5-paper 2- 96f116 afsharian et al-2( 1396 $ 9# 4 ˙'8 9 ˙ ) " ˙ % " ˇ ˝ 526# ١٨ journal of...

مجله بيوتكنولوژي كشاورزي

ISCپژوهشي و -علمي

، با استفاده از )Crocodylus Palustris( بررسي تنوع ژنتيكي گاندو، كروكوديل پوزه كوتاه ايراني

ميتوكندري Cyt bو D-Loopتوالي يابي نواحي

4علي جوادمنش ،3، اسماعيل ابراهيمي∗∗∗∗2، محمدرضا نصيري1احمد افشاريان ، مشهد، ايران.دانشجوي مقطع دكتري، گروه علوم دامي، دانشگاه فردوسي مشهد 1 ، مشهد، ايران.استاد، گروه علوم دامي، دانشكده كشاورزي، دانشگاه فردوسي مشهد 2 .گروه بيومديكال مولكولي، دانشگاه آداليد استراليا دانشيار، 3 ، مشهد، ايران.دانشكده كشاورزي، دانشگاه فردوسي مشهداستاديار، گروه علوم دامي، 4

14/07/1396، تاريخ پذيرش: 19/05/1396تاريخ دريافت:

چكيده

ه منظور ريزي مديريتي بهاي ژنتيكي تمساح پوزه كوتاه ايراني (گاندو)، در برنامهشناسايي ويژگي

وزه كوتاه پلذا اين پژوهش با هدف، بررسي ژنتيكي كروكوديل ،حفاظت و نگهداري آن نقش بسيار مهمي دارد

نمونه 12ر، ايران بر اساس مطالعه جمعيتي نواحي ثابت و متغير ژنوم ميتوكندري انجام گرديد. بدين منظو

بت ، نواحي ثاDNAآوري و پس از استخراج بافت پوست و خون از سه منطقه مختلف شهرستان چابهار جمع

الي تو PCRتكثير گرديد. محصوالت PCRبا استفاده از روش D-loopو Cyt bميتوكندري و متغيير ژنوم

هاي كلئوتيدي و كدونهاي نوافزارهاي بيوانفورماتيك و مبتني بر دادهيابي و سپس آناليز نتايج با استفاده از نرم

والي نوكلوتيدي طالعه، داراي تهاي مورد مانجام گرفت. نتايج اين تحقيق نشان داد كه تمامي نمونهپروتئيني

ونه گها يافت نشد. نزديكترين گونه به گاندو، يكسان هستند و هيچ تنوع ژنتيكي در بين اين نمونه

Crocodylus palustris و سپس گونهC. porosus يگاه جا 12ها نشان دهنده وجود بدست آمد. مقايسه توالي

ه عدم مشاهده ببا توجه ،هاپلوگروپ معرفي گرديد. لذا 5بود و جايگاه مورد مطالعه 1156مورفيك در بين پلي

ژنتيكي در هاي حفاظتي جهت افزايش تنوعاستفاده از برنامههاي مورد مطالعه، تنوع ژنتيكي در بين نمونه

رسد. ضروري به نظر مي بسيار گاندو امري

.ژنوم ميتوكندري تمساح گاندو، تنوع ژنتيكي، درخت فيلوژنتيك،: يكليدكلمات

:[email protected] Email 09153114119تلفن: احمد افشاريانيسنده مسئول: نو ∗

)1396 ، زمستان4، شماره 9مجله بيوتكنولوژي كشاورزي (دوره

١٨

Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

مقدمه

جنس كروكوديل شامل تعداد زيادي از

هاي كوركوديل مي باشد كه ساكن مناطق گونه

گرمسيري و نيمه گرمسيري نواحي آسيا، استراليا،

;Brochu, 2003( باشدآفريقا و نيوزلند مي

McAliley et al, 2006 كروكوديل مردابي يا .(

Crocodylusپوزه كوتاه (گاندو) با نام علمي

palustris اندازه متوسط از جنس كروكوديل است

متر) كه از ايران به سمت 5-4(بيشترين طول قد

شرق تا آسام هند و به جنوب تا سريالنكا پراكنش

دارد و حوزة پراكنش آن در ايران غربي ترين نقطة

آيد (شكل اين گونه به حساب ميپراكنش جهاني

). كروكوديل مردابي داراي پهن ترين پوزه در بين 1

) Crocodylusتمام اعضاي جنس كروكوديلوس (

است و بنابراين بيشترين شباهت ظاهري را به

). Da Silva & Lenin, 2010آليگاتورها دارد (

ها ساكن مرداب C. palustrisاگرچه گونه

ها نشان داده كه اين گونه باشند، اما بررسيمي

ها بوده و ها و بركهها، درياچهبيشتر ساكن رودخانه

هاي مصنوعي و دست به خوبي توانسته در بركه

هاي ساز، كانالهاي آبياري، درياچة پشت سد، بركه

طبيعي نواحي هند، پاكستان، سريالنكا و ايران

Whitaker & Andrews 2003; Daسازگار شود (

Silva & Lenin, 2010 .(

. (Whitaker and Andrews (2003براساس مطالعه C. palustris: پراكنش كروكوديل گونه A -1شكل

B :ايرانچابهار كوكشير يطيمح-ستيز قاتيتحق ستگاهيا در گاندو ،. Figure 1- A: Distribution of C. palustris crocodile according to Whitaker and Andrews

Study (2003). B: Gando in the Environmental Research Station of Rikukash, Chabahar,

Iran.

1396و همكاران، افشاريان

١٩


تواندمي هاجمعيت ژنتيكي ساختار از اطالع

هايطرح براي ريزي برنامه براي بزرگي كمك

ژنتيكي ذخاير حفظ مهمتر، همه از و نژادي اصالح

نشانگرهاي از استفاده و مولكولي هايروش باشد.

به هاگزينه بهترين از يكي زمينه اين در مولكولي

كه زيادي اطالعات به توجه با زيرا آيد،مي حساب

و تجزيه از كه نتايجي تواندمي دهدمي دست به

آمده دست به آماري هايروش با ركوردها تحليل

است ممكن حتي و نموده تكميل و تأييد را است

عالوه، به). Naderi et al., 2007( كند رد را آنها كه

يكي كه دارد زيادي فوايد ملكولي ژنتيك از استفاده

براي افراد ژنوتيپ تعيين دار معني فوايد اين از

,.Mousavizadeh et al( است خاصي جايگاه

در ژنتيكي نشانگرهاي از استفاده همچنين) 2009

طور به است ممكن حيوانات نژاد اصالح و انتخاب

كند تسريع را ژنتيكي پيشرفت مهيجي

)Javanmard et al., 2008( ژنتيكي تنوع مطالعه و

ذخاير ژنتيكي منابع از حفاظت براي بومي نژادهاي

,.Mohammadi et al( است ضروري و الزم بومي

از عميقي دانش اساس بر بايد حفاظت). 2009

براي تالش لذا باشد، خاص نژادهاي ژنتيكي منابع

نژادهاي ژنتيكي خصوصيات تعيين و شناسايي

,.Zamani et al( دارد اهميت بسيار محلي و بومي

طبقه بندي مطالعات متنوعي با هدف ).2013

هاي نزديك به هم، ها و گونهژنتيكي جمعيت

هاي مختلف از يك جد بررسي امكان انشقاق گونه

رابطه فيلوژني هر موجود با ساير مشترك، مطالعه

ها و نژادها و دستيابي به راهكارهايي براي گونه

هاي مختلف كروكوديل، گونه حفظ ذخاير ژنتيكي

در كشورهاي مختلف جهان انجام شده است

)Brochu, 2000; Brochu et al., 2010; Brochu and Densmore, 2001; Gatesy et al.,

2004;McAliley et al., 2006; Willis et al., 2007; Gatesy and Amato, 2008;

