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Detección de Chlamydia trachomatis en Mujeres
Embarazadas por la Técnica de Papanicolaou,
Ensayo Inmunoenzimatico y Reacción en
Cadena de la Polimerasa
Ponente: Sergio Cardona Tebar
Octubre 2010
OBJETIVO
Comparar tres diferentes pruebas diagnosticas utilizadas para
la detección de Chlamydia trachomatis a 125 mujeres
embarazadas con o sin síntomas que asistieron a su primera
consulta en el Hospital General Regional Ignacio Zaragoza de
México D. F.
Técnica de Papanicolaou
Ensayo inmunoenzimatico
Reacción en cadena de la polimerasa
CONCEPTOS GENERALES
REINO ORDEN FAMILIA GENERO ESPECIE
Bacteria Chlamidiales Chlamydiaceae
Chlamydophila
C. AbortusC.Psittaci
C. PecorumC. CaviaeC. Felis
ChlamydiaC. TrachomatisC. Muridarum
C. Suis
Clasificación científica de la Chlamydia trachomatis
Palabra del griego khlamýs, khlamýdös que significa "capa" o "encapotado"
Chlamydia:
Nueva clasificación propuesta por Karin Everett, Bush y Anderson en 2002
Chlamydia trachomatiscaracterísticas
• En un microorganismo intracelular obligado que infecta a las
células del epitelio plano, glandular y especialmente el de
reparación o de metaplasia.
• Es una bacteria Gram-negativa, aerobia y no móvil.
• La Chlamydia es reconocida como el patógeno de transmisión
sexual más común en el mundo.
• Tiene propiedades similares a los VIRUS , ya que contienen
DNA Y RNA.
• Se comporta como PARASITO intracelular ya que utiliza las
proteínas celulares para su crecimiento y multiplicación.
Chlamydia trachomatis características
• No pueden sintetizar ATP *, por lo que requieren un hábitat intracelular.
• Inhibición de fusión de los lisosoma
• Se dividen por fisión binaria.
• Son esféricas u ovaladas observándose como cocos.
• Morfológicamente presenta dos estructuras diferentes que son los llamados Cuerpos Elementales (CE) y los Cuerpos Reticulados (CR).
• la Chlamydia se adhiere a la base de los micro vellos de la célula y de allí se interna por un mecanismo de endocitosis.
*Trifosfato de adenosina (ATP), molécula que se encuentra en todos los seres vivos y constituye la fuente principal de energía utilizable por las células para realizar sus actividades.
Ciclo de vida de la Chlamydia trachomatis
La diferencia de la Chlamydia de otras bacterias y de los virus
es que presentan dos estructuras morfológicas diferentes.
Cuerpos Elementales.
Cuerpo Reticulares.
Características Cuerpos elementales Cuerpos reticularesForma Redondos Redondos
Tamaño 300nm a 400nm 800nm a 1000nmFase Extracelular Intracelular
Metabolismo Inactivos ActivosEstructura Resistentes Frágiles
Fase infectiva Si NoFase replicativa No SiSíntesis de ATP No Si
C.Reticular
Cuadro comparativo Cuerpos elementales y Cuerpos reticulares
C.Elemental
Cuatro cuerpos elementales rodeada por el cuerpo reticulado que los produjo De la Universidad de Southampton Escuela de Medicina.
Ciclo de crecimiento de la Chlamydia
cuerpo elemental
Cuerporeticular
célula
núcleo
inclusión
Ciclo de desarrollo de la Chlamydia trachomatis
Complicaciones de la Chlamydia trachomatis en la mujer
por orden de aparición:
1) Infección vaginal: Al inicio del contacto, portadora asintomática.
2) Cervicitis: Inflamación del cuello de la matriz por la infección.
3) Endometritis: Infección de la mucosa de la cavidad de la matriz.
4) Salpingitis: Inflamación de las trompas de Falopio.
5) Enfermedad Inflamatoria Pélvica (Linfogranuloma venéreo):
Infección de la cavidad peritoneal y estructuras anexas
Chlamydia trachomatis
En las mujeres embarazadas, si no es tratada la enfermedad puede provocar partos prematuros.
Cérvix con secreción
Chlamydia trachomatis
La Chlamydia puede provocar en el hombre:
• Epididimitis (esterilidad).
• Linfogranuloma venéreo.
• Uretritis, cuyos síntomas son:
-Dificultad para orinar.-Micción dolorosa.-Sensación de orinar.-Secreción del pene.-Sensibilidad testicular.
