1 baltymai C-gale turi į prioną panašų domeną PRD ir skatina streso granu-lių susidarymą. N-gale šie baltymai turi tris RRM. Tai labai panašu į miglinių grūdo atsarginius baltymus prolaminus, kurie sudaro baltymų kūnelius. Pakanka vieno TIA-1 baltymo PRD do-meno, kad citoplazmoje susidarytų mikroagregatai. Tad manoma, kad PRD yra pastolis, apie kurį susidaro streso granulės. Tai būdas saugoti netransliuojamas mRNR neaktyvios būsenos. TIA-1 tipo baltymai taip pat reguliuoja alternatyvųjį splaisingą. Jungiasi su RNR vietomis, ku-riose gausu U. Be baltymų, kurie tiesiogiai dalyvauja, kai sintetinamos, modifikuojamos, brandinamos ir t. t.

266 |

mRNR, yra ir baltymų grupių , kurios reguliuoja mRNR raišką. Viena jų jau minėta TIA-1/TIAR. Be šios, yra dar keletas reguliacinę funkciją turinčių, prie RNR prisijungiančių baltymų grupių, tarp jų:

– Y-box šalčio atsako baltymai. Jie turi CSD (nuo Cold Shock Domain) domeną, kuriuo jie jungiasi su RNR, viengrandine ar dvigrandine DNR, atpažįsta Y-box elementą: CTGATTGGCCAA.

Į baltymų, kurie jungiasi su RNR, grupę jie patenka todėl, kad turi du RRM. Vairenio GRP (Glycine-rich RNR-binding Protein) irgi turi du RRM. Jis reguliuoja transkripciją ir transliaciją. Dar Žakobas ir Mono suvokė, kokia svarbi geno raiškai mRNR egzistavimo trukmė. Ji užko-duota pačioje mRNR, o tuo pačiu gene, nuo kurio ji nurašoma. Tačiau mRNR stabilumui itin svarbus mRNR modifikavimas (kepurės ir uodegos prijungimas), taip pat baltymai, kurie jun-giasi prie kepurės ir prie uodegos. PABP saugo mRNR ne tik uodegą, bet netiesiogiai ir kepurę. PUF baltymai (nuo drozofilos geno Pumilo) taip pat stabilizuoja mRNR. Abi baltymų grupės sudaro kompleksus ir yra daugiareikšmės. Šios baltymų grupės ne tik slo-pina mRNR skaidymą, bet ir skatina transliaciją. PABP taip pat sąveikauja su baltymais, kurie atlieka RNR pernašą į citoplazmą. Vairenis turi bent 8 baltymus, kurie jungiasi su poli-A. PUF baltymai ne tik suteikia RNR stabilumo, bet irgi reguliuoja transliaciją. Tai labai konservatyvių baltymų grupė. Visų jų C-gale yra RBD domenas ir 8 kartotinių sekų tandemas. Jungiasi su mRNR 3′-UTR. Vairenio genome yra apie 20 PUF koduojančių genų. Bet ateina „mirties“ metas. Žinomi du mRNR suskaidymo keliai, susiję su poli-A ir su 7mGpppN kepure. Abu prasideda vienodai: nuo poli-A suskaidymo RNR egzonukleazėmis (vyksta deadenilinimas). Bet toliau keliai išsiskiria: vieno jų hidrolizuojama kepurė, ir 5′-egzonukleazės suskaido mRNR. Kitas kelias: pagrindinė mRNR dalis suskaidoma 3′-egzonukleazėmis dar prieš kepurės hidro-lizę. Galiausiai lieka tik kepurė, ir 5′-egzonukleazės suskaido ir ją.; mRNR suskaidymas yra griežtai reguliuojamas reiškinys. Augaluose reguliacijos plonybes dar teks ištirti. Daugiau tenka pasiremti tuo, kas vyksta drozofilos ląstelėse. Jose Pumilo (PUF) baltymas jun-giasi su kitu baltymu Nanos, ir tai skatina labai esminius drozofilos raidos posūkius. Suskaido-ma vieno iš pagrindinių drozofilos raidos genų Hunchback koduojama mRNR. Šios mRNR 3′UTR gale yra specialus šiam skaidymui reguliuoti Nanos atsako elementas NRF. Kito pagrin-dinio raidos geno koduojama TV bicoid mRNR irgi turi NRF elementą 3′-dalyje. Tai tik parodo koks sudėtingas ir griežtai kontroliuojamas mRNR suskaidymas. Panašaus mechanizmo galima tikėtis ir augaluose.

IIa

III

IIb

I

IV

Labai svarbus yra mRNR, ypač TV mRNR, pastatymas į vietą. Ypatinga jo svarba irgi pirmiausia įsitikinta drozofilos raidai. Morfogenų (raidą kon-troliuojančių baltymų) pasta-tymas į vietą sukuria bendrąjį drozofilos raidos planą, polius ir pagaliau net vietą, kur bran-duoliai, o paskui kamieninės ląstelės determinuojamos or-ganų raidai. Panašiai yra ir augaluose. Prisiminkime gema-lo raidą (žr. 3.2 sk.), auksino ir PIN baltymų reikšmę susida-

ryti poliams ir determinuotoms gemalo ląstelėms. Augalų TV mRNR, panašiai kaip drozofilos



bicoid mRNR, pernešamos iš vienų ląstelių į kitas (AP2 iš L1 į L2), tačiau labai svarbi ir reikš-minga mRNR pernaša floema dideliais atstumais, iš vieno organo į kitą, pvz., mįslingojo flori-geno iš lapų į ūglio meristemą (žr. 5.6 sk.). Tai numatyta mRNR sandaroje. Dar dvi baltymų grupės, kurios jungiasi su mRNR, yra labai intensyviai tiriamos. Tai EJC (Exon Junction Complex) baltymai, kurių jungimosi vieta yra 20−24 nt prieš introną. Jie turi RRM/RBD. Jų reikšmė irgi labai įvairi, bet pirmiausia svarba splaisingui. Be to, nuo jų priklau-so mRNR asociacija su polisomomis, aberantinės RNR suskaidymas. Dar intensyviau yra tiriami SR baltymai, kurie irgi yra daugiaveiksniai, bet jų reikšmė ypač aki-vaizdi splaisingo metu. Jie reguliuoja geno raišką būtent šiuo metu. SR baltymai turi ne tik RRM, bet ir aminorūgščių seką, kurioje gausu serino ir arginino liekanų (iš čia šių baltymų pa-vadinimas). Serinas yra kintančio fosforilinimo vieta. Taip reguliuojama ne tik SR, bet per jas ir įvairių genų raiška potranskripciniame etape. Įvairus ir margas baltymų, kurie jungiasi su RNR „pasaulis“ (pav. pagal S. Meyer at al. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2004, Vol. 39, P. 197–216).

5.5.2. Splaisingas augaluose. Introninės-egzoninės geno sandaros privalumai. SR baltymai

5.5.2.1. Splaisingo privalumai

Privalumų yra keletas, ir visi jie yra bendro pobūdžio, vienodai reikšmingi įvairiems augalų genams, kurie transkribuojamoje dalyje turi egzoninę-introninę sandarą.

• Intronai labai padidina geno ilgį koduojančioje geno dalyje. Tai turi dvejopą prasmę.

Padidėja rekombinacijos dažnis geno viduje, o dėl domeninės baltymo sandaros, modulių,atsiranda galimybė pertvarkai geno viduje – permutaci-joms. Tokio tipo kitimus geno viduje jau esame nagrinėję. Prisiminkime So-lanaceae š. augalams būdingą proteinazės inhibitoriaus geną Pin2 (žr. 1.10.3 sk. ir 1.11 intarpą). Šį geną turi ir kiti augalai, tik be duplikacijų geno viduje, bet Solanaceae š. augalų Pin2 geno baltymą koduojanti dalis yra sudaryta iš duplikuotų segmentų, pastoviai vyksta jų pertvarka ir atsiranda naujos dupli-kacijos dėl netolygaus krosingoverio geno viduje. Pastoviai duplikuoti seg-mentai sumaišomi kaip kortos kaladėje, ir netgi toje pačioje ląstelėje yra įvai-rūs Pin2 baltymai. Baltymai skiriasi duplikuotų segmentų skaičiumi ir tvarka. Prisiminkime ir tai, kam visa tai reikalinga. Proteinazės inhibitoriai yra tarp PR-baltymų, kuriais augalas kovoja su patogenu. Patogenas išskiria proteoli-tinius fermantus, kad skaidytų ląstelės-šeimininko turinį. Į tai ląstelė atsako inhibitoriumi, kuris slopina proteolitinius fermentus. Bet ir patogenas prisi-taiko prie šio augalo ginklo. Jo baltymai tampa atsparūs inhibitoriui. Kad taip neatsitiktų, augalas vis keičia ir keičia proteinazės inhibitoriaus sandarą. Taip augalas santykinai tampa neįveikiamas. Permutacijos − ne tik Pin2 geno išradimas. Jos būdingos ir kitų apsauginių baltymųs, tarp jų lektinų, genams. Lektinais augalai apsisaugo nuo žolėdžių. Lektinų ypač gausu pupinių augalų sėklose, ir selekcininkams pavyko jų kiekį žemės ūkio augalų sėklose sumažinti iki nekenksmingo lygio.

268 |

Gali būti keičiamasi egzonais (geno moduliais) tarp alelinių ir netgi neale-linių genų. Tai atsitinka genams, kuriems būdingas vadinamasis trans-splaisingas. Sujungiamos dalys esančios per atstumą. Toks trans-splaisingas aptiktas tabako chloroplastų (rps12, psaA) ir mitochondrijų (nad1, nad2, nad5) genų transkriptuose. Be to, tokia pertvarka vyksta ne pačiame gene, o tarp mRNR, todėl yra nepaveldima ir prireikus vėl gali būti pakartota, galbūt net naujais deriniais.

• Kita vertus, labiausiai kintantys yra intronai, nekoduojančios DNR sekos. Egzo-nai, kurie koduoja aminorūgščių seką, yra konservatyvesni. Susikuria skirtumai paralogų intronuose, dėl kurių yra apsunkinta konjugacija tarp paralogų mejozės metu. Tai irgi naudinga savybė.

• Alternatyvusis splaisingas (intronų/egzonų pašalinimas) įvairiais deriniais su-kuria vieno geno koduojamų transkriptų ir baltymų (izofermentų) įvairovę.

• Intronai riboja skaitymo rėmelio poslinkio mutacijų plitimą tik iki egzono 3′-galo. Kitaip būtų pakitęs (pasislinkęs) visų kodonų skaitymas nuo pat mutacijos (iškritos ar intarpo) vietos. Tik kai mutacija įvyksta sekose, svarbiose splaisingui (žr. toliau), tai gali pasireikšti splaisingo mutacijomis ir susidaryti pertrauktos sandaros neaktyvūs baltymai.

• Svarbus reguliacinis intronų vaidmuo. Juose daug įvairių reguliacinių cis ele-mentų, ypač stambiuose intronuose, kaip tai yra jau minėto AGAMOUS geno 2-ame in-trone.

Vienas svarbiausių intronuose esančių reguliacinių cis elementų privalumų yra tai, kad iškirpus introną su jame esančiais cis elementais, geno raiška ar koduojamas reiškinys tampa negrįžtami. Negali vykti transdiferenciacija.

Labai svarbu taip nuslopinti identiteto genų koduojamų organų transdiferenciaciją. Kita vertus, pats genas nesikeičia ir išsaugo visą pradinę genetinę informaciją.

• Intronai patys gali koduoti RNR (pvz., mažąsias branduolėlio RNR) arba patys gali veikti kaip biokatalizatoriai – ribozimai. Tokie intronai aptinkami mitochondrijų genuose. Jie katalizuoja splaisingą. Kai kurių genų intronai koduoja baltymus.

• Intronuose esančios cis sekos regulioja RNR modifikavimą, netgi tada, kai pašali-nami intronai (bent jų dalis). Taip, pvz., atsitinka plastidžių tRNR. Jų pre-tRNR turi in-tronus. CCA prie plastidžių tRNR prijungiamas sunkiai, kol neiškirpti intronai.

Splaisingas – vienas iš potranskripcinio genų valdymo būdų. Kaip minėta, mRNR, iš kurios nepašalinti intronai, apskritai nepernešamos per branduolio porų kom-pleksą. Įsitikinta, kad tai irgi būdas reguliuoti geno pasireiškimą vietoje ir laike, t. y. tam tikrose ląstelėse ir tam tikru metu. Papildomas galimybes valdyti genų raišką teikia alter-natyvusis ir trans-splaisingas. Alternatyvusis splaisingas sukuria transkriptų ir baltymų įvairovę iš vienos bendros pre-RNR, kurią koduoja vienas genas. Be to, kontroliuojamas alternatyviojo splaisingo laikas. Tad įvairūs vieno geno produktai gali pasigaminti skirtin-gose ląstelėse ir skirtingu laiku.

Kita splaisingo variacija, trans-splaisingas, dar įdomesnė. Iš esmės, jis sukuria hibri-dines mRNR. Dalis egzonų nuo vieno transkripto prijungiama prie kito transkripto eg-zonų.



Tačiau apie 30 % vairenio genų apskritai neturi intronų, ir jų transkriptui splaisingas nereikalingas. Su prijungta „kepure“ arba „uodega“, arba be jų, jie tiesiai gabenami į ci-toplazmą, o branduolio RNR pastatomos į reikiamą vietą branduolyje. Tai irgi būdas diferencijuotai valdyti genus grupuojant:

– turi intronus - neturi intronų; – reikalingas „kepurės“ ir „uodegos“ prijungimas, ar ne. Visos šios pre-RNR modifikacijos ar jų nebuvimas irgi sudaro galimybes prie tran-

skripto/RNR prisijungti skirtingiems baltymams (žr. 5.6 intarpą ir toliau).

5.5.2.2. Intronai ir egzonai. Splaisingo mechanizmas

Splasingo pobūdis, visos su juo susiję sąveikos yra numatytos genuose, jų atitinka-mose nukleotidų sekose. Egzonų ir intronų sekos yra ne tik pre-RNR, bet ir jas koduo-jančiuose genuose.

Prisiminkime splaisingą (5. 18 pav.). Tai vienas iš tų pre-RNR, kurios turi antro-

pre-mRNR Kep

Kep

Kep

Kep

Uo

Uo

Uo

Uo

3'

3'

3'

3'

3'

5'

5'

5'

5' Egzonas 1 Egzonas 2

mRNR

+

Introno kilpa (bus degraduota)

Splaisosomos komponentai

(ciklas kartojasi)

Sujungti egzonai 1 ir 2

A

Egzonas 2

Intronas

Egzonas 2

Egzonas 1

Egzonas 1

Splaisosoma

Splaisosomos komponentai

IntronasGU CUNAN AG

Atsišakojimo seka Vieta Vieta

Egzonas 2mb RNR U1, U2, U5, U4/U6 ir baltymai

(1)

(2)

(3

Egzonas 1

Splaisosomos sąveika su intronu

5.18 pav. Splaisingo eiga, dalyvaujant splaisosomai: (žr. tekstą). ir , − egzonai; − intronas; Kep – kepurė; Uo – uodega; U – ma-žosios branduolio RNR.

270 |

nus brendimo procesų. Intronai iškerpami, o likę egzonai sujungiami į vieną bendrą gran-dinę. Tik iš pažiūros čia viskas paprasta. Iš tiesų tai vienas sudėtingiausių reiškinių, ku-riame dalyvauja dinamiškas (kintantis) baltymų ir mažųjų branduolio RNR (mbRNR arba angl. snRNA) kompleksas. Mažosios branduolio RNR, žymimos U raide, jau būna susi-jungę su baltymais − yra mbRNP. Splaisomoje dalyvauja bent keturios mbRNR: U1, U2, U4/U6, U5. Kitos U reikalingos egzono/introno atpažinimui arba yra labiau dinamiškos. Tai priklauso nuo introno sandaros. Papildomai turi susidaryti atpažinimo kompleksai, kurie atpažįsta egzoną/introną apskritai ir vadinamąsias 5′ ir 3′splaisingo vietas. Splaisin-gas labai konservatyvus, todėl kas žinoma apie žinduolių pre-RNR splaisingą, beveik vis-kas tinka ir augalams, tačiau skirtumų yra: ne tiek splaisosomos, kiek intronų, egzonų atpažinimą ir splaisingo pradžią reguliuojančių baltymų. Nuo jų priklauso ir alternatyvusis splaisingas.

Trumpai splaisingo įvykius galima apibūdinti taip: – atpažįstamos 5′ ir 3′ intronų ribos; – splaisosomos baltymai kerpa introną 5′-gale ir 5′-galą sujungia su vadinamuoju

atsišakojimo tašku - tai būdinga nukleotidų seka, kurioje esminis yra A nukleo-tidas;

– kerpamas introno 3′-galas, ir iš introno susidaro laso pavidalo kilpa; – paprastai intronas suskaidomas. Išlieka tik tos intronų sekos, kurios turi papil-

domą paskirtį. Pačios dalyvauja splaisinge kaip ribozimai arba mažosios bran-duolio mRNR vadinamos U. Kartais intronai koduoja baltymą (tai būdinga san-klotiniams genams ─ ,,genas-gene“). Introno seka gene gali koduoti mažąsias branduolio ar branduolėlio arba nekoduojančias reguliacines RNR (5.19 pav.).Visa splaisingo eiga, baltymų sąvekos su pre-RNR sekomis (egzone ir introne) yra koduojamos konkrečių geno sekų, kaip ir kitos modifikacijos, kurias patiria RNR ir baltymai.

5.19 pav. Splaisingo komplekso dalis: egzono ir introno ribų nustatymas: E – egzonas; AT – atsišakojimo taškas; sv – splaisingo vieta; kiti paaiškinimai tekste (pagal A. S. N. Reddy. Annual Review of Plant Biology. 2007, Vol. 58, P. 267−294). Intronų/egzonų ribų nustatymas ir splaisingo pradžia − labiausiai genetikus

dominantys įvykiai. Būtent tuo metu splaisingas pasireiškia kaip genų potranskripcinio valdymo būdas.

Egzono nustatymas Introno nustatymas



Introno ribas iš abiejų pusių žymi labai konservatyvūs dinukleotidai: 5′-GA, kitaip vadinami donoru, o 3′-UG − receptoriumi. Tai splaisingo vietos. Dėl didelio konservaty-vumo (nurodoma 100 %) jos vadinamos invariantinėmis. Apie 0,4 % intronų turi ne-įprastas 5′ ir 3′-vietas: tai AT-AC, AT-AA, AT-AG, AT-AT, GT-GG. Šios nekanoninės vietos sąveikauja su kitais baltymais ir U. Pagal tai intronai netgi skirstomi į U2 (kanoni-nius) ir U12 (nekanoninėms 5′ ir 3′-vietomis). Splaisingui svarbūs ir gretimi 5′ ir 3′-vietomis nukleotidai egzone ir introne: 5′-gale 9 nukleotidai CAG:GUAAGU ir 5 nu-kleotidai 3′-gale GCAG:G (dvitaškis žymi egzono-introno ribas). Tai konsensusai. Jų reikšmė įrodyta splaisingo/intronų mutacijomis (žr. toliau).

Laso kilpai (5.18 pav.) susidaryti labai svarbus atsišakojimo taškas. Nesutariama, ar visi augalų genai savo intronuose turi šią nukleotidų seką. Pati seka, matyt, labai variabili, nes netgi jos konsensusas užrašomas įvairiai: CUNAN, UUNAN, RUNAN. Bulvių genų intronuose, pvz., ji yra CUAAU (arba kitaip CURAY).