Meganathan et al., 2010 اين مطالعات به .(

برنامه ريزي صحيح جهت حفظ بقاي اين گونه كه

طبقه بندي كتاب سرخ اتحاديه جهاني حفاظت در International Union for the conservation

)IUCN،در طبقه آسيب پذير قرار گرفته است (

,Da Silva & Leninنمايد (كمك شاياني مي

هاي مولكولي امروزه استفاده از روش). 2010

در مطالعات تنوع و ساختار DNAمبتني بر

هاي كروكوديل در اولويت قرار گرفته جمعيت

هاي ميتوكندري يابي ژناست. در اين بين توالي

ها براي تعيين رابط ترين روشيكي از كاربردي

هاي نزديك به ها و گونهي بين جمعيتفيلوژنتيك

;Bruford et al., 2003شود (هم محسوب مي

Dolati et al., 2016.( همچنينDNA ميتوكندري

اي نشانگر بسيار مناسبي براي تشخيص بين گونه

سال از هم 10000تا 100هايي است كه براي گروه

تكامل سرعت باالياند و نيز به دليل جدا بوده

DNA در مقايسه با ميتوكندريDNA اي هسته


٢٠


باعث شده كه از آن براي مطالعات تكاملي استفاده

ميتوكندريايي Nassiri et al., 2010(. DNA( گردد

)DNA ها و ترسيم ) در تشخيص گونهميتوكندري

روابط فيلوژنتيكي داراي مزايايي از جمله تعداد

آن زيادي نسخه به ازاي هر سلول، اندازه كوچكتر

ژنومي، وراثت پذيري مادري، هاپلوئيد DNAاز

ها، وجود نواحي بودن، عدم وجود نوتركيبي در آن

اي حفاظت شده و وجود نواحي حفاظت نشده

براي مطالعات تكاملي گونه D-Loopمانند ناحيه

).Bellagamba et al., 2001باشد (هاي وابسته مي

هاي ميتوكندري به عنوانشناسايي توالي ژن

شود و به تهيه مشخصه ژنتيكي ثابت محسوب مي

شناسنامه ژنتيكي، ميزان تنوع موجود در جمعيت،

ها، نگهداري خلوص ها و نژادامكان تشخيص گونه

هاي بومي از خطر نژادهاي بومي و به حفظ گونه

ها كمك انقراض و اختالط ژنتيكي با ساير نژاد

,Janke et al., 2005; Roos et al., 2007كند (مي

Feng et al., 2010; Meganathan et al., 2010(.

بنابراين مطالعه ژنتيكي و فيلوژنتيكي كروكوديل

پوزه كوتاه استان سيستان و بلوچستان به منظور

ها و گونهدستيابي به اطالعاتي از قبيل تنوع

ها، اطالعات در مورد منشأ اهلي شدن زيرگونه

ت. در اين مبناي انجام اين پژوهش قرار گرف

پژوهش براي اولين بار در ايران، كروكوديل پوزه

منطقه چابهار از ديدگاه ژنتيكي، در كوتاه ايران

محاسبه پارامترهاي ژنتيكي و تعيين نقشه

ميتوكندريايي آن بر اساس مطالعه جمعيتي نواحي

ثابت و متغير ژنوم ميتوكندري كه در معرض خطر

شود.انقراض مي باشد، گزارش مي

مواد و روش ها

با هماهنگي و همكاري اداره محيط زيست

,N ″31 ′17 °25(مختصات: منطقه چابهار

60° 38′ 35″ E( ،12 نمونه بافت از بخش هاي

سطحي پوست و خون از كروكوديل پوزه كوتاه

منطقه اين شهرستان جمع آوري و در 4ايراني، از

از آنجا كه داخل اتانول مطلق نگهداري شد.

هاي بافت، داراي بافتي به شدت متراكم و دير نمونه

گرم از هر نمونه با استفاده 1/0هضم بودند، مقدار

از تيغ اسكاپل جدا شده و سپس با استفاده از

DNAاستخراج نيتروژن مايع هموژن گرديد. سپس

K0721 GeneJET #با انجام تغييراتي در كيت

Genomic DNA Purification Kit شركت

Thermo اين تغييرات شامل افزايش انجام شد .

به Kمدت زمان هضم بافت با استفاده از پروتئيناز

ساعت بود. مابقي مراحل با توجه به 16مدت

يك ناحيه متغير دستورالعمل كيت صورت گرفت.

و يك ناحيه حفاظت شده از ميتوكندري به منظور

ورد بررسي بررسي پارامترهاي ژنتيكي جمعيت م

ناحيه مد نظر براي بخش مورد مطالعه قرار گرفت.

و ناحيه مورد نظر براي بخش Cyt bثابت كل ناحيه

اي از منطقه كنترل ژنوم ميتوكندريمتغير، ناحيه

) D-Loop )Displacement Loopحاوي بخش

بدين منظور توالي ميتوكندريايي مربوط به بود.


٢١


از بانك Crocodylus palustrisميتوكندري گونه

دريافت شد) Benson et al., 2013ژني (

)Accession Number: HM488007( همچنين .

به گونه به منظور افزايش ضريب دقت توالي مربوط

Crocodylusهاي ديگر كروكوديل متعلق به جنس

نيز دريافت شدند تا بر اساس نواحي حفاظت شده

(جدول بين گونه اي طراحي پرايمر صورت بگيرد

). طراحي پرايمر بوسيله برنامه 2) (شكل 1

Primer Premier v.5 )Lalitha, 2000 صورت (

).2پذيرفت (جدول

.گونه هاي كروكوديل مورد مطالعه در طراحي پرايمر -1جدول Table 1- Crocodile species that used to design primer pair.

accession number شماره دسترسي Species گونه

كروكوديلوس آكيتسCrocodylus acutus

JF502241

يلوس اينترمديسكروكود Crocodylus intermedius

JF502242

كروكوديلوس جانسونيCrocodylus johnsoni

HM488008

كروكوديلوس مورلتيCrocodylus moreletii

HQ585889

تايلوتيكسكروكوديلوس Crocodylus niloticus

AJ810452

كروكوديلوس نوايژنيCrocodylus novaeguineae

JF502240

كروكوديلوس پالستوريسCrocodylus palustris

HM488007, FJ173278, FJ173279, FJ173280,

FJ173281, FJ173282, FJ173283, FJ173284,

FJ173285, FJ173286, FJ173276, FJ173277,

كروكويلوس پايروسسCrocodylus porosus

AJ810453

كروكوديلوس رومبايفرCrocodylus rhombifer

JF502247

كروكوديلوس سايمنسسCrocodylus siamensis

DQ353946


٢٢


كنترل هيناح از يبخش و Cyt b هيناح ريتكث يبرا مريپرا يطراح منطقه كيشمات ريتصو -2شكل

.سيپالوستر لوسيكروكود يتوكندريمFigure 2- Schematic showing the primer design of Cyt b and D-loop region of C.

palustritis.