Chlamydia trachomatis
En los niños la Chlamydia puede causar:
Conjuntivitis neonatal.Neumonía tempranaConjuntivitis purulentaRinitisVulvitisOtitisRinofangitis
Manifestación clínica y Serotipos
Manifestaciones clínicasEspecie Serotipo Enfermedad
Chlamydia tracomatis
A,B,C Tracoma
D,E,F,G,H,I,J
Conjuntivitis
Uretritis
Cervicitis
Salpingitis
Endometritis
Epididimitis
Neumonía
L1, L2, L3Linfogranuloma
venéreo
TECNICA DE PAPANICOLAOU
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA(PCR)
ENSAYO INMUNOENZIMATICO (EIA)
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (DIF)
Para Shinna y Gupta, la imagen que da mayor sensibilidad diagnostica esal inicio del ciclo celular, en la que se puede observar una finavacuolación del citoplasma en forma de mordidas de polilla o comoinclusiones nebulares, sumado a esto se puede observar una granpresencia de polimorfonucleares
Citología
No se le considera positivo a presencia de Chlamydia
Técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis. Bioquímico estadounidense que imita el fenómeno de replicación del ADN que ocurre de manera natural en las células vivas
La PCR utiliza una enzima llamada
Polimerasa para multiplicar rápidamente
el pequeño fragmento de ADN.
Reacción en cadena de la polimerasa(PCR)
Para llevar a cabo esta técnica los científicos aíslan el
fragmento que va a ser amplificado en un tubo de
ensayo y le aplican calor para separar las dos cadenas
de la molécula
Termociclador
Ciclo de la PCR
Se divide en 3 fases:
1)Desnaturalización
Donde se calienta el ADN para separar las cadenas que lo forman
2)Templado
La temperatura de la mezcla se rebaja para que los cebadores ofragmentos iniciadores del ADN se enlacen con las cadenasseparadas de esta molécula
3) Polimerización
La temperatura de la mezcla se eleva hasta los 75 °C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN
Ciclo de la PCR
Inmunoensayo enzimático (EIA)
• El fundamento de esta técnica consiste en que la Chlamydiatrachomatis cuando está presente en la muestra, se une alanticuerpo monoclonal anti-LPS usado como el reactivodetector presente en la placa comercial, formando uncomplejo que se revela al adicionar el conjugado delanticuerpo anti-inmunoglobulina humana con la peroxidasa yposteriormente el sustrato de enzima.
• Se desarrolla un color amarillo a naranja en proporción a lacantidad de antígeno presente en la muestra, por medio deun detector espectrofotométrico.
Inmunofluorescencia (DIF)
• La inmunofluorescencia (DIF) es una técnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos.
• Sobre un porta se deposita una muestra en la que se busca la presencia de un determinado antígeno.
• Se añade un suero específico del antígeno problema marcado con isotiocinato de fluoresceína (conjugado).
Detención de antígeno por Inmunofluorescencia Directa
Si el antígeno problema se encuentra presente en lamuestra, se une el conjugado. En caso contrario elconjugado se elimina con un lavado del porta.La lectura se realiza en un microscopio de fluorescencia,que emite luz ultravioleta de una determinada longitud deonda.
ESTUDIO
Material y métodos
Material biológico• 2 muestras fueron tomadas a cada
una de las 125 mujeres embarazadas al acudir a su primera revisión medica
• Las muestras fueron tomadas con un hisopo de algodón esterilizado
• Todos las muestras fueron encontradas satisfactorias para su evaluación citopatológica. De las que 105 mostraban síntomas de la infección y 20 no mostraban ningún síntoma
Estudio citológico
El primer hisopo de algodón fue extendido en una laminillafue teñida usando la técnica de Papanicolaou y observada enun microscopio de luz.Se encontró:
Células de metaplasia infectadas conChlamydia que contenían múltiples osencillas inclusiones al interior delcitoplasma. Los cuerpos de inclusióntenían una homogénea distribución deapariencia nebular.
Además se observo una sustancial cantidad de polimorfonucleares
•Células de metaplasia donde se observan múltiples inclusiones nebulares dentro del citoplasma•el contorno de las vacuolas no está claramente definido.•Polimorfonucleares.
•Inclusiones nebulares se observa al interior de la célula de metaplasia.•Nucleos excentricos•el contorno de la célula está bien definido.
Inmunoensayo enzimático (EIA)
• El segundo hisopo de algodónfue puesto en el medio detransporte incluido en el equipode EIA.
• Todas las muestras se probaron para el antígeno según las instrucciones incluidas en el equipo
• La muestra fue considerada positiva si la densidad óptica estuviera más allá del límite calculado usando un control negativo
Detector de inmunoensayo
• 500 micro litros de la mezclapreparada para EIA fueron tomadosy procesados.