Stuburinių intronuose šalia 3′-galo yra vadinamasis pirimidinų ruožas (traktas). Bent jau dauguma dviskilčių augalų šios nukleotidų sekos neturi. Vietoje jos augalų intro-nuose gausu AU kartotinių sekų. Jos būtinumu splaisingui įsitikinta, kai į kukurūzų Bron-ze2 (Bz-2) geną įterpta gausi AU nukleotidų seka. Splaisingas vyko intensyviau, atsirado alternatyvusis splaisingas, susidarė naujas intronas, nes intronuose gali būti paslėptų (kriptinių) invariantinių sekų, kurios gali pakeisti kanonines 5′ ar 3′-vietas. Tai vienas iš alternatyviojo splaisingo mechanizmų. Kai šiose AU sekose U pakeičiamas į A, lieka ne-pašalinti intronai. Prie AU jungiasi būdingi baltymai (UBP1, RBP4, RBP47). Jie keičia splaisingo efektyvumą, tai turi įtakos geno raiškai. Pagaliau augalų genuose (bet ne visuo-se) aptikta ir pirimidinų ruožas, kuriame ištisai yra U...(įvairaus ilgio). Dviskilčių augalų intronuose sėkmingam splaisingui turi būti ne mažiau kaip 59 % UA sekų.

Splaisingui yra svarbios ir nukleotidų sekos, esančios egzonuose. Juose yra vadina-mieji splaisingo enhanceriai. Prie jų jungiasi SR baltymai. Splaisingo enhanceriai yra ir intronuose. Jų derinys nulemia konkrečios pre-mRNR splaisingo savitumą.

Gretimai esantys egzonas ir intronas, taip pat gretimai esantys egzonai sujungti į vi-eną bendrą funkcinę splaisingo atžvilgiu grandinę. Tuo įsitikinta dvejopu būdu:

• pagal intronų mutacijas, kai mutacija viename introne atkuria normalų gretimo mutantinio introno splaisingą;

• naudojamos įvairios dirbtinės konstrukcijos, pavyzdžiui, derinys iš introno, paim-to iš žirnių atsarginio baltymo legumino geno ir kviečių amilazės geno. Pirmojo intronas turi gausią AU sritį ir intensyviai pasireiškia splaisingas, o amilazės introne mažai AU ir splaisingas labai lėtas.

Tokiame derinyje amilazės introno splaisingas padidėjo 3,5−4,4 karto.

Dirbtinės konstrukcijos, kaip ir splaisingo mutacijos, yra viena pagrindinių priemonių tirti splaisingo mechanizmą.

Spalaisosoma ir introno atpažinimas. Bendras splaisingo veiksnių skaičius augalo branduolyje yra per 200, tačiau pačią splaisosomą, kuri atpąžįsta 5′-GU ir 3′-AG vietas, suda-ro penkios mbRNR, žymimos U1, U2, U4/U6, U5, ir apie 40 splaisingo veiksnių. Tarp jų yra baltymai, kurie sudaro splaisosomos šerdį. Jie žymimi tiesiog raidėmis ir skaičiais, pana-šiai kaip mbRNR: B, B′, D1, D2, D3, E, F, G. Splaisosomos baltymai yra dviejų tipų:

272 |

• kurie jungiasi su U1, U2 mbRNR ir kitomis mbRNR ir splaisosomoje veikia kaip ribonukleoproteidai – mbRNP;

• ne-mbRNP (angl. non-snRNP) baltymai. Dar prieš tai, kai susidaro splaisosoma, nustatomos intronų ir egzonų ribos. Tai at-

lieka U2AF veiksnys. Jis sudarytas iš skirtingos paskirties subvienetų: U2AF65, kuris jun-giasi su pirimidino ruožu, o U2AF35 – prie introno 3′-galo (5.21 pav.). Vairenio genome yra keturi genai (tarp jų vienas pseudogenas, žymimasΨ), kurie koduoja AF65, ir du AF35 genai. Skaičiai parodo jų molekulinę masę, o U2, kad AF65 ar AF35 susijungęs su U2 mbRNR. Tarpininkas tarp kaimyninio egzono ir introno yra SR baltymas (SRp), o U2AF35 yra tarpininkas tarp SRp ir U2AF65.

Prie 5′-GU vietos jungiasi U1mbRNP. Tarpininkais tarp egzono ir introno, taip pat 5′ ir 3′- vietų vėl yra SRp (5.19 ir 5.20 pav.).

Patys didžiausi kiekiai yra mažosios branduolio RNR U1, nes ją koduoja daugybė į vieną santalką sutelktų genų. Visi splaisingo komponentai saugomi branduolyje iki reikiamo momento Kajalo kūneliuose ir taške-liuose (angl. specles).

SR baltymai. Jau galėjome įsitikinti, kokie egzono/introno ribų nustatymui yra svarbūs SR baltymai, tačiau jų reikšmė kur kas didesnė. Jie jungiasi prie egzone esančių splaisingo enhancerių ESR arba/ir introne esančių panašios paskirties cis elementų IRS (nuo Intron Splaising Regulator). Taip nustatomi splaisingo laikas ir vieta (5.20 pav.). Auga-lams, kurių genome alternatyvusis splaisingas nėra toks dažnas kaip gyvūnų, tai gali būti labai svarbus būdas reguliuoti geno raišką po transkripcijos. Iš dalies tai patvirtina dvigu-bai didesnis įvairius SR baltymus koduojančių genų skaičius augalo genome. Vairenio genome koduojami bent 20 SRp, o ryžio dar daugiau – 23, žmogaus genome koduojama tik 10 skirtingų SRp. Mielių Schizosaccharomyces pombe apskritai yra tik du SR baltymų genai. Tai rodo, koks didelis SR genų evoliucijos šuolis padarytas gyvūnų ir ypač augalų geno-muose ir kaip „lyg ant mielių“ augo SR baltymų svarba ir funkcijų įvairovė.

5.20 pav. SR baltymų sąveika su ESE sekomis egzonuose ir baltymais, kurie jungiasi su splaisingo pradžios vietomis intronuose: (žr. tekstą; pagal L. Collins, D. Penny. Molecular Biology and Evolution. 2006, Vol. 23, P. 901─910). Pats jų pavadinimas kilęs nuo dviejų aminorūgščių − serino (S) ir arginino (R), kurių

gausu domene, esančiame C-gale. Tipiškas SR baltymas N-gale turi vieną arba du RRM ir C-gale RS domeną:

RRM1 RRM2 RS



Tačiau augalų SRp labai įvairūs. Kai kurių SR baltymų vidinėje dalyje yra vienas arba du Zn lankstai (angl. knucles):

RRM Zn Zn RS

SRp saugomi taškeliuose (angl. specles), kurie yra diferencijuoti, kaip ir daugelio SRp pa-skirtis: atpažinti introno-egzono ribas, sujungti atpažinimo sritis ir splaisosomą į vieną derinį, reguliuoti alternatyvųjį splaisingą ir, svarbiausia, diferencijuotai reguliuoti konkre-čių pre-mRNR splaisingo vietą ir laiką. Deja, kaip tai SRp atlieka, kol kas kuriami tik spė-jami modeliai (5.19 ir 5.20 pav.), bet SR genai ir baltymai dabar intensyviai tiriami toliau.

Kai kurie SRp yra bendri gyvūnams ir augalams, bet vairenio genome koduojami bent 7 SRp, kurių gyvūnai neturi. Toks yra, pvz., SR45 baltymas, kuris turi du RS dome-nus, o juos skiria įsiterpęs tarp jų RBD domenas. RS domenu SR baltymas jungiasi su baltymais, todėl galima manyti, kad SRp45 iš karto jungiasi su dviem baltymais.

SRp kontroliuoja abu, vad. konstitucinį ir alternatyvųjį, splaisingo tipus. Tačiau ir pačioms keleto genų koduojamoms SR pre-mRNR irgi būdingas alternatyvusis splaisingas (9 iš 20 vairenio genų). Kita vertus, nors pirmaeilė SRp paskirtis yra splaisingo kontrolė, jie yra daugiaveiksmiai baltymai. Dalyvauja RNR pernašoje, stabilizuoja mRNR ir net patys reguliuoja transliaciją. Kai kurie SRp juda tarp citoplazmos ir branduolio ,,šaudyklės“ (audimo staklių) principu „pirmyn-atgal“. Keista, tačiau toks yra SRp1, kuris labai svarbus splaisingui. Be to, jis turi dar vieną paskirtį: prisijungęs prie mRNR 3′UTR dalies jis stabilizuoja mRNR. SR reikšmė splaisingui pirmiausia nustatyta žinduolių ir mielių ląstelių branduoliuose. SR baltymas, pa-vadintas ASF/SF2 veiksniu, atpažįsta būdingas sekas pre-mRNR. Tai egzono enhanceriai ESR (arba dar kitaip ESE) (5.20 pav.). ASF/SF2 skatina splaisingo veiksnių prisijungimą prie 3′ ir 5′-splaisingo vietų. Vien tik su U1-70K, kuris nustato 5′-splaisingo vietą, jungiasi bent keturi skirtingi SRp, tarp jų ir SRp45, kuris būdingas tik augalams. Augalų SRp numeruojami atradimo tvarka, todėl ASF/SF2 homologas yra žymimas SR1/SRp34. Vairenio genome šį SRp koduoja net 4 genai. Manoma, kad tik SR1/SRp34 yra bendro veikimo splaisingo veiks-nys. Kiti SRp yra saviti audiniams. Pvz., RSZ33p, kuris turi du Zn lankstus, įsiterpusius į RS sritį, aptin-kamas tik kai kuriose augalo dalyse: žieduose, ūglio ir šaknies viršūninėje meristemoje. Šis baltymas kon-troliuoja SRp (AtSRp30 ir AtSRp34/SR1) veiklą. SR baltymus kontroliuoja ir įvairios proteinkinazės. Tai turi įtakos SRp perskirstymui branduolyje.

Papildomi pagrindiniam splaisingo kompleksui SRp baltymai sukuria papildomą lyg-menį reguliuoti geno raišką po transkripcijos. Patys SRp ir kiti baltymai tampa moduliais baltymų komplekse, sukurdami komplekso pasireiškimo savitumą įvairiuose augalo audiniuose ir esant įvairioms aplinkybėms.

Didieji augalų genų intronai – reguliacinių cis elementų buveinė? Įsitikinta, kad splaisingui prasidėti ir sėkmingai jo eigai labai svarbūs pirmasis egzonas ir intronas, kurie dažnai yra 5′-UTR, t. y. netransliuojamoje transkripto dalyje. Nuo jų prasideda ir plinta tolyn splaisingas. Tad yra signalai splaisingo pradžiai.

Paprastai augalų intronai yra trumpi, gerokai trumpesni nei gyvūnų ir ypač žmogaus: vairenio intronų vidutinis ilgis yra 169 bp, o žmogaus – 3400bp. Tačiau aptikta daug au-galų genų, kurių pirmasis intronas yra palyginti stambus. Apskritai atkreiptas dėmesys į stambiuosius intronus. Jau minėjome, kad AG, FLC, STK genų cis elementai yra dideliame 3 kbp introne. Tik AG geno tai yra antrasis intronas. Be to, nustatyta, kad šis intronas gali

274 |

būti intensyviai metilinamas. Tad manoma, kad taip epigenetiniu būdu kontroliuojamas šio geno pasireiškimas tik tam tikrose ląstelėse ir tam tikru laiku. Panašiai yra FLC geno, tik pirmajame introne.

Vienas iš būdų ištirti introno reikšmę − šį introną įterpti arba pašalinti genui, kuris sulietas su genu reporteriu. Tokia analizė Vašijo ir Morikavos (K. Washio, M. C. Morika-va, 2006) atlikta su ryžių aleurono GMD1,2,3, RPD1,2,3, RPBF genais, kurie yra giberelino (GA) atsako genai ir pasireiškia, kai grūdas dygsta. Stambųjį 1-ąjį GAMyb ir RPBF introną koduojančios sekos buvo įvestos arba ne į tirtų genų 5′UTR sritį. Tai labai padidino tirtų genų raišką (iki 6,3 karto).

Mikro arba miniegzonai. Pagal dydį − jie kitas kraštutinumas, nes jų dydis pačiame gene neviršija 25 bp. Kol kas jų daugiausia aptikta žmogaus genome. Vairenis yra antroje vietoje (5.4 lentelė), bet tai gali nulemti šių mikroegzonų ištirtumas genomuose, nes dviejų ar kelių nukleotidų egzoną aptikti nelengva. Paprastai remiamasi kanoninėmis splaisingo vie-tomis 5′-GU ir 3′-AG (5.21 pav.). Egzonui būtinos vidinės sekos, kurios reguliuoja splaisin-gą – splaisingo enhanceriai. Paskaičiuota, kad minimalus gyvūnų egzono dydis, dėl kurio jau gali vykti autonominis splaisingas, yra 51 nt. Tad netgi 25 nt egzonas yra mažiau šio minima-laus ilgio, o ką kalbėti apie 2 nt mikroegzoną. Pasirodo, šie egzonai apsirūpina padedami kaimyninių intronų. Manoma, kad mikroegzonai svarbūs alternatyviajam splaisingui, tačiau iš dviejų ištirtų mikroegzonų vairenio genome, alternatyvusis splaisingas nustatytas tik vieno (5.4 lentelė). Be to, dviejų nukleotidų iškirpimą galima palaikyti paprasčiausia iškrita, ir mik-roegzonų alternatyvųjį splaisingą nelengva aptikti.

5.4 lentelė. Mikroegzonų pasiskirstymas pagal ilgį (bp) įvairių organizmų genomuose (pagal N. Volfovsky, B. J. Haas, S. L. Salzberg. Genome Research. 2003, Vol. 13,

P.1216−1221)

Mikroegzono ilgis bp Genomas 2−5 6−10 11−15 16−20 21−25

Iš viso

Egzono peršoka

Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana Homo sapiens

0 1 7 5

2

10

19

59

1 6

13

77

3 5

28

90

4

12

74

194

10

34

141

425

3 4 1

60 Geriausiai jis ištirtas bulvių invertazės miniegzono. Jis koduoja iš viso tik 3 amino-

rūgštis, tačiau neabejotinai įrodyta, kad šio miniegzono peršoką (praleidimą subrendu-siame transkripte) sukelia šalčio stresas. Invertazė (β-fruktozidazė) yra fermentas, kuris sacharozę skaido į gliukozę ir fruktozę. Didesnė cukrų koncentracija ląstelėje yra labai svarbi priemonė apsisaugoti nuo šalčio. Be to, cukrai augalo ląstelėse yra procesų regulia-toriai, šiuo metu priskirami prie hormonų.

Miniegzonas aptinkamas ir kitų augalų invertazės genuose. Tad reikia manyti, kad taip valdoma ir kitų augalų invertazės geno raiška.



5.21 pav. Vairenio (Arabidopsis thaliana) mikroegzono alternatyvusis splaisingas. Mikroeg-zono vietą galima nustatyti pagal 5‘GT-...AG-3‘ (pagal N. Volfovsky et al. Genome Research. 2003, Vol. 13, P. 1216−1221).

5.5.2.3. Intronų ir splaisingo mutacijos

Jos labai intensyviai tiriamos žmogaus genome. Tai visiškai suprantama, nes splai-singo ir intronų mutacijos yra daugelio paveldimų ligų priežastis. Be to, paaiškėjo, kad panašaus fenotipo mutacijos gali atsirasti dėl pokyčių aminorūgštis koduojančioje geno dalyje (egzonuose) ir nekoduojančiose DNR sekose, tarp jų intronuose.

Augalų genome šios mutacijos leidžia išsamiau pažinti splaisingo mechanizmą ir geno funkcinę sandarą, bet, svarbiausia, alternatyviojo splaisingo ir genų valdymo me-chanizmų evoliuciją: iš kur ir kaip atsirado alternatyvusis splaisingas. Daugelis alternaty-viojo splaisingo atvejų yra laiku natūraliosios atrankos „panaudotos“ splaisingo ir intronų mutacijos.

Splaisingo ir intronų mutacijos dažniausiai pasireiškia vienu kuriuo iš trijų būdų: • introno (arba intronų) išsaugojimu – intronas subrendusioje mRNR išlieka nepaša-

lintas; • egzono (arba egzonų) peršoka (angl. skipping) – egzonas pašalinamas kartu su jį su-

pančiais intronais; • sutrumpėjusiu egzonu ar intronu dėl ne vietoje atsiradusių 5′- ar 3′-splaisingo arba po-

liadenilinimo vietų. Visi šie pokyčiai stebimi ir kai vyksta alternatyvusis splaisingas. Intronų mutacijos invariantinėse ir variantinėse sekose. Pagal mutacijos atsira-

dimo vietą introną koduojančioje geno dalyje intronų mutacijos skirstomos į • invariantines, kurios įvykę gene 5′-GTarba 3′-AG splaisingo vietose, • variantines, kurios įvykę kitose labiau kintančiose, ne tokiose konservatyviose vie-

tose. Invariantinių nukleotidų sekų (5′-GT arba 3′-AG) mutacijos yra geriausiai ištirtos.

Jos padėjo išryškinti gene ir pre-RNR slaptąsias (kriptines) splaisingo vietas. Potencialiai jos jau egzistavo introne ir iki mutacijos. Mutacija jas tik priverstinai išryškino, nes 5′ ar

B

A

C

276 |

3′-vietos funkciją teko perimti slaptajai vietai. Slaptosios splaisingo vietos gali atsirasti ir egzoną (tai jau egzono/splaisingo mutacija), ir introną koduojančioje geno dalyje. Pri-klausomai nuo jų atsiradimo vietos susidaro ilgesni ar trumpesni transkriptai: pailgėja ar sutrumpėja egzonas (5.22 pav.).

5.22 pav. Invariantinių sekų mutacijos, slaptųjų splaisingo vietų atsiradimas ir pasekmės: Mutantiniai egzonai, intronai ir splaisingo vietos žymimos ′, ′′, ′′′. Pilkai žymima nauja egzono dalis, at-siradusi egzone papildomai dėl splaisingo vietos mutacijos; baltai – egzono dalis ar visas egzonas per-šoktas, kurio nėra subrendusioje RNR. Dažnesnės, netgi dažnos, yra variantinių sekų mutacijos, bet šias mutacijas rečiau

pavyksta nustatyti pagal fenotipo pokyčius. Tik jeigu tai intronuose esančių cis elementų arba svarbių splaisingui AU, pirimidinų ruožo ar atsišakojimo taško mutacijos, jas galima nustatyti ir pagal fenotipo pokyčius. Apie daugelį intronų variantinių sekų mutacijų tenka spręsti iš sekoskaitos rezultatų, tačiau kasmet didėja skaičius genų, pagal kurių mutacijas, pasireiškiančias fenotipe, nustatomos cis reguliacinės sekos intronuose. Be jau minėtų AGAMOUS, SPINDLY, COP1, FCL, ribulozobisfofatokarboksilazės/oksigenazės (kitaip Rubisko) mutacijų intronus koduojančiose sekose ir taip aptiktų cis elementų, panaši yra irgi minėta miežių dominuojančioji mutacija Hooded (žr. 5.8 pav.) Ji įvykusi dėl stambios 305 bp duplikacijos IV- Knox 3 geno introne

Atsišakojimo taško mutacijos pasireiškia silpniau nei 5′-GU arba 3′-AG splaisingo vietų mutacijos. Tai nustatyta įvairiems augalams ir įvairiems genams: žirnių legumino, kviečių α-amilazės ir kt.

Egzono peršoka, kai egzonas arba egzonų grupė tiesiog peršokamas arba dar kitaip praslystami (angl. slipping) – dažna splaisingo mutacija. Vienas arba daugiau egzonų su-



brendusioje RNR yra praleidžiami (5.22 pav.). Priežastys įvairios: 5′-GT arba 3′-AG vietų mutacijos, slaptų splaisingo vietų atsiradimas, kitų splaisingui svarbių nukleotidų sekų pokyčiai. Kai peršokamas egzonas ar egzonai, nuo tokios mRNR sintetinamas pertrauk-tas, todėl dažnai neveiklus baltymas. Kai ne vietoje atsiranda nukleotidų seka, prie kurios prijungiamas poli-A, nuo mRNR sintetinamas trumpesnis, nei turėtų būti polipeptidas. Tai dažnas įvykis, kai yra alternatyvusis splaisingas.