ميتوكندري D-loopو بخشي از Cytbشده براي تكثير ناحيه استفادهمشخصات پرايمرهاي -1جدول

كروكوديلوس پالوستريس.Table 2- The primer characteristics used for amplifications of Cyt b and D-loop regions

of C. palustritis mitochondria.

نام پرايمرPrimer

Name

تواليSequence

طول

(جفت

باز)Length

(bp)

∆G [-kcals/mol]

محتواي

-گوانين

سيتوزينGC

Content

دماي ذوبMelting

Temperature

اندازه

محصول

(جفت باز)Product

Size (bp)

A.F CCACACTAATTATCATTAAGCA 22 36 32 52 710

A.R CTGTGAGGATAAACGGGAG 19 35 52

B.F AGGAGGACCATCCGTCAACAG 21 40 57 61

649

B.R CCGAAGGGGTTTGAATAGTGTG 22 42 50

C.F GAATCGGAGGACAGCCAGTA 20 38 55 58 846 C.R CGGGTAGTGGATGAGATCTCC 21 39 57


٢٣


واكنش زنجيره اي پليمراز توسط دستگاه

35در T personalمدل Biometraترموسايكلر

انجام ميكروليتر 50چرخه حرارتي و با حجم نهايي

شركت آمپليكون PCRشد. از كيت مسترميكس

ميلي موالر MgCl2 ،5/1(دانمارك) با غلظت

جهت تكثير قطعات هدف استفاده گرديد. به منظور

، PCRتاييد تكثير ناحيه مورد نظر، طي واكنش

بر روي ژل آگارز PCRالكتروفورز محصوالت

صورت گرفت. GelRedدرصد با رنگ آميزي 5/1

با استفاده از PCRاز محصول ميكروليتر 50سپس

شركت GeneJET PCR Purification Kit تيك

Thermo )شد و به همراه خالص سازي) امريكا

رفت و برگشت با ياز آغازگرها ميكروليتر 50

به شركت يابي يبه منظور توال كوموليپ 10غلظت

ها با نمونه ني. اديارسال گرد يماكروژن كره جنوب

كيبه روش اتومات ABI 3130استفاده از دستگاه

يحاصل از توال يهاشدند. داده يابي يسانگر توال

پوزه كوتاه پس ليكروكود ييايتوكندريژنوم م يابي

يابي يتوال يخطاها حيبه منظور تصح افتياز در

يهايتوال هياول يقرار گرفتند. بررس ينيمورد بازب

Chromas Liteبدست آمده با استفاده از برنامه

2.01 (Mccarthy, 2005) نييانجام شد. جهت تع

هيپوزه كوتاه از رو ليكروكود يهمولوژ نيباالتر

NCBI (Sayers گاهيتحت پا يديبالست نوكلئوت

et al., 2011( مورد توافق ياستفاده شد. توال

1 Neighbor Joining

)Consensusت،ياكثر اري) بدست آمده بر اساس مع

,Swindell & Plasterer)افزار با استفاده از نرم

1997) SEQMAN توسط ابزار يتوال نيو ا نييتع

BankIt پايگاه اطالعاتيNCBI (Sayers et al.,

در سطح يكيتنوع ژنت ي. بررسديثبت گرد (2011

) (DIVEIN نيبه كمك ابزار آنال يدينوكلئوت

)Deng et al., 2010 (و Arlequin suite ver 3.5

(Excoffier & Lischer, 2010) رفتيصورت پذ .

گريمطالعه با د نيا يهاداده سهيمنظور مقا به

مرجع ثبت شده در بانك يهايمطالعات از توال

مرجع استفاده يها يموسوم به توال NCBIداده

يمنظور توال ني). بدPruitt et al., 2007شد (

گونه مربوط به جنس 13 كسيتوژنوميما

مربوط به جنس يهايتوال نيو همچن ليكروكود

Osteolaemus از دو نيشد. همچن افتيدر

به زين Gavialinaeو Alligatorinae رخانوادهيز

فياستفاده شد. همرد يخواهر يهاعنوان كالستر

تميبه كمك الگور يديدر سطح نوكلئوت يساز

Clustal 2نسخه )Larkin et al., 2007 صورت (

به كمك يكيلوژنتيدرخت ف مگرفت. رس

اتصال شامل ط،يمختلف بنا به شرا يهاروش

2امساك حداكثر)، ,.1987Saitou & Nei( 1نزديك

)Farris, 1970; Fitch, 1971 روش حداكثر ،(

) و استنباط Felsenstein, 1981( ييدرست نما

ماركوف مونت رهيبه كمك زنج افتهيبهبود يزيب

2 Maximum Parsimony


٢۴


) بود. ابزار مورد Yang & Rannala, 1997كارلو (

برنامه امساك حداكثر و اتصال نزديك زينظر در آنال

) و Swofford, 2003( 4نسخه PAUP يتجار

يزيب زيو آنال ييحداكثر درست نما زيدو آنال يبرا

و (RAxML (Stamatakis, 2006 بيبه ترت

PhyloBayes MPI )Lartillot et al., 2013 (

به يابيو دست يابيبه منظور ارز انجام گرفت.

، روش بوت استرپ نهيبه يپارامترها

)Stamatakis et al., 2008 و ((Felsenstein,

از نيگانه مكرر انجام شد. همچنچند 100 (1985

اسيمق ييحداكثر درست نما ازيامت يهاشاخص

(RC)شده اسيمق يداريشده و شاخص پا

(Farris, 1989) بر يكياستفاده شد. فاصله ژنت زين

كدكننده يتوال نيو همچن يدينوكلئوت ياساس توال

. رفتيانجام پذ Cyt b هياحمربوطه در ن ينيپروتئ

Maximumروش مورد استفاده روش

Composite Likelihood بود و در محاسبه فاصله

هر كدون، به شكل مشترك مد گاهيسه جا ،يكيژنت

نظر قرار گرفت.

يج و بحثانت

ها با از بافت در تمامي نمونه DNAاستخراج

هاي استخراج شده فاقد DNAموفقيت انجام شد.