• Fueron centrifugadas por 15minutos a 4 C, se des-ionizó y selavaron por 10 minutos.
• Se volvió a centrifugar y seincubaron a 54 C con proteinasapor 10 minutos
Termociclador
Tubos de PCR
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• Las muestras cuyos resultados difirieron fueron testeados (probados) por DIF.
• Las muestras fueron analizadas con un microscopio de fluorescencia.
• El criterio usado para determinar positivo a Chlamydia fue la presencia de 5 o más cuerpos elementales.
Una muestra fue considerada como Verdadera positiva cuando 2 o más de las técnicas de diagnostico comparadas, demostraron la presencia de Chlamydia
Inmunoflourescencia directa (DIF)
RESULTADOS
Detección De Chlamydia trachomatis Grupo
Sintomáticas Asintomáticas(112) (13)
Método Positivos Positivos Total positivosPapanicolaou 2 2 4
EIA 11 1 12PCR 2 1 3
2% 10% 2%
86%
sintomáticas
Papanicolaou EIA PCR NEGATIVAS
15% 8%
8%69%
asintomáticas
Papanicolaou EIA PCR NEGATIVAS
MUESTRA PAPANICOLAOU EIA PCR DIF
24
25
47
50
71
72
74
77
89
99
101
103
104
POSITIVO
NEGATIVO
Muestras Positivas para Chlamydia trachomatisPor los 4 diferentes métodos
Características sociales y demográficas de las pacientes
• La edad promedio de las personas infectadas fue de 24 años
• 2 de las pacientes infectadas eran solteras
• Las pacientes eran sexualmente activas con una edad promedio de 21 años
• 100% de los participantes estaban en el tercer trimestre de su embarazo
• El número de embarazos promedio fue de 3
• El número promedio de parejas sexuales fue de 1
• El nivel socioeconómico promedio fue medio
• Solo una paciente tenia historia de ETS
Análisis Comparativo para la detección de Chlamydia por los 3 diferentes métodos
Método Sensibilidad EspecificidadPositivos
verdaderosPrecisión
Papanicolaou 100 99.18 75 99.2
EIA 100 92.62 25 92
PCR 100 100 100 100
Hallazgos citológicos adicionales
Diagnostico citológicoNegativas 2
Cándida spp 17Coco bacilar 5
Actinomyces spp 1Proceso inflamatorio 96
chlamydia 4Total muestras 125
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Porcentaje de casos
Negativas 1.6%
Candida spp 13.6%
Cocobacilar 4.0%
Actinomyces spp 0.8%
Proc. Inflamatorio 76.8%
Chlamydia 3.2%
RESUMEN
En resumen, a pesar de que la técnica de Papanicolaou no es
considerada fiable para el diagnostico de la Chlamydia ésta
puede ser superior a el Inmunoensayo enzimatico y ofrecer un
diagnostico adecuado en mujeres embarazadas cuando la
muestra es satisfactoria para ser diagnosticada y es realizada
por citotecnólogos muy experimentados y calificados.
Por otra parte, PCR demostró ser la prueba diagnóstica con
mas especificidad y sensibilidad
Varios autores como, Geerling, Kapur y Waters no consideran a la
técnica de Papanicolaou lo suficientemente especifica debido a la
dificultad para diferenciar entre una real inclusión de
Chlamydia, de otros con características morfológicas o estructuras
parecidas, como núcleos degenerados, gránulos de lípidos, detritus
bacteriana.
Por consiguiente han sugerido que la Chlamydia es encontrada solo
en casos donde las inclusiones son de tipo nebular y no en las de
tipo de tiro al blanco, ya que estas representan material celular
amorfo, según Michelle Henry
En este estudio el tipo de inclusiones encontrados en las
muestras positivas fueron del tipo nebular y tales inclusiones
fueron encontradas en un número limitado
Esta observación es respaldada por varios investigadores
como Kellogg y Foster que han reportado que tales
inclusiones son muy frágiles y por lo tanto rara vez son
encontradas intactas
CONCLUSIÓN
La técnica de Papanicolaou y PCR son adecuadas pruebas
diagnosticas para la detección de Chlamydia trachomatis en
mujeres embarazadas. EIA no es una prueba diagnóstica
confiable
BIBLIOGRAFIA
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Murray P. Drew W. Kobayashi G. Thompson J. Microbiología médico 1ª edición Española 1992. p. 354-378.
Masson-salvat Diccionario medico.3ª edición. Barcelona: Salvat editores, S.A. 1971: p.45.
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Henry M. Jensen K.Skoglund C. Armstrong D. Clamydia trachomatis in routine cervical smears. A microscopic and ultrastructural analysis. Acta Cytologica. 1993. 37: 343-352
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