Ištyrus kai kurias splaisingo mutacijas įsitikinta, kad splaisingui svarbios ne tik kano-ninės nukleotidų sekos, pvz., 5′-GU arba 3′-AG, bet ir jiems kaimyniniai nukleotidai, to-dėl nurodomos ir sekos, kurios supa 5′-GU arba 3′-AG iš abiejų pusių. Pvz., egzono per-šoka nustatyta vairenio APETALA3 (AP3) geno mutante ap3-1. AP3 genas pagal žiedo tapatybės genų klasifikavimą ABCDE priklauso B genams. Vadinasi, lemia žiedo vainik-lapius ir kuokelius, pastaruosius kartu su kitu žiedo organų genu AGAMOUS. Kai atsi-randa ap3 geno mutacija, kuri inaktyvina AP3 geną, susidaro tik piestelės ir taurėlapiai. Žiedas be vainiklapių, ir tai labai pastebimas fenotipo pokytis. Iš čia mutacijos pavadini-mas − be vainiklapių.

Mutanto ap3-1 subrendusioje mRNR trūksta vieno, būtent 5-ojo egzono. Jis peršok-tas, vykstant pre-RNR splaisingui. Gana tipiška splaisingo mutacija, tik ji įvykusi 5-jo egzono gale, per 2nt nuo 5-ojo introno splaisingo vietos. Vienas nukleotidas pre-mRNR pakeistas kitu, būtent A→T (5.23 pav., A). Lygiai toks pat rezultatas gautas su transgeni-niu AP3, kuris buvo prijungtas prie CaMV 35S promotoriaus, o DNR nukleotidų sekoje, kuri koduoja 5-ąjį egzoną, toje pačioje vietoje (2 nt prieš 5′-GT) atlikta pakaita A→T. Introno mutacija jos negalima vadinti, todėl splaisingo mutacija yra platesnis terminas nei introno mutacija, kuri vyksta tik introne. Splaisingo mutacija yra bet kuri mutacija, kuri keičia splaisingą.

Splaisingo/intronų mutacijos gene netelpa į įprastų pakaitų ar iškritų grupę, kurios pa-sireiškia kaip missense, nonsense, rėmelio poslinkio (frame shift) mutacijos. Tai savita muta-cijų grupė, dažnai sukelianti tokį patį fenotipo pokytį, kaip įvardytos mutacijos.

Dar vienas reversijų tipas – splaisingo/intronų mutacijų reversijos. Reversijos, kitaip yra grįžtamosios mutacijos. Kai jos įvyksta, mutantas vėl virsta normalaus fenotipo augalu. Grįžtamosios mutacijos atsiranda įvairiu būdu (5.7 intarpas). Splaisingo/intronų mutacijų tyrimai padėjo atrasti dar vieną jų atsiradimo tipą: grįžtamąsias splaisin-go/intronų mutacijas.

Augalų tokio tipo grįžtamosios mutacijos, matyt, ir buvo pirmą kartą aptiktos tarp jau minėto APETALA3 geno splaisingo mutanto ap3-1 palikuonių. Ištirtas normalaus fenotipo augalas ir jo palikuonys. Jie turėjo vainiklapius, o subrendusioje AP3 mRNR ap-tiktas ir 5-asis egzonas. Jis mutante ap3-1 buvo peršoktas. Bet transkripte be tiesioginės mutacijos, aptikta dar viena mutacija. Be to, netikėtoje vietoje, sekoje, koduojančioje 4-ąjį introną. Tad ap3-11 pažymėti augalai yra dvigubi mutantai (5.23 pav., B ir C): mutacija 4-ajame introne slopino mutaciją (tiesioginę) 5-ajame egzone.

Kas įvyko, kad atsirado toks revertantas? Tiksliai revertanto fenotipą paaiškinti sun-ku, bet manoma, kad 4-ajame introne dėl vėl vieno nukleotido pakaitos G→A 33 vietoje atsirado naujas papildomas atsišakojimo taškas.

278 |

5.23 pav. Egzono (5-ojo) peršoka (nėra subrendusiame transkripte) vairenio APETALA3 mutante ap3-1 ir normalaus splaisingo reversija dvigubame mutante ap3-11: Spėjama, kad reversija įvykusi dėl naujo papildomo atsišakojimo taško 4-ajame introne. A – AP3 genas – normalus fenotipas; mutantas ap3-1 – mutantinis fenotipas, jo subrendusioje mRNR praleistas 5-asis egzonas; revertantas ap3-11 − jis atsirado dėl naujos mutacijos (pakaitos, ji parodyta rodykle) jo sekoje, koduojančioje 4-ąjį introną, ir jame susidarė du atsišakojimo taškai (senas ir naujas). Siekiant atskirti egzonų sekas nuo intronų nukleotidų sekų, pastarosios gene užrašomos mažosiomis raidėmis. B ir C – dirbtinė pakaita (B) transgeno CaMV35S::AP3 5-ojo egzono gale A→T (mRNR A→U) ir (C) jos pasekmės – peršoktas E5 egzonas. Jo nėra subrendusioje transgeninėje mRNR (pažymėtoje AP3-Met-153mRNR). E5 pavaizduotas juodai (pagal Y. Yi, T. Jack. Plant Cell. 1998, Vol. 10, P. 1465−1478 ).

Šis revertantas yra pakankamai svarus įrodymas, kad tarp šalia esančių egzonų ir intro-nų palaikomas funkcinis ryšys, ir egzonų sujungimas į bendrą grandinę subrendusioje mRNR yra griežtai kontroliuojamas.

Splaisingo/introno tiesioginės mutacijos ir reversijos dėl judriųjų genomo elementų vietos kitimo (transpozicijos). Gamtinės splaisingo/intronų mutacijos gali atsirasti dėl transpozonų įsiterpimo į splaisingui svarbias vietas egzone ar introne. Tokia mutacija aptikta didžiojo žioveinio (Antirrhinum majus) Plena gene, kuris yra ortologas vai-renio AGAMOUS genui. Dvi Plena geno mutacijos yra atsiradę dėl transpozono Tam3 įsiterpimo į šio geno didijį introną, be to, dvejopu būdu, dėl ko atsiranda fenotipų skir-tumai. Tad mutantai pavadinti skirtingais vardais plena ir ovulata.

U Pakaita

...AUG - Met



Vieno mutanto (ple-625) Plena gene Tam3 įsiterpęs ta pačia kryptimi, kaip geno nu-kleotidų seka (5′→3′) (5.24 pav.). Alelis tampa neaktyvus, atitinka apibūdinimą loss-of-function, nes Tam3 turi transkripcijos pabaigos (terminacijos) seką. Pasireiškia plena fenotipas: nesusidaro kuokeliai ir piestelės (panašiai kaip vairenio ag mutanto).

5.24 pav. Skirtinga Tam transpozono įsiterpimo padėtis į žioveinio (Antirrhinum majus) Plena geną ir du skirtingi žiedo morfologijos mutantai: ovulata – vidutinis; kairėje – WT ; de-šinėje – plena (žr. tekstą; pagal D. Bradley et al. Cell. 1993, Vol. 72, P. 85−95). Kitas dėl Tam3 įsiterpimo atsiradęs mutantas (ple-627) vertinamas kaip gain-of function

(perteklinis). Transpozonas Tam3 įsiterpęs beveik toje pačioje vietoje, kaip ir pirmojo mu-tanto, tik priešinga geno Plena nukleotidų sekai (3′→5′) kryptimi (5.24 pav.). Pasireiškia ne-kontroliuojamas ištisinis skaitymas (angl. read-through). Geno produktai kaupiasi ne vietoje, todėl išsivysto ovulata fenotipas: vien tik kuokeliai ir piestelės. Nėra kitų žiedo dalių.

Reikia transpozonui Tam3 „išsikraustyti“ iš introno, ir įvyksta grįžtamoji mutacija, augalai įgyja normalią žiedo sandarą.

Tad ir splaisingo/intronų mutacijos, kaip ir jų reversijos, gali vykti dėl įvairių prie-žasčių.

5.7 intarpas. Kuo skiriasi intronų/splaisingo mutacijų reversijos nuo kitų grįžtamųjų mutacijų

Tikrasis grįžimas iš mutanto į pradinę padėtį labai retas. Dažnai pakanka, kad nul (arba kitaip loss-of-function) mutantas vėl atgautų gebėjimą sintetinti veiklų baltymą, nors ir su šiek tiek pa-keista aminorūgščių seka. Tarp tokių mutantų gana dažnos grįžtamosios mutacijos iš nonsense mutanto (ne vietoje atsirado stop kodonas – UAG, UAA ar UGA). Reikia, kad tokiame be-prasmiame kodone įvyktų nukleotido pakaita, ir kodonas koduotų kokią nors konkrečią amino-rūštį. Kad ir taip:

AAG → UAG → UUG

Lys Nonsense Leu (WT) Tiesioginė mutacija (Reversija)

280 |

Kitas labai gerai žinomas tipas yra Kriko reversijos. Jos būdingos mutantams, kurie atsiradę dėl vadinamųjų rėmelio poslinkio mutacijų: gene iškritusi arba įsiterpusi nukleotidų pora. Nuo šios vietos visų kodonų skaitymas sutrinka, pasislenka per vieną nukleotidą, todėl ir šios mutacijos yra nul fenotipo. Bet pakanka, kad gene netoli pirmosios mutacijos įvyktų kita irgi rėmelio po-slinkio mutacija, bet priešinga pirmajai: • jeigu iš pradžių buvo iškrita, tai antroji mutacija turi būti intarpas (seka nurodyta mRNR):

CCA UGG CGG CAC AAA UUU GAG − WT ↓ → G CCA UGC GGC ACA AAU UUG AG − rėmelio poslinkio mutacija (iškrita) CCA UGC GAG CAC AAA UUU GAG − Kriko reversija (intarpas) ↑ A • arba atvirkščiai, jeigu pirmoji buvo intarpas, tai antroji − iškrita. Abiem atvejais, nors dalis aminorūgščių sekos yra pakitusi, polipeptido sintezė dvigubame mu-tante atsikuria. Tai ir yra Kriko reversija. Reversija gali įvykti dėl netolygaus krosingoverio seg-mente, kuriame prieš tai įvyko duplikacija. Vienoje homologinėje chromosomoje lokusas patri-gubėja, bet kitoje – vėl lokusas tik viengubas (WT), t. y. joje yra reversija į WT:

Grįžimas į pradinį fenotipą taip pat gali būti dėl nealelinio geno, vadinamojo supresoriaus po-veikio. Supresija gali vykti dėl įvairių priežasčių. Viena jų: kai supresorius nuslopina ne vietoje (ektopiškai) pasireiškiantį mutantą, apibūdinamą kaip gain-of-function. Grįžtamųjų mutacijų būrį papildo ir splaisingo/intronų mutacijų reversijos. Tiesiogines mutacijas gali sukelti judriųjų genomo elementų įsiterpimas, tarp kitų ir splaisin-go/intronų mutacijas. Kai judrusis elementas „išsikrausto“ iš įterpimo vietos, iš mutantinio grįžtama į normalųjį fenotipą. Tai irgi vertinama kaip grįžtamoji mutacija. Taip atsitinka ir splai-singo/intronų mutantams, kurie atsiradę dėl judriojo genomo elemento įsiterpimo.

5.5.3. Alternatyvusis splaisingas augaluose. Autonominis žydėjimo meto kontrolės kelias ir alternatyvusis splaisingas

5.5.3.1. Alternatyvusis splaisingas augaluose

Augalų įvairovė pagal alternatyvųjį splaisingą. Įsigalėjusi neteisinga nuomonė, kad alternatyvusis splaisingas (AS) augalų genomuose nėra toks dažnas ir reikšmingas reiškinys, kaip tai yra žmogaus ar gyvūnų genomuose. Žmogaus iki 74 % visų transkriptų yra AS produktai. Tačiau tyrimų rezultatas priklauso nuo pasirinkto vertinimo metodo, ištirtų genų ir transkriptų skaičiaus, augalų rūšies ar netgi veislės. Geriausiai tai parodo tyrimai, kuriuos atliko Ner-Gaonas (H. Ner-Gaon et al., 2007) su bendradarbiais. Jie išty-rė, kokią dalį sudaro AS transkriptai 11 augalų rūšių, o kai kurių augalų ir veislėse. Įdo-miausia tai, kad mažiausia dalis transkriptų, atsiradusių dėl AS, teko vaireniui ir ryžiams. Iki šiol šie augalai buvo etalonas, pagal kurį buvo sprendžiama apie AS mastą augaluose.



Didžiausias AS transkriptų procentas tarp tirtų augalų aptiktas salotos (Lactuca sativa) ir sorgo (Sorghum bicolor). Dideli skirtumai aptikti ir tarp augalų veislių. Bet ir vairenio, ir ryžių AS transkriptų „kartelę“ teko pakelti iki 30-45 %, nors dar neseniai manyta, kad jų dalis šiuose augaluose yra apie 11 %. Manoma, kad maždaug ant 30 tūkstančių vairenio genų turėtų susidaryti per 120 tūkstančių transkriptų.

Kai kurių, ypač SR baltymus koduojančių, genų AS pobūdis yra labai konservatyvus. Tokiu pačiu būdu vyksta AS netgi samanose (Physcomitrella patens). Nepaisant to, augalai gali skirtis ir pagal pavienių, konkre-čių genų splaisingo pobūdį. Tai nustatyta, pvz., labai svarbiam augalų genui CONSTANS (CO), kuris yra vienas iš pagrindinių fotoperiodizmo genų ilgadienio augalo vairenio genome. Jame AS nevyksta. Kitaip yra trumpadienio augalo sukučio (Pharbitis nil) ortologe PnCo. Tarp 18 ištirtų PnCo geno transkriptų visi intronai buvo pašalinti tik viename jų. Vienas transkriptas kodavo pertrauktą baltymą, o likusiuose intro-nai buvo nepašalinti. Intronų iškirpimą iš PnCo pre-mRNR reguliuoja dienos/nakties trukmės santykis. Intronai pašalinami tik tada, kai yra trumpa diena. Vertas dėmesio ir transkriptų, kuriems pašalinti intro-nai, santykis. Gali būti, kad tai raktas, kaip reguliuojama augalo atmintis, kiek dienų augalas augo trumpos dienos sąlygomis, nes augalas pradeda žydėti tik po tam tikro trumpų dienų skaičiaus. Gali būti, kad kuo ilgiau augalas išbūna trumpos dienos sąlygomis, tuo daugiau transkriptų yra su pašalintais intronais. Suku-čio normaliai žydėjo co mutantas, jeigu į jo genomą įvesta CO kDNR, kuri neturi intronų. Genų įvairovė pasireiškia jau vien pagal tai, kad ne visi genai turi intronus. Vairenio genome intronus turi 79 % branduo-lio, tik 18 % - plastidžių ir 12 % mitochondrijų genų. Mitochondrijų ir plastidžių genomai yra kilę iš bak-terijų, todėl nedidelis genų su intronais skaičius jų genomuose visiškai normalus reiškinys. Jų genome mus domina daugiau tie genai, kurie turi intronus. Jie vėlesnės kilmės.

Genai, kurie neturi intronų, išvengia sudėtingo splaisingo kaip potranskripcinio genų raiškos reguliavimo būdo. Alternatyvusis splaisingas, atvirkščiai, sukuria to paties geno transkriptų įvairovę. Vie-nas genas gali koduoti daugiau kaip vieną mRNR ir baltymą. Be to, skirtingi geno pro-duktai gali pasigaminti skirtingose ląstelėse skirtingu metu ir priklausomai nuo aplin-kybių.

Transkriptų įvairovė, kurią sukuria alternatyvusis splaisingas. Bendro pobū-džio rezultatai dar nepakankamas pagrindas spręsti apie AS reikšmę augalams. Didelis vieno kurio geno transkriptų skaičius, kuris susidaro dėl AS, gali gerokai santykinai padi-dinti AS transkriptų santykį bendroje transkriptų masėje. Kad tai įmanoma, parodo du drozofilos genai, kurie koduoja neįtikėtinai didelį transkriptų skaičių. Tai drozofilos genas Dscam (Down syndrome cell adhesion molecule). Nuo jo dėl AS pasigamina net 38016 įvairių transkriptų. Bet visus pralenkia kitas drozofilos genas Neuroplegic. Dėl jo pre-mRNR įvai-rių modifikacijų, tarp jų ir AS, susidaro per milijoną įvairių transkriptų. Abu drozofilos genai labai svarbūs ryšiams tarp nervinių ląstelių, o Dscam geno mutacija imituoja žmo-gaus žinomo defekto Dauno sindromo pagrindinį pasireiškimą: sutrikusius ryšius tarp ląstelių dėl adhezijos baltymų stygiaus.

Augaluose tokie genai, nuo kurių susidarytų tiek daug transkriptų bent kol kas neap-tikti. Tačiau transkriptų įvairovė, kuri atsiranda dėl AS ir kitų RNR modifikacijų nustatyta gana dideliam genų skaičiui. Dažnai AS būdinga SR genams, pvz., kukurūzų zmRS31A geno susidaro bent šeši transkriptai, o jo ortologo RS31B – keturi. Bent tris transkriptus pavyko jau aptikti ryžių SR32 geno, o vairenio atSR45a – net septynis transkriptus. Dau-guma jų neturi RS domeno (5.25 pav.). Daugiausia transkriptų aptikta bulvių ureazės geno, kurio koduojamas fermentas skaido šlapalą. Jį augalas naudoja kaip amoniako (azo-to) šaltinį. Prie kito bulvių geno, kuris koduoja invertazę, transkriptų įvairovės prisideda

282 |

miniegzonas. Invertazė yra svarbus fermentas. Jis skaido sacharozę. Cukrai yra būtini ne tik augalo metabolizmui, bet ir kaip signalinės molekulės.

Genomas

Konstitucinis splaisingasAlternatyvi donoro vieta

Alternatyvi akceptoriaus vieta

Apskritai alternatyvi padėtis

Konstitucinis splaisingas Egzono peršoka

Introno išsaugojimas

Konstitucinis splaisingas

atSR45a pre-mRNA

Koduojamasbaltymas

Alternatyvusis splaisingas

atSR45a-1a

atSR45a-1b

atSR45a-1c

atSR45a-1d

atSR45a-1e

atSR45a-2

atSR45a-2b

B

A

1 2 3 4 5 6 7 8

300 kb

P3P2 P1

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 7

3 42 7 8

2 3 4 5 6 7 8 RS RRM

RS RRM

RS RRM

RS RRM

RS RRM

RS RRM

RS RRM RS

RS

AUG

AUG

AUG

AUG

5' 3'

6

AUG

AUG

Konstitucinis splaisingas AUG

86

5.25 pav. Alternatyviojo splaisingo tipai (A) ir vairenio (at – A. thaliana) SR45a pre-mRNR alternatyvusis splaisingas ir koduojamų SR baltymų įvairovė po alternatyviojo splaisingo (B): RS ir RRM baltymo domenai (A – pagal B - B. Wang, V. Brendel. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2006, Vol. 103, P. 7175–7180; B – N. Tanabe et al. Plant Cell Physiology. 2007, Vol. 48, P. 1036–1049). Labai svarbu, kad RS, invertazės, uriazės genų AS priklauso nuo aplinkos veiksnių.