باشند كه نشان دهنده كيفيت مناسب شكستگي مي

و حداقل آسيب وارده به آن طي DNAاستخراج

.)3فرايند آماده سازي و استخراج مي باشد (شكل

Cyt bفرآيند تكثير قطعات مربوط به ناحيه

و ناحيه كنترل با موفقيت انجام گرفت. كيفيت

مورد 5/1آگارز قطعات تكثير شده به كمك ژل

، دو Cyt bارزيابي قرار گرفت. با توجه به طول ژن

جفت باز 649و 710هاي با اندازه PCRمحصول

، محصول D-loop) و براي بخش B4و A4(شكل

PCR جفت باز تكثير شد (شكل 842به اندازه

C4.(

نمونه از لحاظ 12هاي حاصله از توالي

نرم افزار توسطيابي براي هر باز كيفيت توالي

Chromas Lite 2.01 الگوريتم و PHRED

)Ewing et al., 1998 مورد آناليز قرار گرفته و (

يابي براي هر باز مشخص شد. كيفيت توالي

هايي با كيفيت پايين بر اساس انتخاب توالي

بلندترين ناحيه با آستانه ميانگين خطاي كمتر از

در ند.درصد، از دو انتهاي قطعات حذف شد 1/0

تر از مقدار مورد هايي با طول كوتاهنتيجه توالي

ها حاصل شد.انتظار براي نمونه


٢۵


.آگارز ژل يرو بر DNA استخراج جينتا -3شكل Figure 3- Extracted DNA results on agarose gel.

: Cyt b ،Bجفت بازي 710: قطعه A. آگارز ژل يرو D-loopو Cyt b اتقطع ريتكث جينتا -4شكل

خالي نشان دهنده كنترل چاهك هاي. D-loopجفت بازي 842: قطعه Cyt b ،Cجفت بازي 649قطعه

مي باشد. Thermo+ شركت 100منفي و ماركر استفاده شده Figure 4- Agarose gel electrophoresis of PCR products of Cyt b and D-loop region. A: 710

bp fragments of Cyt b PCR products, B: 649 bp fragments of Cyt b PCR products, C: 842

bp fragments of D-loop PCR products. Empty wells are negative PCR control and 100+

Marker (Thermo, USA) was used in all of gel electrophoresis.


٢۶


درصد 97به طور ميانگين بيش از

يابي نوكلئوتيدهاي اين توالي ها صحت توالي

درصد را نشان دادند كه نشان دهنده 99معادل

ضريب اطمينان باال در نتيجه گيري بر اساس

از آنجايي كه در باشد.هاي بدست آمده ميتوالي

طراحي پرايمرها نواحي همپوشان بين قطعات در

هاي نامرغوب نظر گرفته شده بود، با حذف توالي

ها يكپارچگي قطعات مورد از دو انتهاي توالي

مطالعه كامال حفظ شده بود و در نتيجه يك قطعه

باز از ژنوم ميتوكندري بدست آمد 1962به طول

بخشي از ناحيه كنترل و Cyt bكه شامل كل ناحيه

).5باشد (شكل مي

-يم يساز كپارچهي منظور به يكاف يهمپوشان يدارا پردازش از بعد آمده بدست يها يتوال -5شكل

.باشندFigure 5- Sequences obtained after processing, had sufficient overlap in order to assemble

the consensus.

به دست آمده با نرم افزار يهايتوال

DIVEIN وArlequin suite v.3.5 شدند. يبررس

يهااين ابزار تعداد جهش مشاهده شده، جايگاه

و ساختار و يديمورفيك، سطح تنوع نوكلئوتيپل

مورد مطالعه تيرا در جمع يپيتنوع هاپلوتا

نشان داد كه در هر سه جينتا. دينما يم صمشخ

چينمونه مورد مطالعه ه 12 نيب يمورد بررس هيناح

نيدر ا تيوجود ندارد و جمع يدياختالف نوكلئوت

يكيفاقد تنوع ژنت يتوكندريبخش از ژنوم م

نشان دهنده شدت توانديم دهيپد نيباشد. ايم

در يخانوادگ ديو روابط شد يهمخون يباال

كوتاه مورد مطالعه باشد پوزه ليروكودك تيجمع

يبحران تيدهنده وضعنشان يو به طور آشكار

الزمه يستياست. تنوع ز تيجمع نيا يستيتنوع ز

نييباشد و سطح پا يم طيگونه در مح كي يبقا

را در خطر انقراض در مواجه با تيتنوع، كل جمع


٢٧


شيدايپ ايو يمياقل راتييخاص مانند تغ طيشرا

يكيدهد. تنوع ژنت يخاص قرار م يهايماريب

بلند مدت يبقا ياز دو لحاظ برا يتيدرون جمع

يپيتنوع فنوت نكهيباشد. اول ا يها مهم م تيجمع

يسازگار زانيكننده م نييكه تع پيوابسته به ژنوت

است يكيباشد محصول تنوع ژنت يم تيجمع كي

)Blows & Hoffmann, 2005؛Bell & Collins

2008; Hoffmann & Sgrò, 2011تنوع اي). ثان

) در Neutral Genetic Diversity( يخنث يكيژنت

و يخونانعكاس دهنده هم يعيطب تيجمع كي

است كه هر دو مورد از عوامل يكيرانش ژنت

هستند هاتيجمع يمشخص كاهش توان بقا

)Reed & Frankham 2003; Puurtinen et al.,

2004; O’grady et al., 2006 .(وجود نيا با

يخنث يكيانتظار داشت كه تنوع ژنت توانينم

يپيكفنوت يژگيمترادف با تنوع در هر و مايمستق

)، اما Reed & Frankham, 2001باشد ( يخاص

تواند يموثر م تيبخاطر ارتباط آن با اندازه جمع

ها در تيجمع يسازگار ليانعكاس دهنده پتانس

,.Frankham, 2005; Willi et alلند مدت باشد (ب

2006; Lanfear et al., 2014كاهش جهي). در نت

يكي(چه تنوع ژنت يتيدرون جمع يكيتنوع ژنت

فشار انتخاب باشد و چه تنوع جهيو در نت يانطباق

شيو نهفته در ژنوم باشد) با افزا يخنث يكيژنت

مرتبط يعيطب يهاتيخطر انقراض جمع

ريچون تحت تاث ييايتوكندريم DNAاست.