Tačiau daugelis susidariusių po AS transkriptų ir jų koduojamų baltymų yra pertrauktos



sandaros, neaktyvūs, kaip jau ir minėto geno atSR45a (5.25 pav.). Kokia prasmė susidaryti neaktyviems geno produktams, daugeliui genų dar kol kas neaišku. FCA, kuris yra vienas pagrindinių autonominio žydėjimo kelio genų, taip reguliuojamas poreikis aktyviam bal-tymui. Panašiai yra ir bulvių ureazės genui. Paprastai šis genas veikia pastoviu režimu, bet silpnai, todėl dauguma baltymo izoformų yra neaktyvios. Tik kai yra šlapalo, padidėja aktyvių baltymo molekulių. Be to, ureazės skirtingi izoformų spektrai yra šaknyse ir la-puose. Tad AS yra kontroliuojamas.

AS svarba augalui. Kaip galėjome įsitikinti, svarbu ne bendras genų skaičius, ku-riems būdingas AS, o ką tie genai koduoja. Labai svarbus požymis yra pats splaisingas. AS būdingas ne tik apie pusei SR genų, bet ir dar vienam tiesiogiai splaisingą vykdančiam veiksniui U1-70K. Šis baltymas sudaro RNP su U1mbRNR. Dėl AS susidaro du jo transkriptai ir baltymai: vieno jų pašalinti visi intronai, o kito lieka nepašalintas vadinama-sis įterptinis intronas. Vienas U1-70K baltymas yra 204 aminorūgščių, o kitas – 427 ami-norūgščių.

Susidarę kiekybiniai SRp profiliai svarbūs prisijungti prie skirtingų pre-mRNR ir prie skirtingų egzono enhancerių tame pačiame gene. Atsiranda skirtumai tarp ląstelių, audi-nių, o gal būt ir organų. SR pre-mRNR AS tai vienas iš būdų reguliuoti genų raišką po transkripcijos.

Įdomu tai, kad ir II RNR polimerazės kai kurie subvienetai susidaro dėl AS. Taip ir-gi reguliuojama genų veikla. Pvz.,nustatyta, kad RNRP II sąveikauja su HUA2 baltymu ir taip reguliuojami keletas žydėjimo laiko ir žiedo organų identiteto genų, tarp jų AG, FLC, FLM.

Tarp genų, kuriems būdingas AS, bent trys yra susiję su fotosinteze. Tai pagrindinio fotosintezės baltymo ribulozo-1,5-bisfosfato karboksilazės/oksigenazės (Rubisko) akty-vazės genas. Jo koduojamas fermentas aktyvina Rubisko, kai dėl apšvietimo keičiasi re-doks potencialas arba ADP/ATP santykis. Tai atlieka dvi to paties geno koduojamos baltymo izoformos, atsiradę dėl AS. Špinatų jos abi yra aktyvios, tik skiriasi dydžiu. Di-desnioji turi papildomas aminorūgštis C-gale. Vairenio AS vyksta tose pačiose vietose, bet susidarę baltymai skiriasi daugiau: vienas - 44, o kitas – 47 kDa.

Plastidžių, fotosintezės ir viso augalo saugai svarbus yra fermentas askorbato peroksidazė. Šis fermentas inaktyvina laisvuosius radikalus, kurie susidaro, kai vyksta fotosintezė. Dėl AS susidaro keturios izofor-mos. Skiriasi jų vieta: viena įsijungia į chloroplasto stromą, kitos – į tilakoidus. Moliūgų NADH hidroksipiruvato reduktazė nėra chloroplastų, o peroksisomų baltymas, bet jis yra svar-bus fotorespiracijai ir veikia kartu su chloroplastų ir mitochondrijų fermentais. Jo AS reguliuoja šviesa. Susidaro dvi izoformos. Viena jų turi signalą (Ser-Lys-Leu) C-gale lokalizacijai peroksisomoje, o kita netu-ri. Tad yra lokalizuojama citozolyje. Šviesa reguliuoja ir askorbatperoksidazės AS.

Kita labai svarbi genų grupė, kurios transkriptų AS vertas ypatingo dėmesio tai genai, kurie koduoja baltymus, lemiančius augalo imunitetą. Tarp tokių genų yra tabako N (arba kitaip RSP4) genas. Jis koduoja R baltymą, kuris lemia atsparumą tabako mozaikos virusui TMV. Dėl AS susidaro dvi šio baltymo izoformos. Abi jos būtinos visiškam atsparumui TMV, nes viena kitą papildo. Viena jų viso ilgio sintetinama prieš ir 3 val. po infekcijos, o kita trumpesnė, pertraukta – po 4−8 val. Tada įgyjamas visiškas atsparumas TMV.

R genų AS yra būdas išvengti patogeno prisitaikymo prie gynybinių augalo priemonių prieš patogeną.

284 |

Kaip jau minėta, AS sukuriama baltymo izoformų įvairovė gali būti atsakas į įvairius ap-linkos, ypač stresą sukeliančius veiksnius, atsakų sudėtinė dalis. Sukuriama baltymo izo-formų įvairovė leidžia augalui geriau prisitaikyti prie pasikeitusių aplinkos sąlygų. Kai kurie baltymai, kuriuos koduojančių genų transkriptui būdingas AS, yra tiesioginiai atsakų dalyviai. Toks fermentas yra FeSOD (superoksido dismutazė). Šis fermentas inaktyvina superoksidinį radikalą ·O2¯, kuris susidaro ne tik oksidacinio ar kitų stresų, bet ir norma-liomis sąlygomis. Tai irgi apsauginis baltymas. Dėl AS susidaro dvi Fe SOD izoformos, kurios abi yra aktyvios.

Kai kurių genų AS labai konservatyvus. Panašiai vyksta ne tik ryžių ar vairenio, bet ir samanos Physcomitrella patiens ląstelėse. Tai nustatyta SR baltymus koduojantiems genams.

AS sukuria ne tik baltymo izoformų įvairovę, bet ir yra būdas reguliuoti geno raišką. Taip, pavyzdžiui, reguliuojama Solanaceae š. augalų geno PPCK2 raiška. Genas koduoja fermentą fosfoenolpiruvato karboksilazės kinazę. Dėl AS susidaro du baltymai: visas (ilgas) ir pertrauktas (trumpas). Kai tik poreikis fermentui sumažėja, sintetinamas per-trauktas baltymas.

Alternatyviojo splaisingo tipai. AS vyksta panašiu būdu, kaip atsiranda splaisingo mutacijos:

• gali būti peršokamas egzonas arba egzonai; • išsaugomas intronas arba intronai; • pašalinama dalis egzono arba paliekama dalis introno (5.25 pav.). Pastarasis susi-

daro dėl alternatyviosios donoro (5′-GU) arba alternatyviosios receptoriaus (3′-AG) vie-tos, o gali būti ir dėl abiejų. Tarp jų gali pasireikšti ir nekanoninės splaisingo vietos, ku-rios apskritai yra retos. Paprastai introno ribas žymi 5′-GU ir 3′-AG. Pvz., kukurūzų SR geno zmRSp31A alternatyvūs transkriptai atsiranda dėl nekanoninių splaisingo vietų: AU-GA, GU-AU, CU-AG, AA-AG, o jo ortologo RSp31B – dėl GU-UG, UA-AG.

Pagal AS pobūdį augalai irgi skiriasi nuo gyvūnų. Žmogaus ir gyvūnų vyraujantis AS tipas yra egzono arba egzonų peršokimas. Be to, gali atsirasti alternatyvi poliadenilinimo vieta, dėl kurios transkriptas netenka vieno ar kelių C-gale esančių egzonų. Augalų vyrau-jantis AS tipas yra introno išsaugojimas. Tokio tipo yra apie 56 % alternatyviųjų vairenio transkriptų ir apie 53,5 % alternatyviųjų ryžių transkriptų.

Pagal intronų pašalinimo pobūdį intronai ir egzonai skirstomi į: – konstitutyviuosius, kurie, atitinkamai, pašalinami arba išlieka visuose geno transk-

riptuose; – alternatyviuosius, kurių iškirpimas ar išsaugojimas priklauso nuo AS.

5.5.3.2. Alternatyvusis splaisingas ir autonominis žydėjimo pradžios kelias. Alternatyvusis poliadenilinimas ir autoreguliavimas

Raidos programų perjungimas iš vegetacinės į reprodukcinę. Ko gero, vienas didžiausių augalo funkcinės genomikos ypatumų yra tai, kad augalas kelis kartus keičia raidos programą ir kad jo morfologinė raida gemalu nesibaigia, o praktiškai vyksta visą augalo gyvenimą. Raidos programa perjungiama:

• kai pereinama iš gametofito į sporofitą, ar atvirkščiai = pasireiškia kartų kaita;



• sėklos raidos metu: nuo zigotos (netgi dar neapvaisintos kiaušialąstės – dar ga-metofito) iki visiškai susiformavusio gemalo su apikaline (viršūnine) ūglio ir šaknų meris-temomis:

atskirą programą įgyja centrinė gemalo maišelio ląstelė; ypatingomis sąlygomis gemalo raidos programą įgyja somatinė ląstelė = tai

dar vienas programos pakeitimas iš somatinės į gemalo raidos programą – tai išskirtinė augalo ypatybė;

• gemalo raidos pakeitimas į vegetacinę augimo programą, perjungimas vyksta, kai sėkla dygsta;

• perjungimas iš vegetacinės į reprodukcinę raidos programą: žiedyno, žiedo susi-darymas.

Ypač sudėtinga daugiamečių augalų, medžių programų kaita. Tam reikia papildomų reguliacinių genų, todėl toks didelis tuopos transkripcijos veiksnių skaičius (žr. 5.14 pav.).

Žydėjimo pradžios kontrolė. „Metas žydėti!“ frazė geriausiai paaiškina raidos programos pasikeitimo pobūdį. Augalui ateina metas žydėti, ir jo vegetacinės raidos pro-grama yra keičiama į reprodukcinę. Ūglio viršūnės meristemoje susidaro žiedyno/žiedo meristema. Iš jos vystosi žiedynas ir žiedas. Be to, žiedyno ir žiedo meristemų ir organų raidą kontroliuoja skirtingos genų grupės, tačiau svarbiausi yra genai, kurių koduojami transkripcijos veiksniai neleidžia augalui žydėti, kol neatėjo tam metas. Tokių genų yra keletas, bet tarp jų, bent kol, kas centrinis yra FLC (FLOWERING LOCUS C). FLC nėra blogas, greičiau − atvirkščiai. Jo paskirtis itin svarbi − neleisti žydėti, kol tam neatsirado būtinos sąlygos:

• augalas nepasiekė tokio vegetacinės raidos laipsnio, kad pajėgtų išmaitinti repro-dukcinius organus, sėklos ir vaisiaus augimą ir sukaupti pakankamą kiekį atsarginių me-džiagų;

• yra reikiamos aplinkos sąlygos žydėjimui ir sėklos/vaisiaus raidai, pvz., baigėsi žiemos/šalčio periodas (vernalizacija) ar sukaupiama pakankamai fotosintezės produktų (fotoperiodizmas).

Augalai pagal žydėjimo pradžios kontrolę labai įvairūs, todėl pagrindinius žydėjimo kontrolės mechanizmus papildo saviti konkrečioms augalų grupėms ar net konkrečiam augalui būdingi kontrolės būdai. Vienų augalų (efemerų) vegetacinė fazė labai trumpa, kiti žydi tik antraisiais raidos metais (dvimečiai, pvz., kopūstai), o kalnų žolinis augalas ferula (Ferula) pražysta tik septintais metais ir žydi tik vieną kartą, paskui nunyksta. Medžių ir kitų daugiamečių augalų vegetacinė-reprodukcinė raida kartojasi cikliškai, bet dažniausiai ciklinis kartojimasis prasideda ne iš karto. Augalas pradeda žydėti tik tada, kai subręsta, po didesnio ar mažesnio grynai vegetacinės fazės metų skaičiaus. Šios augalų įvairovės genetinės priežastys irgi yra tiriamos.

FLC genas – centrinis žydėjimo pradžios supresorius. Jis koduoja MADS šei-mos (žr. 5.5 intarpą) transkripcijos veiksnį. Šis baltymas pagal veikimo pobūdį yra repre-sorius. Jis slopina bent du žiedo meristemos integratorius. Tai FT (FLOWERING LOCUS T) ir SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1). FLC geno mutantai flc flc yra anksti žydintys. Be to, jiems nereikalinga vernalizacija. Vairenio Land-sberg erecta ekotipo augaluose į FLC geno paties didžiausio 3-ojo introno 3′ galą yra įsiter-pęs Mutator-like tipo transpozonas. Tad, iš esmės, tai introno mutantas. Be to, šio ekotipo

286 |

augaluose mutacija įvykusi FRIGIDA gene, kuris normaliai skatina FLC geno raišką. Dėl šių aplinkybių Ler ekotipo augaluose FLC geno raiška yra labai silpna.

Visai priešingas vairenio genotipas gautas panaudojus kaip papildomas geno kopijas FLC transgenus. Rezultatas pralenkė bet kokius lūkesčius. Vairenis iš vienmečio augalo virto dvimečiu augalu, todėl manoma, kad kaip žydėjimo slopiklis FLC TV veikia reostato principu: kuo jo mažiau, greičiau žydima; didinant FLC TV kiekį, vis labiau uždelsiama žydėjimo pradžia (žr. 5.8 pav.).

FLC geno kontrolė. Keturi kontrolės keliai. Pagrįstai manoma, kad žydėjimo pradžios kontrolė dar sudėtingesnė, negu pavaizduota 5.26 pav., nes čia pateikti tik pa-grindiniai žydėjimo pradžios kontrolės genai ar netgi tik jų grupės (vernalizacijos, auto-nominio, šalčio, šviesos/fotoperiodo, giberelino kelių) ir vadinamieji genai integratoriai SOC1, TSF/FD, FT, LFY. Jie suderina visus gaunamus signalus ir aktyvina žiedo meriste-mos genus, tarp jų AP1.

5.26.pav. Žydėjimo kontrolė vairenio genome: Genai: žydėjimo slopiklis (supresorius) FLC (FLOWERING LOCUS C) – jį nuslopina vernalizacijos genai; fotoperiodizmo genai GI (GIGANTEA) ir CO (CONSTANS) – jų raišką vairenio lapų gyslose sužadina ilgabangė šviesa; žydėjimo integratoriai: FT (FLOWERING LOCUS T) – jo baltymas yra flo-rigenas, veikia kartu su FD (FLOWERING LOCUS D), sužadina kitus integratorius SOC1 (SUPRESSOR OF CONSTANS 1) ir du žiedo meristemos genus AP1 (APETALA1) ir LFY (LEAFY) (pagal L. Corbesier and G. Coupland. Journal of Experimental Botany, 2006, Vol. 57, P. 3395−3403).

Veikia ir kiti žydėjimo pradžios slopikliai, ne tik FLC genas. Be to, jie pasireiškia apeinant FLC. FLC ge-nas vairenio genome turi net penkis homologus MAF (MADS AFFECTING FLOWERING 1−5). Vie-nas jų atrastas anksčiau, todėl dažnai vadinamas kitu pavadinimu FLM (FLOWERING LOCUS M). Dėl šių genų žydėjimo pradžia slopinama iki reikiamo momento ir tada, kai nėra aktyvaus FLC geno, veikia savarankiškai. Bet FLC geno pagrindinis vaidmuo, matyt, išliks ir kaupiantis naujoms žinioms apie žydėjimo pradžios kontrolę. Pasirodo, FLC koduojamas MADS transkripcijos veiksnys tiesiogiai jungiasi su CArG cis ele-mentais SOC1 ir FD promotoriuose ir pirmuoju intronu FT gene. Pastarasis genas, 2005 m. sensacija, ko-duoja florigeną, veiksnį, kuris pasigamina lapuose. Vėliau pernešamas į ūglio viršūnę (SAM) ir ten sąvei-kauja su FD. Būtent veiklus integratorius yra (FT+FD) kompleksas. FLC slopina FT ir ūglio meristemoje ir lapuose. Šios sąveikos įrodytos imunoprecipitacijos metodu, todėl nekelia abejonių ir tik dar labiau su-stiprina FLC, kaip žydėjimo pradžios reguliatoriaus,svarbą. Suprantamas dėmesys ir paties FLC geno reguliacijai. FLC genas reguliuojamas labai sudėtingai: • jo veiklą reguliuoja ne tik transkripcijos veiksniai: vieni jų FLC raišką skatina, kokie yra, pvz., FRIGIDA

grupės genai, kiti, atvirkščiai, slopina, kaip tai daro autonominio kelio genai;



• dalis šių veiksnių patys patiria potranskripcinį modifikavimą ir nuo to priklauso jų aktyvumas, o tuo pa-čiu poveikio FLC stiprumas:

pats FLC irgi reguliuojamas po transkripcijos; • FLC ir jį kontroliuojantys veiksniai yra reguliuojami epigenetiniu būdu, be to, irgi labai sudėtingai:

vieni genai FLC lokuso chromatiną aktyvina, dažniausiai di-, trimetilindami histonus H3 ir H4 FLC promotoriaus srityje;

kitų, pvz., autonominio kelio genų FLD, LD, FVE koduojami baltymai FLC chromatiną slopina; • Svarbiausia, FLC geno raiška priklauso ne tik nuo vidinių, bet ir nuo išorinių aplinkos veiksnių: šalčio ir

karščio, apšvietimo sąlygų (šviesos kokybės ir dienos/nakties santykio ir kt.). Žydėjimo pradžios kontrolė labai sparčiai pasipildo naujais faktais ir genais. Netgi integratorių gretas pa-pildė naujas genas FD, sin. TSF (TWINSISTER OF FT), kuris koduoja bZIP TV ir priklauso nuo šviesos kokybės, o taip pat vernalizacijos ir autonominio kelio genų, nes yra kontroliuojamas FLC geno. Kita vertus, svarbus vaidmuo žydėjimo pradžiai kontroliuoti skiriamas miRNR.

Kaip apibendrinimas iki šiol turimoms žinioms, skiriami bent keturi žydėjimo pra-džios kontrolės keliai (5.26 pav.).

Vernalizacija būtina žiemojantiems/žieminiams augalams. Tai šaltų dienų skaičius, be kurio augalas nežydėtų. Tuo galima įsitikinti pasėjus žieminius rugius ar kviečius pava-sarį. Augalas krūmijasi, bet šiaudas nesusidaro. Pagal reakciją į žemą temperatūrą, būtiną augalo raidai, augalai skirstomi į žieminius, vasarinius ir tarpinius. Žieminiai augalai be reikiamo šaltų dienų skaičiaus visai nežydi arba kaip vairenis žydi labai uždelstai. Pagrei-tinti jo žydėjimą užtenka šalčio šoko.

Būtina skirti vernalizaciją – būdą reguliuoti augalo raidą nuo tolerancijos (atsparumo) šalčiui. Tai skirtingos savybės, kontroliuojamos skirtingų genų.

Fotoperiodizmas susijęs su kitu aplinkos veiksniu – šviesa, cirkadiniais ritmais švie-sa/tamsa, diena/naktis. Be to, įsigilinus aiškėja ir augalo priklausomybė nuo šviesos ko-kybės – spindulių spektrinės sudėties, kuri mūsų platumose keičiasi: vienokia yra pavasarį, kitokia - vasaros pabaigoje/rudenį. Tai papildomi signalai augalo raidai, ypač daugiame-čiams augalams. Prisitaikymas prie cirkadinio ritmo diena/naktis yra ir signalas, kad auga-las sukaupęs pakankamai išteklių žydėjimui, sėklų ir vaisių brandinimui.

Tačiau yra ir kita šio kelio dalis: tam tikras reikiamo ilgio dienų skaičius. Jis netgi tos pačios augalo rūšies skirtingoms veislėms yra nevienodas. Kaip augalas tvarko savo ka-lendorių: skaičiuoja, kiek dienų jį veikia šaltis, ar ilga/trumpa diena, yra viena iš aktualių genetikos problemų.

Pagal fotoperiodizmą augalai skirstomi į ilgadienius (tarp jų vairenis), trumpadienius ir neutralius, kuriems dienos/nakties santykis nesvarbus.

Vernalizacijos ir fotoperiodizmo keliai atsiradę istoriškai, priklausomai nuo aplin-kos, kurioje augalai metų metus gyvuoja. Pvz., apie pusiaują, kur dienos/nakties santykis nesiskiria, auga vairenio rūšis A.suecica, kuri fotoperiodizmui neutrali. A. thaliana priklau-somai nuo istorinių sąlygų atsirado ekotipai. Daugelis vairenio ekotipų yra žieminiai ir ilgadieniai. Jiems būtina vernalizacija ir ilga diena. Tačiau yra keletas vadinamojo. greitojo ciklo ekotipų (Shakhdara, Wilna-2, Cvi, Kondara, Kz-9), tarp jų ir pagrindiniai laborato-riniai ekotipai Col (Columbia), Ler (Landsberg erecta), kuriems vernalizacija nereikalinga. Jų atsiradimo priežastys ne mažiau įdomios. Nustatyta, kad įvykę mutacijos vernalizacijos gene FRIGIDA ir/ar labai susilpnėjusi pagrindinio žydėjimo stabdžio geno FLC raiška.

288 |

Giberelino kelias tampa akivaizdus, kai augalas dėl nepalankių augimo sąlygų nu-stoja augti ir vystytis, o kai atsiranda palankios sąlygos, vėl šie procesai atsinaujina. Augi-mo ir raidos slopinimas, kaip ir atsinaujinimas yra reguliuojami transkripcijos veiksnių. Augalo augimą slopina TV, kurie turi DELLA domeną, o procesus aktyvina genai, kurie reaguoja į gibereliną, turi atitinkamas cis sekas (žr. 5.1 lentelę). DELLA domeną, pvz., turi GAI (GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE), RGA (REPRESSOR OF GAI 1-3), RGL-1 (RGA-LIKE1), SPY (SPINDLY) genai.

Šis kelias vienodai svarbus žieminiams/vasariniams, ilgadieniams/trumpadieniams augalams.

Autonominis kelias pirmiausia aptiktas neutraliuose augaluose, tarp jų tabake (Ni-cotiana tabacum). Tabako augalai į šį kelią įžengia pasiekę tam tikrą lapų/bamblių skaičių ant stiebo. Klonavus tokio augalo viršūnę, prigijęs augalas žydi kur kas anksčiau negu augalas, išaugęs iš sėklos. Be to, pats augalas nedidelis, išaugina nedaug lapų. Kas kita, jeigu viršūnė nupjaunama ir klonuojama nuo augalo, kuris pasėtas iš sėklos, bet dar ma-žas ir turi nedaug lapų. Klonui iki žydėjimo teks nueiti visą kelią.

Be indukcijos autonominio kelio genai aktyvūs ir flc flc mutantuose, taip pat vairenio ekotipuose, kurie turi silpną FLC alelį. Tai Shakhdara ir Kondara – iš Tadžikijos, Kz-9 – iš Kazachijos, pagaliau gerai žinomas ekotipas Landsberg erecta. Jų genome normaliai pasireiškia autonominio kelio genai, nors jų paskirtis yra slopinti FLC. Manoma, kad jie slopina liekamąją FLC raišką ir FLC homologus.

Taip pat įsitikinta, kad augalui įžengus į autonominį žydėjimo kelią, žydėjimą tik lai-kinai gali pristabdyti nepalankios sąlygos. Atsiradus galimybei, jis vėl atnaujinamas (pasi-reiškia giberelino kelias). Augalas genome turi visus reikiamus genus susidaryti žiedo me-ristemai ir organams, tik reikia, kad išnyktų visi stabdžiai, kurie neleidžia augalui žydėti.

Visų keturių žydėjimo kelių pagrindinis tikslas yra bendras: žydėjimo pradžia, ta-čiau sprendžiami skirtingi uždaviniai.

Giberelino kelio genų tikslas − slopinti DELLA baltymus ir juos nukreipti į proteo-somas. Gana panašūs, bent formaliai, yra ir vernalizacijos ir autonominio kelio tikslai: slopinti FLC (ir galbūt jo homologus), tačiau tai atlieka skirtingos genų grupės.

Vernalizacijos metu aiškiai išsiskiria dvi skirtingu metu pasireiškiančios genų grupės. Viena jų, kurios lyderis yra FRIGIDA genas, padeda FLC slopinti žydėjimą, kol augalui nesibaigė vernalizacija (nesulaukė reikiamo šaltų dienų skaičiaus). Tai FRL-2, VIP4, VIP6 ir kt. Jų skaičius vis dar pasipildo naujais (FLM, SVIP, TFL1, TFL2). Priešingo veikimo genai pradeda veikti, kai augalas baigė vernalizaciją. Jie slopina FRI, FLC ir kitus žydėjimo supresorius, − tai VIN3 (VERNALISATION INSENSITIVE 3), VRN, VRN2. Manoma, kad jie pakeičia chromatino sandarą FLC lokuse ir taip nuslopina šį geną. Panašiai veikia ir kai kurie autonominio kelio genai (FLD, REF6, FVE, MGO3).

Kai kurių supresorių koduojami TV gali tiesiogiai jungtis su genais, kurie yra žydėjimo integratoriai, pvz., MADS veiksnys SVP (SHORT VEGETATIVE PHASE) pats jungiasi su integratoriaus FT (FLOWERING TIME) CArG cis elementu. Netgi vernalizacijai aptiktas kelias, kuris aplenkia FLC geną. Manoma, kad vernalizacijos genai gali tiesio-giai sąveikauti su integratoriais FT, SOC1 (SUPRESSOR OF THE OVEREXPRESSION OF CO/AGAMOUS LIKE 20) ir, be to, su naujai atrastu integratoriumi AGL24.



Kita vertus, vernalizacijos, fotoperiodizmo ir autonominiame kelyje pagrindinis vaid-muo tenka FLC genui (žr. 5.26 pav.), kurio koduojamas TV sąveikauja ne tik su SOC1, FT, bet ir dar su vienu naujai atrastu genu integratoriumi, pavadintu FD. Kitaip pavadintu TSF (TWEEN SISTER OF FT) dėl labai didelės FT (82 %) aminorūgščių homologijos.

Autonominio kelio genai (5.5 lentelė) kas metai pasipildo genu. Lentelėje nepa-teiktas dar vienas naujas genas MGO3, kuris kaip nedaugelis turi net tris pavadinimus: MGO3 (MGOUN3), BRU (BRUSHY) ir TSK (TONSOKU) skirtingomis kalbomis, nes jį atra-do skirtingos mokslininkų grupės. Vadinasi, net jo pavadinimas nenusistovėjęs, bet jau žinoma, kad tai chromatino modifikavimo genas, kuris reguliuoja ir FLC geną. FLC loku-se deacetilinamas histonas H3, o deacetilinimas paprastai slopina geno raišką. Tačiau, kad MGO3 priklauso autonominio kelio genų grupei, dar reikia įrodyti. Abejonių kelia tai, kad šis genas pasireiškia ir ūglio (SAM) ir šaknų (RAM) viršūnėlių meristemose. Mutantui mgo 3 būdingi stiebo ir ūglių suaugimai (fasciacijos), ne vietoje (ektopiniai) pasireiškia žiedo organų genai AGAMOUS, SEPALATA, PISTILLATA.

5.5 lentelė. Vairenio autonominio žydėjimo kelio genai ir jų koduojami baltymai Genas Baltymas

FCA FPA FLK (FLOWERING LATE KH MOTIF) FY1 LD (LUMINIDEPENDENS) FLD(FLOWERING LOCUS D) FVE REF6(RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6)

Jungiasi prie RNR, N-gale turi du RRM motyvus ir C-gale WW aminorūgščių seką turi tris RRM motyvus ״ turi tris KH motyvus ״ Poliadenilinimo veiksnys, turi 7 WD-40 ir dvi PPLPP aminorūgščių sekas HD baltymas Chromatino remodialiavimo: susijęs su HDAC2

Chromatino remodialiavimo: MSI1 homologas,3 turi ND-kartotinę seką ir yra su RB susijusio baltymo homologas Chromatino remodialiavimo: vadinamasis Jumonji/Zn ,,pirštelių“ TV, jam būdingas ir histonų demetilazės aktyvumas

1 − FY sąveikauja su FCA, skatina FCA pre-mRNR alternatyvųjį splaisingą; 2 − lizinspecifinės histono de-metilazės LSD1 homologas; 3 − FVE yra su retinoblastomos baltymo (RB) homologu augaluose susijęs baltymas. RB tiesiogiai reguliuoja meristemos raidą.

Kitus pripažintus autonominio kelio genus (5.5 lentelė) galima suskirstyti į dvi gru-pes:

• genai, kurie kontroliuoja FLC ir kitus genus jų transkripto brendimo metu, turi jungimosi prie RNR domenus, bet vėl jie yra dvejopi:

vienų koduojamas baltymas turi RRM (tai FCA, FPA), o kitų koduojamas bal-tymas, konkrečiai FLK, – turi kitą jungimosi su RNR motyvą KH, kuriuo irgi jungiamasi su RNR;

• kita autonominio kelio genų grupė, būtent FLD, FVE, ir ELF6, slopina FLC geną epigenetiniu būdu. Mažina FLC lokuso histonų acetilinimą, o tuo pačiu ir FLC geno raiš-

290 |

ką. FLD ir FVE baltymai deacetilina FLC lokuso chromatiną dviejose vietose: apie tran-sliacijos pradžios tašką ir ties seka, kuri koduoja 1-ąjį FLC pre-mRNR introną. ELF6 genas irgi mažina FLC lokuso histonų acetilinimą. Jo koduojamas baltymas turi Jmj domeną ir keturis C2H2-Zn „pirštelių“ domenus. Kitas labai homologinis ir panašios sandaros bal-tymas REF6, atvirkščiai, aktyvina FLC lokusą.

Nors tai galutinai neįrodyta, bet ir LD(LUMINIDEPENDENS) genas, nors ir koduoja HD baltymą, yra chromatino remodeliavimo genas. Irgi slopina FLC geną, keisdamas chromatino sandarą FLC lokuse. Tokia išvada daroma, kad ir kitas VIN3 genas, kuris priklauso FRIGIDA genų grupei ir, atvirkščiai, sustiprina FLC raišką, irgi koduoja HD baltymą. Konkrečiai vadinamųjų PHD, nes be homeodomeno dar turi Zn-„pirštelį“(žr. 3.3 intarpą).

Dar vienas, jau dešimtas, genas HAC1 pretenduoja į autonominio kelio genų grupę Jo koduojamas baltymas jungiasi su FLC mRNR „kepure“, priklauso CBP80 baltymų gru-pei. HAC1 savitai slopina FLC geną. Be to, kartu su kitais dviem CBP/P300 baltymais, kurie jungiasi prie „kepurės“. Netiesiogiai šie baltymai irgi keičia chromatino remodelia-vimo pobūdį.

Tad neaišku, kiek dar naujų autonominio kelio genų bus atrasta. FCA geno alternatyvusis splaisingas, autoreguliavimas ir autonominio kelio

kontrolė. Kol kas nei vienas autonominio kelio genas nėra taip išsamiai ištirtas, kaip FCA. Tai dėl šio geno autoreguliacijos alternatyviojo splaisingo (AS) būdu. Vairenio mu-tantas fca yra vėlai žydintis (5.27 pav., A) Uždelsto žydėjimo pavyksta išvengti dvigubame mutante fca flc arba kai FLC genas nuslopinamas antiprasmine FLC mRNR. Tad įtikinamai įrodyta, kad FCA genas slopina FLC geno raišką.

FCA geno valdymo ypatumai paaiškina itin svarbią problemą: • kodėl dauguma augalo ląstelių yra vegetatyvinio augimo fazėje, nors

genome yra visi žydėjimo kontrolės ir žiedo/generatyvinių organų genai.

Problema daug kuo primena ląstelės ciklo reguliaciją gyvūnų somatinėse ląstelėse. Visais būdais uždrausta, kad tik ląstelė nepradėtų dalintis. Taip ir čia. Visais būdais uždrausta, kad tik ląstelė nepakeistų vegetatyvinės programos į reprodukcinę programą.

Tai paaiškina ir iš pirmo žvilgsnio įdomią padėtį: dauguma FCA transkriptų dėl AS yra neaktyvūs.

FCA genas turi 20 egzonų, ir alternatyvusis splaisingas vyksta 3-ajame arba 13-ajame intronuose (5.27 pav., B ir C). Susidaro keturi skirtingi transkriptai. Jie žymimi α, β, δ, γ ir jų dalis atitinkamai yra 1 %, 54, 10, 35 %. Aktyvi FCA izoforma yra γ, kuriai yra pašalinti visi intronai. Kaip galėjome įsitikinti, jos susidaro tik apie trečdalį. Baltymas turi du RRM motyvus, kuriais jis sąveikauja su mRNR ir WW domeną, kuriuo sąveikau-jama „baltymas-baltymas“. Šis domenas labai svarbus, nes juo sąveikaujama su kitu auto-nominio kelio geno FY koduojamu baltymu (5.27 pav., C). Tačiau, kaip aiškėja, FCA bal-tymo C-gale yra ir daugiau labai svarbių aminorūgščių sekų. Su viena jų sąveikauja papil-domas saugiklis, neleidžiantis pasireikšti netgi aktyviai γ FCA izoformai. Tai abscizo rūgš-ties jungimosi vieta.



5.27 pav. Vėlai žydintis fca-1 mutantas (A), FCA mRNR izoformos po alternatyviojo splai-singo (B) ir FCA, FY, FLC genų sąveika ir žydėjimo kontrolė (C): (A, B – pagal V. Quesada et al. EMBO Journal. 2003, Vol. 22, P. 3142─3152; C ─ V. Quesada et al. International Journal of Development Biology. 2005, Vol. 49, P. 773─780).

Gausiausias yra β FCA transkriptas. Jis turi tik šiek tiek daugiau kaip N-galą. Nėra RRM ir WW (gausaus prolino) domenų. Jis atsiranda dėl alternatyviojo splaisingo ir ne vietoje atsiradusios poliadenilinimo vie-tos 3-ojo paties didžiausio introno viduje (5.27 pav., B). Atkerpama ir išlieka transkripte tik dalis šio intro-no. Vėl vienas paradoksas: • poliadenilinimui vietą nustato ir tuo pačiu neaktyvios FCA izoformos β polipeptido susidarymą reguliuo-

ja FCA ir FY kompleksas, kai FY baltymas prisijungia prie WW domeno (5. 27 pav., C). Vadinasi, FCA genas pats save reguliuoja. Kita vertus, labai svarbūs yra baltymai, kurie parenka alternatyviąsias poliade-nilinimo vietas.

Autoreguliacija tuo nesibaigia. Susidaręs βFCA transkriptas savo eile, bent kai kuriose ląstelėse gali regu-liuoti γFCA transkriptų pasireiškimą. Tai nustatyta transgeniniu FCA be intronų. βFCA slopino transgeno pasireiškimą ūglio ir šaknų viršūnėlėse, jaunuose žiedpumpuriuose. Geno FCA δ transkripto, kaip ir γFCA-transkripto, iškirpti visi intronai, tačiau dėl AS 13-ajame introne (5.27 pav., B) ne vietoje susidaro stop kodonas. Dėl šios priežasties transliacijos metu δFCA prarandamas WW domenas. Kol kas δ ir α FCA paskirtis nėra išaiškinta. Visas dėmesys β ir γ FCA transkriptams. Ne-pavyko įrodyti, kad transkriptų α,β,γ,δ santykis keistųsi, kai kaitaliojamos aplinkos sąlygos arba anksti žy-dinčiuose mutantuose ap1-1 ir tfl1-2.

Vėl du antagonistai: abscizo rūgštis ir giberelinas. Giberelino kelią, nors trum-pai, jau aptarėme. Prisiminkime antagonistinius abscizo rūgšties (ABR) ir giberelinų san-tykius, kai sėkla bręsta ir dygsta (žr. 3.1 ir 3.4.4 sk., 3.2 ir 3.5 intarpus). Abscizo rūgštis neleidžia sėklai dygti, o giberelinai, atvirkščiai, skatina sėklos dygimą. Tik nelaimė, jeigu šis dviejų hormonų „karas“ sutrinka, kaip tai atsitinka viviparous mutantuose. Sėk-los/grūdai sudygsta ne laiku, dar derliaus nenuėmus.

A

B C

292 |

Lygiai taip subtiliai abscizo rūgštis reguliuoja žydėjimo pradžią ir tai atlieka per FCA geną. Nustatyta, kad FCA baltymas pasireiškia ir kaip hormonų abscizo rūgšties ir etileno jutiklis. FCA baltymo gale, už RRM ir WW domenų yra nekonservatyvi aminorūgščių seka, su kuria jungiasi ABR. FCA+ABR kompleksas neleidžia prisijungti prie FCA balty-mo FY baltymui. Tik kai FCA išsilaisvina iš ABR „gniaužtų“, prie FCA galo (kitos vietos, negu kai slopinama FCA raiška) prisijungia FY.

Manoma, kad FCA+FY kompleksas iš 3′-galo slopina FLC geną, nes pats FLC transkriptas nesikeičia.

FCA baltymo C-galas iš tiesų intriguojantis. Prie jo jungiasi Swi/Snf chromatino remodeliavimo komplekso šerdį sudaran-tis At SWI3B baltymas, ir ta vieta irgi yra už WW domeno ribų. Tad FCA reguliuojamas sudėtingiau, negu anksčiau manyta: ne tik alternatyviųjų splaisingo ir poliadenilinimo, bet ABR, o taip pat ir chromatino remodeliavimo būdu.

Ir FCA geno alternatyviojo splaisingo tipas, ir reikšmė nėra dar visiškai ištirti. Pvz., miežių aleurone yra ABAP1 baltymas, kuris yra ABR atsako bal-tymas, vadinasi, slopina aleurono ląstelių funkciją. Savo C-galu jis yra visiškai tapatus γFCA, tik neturi RRM domenų būdingų γFCA:

FCAγ RRM RRM Q WW Q

ABAP1 Q WW Q

Manoma, kad tai irgi FCA geno alternatyviojo splaisingo produktas, pertraukta, tik iš kito galo, izoforma.

Vėl viskas iš naujo. Laikrodis „persukamas“ atgal (angl. reseting). Epigenetinių ir potranskripcinės genų raiškos kontroliavimo mechanizmų gausa žydėjimo keliuose neat-sitiktinė. Tai yra lengviausias kelias grįžti atgal į pradinę padėtį. DNR nukleotidų sekos nuo to nesikeičia, tad išsaugojama pradinė genetinė informacija. Panašiai kaip žinduolių genomo ,,imprintingo“, kai pradeda susidaryti žinduolių generatyvinės ląstelės, visi iki tol buvę laikini reguliaciniai mechanizmai išnyksta.

Potranskripcinės ir epigenetinės genų raiškos kontrolės mechanizmai yra patogūs ir tuo, kad leidžia kaupti patirtį viena kryptimi, kad ir pagal laipsniškai didėjantį ar mažėjantį transkriptų kiekį.

Kita vertus, augalo genome yra reguliaciniai genai, kurie išsaugo kamienines ląsteles (nediferencijuotą meristemą) pradinės būsenos. Vienas iš tokių genų yra EMF2. Dėl jo veiklos meristemos ląstelės normuotai pereina iš vegetatyvinės programos į žydėji-mo/reprodukcinę programą. Tad palaipsniui susidaro nauji ir nauji žiedai. Mutanto emf2 labai greitai atsiranda viršūninis žiedas ir susidaro labai nedaug žiedų.