است)، تنوع ديهاپلوئ راي(ز رديگيقرار نم يبيركنوت

جهياست و در نت يعيانتخاب طب ونيخود را تنها مد

. ستين تيآن وابسته به اندازه جمع يكيتنوع ژنت

مضر يهابر ضد جهش يديانتخاب شد نيهمچن

جنس ماده صورت اليه زاينده در يتوكندريژنوم م

سطح تنوع شتريكه منجر به همگن شدن ب رديگيم

Stewart et) (يا نهيگردد (انتخاب پس زميآن م

al., 2008يمطالعه در سالها نيحال چند ني). با ا

به عنوان ماركر اندازه ييايتوكندريم DNA رياخ

& Ballard( اندسوال برده ريرا ز تيجمعWhitlock, 2004; Hurst & Jiggins, 2005;

Bazin et al., 2006مطالعات نيا ني). مهمتر

DNAدر يكيتنوع ژنت نكهيبر ا يمبن يشواهد

ندارد را يهمبستگ تيبا اندازه جمع ييايتوكندريم

با جينتا ني). اBazin et al., 2006دهد (يارائه م

بزرگ كيتاكسونوم يگروه ها سهيمطالعه و مقا

بدست آمده است. به عنوان مثال، سطح يجانور

مهرگان مشابه يمهره داران و ب نيب سميمورف يپل

مهره گان اندازه يب كهياند، در حالبوده گريكدي

دارند. عتيدر طب يبزرگتر اريبس تيجمع

نتايج بررسي فيلوژنتيكي بر اساس توالي

كروكوديل پوزه كوتاه ايران با ديگر Cyt bكامل

) taxid:8493اعضاي خانواده كروكوديلينه (

). اين مقايسه با 6شده است (شكل نمايش داده

هاي ژنوم مرجع هر گونه انجام استفاده از توالي

گونه 12جايگاه و 1149شده است. به طور كلي

مختلف خانواده كروكوديلينه در اين بررسي مورد


٢٨


استفاده قرار گرفته است و نتايج بدست آمده مبتني

هاي پروتئيني به بر داده هاي نوكلئوتيدي و كدون

باشد.ور مشترك ميط

درخت فيلوژنتيكي بدست آمده براساس فاصله

نمايي ژنتيكي و به كمك روش حداكثر درست

). براي محاسبه 7تركيبي بدست آمده است (شكل

هاي نوكلئوتيدي از اين مقادير عالوه بر داده

هاي پروتئيني و نرخ جهش در سه جايگاه داده

تيجه عالوه كدون پروتئيني استفاده شده است. در ن

بر مدل تكاملي خنثي، مدل تكامل انطباقي نيز در

محاسبات مد نظر قرار گرفته است. معيار فاصله

هاي نوكلئوتيد در هر ژنتيكي تعداد جايگزيني

باشد. ها ميجايگاه بين توالي

مشاهده مي شود، 7همانطور كه در شكل

Crocodylusگاندو گونه نزديكترين گونه به

palustris يا ماگر است كه مطابق با يافته هاي

ن مورفولوژيكي مي باشد كه قبال ارائه شده است. اي

نكته بدين مفهوم است كه جايگاه رده بندي

از palustrisكروكوديل پوزه كوتاه به عنوان گونه

ر ديدگاه ژنتيك مولكولي قابل تاييد است. از كالست

ر خواهري بين اين دو در ادامه با عنوان كالست

).6گاندو ياد خواهيم كرد (شكل

پس از ماگر نزديكترين گونه به گاندو

Crocodylus porosus يا كروكوديل آب شور

باشد. اين در حالي مي باشد كه اين كروكوديل مي

از لحاظ مورفولوژيكي تفاوت هاي زيادي با گاندو

دارد. به عنوان مثال كروكوديل آب شور بزرگترين

مي شود و طول جنس نر آن خزنده دنيا محسوب

بالغ مي شود در حاليكه جنس نر 3/6به حدود

كند. اين متر رشد مي 5الي 4گاندو حدود

كروكوديل عمدتا در سواحل شرقي هند زندگي

كند و در نواحي ديگر هند به ندرت يافت مي

). تشابه بين اين دو گونه Devos, 1984شود (مي

د و اگر به خاستگاه ريشه در تاريخ تكامل آن دو دار

هر دو گونه توجه شود، به كشور هند خواهيم

رسيد.

در حال حاظر ماگر و كروكوديل آب شور دو

گونه از سه گونه كروكوديل مي باشد كه در هند

كنند. مطالعات متعدد ديگري نيز وجود زندگي مي

دارند كه خويشاوندي بين اين دو گونه را مورد

آب ليكروكود نكهيتوجه به ادهند. با تاييد قرار مي

كالستر كي ليتشك سيامنسيس ليشور و كروكود

كالستر در ادامه با عنوان نيدهند. ا يرا م يخواهر

گاندو به يكالستر پروسوس و كالستر خواهر

).6شوند (شكل يم يكالد گاندو معرف كيعنوان


٢٩


. خانواده نيا در گاندو گاهيجا و ليكروكود خانواده مختلف يها گونه نيب كيلوژنتيف درخت -6شكل

تكرار 100 اساس بر محاسبه نانياطم سطح دهنده نشان كي هر رنگ و يكيژنت فاصله نيمب ها شاخه طول

. خط چين قرمز نشان دهنده كالستر خواهري گاندو، خط چين آبي نشان باشد يم استرپ بوت آزمون

پروسوس و خط چين سبز نشان دهنده كالد گاندو مي باشد.دهنده كالستر Figure 6- Phylogenetic tree of different species of crocodylinae family and Gando position

in this tree. The length of the branches indicates the genetic distance and the color of each

represents the confidence level of the calculation based on 100 repetitions of the Bootstrap

test. The red dashed line represents the Gando's sister cluster, the blue dashed line

represents the Prosus cluster and the green dashed line indicates the Gando's clad.


٣٠


حداكثر روش اساس بر كه نهيليكروكود خانواده يها گونه گريد و گاندو نيب يكيژنت فاصله -7شكل

استاندارد يخطا ريمقاد و جدول ينييپا بخش در يكيژنت فاصله ريمقاد. است آمده بدست يينما درست

.است شده گزارش جدول يفوقان بخش در محاسبهFigure 7- The genetic distance between Gando and other species of the crocodylinae

family obtained based on the maximum likelihood method. The genetic distance values in

the lower part of the table and the values of the standard error calculation are reported

in the upper part of the table.

آب ليكروكود نيب يوجود رابطه خواهر

كالد با ليو تشك سيامنسيس ليروكودشور و ك

گزارش شده است زين گريماگر در چند مطالعه د

)Mcaliley et al., 2006; Meganathan et al.,

نيب كيرابطه نزد يگري). البته در مطالعات د2010

كالد با ليآب شور و ماگر و تشك ليكروكود

گزارش شده است سيامنسيس ليكروكود

)Densmore & Owen, 1989; Gatesy &

Amato, 200812 يبا بررس زين يگريد ي). مطالعات

وجود رابطه يتوكندريدر م نيژن كد كننده پروتئ

ليو ماگر و تشك سياميس ليكروكود نيب كينزد

آب شور نشان داده شده است ليكالد با كروكود

)Man et al., 2011يبررس كيدر جهينت ني). هم

). در Oaks, 2011شده است ( دييتا زين گريد

و سياميماگر، س يريمشابه قرار گ يمطالعه ا

كالد بر اساس مطالعه كيآب شور در ليكروكود

قرار گرفته است دييمورد تا يتوكندريم DNAكل

)Meredith et al., 2011.(

بايد توجه داشت كه فاصله ژنتيكي بين گاندو

ها، مانند كروكوديل گينه نو كمتر از و ديگر گونه

اما روند ،فاصله آنها با كالستر پروسوس مي باشد

تكاملي بين آنها متفاوت از يكديگر مي باشد و در

نتيجه گاندو با پروسوس تشكيل كالد داده است و

كروكوديل گينه نو در اين كالد قرار نگرفته است.