FCA ABA

FCA FCA FY

FCA FCA

Nežydi Žydi



5.6. Signalų pernaša ir signalo molekulės. Meristemos. Žydėjimo kontrolė. Cirkadiniai reiškiniai. Florigenas. Sisteminiai atsakai ir imuniteto pagrindai

5.6.1. Plazmodezmos ir reguliaciniai ryšiai tarp ląstelių. Simplastas

Koordinuota genų raiška tarp augalo dalių. Augalas neturi tokių puikių signalų perdavimo sistemų kaip humoralinė-kraujotakos ar nervų sistemos, kurias turi gyvūnai, bet signalai yra išnešiojami po visą augalą. Tai ypač pasidaro ryšku, kai augalą paveikia stresas vienoje vietoje (lokaliai), o atsakas į stresą išplinta po visą augalą. Tai vadinama bendruoju, arba sisteminiu, atsaku. Tai gali būti mechaninis augalo pažeidimas ar vabz-džio (amaro) įkandimas, ar kokio patogeno (viruso, bakterijos, grybo) lokalus pažeidimas. Pasireiškia bendrasis (sisteminis) atsakas į stresą arba patogeną. Pastaruoju atveju šis reiš-kinys apibūdinamas kaip sisteminis įgytas atsparumas (angl. SAR – Systemic Acquired Resistance). Prie koordinuotos genų veiklos augale prisideda mineralinių medžiagų gabe-nimas į lapus, o fotosintezės produktų – po visą augalą. Ypač svarbų reguliacinį vaidmenį atlieka cukrai per jų valdomus reguliacinius genus. Dėl šios priežasties cukrai šiuo metu vertinami kaip hormonai.

Signalai perduodami dviem pagrindiniais keliais: • iš ląstelės į ląstelę per plazmodezmas; • po visą augalą indų sistema (floema ir ksilema.)

Plazmodezmos. Simplastas ir apoplastas. Plazmodezmos (5.28 pav.) – tai gana sudėtingos sandaros kanalėliai, kurie jungia vieną augalo ląstelę su kita. Unikali, bet, ma-tyt, priverstinė augalo ypatybė, nes augalo vieną ląstelę nuo kitos skiria ląstelių sienelės. Jeigu jose nebūtų kanalėlių, tarpląsteliniai ryšiai būtų neįmanomi. Plazmodezmos sujung-tos su ląstelės vidinėmis pernašos struktūromis (endoplazminiu tinklu, Goldžio komplek-su), o per jas su ląstelės branduoliu. Tad susidaro bendra protoplazmų sistema simplas-tas, o ląstelės sienelių su jose esančių ertmių, kanalėlių sistema apoplastas.

5.28 pav. Plazmodezmos schema: ET – endoplazminis tinklas, J – jungtys tarp vidinės ir išorinės dalių; R – jungtis su ET; VD – vidinė dalis/šerdis (pagal P. Zambryski. Journal of Cell Biology. 2004, Vol. 164, P. 165−168).

294 |

Plazmodezmos skirstomos į dvi grupes: • pirmines, kurios susidaro citokinezės metu ir yra paprastesnės sandaros, bet labai

svarbios genų (ypač raidos) raiškos reguliavimui: per jas palaikomi ryšiai tarp vieno klono ląstelių;

• antrines, kurios atsiranda tarp ląstelių, negiminingų klono ryšiais. Šis suskirstymas esminis, nes labai svarbi transkripcijos veiksnių ir jų reguliatorių

pernaša iš vienos ląstelės į kitą, būdinga jaunoms meristemos ląstelėms. Ji yra raktas, kaip susidaro diferencijuotų ląstelių klonas. Šių ląstelių netgi plazmodezmų diametras yra di-desnis, o sandara paprastesnė, kad nebūtų apsunkinti ryšiai tarp ląstelių ir galėtų lengviau pro plazmodezmas praeiti makromolekulės.

Keista, bet suvokti kaip vyksta makromolekulių pernaša per plazmodezmas ir kar-niena, padėjo augalinių virusų tyrimai. Augalų virusai tiesiog kaip piratai užgrobia šį per-našos kelią. Pirmiausia, buvo nustatyta, kaip keičiamas plazmodezmos diametras, kad galėtų pereiti stambios molekulės, kokios yra virusinės RNR. Kita vertus, aptikti pernašai reikalingi viruso koduojami MP (Movement Protein) baltymai. RNR molekulių pernašai tirti netgi kaip modelis dažnai yra naudojama viroidų RNR, kuri yra mažos molekulinės ma-sės, pvz., bulvių PST (Potato Spindle Virus) yra tik 359 nukleotidų ilgio.

Taip pavyko nustatyti, kad ir RNR pernaša per plazmodezmas yra genetiškai numa-tyta. Pernešamos tik tos RNR, kurios turi tam skirtas nukleotidų sekas, panašiai kaip to reikia pernašai per branduolio porų kompleksą. Pagal tai RNR ir baltymai yra skirstomi į dvi grupes:

• ląstelės autonominiai, neišeina už ląstelės ribų; • ląstelės neautonominiai, kitaip NCAP (Non Cell Autonomous Protein), pernešami

plazmodezmomis arba floema į kitas ląsteles ar netgi dideliais atstumais. Dalis neautonominių baltymų yra tiesioginiai pernašos vykdytojai per plazmodezmas

ar floema (karniena), tarp jų MP ir CP, kurie reguliuoja plazmodezmos plyšio, pro kurį pereina molekulės, diametrą, vadinamąjį SEL (nuo Size Exclusion Limit). Anksčiau manyta, kad mažas plazmodezmos diametras (2−4 nm) yra kliūtis pereiti pro ją makromoleku-lėms. Šiuo metu, ne be virusų tyrimų, įsitikinta, kad kai reikia, plazmodezma keičia dia-metrą, panašiu būdu kaip gyvatė ar žaltys rydami varlę, ir tai reguliuoja MP ir CP (viruso apvalkalėlio) baltymai. Plazmodezmos anga gali ir visai užsidaryti nepraleisdama jokių molekulių. Tad molekulės pro plazmodezmą praleidžiamos pasirinktinai. Toks pasi-rinkimas ypač svarbus augalo embriogenezei. Tai nustatyta naudojant specialiai sukonst-ruotus transgenus, kurie vadinami MSG (Meristem Specific GFP). Jie ekspresuoja įvairaus dydžio tirpų žaliai fluorescuojantį baltymą GFP. Pvz., nustatyta, kad 27 kDa dydžio transgeninis baltymas laisvai juda po visą gemalą nuo šerdies iki torpedos stadijos vidurio (žr. 3.2.1 sk.), o apskritai gali judėti transgeninis baltymas, kurio dydis yra iki 54 kDa. Be to, simplastas pasidalija į atskirus domenus (skyrius), kurių dydis keičiasi gemalo ir sėklos raidos metu. Tad neautonominės RNR ir baltymai simplasto domene gali judėti tik iki tam tikro laiko, kol nepasikeičia simplasto domeno ribos.

Kita vertus, įvairiuose gemalo ir meristemų audiniuose SEL yra nevienodų matmenų ir praleidžia nevienodo dydžio makromolekules. SEL dydžiui reguliuoti labai svarbūs motoriniai baltymai aktinas ir miozinas. Per plazmodezmą molekulės juda difuziniu būdu arba pernešamos specialių nešiklių. Vienas iš tokių baltymų CmPP16 aptiktas moliūgo ir



(Cucurbita maxima) floemoje, bet yra ir plazmodezmose. Šis baltymas panašus į virusų MP ne tik paskirtimi, bet ir aminorūgščių sekomis. Pernešamų plazmodezma baltymų erdvinė sandara gali būti keičiama šaperonų. Taip, pvz., modifikuojamas transkripcijos veiksnys KNOTTED1 (KN1). Šaperonai keičia ir SEL diametrą. Baltymai, kaip ir plazmodezma pernešamos RNR, turi pernašos plazmodezma signalą. Jį turi ir KN1 baltymas.

Labai patogus ūglio meristemai tirti modelis yra bulvių stolonas, požeminis stiebas, iš kurio išauga bulvės gumbas. Taip, pvz., nustatyta, kad karniena juda ne tik KNOX, bet ir kitas HD TALE TV BEL5-LIKE. Jis gabenamas į stolono viršūnę, iš kurios išauga bul-vės gumbas.

Transkripcijos veiksniai, kurie gabenami plazmodezmomis iš vienų ląstelių į kitas. Labai svarbūs gyvūnų raidos įvykiai yra reguliuojami TV pernašos iš vienų ląstelių į kitas. Taip buvo aptikti drozofilos motininiai genai, kurių produktai pasigamina motinos ląstelėse ir gabenami į ovocitą. Tai nulemia bendrąjį būsimo individo raidos planą. Perne-šama bicoid, nanos ir kt. genų koduojama mRNR. Tokių genų, kurie nulemtų gemalo rai-dos planą, ieškoma ir augalo genome (žr. 3.2.3 sk.). Kita vertus, kyla klausimas, kas per-nešama iš vienų ląstelių į kitas: mRNR ar baltymas. Įtikinamai įrodyta, kad iš nematodo Caenorhabditis elegans inkarinės ląstelės į kaimynines ląsteles pernešamos ir nekoduojančios RNR. Inkarinė ląstelė per joje sintetinamus TV nulemia kaimyninių ląstelių raidą į kiau-šintakį. Kai ablacijos būdu sunaikinama šį ląstelė, kiaušintakis nesusidaro.

Panašus reiškinys, vienų ląstelių determinuojantis poveikis kitų ląstelių raidai, nese-niai aptiktas ir augaluose.

Vairenio SHORT-ROOT (SHR) genas koduoja GRAS šeimos TV. Genas nule-mia šaknų endodermio raidą, bet pasireiškia stelės periciklo ląstelėse. Iš jų baltymas per-nešamas į būsimas endodermio ląsteles (5.29 pav.). Stelės ląstelėse SHR baltymas aptin-kamas branduolyje ir citoplazmoje, o endodermio ląstelėse tik branduolyje. Tai supran-tama. Citoplazminė SHR forma yra paruošta pernašai į būsimas endodermio ląsteles. Pri-siminkime, kad TV turi prisijungti prie reikiamų cis sekų, valdomų genų promotoriuose. Tai branduolio baltymai. SHR tapo puikus modelis tirti neautonominius TV. Nustatyta, kad pakeitus vieną aminorūgštį izoleuciną SHR baltymo VHIID domene treoninu, su-trinka ir SHR lokalizavimas branduolyje, ir pernaša į kaimynines ląsteles.

5.29 pav. SHR (SHORT ROOT) transkripcijos veiksnio pernaša iš periciklo (stelės) ląstelės į kaimynines ląsteles, kurios diferencijuojasi į endodermį St – stelė; En – endodermis; Žv − žievė (korteksas); Ep – epidermis; (žr. tekstą; pagal T. Kurata et al., Current Opinion in Plant Biology. 2005, Vol. 8, P. 600–605).

296 |

Bet svarbiausia, kad surastas genas, kurio koduojamas baltymas riboja SHR baltymo plitimą iš ląstelės į ląstelę. SHR baltymas neaptinkamas žievės ląstelėse. Tai geno SCARECROW (SCR), koduojamas irgi GRAS šeimos TV.

Panaši pozicinė raiška nustatyta ir kitam šaknyse pasireiškiančiam genui CAPRICE (CPC), kuris koduoja nedidelį tik 94 aminorūgščių baltymą. Tai labai paranki judėjimui plazmodezma ypatybė: CPC mRNR aptinkama tik tose ląstelėse, kurios neturi plaukelio. Šaknų plaukelis susidaro ląstelėje, į kurią pernešamas CPC baltymas:

Įdomu tai, kad pasireiškia savotiška kryžmiška TV raiška. GLABRA3 (GL3) ir EN-HANCER OF GLABRA 3 (EGL3) genų, kurie koduoja bHLH TV, mRNR aptinkama tik šaknų plaukelius turinčiose ląstelėse, o baltymas, atvirkščiai, pernešamas į ląsteles, kuriose šaknų plaukelis nesusidaro.

Kaip atsiranda augalų chimeros? Vienas pirmųjų augalų vienų ląstelių įtaką kitų ląs-telių raidai tyrė vokiečių mokslininkas Vinkleris (H. Vinkler). Jis dar 1907−1916 m. dirbtinai kūrė augalų chimeras ir ieškojo taip vadinamųjų įtakos hibridų. Tik po daugelio metų (Sessions et al., 2000) chimeros vėl prisimintos ir panaudotos kaip modelis tirti transkripcijos veiksnių pernašą iš vieno ūglio viršūninės meristemos sluoksnio (L1) į kitus du (L2 ir L3). Chimeros sukurtos keliais būdais, bet panaudoti transgenai. Vienas jų: prie vairenio LEAFY (LFY) ar APETALA1 (AP1) genų, kurie koduoja žiedo meristemos susidarymą, prijungtas savitas tik L1 sluoksnio ląstelėms būdingas promotorius. Tad abu genai galėjo pasireikšti tik L1 ląstelėse. Tokie transgenai įvesti į dvigubo mutanto lfy ap1 genomą ir:

– su rekombinantiniu LFY genu žiedai išsivystė normaliai, nes L1 susidaręs LFY TV buvo perneštas į L2 ir L3 ląsteles;

– AP1 genas yra autonominis, pasireiškia tik tose ląstelėse, kuriose sintetinama jo mRNR, tad augalai buvo mutantinio fenotipo, nes genas pasireiškė tik L1 ląstelė-se, o jo TV reikalingas L2-L3 ląstelėms.

Labai panašiai, kaip šaknų plaukelius sudarančiose ir nesudarančiose ląstelėse, L1-L3 irgi yra atvirkščiai pasireiškiantis TV genas. Tai jau ne kartą minėtas HD TV koduojantis genas KNOTTED1 (KN1). KN1 TV aptinkamas L1 ląstelių branduoliuose, bet šio sluoks-nio ląstelėse nerandama KN1 mRNR. Ji sintetinama L3 sluoksnio ląstelėse, ir TV perne-šamas į L1 sluoksnį.

Tokia kryžmiška ląstelių raidos reguliacija apsikeičiant TV, matyt, yra neatsitiktinė, o vienas iš ląstelių diferenciavimo ir specializavimo mechanizmų.

Suprantama, kad tai tik pradžia. Ar plačiai paplitęs toks ląstelių diferenciacijos mecha-nizmas, parodys ateitis.

Meristeminių ląstelių paradoksas. Meristemų ląstelės labiausiai „nusiteikę“ priim-ti svetimas RNR ir baltymus. Jų plazmodezmos yra didžiausio diametro (turi didžiausią SEL). Įdomu tai, kad į meristemas virusai prasiskverbia sunkiai arba visai nesugeba prasi-skverbti. Šiuo reiškiniu pagrįsta labai svarbi biotechnologinė priemonė:

• išauginti devirusuotą sodinamąją medžiagą.



Devirusuota sodinamoji medžiaga išauginama, kai iš meristemos ląstelių regeneruo-jamas augalas. Lietuvoje tokia technologija pritaikyta bulvėms (A. Bujausko) ir gėlininkys-tės ūkiuose dekoratyviesiems augalams (gvazdikams).

Kol kas šio reiškinio mechanizmas neištirtas. Manoma, kad meristemos ląstelės at-pažįsta viruso dvigrandę RNR. Kita vertus, apsisaugoma ir nuo viruso MP baltymų. Jie nepadeda viruso RNR prasiskverbti į meristemos ląsteles. Vadinasi, makromolekulių patekimas į ląsteles, ypač meristemos, labai griežtai kontroliuojamas.

Makromolekulių pernaša per plazmodezmas būdinga tik konkrečioms molekulėms ir ląstelėms, vyksta tik tam tikru laiku ir nustatyta kryptimi.

Aptiktas genas, kurio koduojamas baltymas kontroliuoja plazmodezmos SEL, tai INCREASE SIZE EXCLUSION LIMIT OF PLASMODESMATA (ISE). Tokių genų yra ir daugiau. Gali būti, kad reikiama informacija pernašai reguliuoti yra ir pačioje pernešamoje molekulėje. Tai nustatyta bent vienam iš pernešamų per plazmodezmas TV, būtent, ku-kurūzų HD TV KNOTTED1. Jis sugeba pakeisti plazmodezmos diametrą (SEL).

TV pernašos plazmodezmomis konservatyvumas. Bent kai kurių TV pernaša plazmodezmomis iš vienų ląstelių į kitas yra konservatyvusis požymis. Tokią išvadą gali-ma padaryti, kai kukurūzo (miglinių šeimos augalo) KNOTTED1 geno koduojamas TV palyginamas su ortologų vairenio genome KNAT1/BREVIPEDICELLUS ir SHOOT ME-RISTEMLESS (STM) genų koduojamais baltymais. Jie irgi pernešami iš vienų meristemos ląstelių į kitas. Net judėjimo vieta ir laikas sutampa.

Kita vertus, įsitikinta, kad ir šiuo atžvilgiu augalai yra įvairūs. Pvz., žioveinio (Antirrhinum majus) geno DEF (DEFICIENS) koduojamas TV yra neautonominis balty-mas, juda per plazmodezmas, o jo ortologo vairenio genome koduojamas AP3 TV yra autonominis, aptinkamas tik tose ląstelėse, kuriose jis sintetinamas. Autonominis yra ir PISTILLATA baltymas, nors su šiuo baltymu DEF sudaro heterodimerus.

5.6.2. Ūglio meristemos raida ir ryšiai tarp ląstelių. Polipeptidai kaip signalo molekulės

5.6.2.1. Meristemos ir augimo reguliavimas. Viršūnės vyravimas

Pats organizmų grupės pavadinimas AUGALAS nusako vieną pagrindinių ir išskir-tinių augalo ypatybių: jis pastoviai auga. Nuo pasėtos sėklos iki žydėjimą pasiekusio ir vaisių subrandinusio žolinio augalo ar šimtmečius augančio medžio. Tai lemia meriste-mos, todėl daug dėmesio skiriama genams, kurie lemia jų susidarymą ir susiskaidymą (diferenciaciją) į savitas šoninių organų, žiedyno ir žiedo ir kt. meristemas.

Meristemos yra augalo išskirtinė ypatybė. Augalas, kitaip nei dauguma gyvūnų, išsaugo kamienines ląsteles, kurios nepraranda gebėjimo intensyviai dalintis ir diferencijuotis į įvairius organus, garantuoja augimą į ilgį ir plotį.

Tik visa tai yra numatyta genetinių programų. Kamieninių ląstelių raidos pobūdis priklau-so nuo jų padėties ant augalo. Galima manyti ir atvirkščiai, nes ūglio viršūnės meristemo-je (angl. santrumpa SAM – Shoot Apical Meristem) ir tokios pat šaknų (RAM – root AM)

298 |

ląstelėse veikia skirtingos genų grupės, ir tas skirtumas atsiranda labai anksti, sėklos gema-lo raidos metu, dar globulėje. Dar tada tampa aišku, iš kurios ląstelės kils SAM, o iš ku-rios RAM. Širdies stadijoje SAM įgyja pavidalą, kuris beveik nesikeičia, kol augalas stie-biasi aukštyn: susidaro augimo kūgelis. Išlieka veiklūs ir tie patys SAM genai, daugiausia koduojantys HD šeimos TV: SHOOT MERISTEMLESS (STM), WUSCHEL (WUS), ARABIDOPSIS THALIANA MERISTEM L1 LAYER1 (ATML1).

Netgi šoninių (lateralinių) meristemų raidą kontroliuoja tie patys genai kaip ir sėklos gemale, pvz., CUC1-3 (CUP-SHAPED COTYLEDON 1-3). STM koduojami TV ankstyvo-sios širdies stadijoje sužadina dar vieną meristemos raidai svarbų geną UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO), kuris pasireiškia SAM. Jo raiška aptinkama tik mažoje grupėje L2 ir L3 ląstelių, kuriose pasireiškia ir STM genas. Manoma, kad UFO koduojamas balty-mas nustato ribas tarp meristemos organų pradmenų. UFO koduoja F-box baltymą, kuris yra E3 ubikvitinligazės komplekso sudedamoji dalis ir pažymi baltymus, kurie bus suskai-dyti proteosomoje (žr. 2.7 intarpą).

Dėl SAM augalas auga aukštyn, o dėl RAM skverbiasi gilyn į žemę, bet augimo po-būdis irgi genetiškai kontroliuojamas, nes šaknys gali būti įvairios: pagrindinė ir šoninės arba apskritai kuokštinės, o stiebas gali šakotis ir nesišakoti. Ir augimas turi ribas.

Pagal augimo pobūdį augalai skirstomi į determinuotuosius ir nedeterminuotuosius. • Determinuotųjų augalų viršūnė baigiasi žiedu, toliau neauga. • Nedeterminuotieji augalai teoriškai turėtų augti neribotai, nes viršūnė išsaugo SAM,

tačiau riba vis tik yra. Ją lemia kiti veiksniai: senėjimas, daugelio augalų (ypač vienamečių žolinių) vaisių ir sėklų reprodukcijos pabaiga, aplinkos veiksniai. Kokios būtų priežastys, be genų neapsieinama. Vienu iš tokių genų yra TFL1 (TERMINAL FLOWER 1). Labai subtiliai reguliuojamas ūglio viršūnės meristemos ir žiedyno/žiedo meristemos santykis.

Gana dažnai ta pati augalų rūšis turi determinuotąsias ir nedeterminuotąsias formas ar veisles, pvz., pomidorai, žirniai. Tai gali būti netgi specialių selekcijos programų tikslas, pvz., sukurti determinuotąsias žirnių veisles.

Meristemų diferencijaciją į ūglio, šaknų, šoninių organų ir audinių, žiedyno ir žiedo meristemas nulemia ne tik jau esama jų padėtis, bet ir signalo molekulės, kurios perneša-mos iš vienų ląstelių į kitas, o dėl signalo molekulių pernašos įsijungia kiti genai. Šiuo atveju pernešamos transkripcijos veiksnių mRNR ar patys baltymai irgi atlieka signalo molekulių vaidmenį.

Signalo molekulių pernaša gali būti apribota tik kaimyninėmis ląstelėms ar ląstelių grupe, bet signalas gali būti išplatinamas ir po visą augalą arba iš vienų organų perneša-mas į kitus, pvz., florigenas pernešamas iš lapų į ūglio meristemą (žr. toliau). Kai signalas išnešiojamas po visą augalą, atsiranda bendras (arba kitaip sisteminis) atsakas į signalą ir jį sukėlusį veiksnį. Dideliais atstumais signalas pernešamas floema (karniena), bet netgi karnienoje signalas iš pradžių iš vieno tipo ląstelių pernešamas į kito tipo ląsteles per plazmodezmas (žr. toliau).

Šoninių pumpurų ir ūglių susidarymas. Viršūnės vyravimas. Augalo augimui aukštyn ,,diriguoja“ ūglio viršūnės meristema SAM. Tai gerai žinomas ir seniai žmonių pastebėtas reiškinys. Reikia augalui pašalinti viršūnę ir tuoj pat pasipila šoniniai ūgliai. Netgi pašalinus augalų, kuriems būdingas nešakotas stiebas, pvz., pupoms (Vicia faba), viršūnę, gali išaugti šoniniai ūgliai ar net nauji stiebai. Tiems augalams, kurie natūraliai krūmijasi, tai numatyta jų genetinėje programoje.



Viršūnės ūglio vyraujanti padėtis pavadinta viršūnės vyravimu (arba kitaip apika-liniu dominavimu). Jį pirmiausia lemia augimo hormonų (auksino) koncentracija ir aukštyn nukreiptas maisto medžiagų srautas (aktyvus vaidmuo tenka ir cukrams).

Skiepijimo būdu nustatyta, kad signalas gabenamas stiebu aukštyn (5.30 pav.). Šis signa-las pavadintas SMS (nuo Shoot Multiplication Signal; iš tiesų labai panašu į mobiliojo telefono žinutes). Aptikti mutantai, kurie keičia viršūnės vyravimą ir šoninių pumpurų/ūglių susida-rymą: tai max (more axillary growth), dad (decrease apical dominance) ir kt. Jie ir padėjo išaiškinti, kokias „žinutes“ siunčia jų funkcionalūs aleliai. Teko pripažinti dar vieną grupę hormonų – karotinoidus (zeatiną), nes MAX4 ir jo ortologai kitų augalų genomuose koduoja karotinoidų metabolizmo fermentą polieno grandinės dioksigenazę, kuris metabolizuoja karotinoidus. Kitas genas MAX3 irgi koduoja karotinoidų metabolizmo baltymą, vieną iš citochromų P450, būtent CYP711A1. Jau minėtas kukurūzų pagrindinis raidos genas Teosinte Branched yra vienas iš tų genų, kuris slopina šoninių ūglių augimą, būdingą teosinte. MAX2 koduoja F-box baltymą, kuris, kaip žinome (žr. 2.7 intarpą), yra sudėtinė E3 ubikvitinligazės dalis, atpažįsta konkretų baltymą, skirtą suskaidyti proteosomoje.

5.30 pav. Šoninio augimo reguliacija (modelis pagal C. A. Beveridge. Current Opinion in Plant Biology. 2006, Vol. 9, P. 35−40). ┬ − slopinimas; ← − skatinimas; IAR – indolilacto rūgštis (auksinas); MAX2-MAX4 (MORE AXILLARY GROWTH) – žr. tekstą. Skirtingai nuo transkripcijos veiksnių, SMS ir citokininas (irgi būtinas viršūnės vyra-

vimui) gaminasi ir gabenami ksilema (mediena).

5.6.2.2. CLAVATA ir ūglio viršūnės meristema (SAM). CLE genai

Panašiai kaip kai kurie transkripcijos veiksniai, iš ląstelės į ląstelę pernešami ir kai ku-rie polipeptidai, kurie yra signalo molekulės ir gali būti prilyginamos hormonams. Vienas jų yra CLAVATA 3, svarbus ūglio viršūnės meristemos raidai.

Augimo kūgelis. Skirtingi CLAVATA. Vairenio SAM pasireiškia trys CLAVATA genai (CLV1-3). Du iš jų koduoja labai artimos sandaros baltymus − tai CLV1 ir CLV2. Jie priklauso didelei genų šeimai, koduojančiai receptorines proteinkinazes, kurios turi karto-tinę LRR (nuo Leucine Rich Repeat) seką. Iš viso vairenis turi per 400 receptorinių kinazių, iš jų bent 129 turi LRR domeną. Šiai baltymų grupei priklauso ir daugelis R-baltymų, svarbių sąveikai „augalas-patogenas“. Jie nulemia atsparumą patogenui vadinamuoju „ge-

300 |

nas prieš geną“ arba kitaip „R-avrR“ būdu. Tačiau ne visi baltymai, tarp jų ir R-baltymai, yra receptorinės proteinkinazės.

CLV1-3 genai pasireiškia augimo kūgelyje labai savitai, augimo kūgelio centrinėje zonoje.

Prisiminkime augimo kūgelį. Jis sudarytas iš trijų sluoksnių (5.31 pav., A): L1 – epi-dermio; L2 (1 arba 2 ląstelių eilės) – iš jo išsivysto lapai ir žiedai (bet iš periferinių ląste-lių). Abu šiuos sluoksnius (L1, L2) lengva atskirti nuo trečiojo L3, nes jų ląstelės nukreip-tos statmenai paviršiui. Taip visą laiką jos ir dalijasi. Kai augalas auga, ląstelės diferenci-juojasi. L3 sluoksnis sudaro didžiausią ląstelių masę, bet jos dalijasi įvairiomis kryptimis. Iš šios dalies susidaro stiebas, ksilema (mediena).

CLV1 raiška

CLV3 raiška WUS raiška

SAM

A

CLV1 CLV2

B

CZ PZ

RM

L1 L2

L3

P P Lapo

pradmuo Lapo pradmuo

WUS

5.31 pav. Augimo kūgelio skirstymas į zonas ir sluoksnius (A) ir CLAVATA (CLV) raiš-kos vieta: CZ – centrinė zona; PZ – periferinė zona; P − periferinė zona, determinuota į lapo pradmenis; RM – ribinė meristema; L1, L2, L3 – augimo kūgelio sluoksniai, žr. tekstą (A – pagal R. Sablowski. Journal of Experimental Botany. 2007, Vol. 58, P. 899−907; K. Lindsey et al. Trends in Plant Science. 2002, Vol. 7, P. 78−83; Y. Matsubayashi Journal of Cell Science. 2003. Vol. 116, P. 3863−3870). Svarbus ir kitas SAM suskirstymas į 3 zonas: centrinę (CZ), ribinę (RZ) ir periferinę

(PZ). Kaip minėta, būtent centrinės zonos ląstelėse pasireiškia CLV1 genas. Jo vieta L2 ir keliose viršutinių L3 ląstelių. Ten kaupiamos ir saugomos kamieninės ląstelės, iš PZ esant vegetatyvinio augimo fazei susidaro šoninių ūglių ir lapo meristema, o kai augalas pereina į reprodukcijos fazę – žiedyno ir žiedo meristemos. Iš jų vystosi atitinkami organai.

CLAVATA yra signalų perdavimo sistema, kuri reguliuoja vairenio stiebo ir kamieni-nių ląstelių kiekį centrinėje SAM zonoje, santykį tarp ląstelių dalijimosi ir diferenciaci-jos. Kiti augalai turi CLV genų ortologus.

CLV paskirtimi įsitikinta pagal CLV1-3 genų loss-of- function mutacijas: nenormaliai padidėja ūglio ir žiedo meristemos, susidaro ištįsę arba fascijuoti žiedai ir vaisiai. Ne ma-žiau pavojinga ir per didelė CLV genų raiška. Pvz., kai per daug gaminasi CLV3, labai greitai prarandamos kamieninės ląstelės, ir augalas nustoja augęs.

Nusistovi labai subtili pusiausvyra tarp CZ ir šoninių organų susidarymo. Netgi PZ : CZ santykis yra paveldimas, būdingas konkrečiam augalui požymis:

– Arabidopsis 2>1 – Rudbeckia 1,6:1 – Oryza 7,8:1



CLV1 ir CLV2 koduoja labai artimus baltymus. Skiriasi tik tuo, kad CLV1 baltymas turi citoplazminį domeną, o CLV2 jo neturi (5.34 pav., B). Šie du baltymai, labai panašiai kaip Brassica tipo S-nesuderinamumo baltymai SLG ir SRK (irgi receptorinė proteinkina-zė), sudaro kompleksą, kuris slopina meristemos geną WUS (WUSCHEL). Bet jeigu WUS nepasireiškia, susidaro labai mažai lapų, silpnas augalas. Iš tiesų turi būti labai subtili pu-siausvyra tarp meristemos genų, kad meristemos kamieninių ląstelių būtų nei per daug, nei per mažai.

Pagrindinis vaidmuo tenka CLV1. Jo koduojamas baltymas sudaro du baltymų kompleksus: vieną (185 kDa), kaip jau minėta, kartu su CLV2. Spėjama, kad jis yra L2 sluoksnio ląstelėse. Kitas kompleksas, kur kas stambesnis, 450 kDa, ir jis ne tik iš CLV1 ir CLV2, bet jį papildo kiti signalų perdavimui svarbūs baltymai Rho-GTPazė ir su kinaze susijusi proteinfosfatazė (KAPP). Manoma, kad šis kompleksas yra L2−L3 ląstelių grupė-je, ir jam atsirasti būtinas CLV3. Mutantuose clv3 susidaro tik185 kDa kompleksas.

WUS skatina CLV3 raišką ir tuo pačiu reguliuoja stiebo ląstelių pusiausvyrą su meris-temos ląstelėmis. WUS saugo ląstelių būseną L1 ir L2.

Čia susidaro uždaras ratas: WUS aktyvina CLV3, o šis aktyvina CLV1 ir susidaręs kompleksas slopina WUS, o WUS skatina CLV3:

CLV3 → CLV1/CLV2 ─ WUS

CLV1 reguliuoja dar vienas genas POL (POLTERGEIST – bildukas). Toks jo pavadinimas kilęs todėl, kad pol mutantas visiškai nesiskiria nuo normalaus WT fenotipo [aitvaras, bil-dukas, nepastebima namų dvasia]. WUS irgi priklauso nuo kitų genų: FASCIATA1,2 (FAS1,2), kurie koduoja chromatino sudedamąsias dalis; Pol; AINTEGUMENA (AINT) – jau minėto ląstelės ciklo geno.

CLV3 ir kiti CLE polipeptidai. CLV3 genas priklauso genų grupei, kurie koduoja CLE baltymus (pavadinimas kilęs nuo CLAVATA/ESR-related; ESR baltymai yra miglinių gemalą supančiame endospermo ląstelių sluoksnyje). Vairenio genome yra bent 25 CLE genai. CLV3 – vienas iš jų.

CLV3 sintezė vyksta L1 sluoksnyje, iš kurio jis pernešamas į L2/L3. Pradinis polipepti-das yra iš 96 aminorūgščių, bet brendimo metu kitos aminorūgščių sekos iškerpamos, ir lieka aktyvus 12 aminorūgščių CLE motyvas. Be to, šis polipeptidas modifikuojamas (tik peptidas vadinamas MCLV3 − modifikuotas). Jis ir yra ligandas CLV1/CLV2 kompleksui.

Vienas iš ligando apibūdinimų yra toks: Ligandas yra molekulė, kuri jungiasi su savitomis vietomis ant ląstelės membranos.

Tiksli CLV1-2 raiškos vieta, kaip ir CLV3 aminorūgščių seka, sunkiai nustatomos, nes šie genai ir molekulės pasireiškia tik keliose ląstelėse.Dažnai pasitaiko, kad kai yra didelė genų/baltymų šeima, tarp paralogų yra ir visiškai priešingo veikimo. Tas pat galioja ir signaliniams polipeptidams.

Paaiškėjo dar viena CLV3 peptido paskirtis, manoma, kad galbūt netgi pagrindinė: jis reguliuoja medienos (ksilemos) ląstelių diferenciaciją, bet slopina ląstelių dalijimąsi. Ir at-virkščiai, kai yra mažai CLV3, skatinamas ląstelių dalijimasis, bet slopinama ląstelių diferen-ciacija. Viena iš patogių sistemų tirti ksilemos raidą yra gvaizdūnės (Zinnia elegans L.) lapo

302 |

mezofilo ląstelės (žr. toliau, 3.7 sk.), kurios dėl tam tikro hormonų derinio netikėtai virsta ne kaliumi, o medienos ląstelėmis. Pasirodo, ir ten neapsieinama be CLV3 tipo polipeptidų. Vienas jų, pavadintas TDIF (Tracheary Differentiation Inhibitor Factor), irgi yra CLE polipeptidas, bet veikia priešingai CLV3: slopina ląstelių diferenciaciją į trachėjos (ksilemos) elementus. Tokia jo paskirtis yra ir SAM (augimo kūgelio) L2/L3 sluoksniuose.

Dažnai pasitaiko, kad kai yra didelė genų/baltymų šeima, tarp paralogų yra ir visiškai priešingo veikimo. Tas pat galioja ir signaliniams polipeptidams.

5.6.2.3. Kiti polipeptidai, kurie palaiko ryšius tarp ląstelių ir kontroliuoja genų raišką

Gvaizdūnės (Zinnia) lapo mezofilo virsmas trachėjos elementu padėjo aptikti ir kele-tą kitų veiksnių, kurie skatina augalo ląstelių diferenciaciją, tarp jų ksilogeną, unikalų ara-binogalaktaną, kuris yra tarpininkas „ląstelė-ląstelė“ sąveikose.

PSK (fitosulfoksinai) (5.6 lentelė) aptikti gvaizdūnės ir kitų augalų ląstelių kultūrose. Kaip jau minėta (žr. 3.3.2 sk.), ląstelių kultūrose turi būti tam tikra ląstelių koncentracija, kad jos diferencijuotųsi į gemalą. Lygiai tas pat nustatyta gvaizdūnės mezofilo ląstelių dediferen-ciacijai ir tolesnei diferenciacijai į trachėjos elementus. Siekiant paskatinti ląstelių dalijimąsi ir diferenciaciją izoliuotų ląstelių kultūrose, netgi griebiamasi tokio metodo:

– iš pradžių auginama ląstelių, kurios gerai auga ir diferencijuojasi kultūra; – paskui likusi po jų mitybinė terpė panaudojama auginti sunkiai augančias ląsteles. Iš tokių mitybinių terpių buvo išskirta aktyvi medžiaga ir paaiškėjo, kad tai tik pen-

kių aminorūgščių liekanų polipeptidas: Tyr (SO3H) – Ile – Tyr (SO3H) – Thr – Gln Kaip ir kiti polipeptidai, jis sintetinamas iš didesnio (89 aminorūgščių.) pirmtako ir

sąveikauja su ląstelės membranos baltymais. Kol kas nustatyti du tokie baltymai (120 kDa ir 160 kDa), bet paskaičiuota, kad PSK ląstelėje gali sąveikauti su 104 vietų.

RALF (nuo Rapid Alkalinization Factor) pavadinimas yra kilęs nuo tyrimo metodo, su funkcija ryšio neturi, reguliuoja šaknies raidą. Šį polipeptidą turi įvairūs augalai. Vaire-nio genome yra bent 9 genai, kurie koduoja RALF.

Šaknų raidą reguliuoja dar bent du polipeptidai: POLARIS ir ENOD40. Pastarasis sa-vitas pupiniams augalams ir skatina šaknų gumbelių susidarymą. ENOD40 genas koduoja apie 700 bp transkriptą, bet jo viduje yra du trumpi ORF (atviri skaitymo rėmeliai). Vie-nas jų koduoja 13, o kitas 27 aminorūgščių peptidus. Sojos šie peptidai ne tik trumpesni 12 ir 24 aminorūgščių, bet ir yra sanklotiniai − 24 aminorūgščių ORF „užeina“ ant 12 aminorūgščių polipeptidą koduojančio ORF.

Brasicca tipo S-nesuderinamumas priklauso nuo polipeptido dvigubu pavadinimu SCR/SP11. Jis ypatingas tuo, kad sintetinamas tapeto ląstelėse. Iš jų pernešamas į žieda-dulkę, o pati sąveika su SRK receptorine proteinkinaze vyksta ant motininio augalo pur-kos (žr. 2.4.2.2 sk.)

Sisteminas yra vienas iš geriausiai ištirtų polipeptidų. Jis aptiktas pomidoruose, ku-rie buvo pažeisti amarų. Kaip rodo pats pavadinimas, sistemino signalas plinta ne tik iš ląstelės į ląstelę, bet ir karniena po visą augalą. Atsiranda bendra viso augalo reakcija į mechaninę ar žolėdžio sukeltą pažaidą. Sisteminas sukelia daugybę įvykių, tarp jų linoleno



rūgšties išsilaisvinimą iš membranos ir virtimą oksilipinu. Tai dar viena signalo molekulių, tik nebaltyminės kilmės. Ji sužadina apsauginių genų raišką.

5.6 lentelė. Signaliniai polipeptidai, jų paskirtis ir signalą priimantys receptoriai Aminorūgščių

skaičius Peptidas pre- peptide

Biologinė paskirtis Receptorius

CLAVATA 3

Sisteminas

Tabako Tob Sys I

Tabako Tob Sys II

RALF

ENOD 40

SCR/SP11

PSK (fitosulfoksinai)

POLARIS

200

200

165

165

115

89

12

18(14)

18

18

~25

12-13 ir 24-27

231

5

36

Augimo/diferenciacijos regu-liavimas meristemoje

Apsauga nuo žolėdžio/ gynybinis signalas



Šaknų augimas (slopina), nėra visai aiški

Pupinių šaknų gumbelių susidarymas

S-nesuderinamumas (Brassica tipo)

Ląstelių dalijimasis, šaknų augimas

Sąveika su citokininu ir etilenu, reguliuoja šaknų augimą, ląstelių dalijimąsi

CLV1/CLV2 185 kDa

160 kDa membranos baltymas

MAP kinazės (120 kDa ir 25 kDa

43 kDa gumbelių baltymas

SRK (110 kDa)

120 ir 160 kDa membranos baltymas

1– Sąveikoje SCR/SRK dalyvauja visas baltymas, tai lemia S-nesuderinamumo savitumą .