در گونه Cyt bتوالي براي 16با بررسي بانك ژني،

Crocodylus palustris شناسايي شد. مقايسه اين

گاندو كه در اين مطالعه Cyt bها با توالي توالي

جايگاه پلي 12بدست آمد نشان دهنده وجود

3جايگاه مورد مطالعه بود. 1156مورفيك در بين

ها بصورت سينگلتون با دو مورد از اين جايگاه

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Gando 1 0.001 0.024 0.023 0.025 0.027 0.028 0.028 0.028 0.028 0.027 0.032 0.041

Crocodylus palustris 2 0.002 0.023 0.023 0.025 0.027 0.027 0.028 0.028 0.028 0.027 0.032 0.042

Crocodylus novaeguineae 3 0.095 0.095 0.027 0.014 0.022 0.028 0.028 0.026 0.029 0.030 0.031 0.044

Crocodylus porosus 4 0.093 0.093 0.107 0.027 0.027 0.026 0.026 0.026 0.027 0.006 0.032 0.045

Crocodylus mindorensis 5 0.098 0.098 0.054 0.109 0.023 0.026 0.027 0.026 0.028 0.031 0.031 0.042

Crocodylus johnsoni 6 0.105 0.104 0.086 0.105 0.087 0.027 0.027 0.027 0.030 0.031 0.031 0.042

Crocodylus intermedius 7 0.106 0.106 0.113 0.099 0.105 0.109 0.005 0.013 0.016 0.029 0.017 0.039

Crocodylus acutus 8 0.108 0.108 0.111 0.101 0.108 0.109 0.018 0.014 0.016 0.030 0.019 0.042

Crocodylus moreletii 9 0.109 0.109 0.104 0.102 0.101 0.106 0.050 0.052 0.014 0.029 0.017 0.039

Crocodylus rhombifer 10 0.110 0.110 0.118 0.107 0.110 0.118 0.058 0.058 0.054 0.032 0.022 0.041

Crocodylus siamensis 11 0.110 0.110 0.120 0.020 0.124 0.121 0.113 0.115 0.114 0.124 0.035 0.048

Crocodylus niloticus 12 0.124 0.124 0.127 0.126 0.127 0.124 0.064 0.068 0.065 0.084 0.137 0.044

Mecistops cataphractus 13 0.169 0.170 0.178 0.177 0.172 0.169 0.151 0.165 0.149 0.159 0.191 0.176


٣١


جايگاه ديگر از نوع 9واريانت مي باشند و

هاي حاوي اطالعات پارسيموني هستند كه جايگاه

نمونه در ساختار فيلوژنتيكي در تعيين جايگاه هر

). 3موثر مي باشند (جدول

(جايگاه هاي پارسيمونيك C. palustrisگونه Cyt bتوالي هاي جايگاه هاي پلي مورفيك در -3جدول

).است نمايش داده شده پر رنگبصورت Table 3- Polymorphic positions in the Cyt b sequence of C. palustris (parsimony positions

were shown in bold). 1127 876 750 712 603 570 511 475 306 289 270 139 جايگاه/نمونه

JF315283 G A C A G G C C G G T T

HQ595025 . . . . . A . . . . . .

JF315254 . . . . . A . . . . . .

GU144286 . . . . . A . . . . . .

FJ173286 A G . G A . . . . A C C

HM488007 . . A G A . . G A A C C

FJ173285 . . A G A . . G A A C C

FJ173284 . . A G A . . G A A C C

FJ173283 . . A G A . . G A A C C

FJ173282 . . A G A . . G A A C C

FJ173281 . . A G A . . G A A C C

FJ173280 . . A G A . . G A A C C

FJ173279 . . A G A . . G A A C C

FJ173278 . . A G A . . G A A C C

FJ173277 . . A G A . . G A A C C

FJ173276 . . A G A . . G A A C C

Gando . . . . . . T . . . . .

574/0تنوع هاپلوتايپي بدست آمده برابر

بود، كه نشان دهنده ميزان پراكنش بااليي در

ساختار ژنتيكي كروكوديل ماگر مي باشد. با آناليز

مجدد فيلوژنتيكي بر اساس مجموعه توالي هاي

Cyt b مربوط به مطالعات مختلف در كنار نتايج

اين مطالعه به درخت فيلوژنتيكي جديدي منجر

اي براي دهنده اختالف درون گونهد كه نشانگردي

حتي با استفاده ).8باشد (شكل كروكوديل ماگر مي

از چندين نمونه مختلف بازهم تمامي اعضاي گونه

ماگر در يك كالستر قرار مي گيرند و با فاصله

زيادي تشكيل يك كالد با دو كروكوديل اب شور

و پروسوس را مي دهند كه نشان دهنده صحت

يجه گيري اوليه در مورد رابطه بين كالستر نت

پروسوس و گاندو مي باشد. اين مسئله بدين مفهوم

است كه تنوع درون گونه اي ماگر منجر به تغيير


٣٢


جايگاه آن در ساختار فيلوژنتيكي خانواده

كروكودلينه نمي شود.

اين مطالعه نشان داد كه مطابق با يافته جنتاي

از لحاظ گونه رين هاي مورفولوژيكي، نزديكت

Crocodylus palustris گونه ژنتيكي به گاندو،

است. با اين حال، با توجه به منطقه جغرافيايي

هاي مورد بررسي، فاصله ژنتيكي بين اين دو نمونه

وجود دارد. نكته حائز اهميت در اين پژوهش، عدم

تنوع ژنتيكي در ميان گاندوهاي سه منطقه مورد

چابهار است. فقدان تنوع بررسي در شهرستان

ژنتيكي در داخل يك گونه مي تواند توانايي آن

گونه در سازگاري با تغييرات شرايط محيطي را

تحت تاثير قرار داده و در نتيجه خطر انقراض آنها

را افزايش بدهد. از آنجاييكه هدف نهايي

ها، بقاي بلند مدت هاي حفاظت از گونهبرنامه

ع ژنتيكي درون جمعيتي آنهاست، حفاظت از تنو

بايد از جايگاه ويژه اي برخوردار باشد. لذا

جلوگيري از هم خوني بيشتر در ميان گاندوها با

پيشنهاد تالقي مناسب هاياستفاده از برنامه

گردد.مي

تشكر و قدرداني

اين مقاله مستخرج شده از پروژه پژوهشي

مصوب معاونت پژوهش و 100807به شماره

فناوري دانشگاه فردوسي مشهد مي باشد. لذا، بدين

وسيله از آن معاونت محترم تقدير و تشكر مي

هاي مالي گردد. تصويب اين پروژه از محل حمايت

اداره كل حفاظت محيط زيست سيستان و

ه مراتب تشكر و قدرداني را باشد كبلوچستان مي

از آن اداره كل محترم داريم. پروژه در آزمايشگاه

دانشكده كشاورزي انجام گرفته و بدين ترتيب از

مسئوالن مربوطه كمال تشكر را داريم.


٣٣


باعث ماگر ياگونه درون تنوع. پروسوس كالستر با اسيق در ماگر گونه يهاليكروكود گاهيجا -8شكل

.شودينم آن تيموقع رييتغFigure 8- Position of Mugger species of crocodylus in comparison to Crocodylus porosus

cluster. Inter-species variation of the Mugger does not change its position.

منابع

Ballard JWO, Whitlock MC (2004). The incomplete natural history of mitochondria. Molecular

Ecology 13: 729-744. Bazin E, Glemin S, Galtier N (2006). Population size does not influence mitochondrial genetic

diversity in animals Science. 31: 570-572. Bell G, Collins S (2008). Adaptation, extinction and global change. Evolutionary Applications

1: 3-16.


٣۴


Bellagamba F, Moretti VM, Comincini S, Valfare F (2001). Identification of species in animal

feedstuffs by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism

analysis of mitochondrial DNA. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49: 75-81.

Benson DA, Cavanaugh M, Clark K, Karsch-Mizrachi I, Lipman DJ (2013). GenBank. Nucleic

Acids Research 41: 36-42. Blows MW, Hoffmann AA (2005). A reassessment of genetic limits to evolutionary change.

Ecology 86: 1371-1384. Brochu C (2000). Phylogenetic relationships and divergence timing of Crocodylus based on

morphology and the fossil record. Copeia 3: 657–673. Brochu C, Densmore L (2001). Crocodile phylogenetics: a summary of current progress. In:

Grigg, G., Seebacher, F., Franklin, C. (Eds.), Crocodilian Biology and Evolution. Surrey Beatty and Sons, Chipping Norton, NSW, pp. 3–8.

Brochu C, Njau J, Blumenschine R, Densmore L (2010). A new horned crocodile from the Plio-

Pleistocene hominid sites at Olduvai Gorge, Tanzania. PloS ONE 5: 1-13.

Bruford MW, Bradley DG, Luikart G (2003). DNA markers reveal the complexity of livestock

domestication. Nature Reviews Genetics 4: 900-910. Da Silva A, Lenin J (2010). Mugger crocodile Crocodylus palustris. Crocodile: Status Survey

and Conservation Action Plan (Third ed.), Eds. Manolis SC, Stevenson 94-98.

de Vos A. 1984. Crocodile conservation in India. Biological conservation 29: 183-189. Deng W, Maust BS, Nickle DC, Learn GH, Liu Y (2010). DIVEIN: a web server to analyze

phylogenies, sequence divergence, diversity, and informative sites. Biotechniques 48:

405-417. Densmore LD, Owen RD (1989). Molecular systematics of the order Crocodilia. American

Zoologist 29: 831-841. Dolati V, Evrigh N, Nikbin S, Behmaram R (2016). Phylogenetic analyzing of Khalkhali goats

using cytochrome b gene. Journal of Agriculture Biotechnology 9: 75-86 (In Farsi). Ewing B, Green P (1998). Base-Calling of Automated Sequencer Traces Using Phred. II. Error

Probabilities. Genome Research 8: 186-194.

Excoffier L, Lischer HE (2010). Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform

population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular ecology resources 10:

564-567.

Farris JS (1970). Methods for computing Wagner trees. Systematic Biology. 19: 83-92.

Farris JS (1989). The retention index and the rescaled consistency index. Cladistics 5: 417-419. Felsenstein J (1981). Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood

approach. Journal of molecular evolution 17: 368-376. Felsenstein J (1985). Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap.

Evolution 783-791. Feng G, Wu X, Yan P, Li X (2010). Two complete mitochondrial genomes of Crocodylus and

implications for crocodilians phylogeny. Amphibia – Reptilia 31: 299–309.


٣۵


Fitch WM (1971). Toward defining the course of evolution: minimum change for a specific tree

topology. Systematic Biology 20: 406-416. Gatesy J, Amato G (2008). The rapid accumulation of consistent molecular support for

intergeneric crocodylian relationships. Molecular Phylogenetics and Evolution 48: 1232–

1237.

Gatesy J, Baker R, Hayashi C (2004). Inconsistencies in arguments for the supertree approach:

supermatrices versus supertrees of Crocodylia. systematic biology journal. 53: 342–355.

Hoffmann AA, Sgrò CM (2011). Climate change and evolutionary adaptation. Nature 470: 479-485.

Hurst GD, Jiggins FM (2005). Problems with mitochondrial DNA as a marker in population,

phylogeographic and phylogenetic studies: the effects of inherited symbionts.

Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences 272: 1525-1534. Janke A, Gullberg A, Hughes S, Aggarwal R, Arnason U (2005). Mitogenomic analyses place

the gharial (Gavialis gangeticus) on the crocodile tree and provide pre-K/T divergence

times for most crocodilians. Journal of molecular evolution 61: 620–626.

Javanmard A, Mohammadabadi MR, Zarrigabayi GE, Gharahedaghi AA, Nassiry MR,

Javadmansh A, Asadzadeh N (2008). Polymorphism within the intron region of the

bovine leptin gene in Iranian Sarabi cattle (Iranian Bos taurus). Russian Journal of

Genetics 44: 495-497.

Lalitha S (2000). Primer premier 5. Biotech Software & Internet Report: The Computer

Software Journal for Science 1: 270-272. Lanfear R, Kokko H, Eyre-Walker A (2014). Population size and the rate of evolution. Trends

in Ecology & Evolution 9: 33-44. Larkin MA, Blackshields G, Brown N, Chenna R, McGettigan PA. (2007). Clustal W and

Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23: 2947-2948. Lartillot N, Rodrigue N, Stubbs D, Richer J (2013). PhyloBayes MPI. Phylogenetic

reconstruction with infinite mixtures of profiles in a parallel environment. Systematic

Biology 62: 611-616. Man Z, Yishu W, Peng Y, Xiaobing W (2011). Crocodilian phylogeny inferred from twelve

mitochondrial protein-coding genes, with new complete mitochondrial genomic

sequences for Crocodylus acutus and Crocodylus novaeguineae. Molecular Phylogenetics

and Evolution 60: 62-67. McAliley LR, Willis RE, Ray DA, White PS, Brochu CA (2006). Are crocodiles really

monophyletic? Evidence for subdivisions from sequence and morphological data.

Molecular Phylogenetics and Evolution 39: 16-32.

McCarthy C (2005). Chromas, pp. Technelysium Pty Ltd. Meganathan P, Dubey B, Batzer M, Ray D, Haque I (2010). Molecular phylogenetic analyses

of genus Crocodylus (Eusuchia, Crocodylia, Crocodylidae) and the taxonomic position

of Crocodylus porosus. Molecular Phylogenetics and Evolution 57: 393–402.