Kaip ir daugelis signalinių polipeptidų (5.5 lentelė), sisteminas sintetinamas iš poli-peptido pirmtako, bet sintezė ypatinga tuo, kad vyksta alternatyvusis splaisingas, ir pasi-gamina dvi skirtingos molekulės. Abi yra aktyvios. Sisteminas sukelia jau minėtų protei-nazės inhibitorių sintezę. Sisteminas aptiktas ir kituose Solanaceae šeimos augaluose, tačiau jo neturi tabakas.

Tačiau pastangos surasti sisteminus tabake labai praturtino mūsų žinias apie augalo strategiją prieš žolėdžius ir patogenus. Tabake aptikti kiti panašaus veikimo (kaip sistemi-nų) polipeptidai. Pagal veikimo panašumą, jie netgi pavadinti Tob Sys I ir Tob Sys II,. tačiau bendra su sisteminu yra tik jų paskirtis – apsauga nuo žolėdžių. Pagal aminorūgščių sudėtį jie visiškai skiriasi ir nuo sistemino, ir vienas nuo kito:

304 |

Tuo ir pasireiškia augalo kovos su parazitais strategija. Jeigu būtų tik vienas Tob Sys pep-tidas, amarai ir kiti žolėdžiai vabzdžiai lengvai prie jų prisitaikytų. Dar greičiau tai įvyktų, jeigu visi augalai turėtų vienodas apsaugines priemones. Iš tabako išskirti dar du apsauginį signalą pernešantys polipeptidai, kurie skiriasi nuo Tob Sys I ir II, nes turi daug hidrok-siprolino, todėl pavadinti Tob Hyp Sys I ir Tob Hyp Sys II. Jie skiriasi nuo sisteminų ir tuo, kad yra glikopeptidai. Bet panašių polipeptidų paieškos pomidoruose buvo sėkmin-gos, aptikti net trys turintys daug hidroksiprolino glikopeptidai Tom Hyp Sys I, II, III.

Sprendžiant jau vien iš pomidorų ir tabako palyginimo, signalinių polipeptidų ateity-je turėtų būti atrasta gerokai daugiau, ypač mobilizuojančių augalo apsaugines reakcijas. Prie tokių apsauginių polipeptidų turėtų būti priskiriami ir defensinai.

Defensinai (5.32 pav.) − šiek tiek stambesni polipeptidai (45-54 aminorūgščių, apie 5 kDa). Jie pirmiausia yra apsauginė augalo priemonė, ne tik signalo molekulė. Augaluose aptikti palyginti seniai, dar 1900 m., kviečiuose ir miežiuose. Defensinai yra ir skorpiono nuodai.

5.32 pav. Vabzdžių, ridiko (Raphanus sativus L.) Rs-AFP1 ir žmogaus HNP-3 defensinų pa-lyginimas (pagal W. F. Broekaert et al. Plant Physiology. 1995, Vol. 108, P. 1353−1358). Defensinų apsauginė reikšmė šiuo metu nustatyta ir žinduolių ląstelėms. Be to, de-

fensinus turi netgi vabzdžiai (drozofila), tad defensinai yra bendras ginklas prieš paraziti-nius grybus. Vertinami kaip natūralūs fungicidai, kuriuos mūsų organizmas suskaido iki aminorūgščių. Tad galima išvengti kenksmingų fungicidų vartojimo (dirbtinai vartojant jų veikli koncentracija turi būti 2−20 mikrogramų litrui). Ypač siūloma jais apdoroti vaisius ir uogas. Tai ateities priemonė. Tose augalo dalyse, kuriose tikėtina patogeno invazija, defensinų sintezė yra pastovi (konstitucinė). Labai įvairūs polipeptidai, skirstomi į įvairias grupes ir pošeimius.

5.6.3. Transkripcijos veiksnių ir kitų genų raišką reguliuojančių molekulių pernaša floema. Florigenas. Sisteminiai atsakai

5.6.3.1. Transkripcijos veiksnių ir mRNR, mi/si RNR pernaša dideliais atstumais

Skiepijimo metodas. Augalai neturi kraujo sistemos, kuri išnešioja medžiagas po visą kūną, bet augaluose ją keičia indų sistemos floema (karniena) ir ksilema (mediena).

Kaip minėta, Vinkleris pirmasis ryšiams tarp augalo ląstelių tirti pradėjo naudoti skiepijimo metodą, sukurdamas ūglio meristeminių ląstelių chimeras. Toks metodas ir



šiuo metu yra taikomas. Netgi pavyksta paaiškinti gamtoje pasitaikančius reiškinius, pvz., pilnavidurius žiedus. Kai kuriais atvejais pilnaviduriai žiedai atsiranda todėl, kad transk-ripcijos veiksnys iš L1 sluoksnio nepernešamas į L2 ir L3. Taip yra, pvz., kamelijos veislės „Deasy Eagleson“ pilnaviduriuose žieduose. Palyginimui dirbtinai sukurta chimera tarp dviejų kamelijos rūšių Camelia sasanqua ir C. japonica. Šių dviejų kamelijos rūšių chimeras lengva atpažinti pagal skirtingo dydžio branduolius. Tyrimams naudoti kamelijos žiedo organus koduojančių transkripcijos veiksnių mutantai. Kai L1 sluoksnis buvo iš norma-laus (WT) tipo, o L2 ir L3 iš mutantinio sluoksnio kamelijos žiedai buvo su lytiniais orga-nais, o atvirkščiu deriniu − L1 iš mutanto, o L2 ir L3 iš normalaus – žiedai pilnaviduriai. Jie turėjo bent 60−80 vainiklapių, bet buvo be lytinių organų. Vadinasi, nebuvo perneša-mas transkripcijos veiksnys iš L1 į L2 ir L3, nes L1 mutanto ląstelėse jis nesusidarė.

Kur kas dažniau skiepijimo metodas yra taikomas tirti transkripcijos veiksnių ir sig-nalo molekulių pernašą karniena.

Vėl panašiai kaip kamelijos chimeroms tirti, norint atskirti vieną augalo dalį nuo ki-tos, įskiepis nuo poskiepio privalo skirtis morfologinėmis arba fiziologinėmis savybėmis, pvz., praėjusio vernalizaciją ir nepraėjusio vernalizacijos augalo, ar auginto ilgos ar trum-pos dienos sąlygomis augalų. Augalų fiziologai šį metodą įvertino jau seniai. Genetikai, deja, įsivėlę į diskusiją dėl „vegetatyvinių hibridų“, šio metodo ilgokai vengė. Kai nežino-ta šio reiškinio mechanizmų, manyta, kad tai „kvepia“ lysenkizmu: „vegetatyviniai“ hibri-dai buvo T. Lysenkos „arkliukas“.

Tačiau puikesnio metodo tirti makromolekulių ir signalinių molekulių pernašą ar išnešio-jimą po visą augalą nėra. Ir vėl KNOTTED1 TV buvo pirmasis, kurio pernašą karniena pa-vyko įrodyti. Parankus požymis tirti šio transkripcijos veiksnio pernašą yra pomidorų „pelytės auselės“, ypatinga mutanto Mouse ears (Me) lapų forma (5.33 pav., A). Ji atsiranda dėl pomidorų geno Let6, kuris yra ortologas genui KNOTTED1, perteklinės raiškos. Ma-noma, kad „pelytės auselės“ toliau pažengęs lapo susiskaidymas dėl Let6 TV pertekliaus. Me yra dominuojanti mutacija, atsiradusi dėl dviejų genų susiliejimo. Tai Let6 ir PFP (PYROPHOSPHATE-DEPENDENT-PHOSPHOFRUCTOKINASE):

WT

Me

PFP/LeT6 pernaša karniena buvo įrodyta taip: augalas normalios formos lapais buvo įskiepytas į Me augalą, tačiau ir įskiepis pažymėtas genetiškai. Panaudotas chlorofilinis mutantas Xanthophylic (Xa), kurio lapai yra geltonos spalvos. Jis pažaliuoja, jeigu įskiepytas į normalios (žalios) spalvos augalą.

Visa tai padaryti tiesiog būtina, norint įtikinamai įrodyti PFP/LeT6 geno produktų pernašą ir atskirti tą augalo dalį, kuri susiformavo naujai po skiepijimo. Viršūnė bus paža-liavusi.

Tinkamas bandymo sąlygų planavimas/genotipų parinkimas – vienintelis būdas įtiki-namai įrodyti tiriamą reiškinį/gauti įtikinantį rezultatą.

PFP LeT6

PFP PFP/LeT6

306 |

5.33 pav. Pomidorų normalus (kairėje) ir mutanto Mouse ears (dešinėje ) lapai (A) ir transk-ripcijos veiksnio pernašos tyrimas skiepijimo metodu (B): transkripcijos veiksnys LeT6 pernašamas iš poskiepio į įskiepį, todėl, kai įskiepijama WT į Me, lapai tampa Me fenotipo, o viršūnė pažaliuoja (žr. tekstą) (A – pagal K. H. Chung, N. R. Sinha. Encyclope-dia of Life Science. 2007. John Wiley and Sons, Ltd. www.els.net ; B – D. Jackson. Plant Cell. 2001, Vol. 13, P. 2569−2572).

Neapsieinama be netikėtumų. Pasirodo, įskiepio viršūnės lapai įgauna „pelytės ause-lių“ pavidalą tik tada, jeigu augalas auginamas ne šiltnamio, o lauko sąlygomis:

• arba PFP/LeT6 genas yra temperatūrinis mutantas Ts; • arba PFP/LeT6 geno produktų pernaša/karnienos savybės priklauso nuo aplinkos

veiksnių. Tai, kad dėl poskiepio įtakos (arba atvirkščiai) keičiasi įskiepio fenotipas, yra tik pir-

masis signalas, kad vyksta TV pernaša. Įskiepio fenotipą gali koreguoti ir kitos medžia-gos, netgi neorganinės. Tuo įsitikinta kito pomidorų mutanto chloronerva (chln) tyrimais. Mutantas, kaip ir Xantophylic, priklauso chlorofilinių mutantų grupei. Mutanto chln pakitu-si spalva: lapo gyslos žalios, o tarpgysliai pageltę. Įskiepis būna normalus, jeigu jis įskie-pytas į WT fenotipo augalą. Iš poskiepio į įskiepį pernešama geležis. Mutanto chln sutrikęs geležies įsisavinimas. Jo fenotipą galima normalizuoti ir FeEDTA (5.34 pav.).

5.34 pav. Chlorofilo sintezės atsistatymas pomidorų mutanto chloronerva lapuose po povei-kio Fe EDTA: kairėje − normalaus augalo (+/+), dešinėje − chloronerva (chln/chln), viduryje − chln/chln po poveikio Fe EDTA (iš H. Böhme, G. Scholz.Kulturpflanze. 1960,B. 8,P. 93−109)

A B



Panašiu būdu aptinkami ir augalų, kuriuos lengva skiepyti (pomidorų, tabako) fiziologiniai ir biocheminiai mutantai. Tik būtina žymėti poskiepio ar įskiepio fenotipą. Dažnai tai būna chlorofilinės mutacijos, nes sutrikus kuriam nors fiziologiniam procesui ar medžiagos sintezei, sutrinka ir augalo pigmentų (chlorofilo) sintezė. Taip atsitinka ir augalų mutantams, kurie nesintetina pirimidino. Vairenio tokiems mutantams ir trūkstamoms medžiagoms nustatyti spėjama medžiaga įlašinama į mėgintuvėlį, kuriame aseptiniu būdu auginamas augalas. Jeigu pataikyta parinkti medžiagą, augalas pažaliuoja. Tai kartu yra ir būdas kontroliuo-ti mutanto genetinį grynumą. Kita vertus, per skiepijimo vietą gali būti pernešamos ir sudėtingesnės genetinės struktūros – plazmidės (episomos). Įskiepio-poskiepio sąveika turi ir praktinę reikšmę. Sodo augalų, kurie dauginami vegetatyvi-niu būdu, savybės priklauso nuo poskiepio, ir parenkant poskiepius įskiepiui suteikiamos pageidaujamos savybės, pvz., mažas ūgis.

Floemos (karnienos) sandara ir molekulių pernaša. Gana paradoksali padėtis: nors karnienos anatomija tiriama daug metų, medžiagų pernašos karniena mechanizmas iki šiol nėra pakankamai ištirtas. Magnolijūnų karniena sudaryta iš dviejų pagrindinių ląs-telių tipų: RE ir LL. RE – rėtinis elementas iš tiesų primena rėtį su angelėmis. Jos patiria dalinę apoptozę, yra bebranduolės, labai pakitusios dėl numatytos ląstelių žūties mecha-nizmų, bet citoplazma nėra galutinai suirusi. Išnyksta tik organelės (branduolys, chlorop-lastai, ribosomos). LL – lydimosios ląstelės, atvirkščiai, aktyvios. Manoma, kad perneša-mas karniena junginys pirma pakliūna į LL. Jos atlieka atrankos/sieto vaidmenį, o vėliau junginys patenka į RE ir pernešamas dideliais atstumais. Tad ryšys tarp LL ir RE palai-komas plazmodezmomis. Nustatyta, kad makromolekulės, kurios pernešamos karniena, sugeba pakeisti plazmodezmos diametrą (SEL). Kai kurios molekulės, pvz., labai svarbus signalo, polipeptidas CLAVATA3, yra pernešamos į tarpląstelinę erdvę apoplastą.Tirti, kokios medžiagos pernešamos karniena, labai palengvina tai, kad RE ląstelėse nėra bran-duolio ir ribosomų. Tad šiose ląstelėse nei baltymai, nei RNR naujai susidaryti negali.

Nors baltymų koncentracija karnienoje labai maža (0,2−2 g/l), karnienos sultyse ap-tikta 100-200 įvairių baltymų, manoma, kad jų gali būti iki 1000. Kita vertus, labai ribotas tirtų augalų skaičius. Dažniausiai tokie tyrimai atliekami moliūguose, agurkuose ar pomi-doruose. Surasti baltymai, kurie svarbūs makromolekulių pernašai. Juos aptikti vėl pa-lengvino virusų plitimo po augalą tyrimai. Matyt, pagrindiniu pernašos baltymu yra PP16 baltymas (16 parodo molekulinę baltymo masę kDa; tai nedidelis baltymas, todėl lengvai pereina pro įvairius sietus). Jam tirti irgi taikomas skiepijimo metodas. Ypač daug tyrimų atlikta su vienu iš svarbių signalinių baltymų, o kartu cukrų (sacharozės) nešikliu SUT1 (SUcrose Transporter 1). Prisiminkime, kad cukrai atlieka dvejopą vaidmenį: yra ne tik maisto/energijos šaltinis, bet ir signalo molekulės, augaluose pakylėtos iki hormonų vaidmens. SUC1 mRNR ir baltymas aptikti ne tik LL, bet ir RE ląstelėse, o skiepijimo metodu – pernaša iš moliūgo į agurką. Panašiu būdu įrodyta ir dviejų GR (giberelino) atsako NACP ir GATP baltymų pernaša iš moliūgo į agurką, t. y. karniena. Joje aptikta plaukelių/trichomų raidos TV CAPRICE, TRIPTYCHON, TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (žr. 3.1 sk.) ir svarbiausia įvairūs veiksniai, reguliuojantys ūglio ir žiedo meris-temų raidą. Tarp jų jau minėtas KN1, taip pat kitas TALE HD TV, būtent BEL1. Bulvių karniena pernešamas KNOX TV, pavadintas POTH1. Jis reguliuoja giberelinų sintezę.

Karniena pernešami CmWRKYP (apsauginių atsakų), du GRAS šeimos TV NACP (svarbus meristemų išsaugojimui) ir STMP (irgi meristemų), taip pat kiti TV.

308 |

Dažnai pernešamas ne vienas TV, o kompleksas su savitais baltymais. Pvz., KNOTTED1 TV pernešamas kartu su MPB (Microtubule-associated Tabacco mozaic virus Movement Protein Binding) ir KNB36 (KNOTTED1 –Binding protein 36) baltymais. Karniena gali būti pernešami ne tik baltymai, bet ir mRNR, tarp jų kukurūzų KN1 ir cukraus nešiklio mRNR. Moliūgo (Cucurbita maxima) karnienos sultyse aptikta per 100 skirtingų RNR. Tiek baltymų, tiek karniena pernešamų RNR molekulėse turi būti specialiai šiai pernašai skirtos atpažinimo sekos.

mi/si RNR pernaša karniena. Palyginti neseniai nustatyta, kad tarp tų RNR mo-lekulių, kurios pernešamos karniena yra ir mi/si RNR. Šios RNR dėl jų mažos molekuli-nės masės gali būti geros signalo molekulės.

Skiepijimo būdu nustatyta, kad transgenų nutildymas, kurį sukelia mažosios interfe-rentinės RNR (siRNR), persiduoda iš poskiepio įskiepiui. Moliūgo (Cucurbita maxima) karnienos sultyse yra baltymas, pavadintas PSRP1 (nuo PHLOEM SMALL RNA PRO-TEIN 1), kuris jungiasi ir perneša į ląsteles 25 nt vienagrandes si/mi RNR. Mikro RNR (miRNR) yra koduojamos specialių genų. Jos yra genų raiškos reguliatoriai, dažniausiai po transkripcijos. Tarp miRNR, kurios pernešamos floema, aptikta:

• miR167 – reguliuoja atsaką į auksiną; • miR171 – kontroliuoja GRAS šeimos genus, tarp jų SCARECROW-like; • miR159 – reguliuoja MYB TV genus; • miR156 – reguliuoja SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN geną (ir kt.,

sąrašas vis didėja). Iš ląstelės į ląstelę mi/si RNR pernešamos plazmodezmomis. Taip savitą genų veik-

los programą įgyja konkretaus audinio ląstelės. Nors tai dar nepakankamai ištirta, bet mi/si RNR pernaša plazmodezmomis ir kar-

niena yra kontroliuojama ir skiriami du pernašos keliai: – ilgas, vadinamas LRS (Long-Range Silencing) nuo pagrindinės si/mi RNR paskirties

nutildyti genų raišką; ilgas – reiškia, kad nutildomi genai dideliu atstumu nuo tos vietos, kur susintetinta si/mi RNR;

– trumpas, vadinamas SHM (Short-Range Movement). Pernaša įvyksta tik į artimiausias 10−15 ląstelių nuo tos vietos, kuri produkuoja pre-si RNR.

Signalui plisti didesniame plote reikia, kad mi/si RNR būtų daug. Ji pagausinama (amplifikuojama). Tai atlieka savita nuo RNR priklausoma RNR polimerazė. Jos san-trumpa RDRP (RNA-Dependent RNA Polymerase). Sintetinama ilga pre-siRNR grandinė, paskui transkriptas suskaidomas į atskiras mi/si RNR

5.6.3.2. Florigenas. Cirkadiniai reiškiniai ir signalų pernaša iš lapų į ūglio meristemą

Manoma, kad florigeno atradimas yra vienas didžiausių 2005−2007 m. mokslo pa-siekimų. Tai sena, daug metų neišsprendžiama augalų biologijos problema. Kai kurie mokslo skeptikai pastangas surasti florigeną lygino su ječiu (sniego žmogumi) − jis lygiai toks pat nesugaunamas.

Prasidėjo florigeno istorija dar 1930 m. M. Čailachjanas skiepijimo metodu įtikina-mai įrodė, kad stimulas augalui žydėti dėl šviesos poveikio atsiranda lapuose. Iš ten jis

5skyrius223-308psl

Documents