٣۶


Meredith RW, Hekkala ER, Amato G, Gatesy J (2011). A phylogenetic hypothesis for

Crocodylus (Crocodylia) based on mitochondrial DNA: evidence for a trans-Atlantic

voyage from Africa to the New World. Molecular Phylogenetics and Evolution 60: 183-

191. Mohammadi A, Nassiry MR, Mosafer J, Mohemmadabadi MR, Sulimova GE (2009).

Distribution of BoLA-DRB3 allelic frequencies and identification of a new allele in the

Iranian cattle breed Sistani (Bos indicus). Russian Journal of Genetics 45: 198-202.

Mousavizadeh A, Mohammad Abadi MR, Torabi A, Nassiry MR, Ghiasi H, Esmailizadeh AK

(2009). Genetic polymorphism at the growth hormone locus in Iranian Talli goats by

polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP).

Iranian Journal of Biotechnology 7: 51-53. Naderi S, Rezaei HR, Taberlet P, Zundel S, Rafat SA, Naghash HR, El-Barody MAA, Ertugrul

O, Pompanon F (2007) Large-Scale Mitochondrial DNA Analysis of the Domestic Goat

Reveals Six Haplogroups with High Diversity. PLoS ONE 2(10): 1-12.

Nassiri MR, Parizadeh SA, Mahdavi M, Ariannejad H (2010). Genetic and phylogenetic

analysis of D-Loop in Persian Leopard. Journal of Agriculture Biotechnology 3: 82-95

(In Farsi).

Nassiry M, Tahmorespour M, Javadmanesh A, Soltani M, Foroutani Far S (2006). Calpastatin

polymorphism and its association with daily gain in Kurdi sheep. Iranian Journal of

Biotechnology 4: 188-192.

O’Grady JJ, Brook BW, Reed DH, Ballou JD, Tonkyn DW (2006). Realistic levels of inbreeding depression strongly affect extinction risk in wild populations. Biological

Conservation 133: 42-51. Oaks JR (2011). A time‐calibrated species tree of crocodylia reveals a recent radiation of the

true crocodiles. Evolution 65: 3285-3297. Pruitt KD, Tatusova T, Maglott DR (2007). NCBI reference sequences (RefSeq): a curated non-

redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins. Nucleic acids research

35: 61-65. Puurtinen M, Knott KE, Suonpää S, Ooik Tv, Kaitala V (2004). Genetic variability and drift

load in populations of an aquatic snail. Evolution 58: 749-756. Reed DH, Frankham R (2003). Correlation between fitness and genetic diversity. Conservation

Biology 17: 230-237. Roos J, Aggarwal R, Janke A (2007). Extended mitogenomic phylogenetic analyses yield new

insight into crocodilian evolution and their survival of the Cretaceous– Tertiary boundary.

Molecular Phylogenetics and Evolution 45: 663–673.

Saitou N, Nei M (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing

phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4: 406-425. Sayers EW, Barrett T, Benson DA, Bolton E, Bryant SH (2011). Database resources of the

national center for biotechnology information. Nucleic Acids Research 39: 38-51. Stamatakis A (2006). RAxML-VI-HPC: maximum likelihood-based phylogenetic analyses

with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics 22: 2688-2690.


٣٧


Stamatakis A, Hoover P, Rougemont J (2008). A rapid bootstrap algorithm for the RAxML web

servers. Systematic Biology 57: 758-771. Stewart JB, Freyer C, Elson JL, Larsson N (2008). Purifying selection of mtDNA and its

implications for understanding evolution and mitochondrial disease. Nature Reviews

Genetics 9: 657-662. Swindell S, Plasterer T (1997). SEQMAN, in Sequence Data Analysis Guidebook, edited by S.

Swindell. Springer New York. pp. 75-89 Swofford DL (2003). PAUP. Phylogenetic analysis using parsimony (and other methods).

Version 4. Whitaker R, Andrews H (2003). Crocodile conservation, Western Asia Region: an update.

Journal of the Bombay Natural History Society 100: 432-445. Willi Y, Van Buskirk J, Hoffmann AA (2006). Limits to the adaptive potential of small

populations. Annual Review of Ecology, Evolution and Systematics 37: 433-458. Willis R, McAliley L, Neeley E, Densmore L (2007). Evidence for placing the false gharial

(Tomistoma schlegelii) into the family Gavialidae: inferences from nuclear gene

sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution 43: 787–794.

Yang Z, Rannala B (1997). Bayesian phylogenetic inference using DNA sequences: A Markov

chain Monte Carlo method. Molecular Biology and Evolution 14: 717-724.

Zamani P, Akhondi M, Mohamadabadi M, Saki AA, Ershadi A, Banabazi MH,

Abdolmohammadi AR (2013). Genetic variation of Mehraban sheep using two inter

simple sequence repeat (ISSR) markers. African Journal of Biotechnology 10: 1812-

1817.


٣٨


Genetic Diversity of Persian Crocodile Crocodylus Palustris Using Sequencing of D-

Loop and Cyt b Regions of Mitochondria

Afsharian A.1, Nassiri M.R.∗∗∗∗2, Ebrahimi E.3, Javadmanesh A.4

1PhD Student, Animal Science Department, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad,

Mashhad, Iran. 2Professor, Animal Science Department, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad.

Mashhad, Iran. 3 Associate Professor, School of Molecular and Biomedical Science, The University of Adelaide,

Australia.

4 Assistant Professor, Animal Science Department, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of

Mashhad, Mashhad, Iran.

Abstract

Identification of the genetic features of Persian mugger crocodile, the Gando, is crucial

in management planning for conservation and preservation of this endangered species.

Therefore, this study is aimed to investigate the genetic characteristics of Gando in Iran, based

on population studies of the conserved and variable regions of the mitochondrial DNA. For this

purpose, 12 samples of skin tissue and blood were collected from three regions of Chabahar

city, south east of Iran. After DNA extraction, conserved and variable regions of the

mitochondrial genome Cyt b and D-loop were amplified using PCR. The PCR products were

sequenced and results were analyzed using bioinformatics software based on nucleotide data as

well as protein codons. Results revealed that all samples had similar nucleotide sequences and

no genetic variation was found among the samples. The closest species to Gando were

Crocodylus palustris and then C. porosus. Comparison of sequences with other Crocodile species revealed the presence of 12 polymorphic loci among 1156 loci studied and also 5

haplogroups were introduced. As we didn’t find any nucleotide diversity among studied

samples, therefore, to increase the genetic diversity of the Gando, it is essential to include

specific conservational plans for this endangered species.

Keywords: Gando Crocodile, Genetic Diversity, Phylogenetic Tree, Mitochondria Genome.

∗ Corresponding author: Nassiri M.R. Tel: +98 51 38795618 Email: [email protected]

5-paper 2- 96f116 afsharian et al-2( 1396 $ 9# 4 ˙'8 9 ˙ ) " ˙ % " ˇ ˝ 526# ١٨ journal of...

Documents