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BIOPLASTICOS:BACTERIAS PRODUCTORAS DE PHA

BIOPLASTICOS

Polihidroxialcanoatos(PHA)

Son sintetizados por muchas especies de distintos gneros bacterianos en condiciones de crecimiento caracterizadas por exceso en la fuente carbonada y limitacin de nutrientes como N,P,S,Mg,O2 Estos polmeros se acumulan en grnulos intracitoplasmticos y son utilizados como fuente de carbono y energa en condiciones de escasez nutricional. POLIHIDROXIALCANOATOSBacterias que sintetizan PHA en la fase estacionaria con limitacin de nutrientes y con exceso de fuente de carbono (Cupriavidus necator, Pseudomonas oleovorans ,Azotobacter beijerinckii, Azospirillum brasilense): CULTIVO ALIMENTADO O FED BATCH

Bacterias que acumulan PHA durante su crecimiento sin que se agote algn nutriente (Mesorhizobium plurifarium, Alcaligenes latus, Pseudomonas putida, Haloferax mediterranei, Azotobacter chrococcum): CULTIVO DISCONTINUO O BATCH Azospirillum spp. nativas productoras de polihidroxialcanoatos (PHA)

Azosporillum brasilense y A. lipoferum

1. Inculo: Azospirillum sp. en 1,5 mL de caldo Azotobacter modificado (30 C x 24 horas, constante agitacin ) 2. Cultivo fed-batch o alimentado - Inculo en 15 mL del mismo caldo : 30 C x 24 horas (150 rpm) - Despus, alimentar con carbono: solucin saturada de cido mlico cada 12 horas (24-36-48 horas)

724 horas: Primera alimentacin con 3 mL de solucin saturada de cido mlico- Incubacin 30 C por 12 horas

36 horas :Primera toma de muestra y frotis para detectar PHAs

Tincin con solucin de Sudn negro B x 15 minutos

Decolorar con xilol y secar a temperatura ambiente

Teir con safranina por 1 minuto y despus enjuagar con agua destilada

Secar y observar: Clulas vegetativas rosadas

36 horas: Segunda alimentacin con solucin saturada de cido mlico- Incubacin 30 C por 12 horas

48 horas :Segunda toma de muestra y frotis para detectar PHA

Tincin con solucin de Sudn negro B x 15 minutos

Decolorar con xilol y secar a temperatura ambiente

Teir con safranina por 1 minuto y enjuagar con agua destilada

DETECCIN DE PHALos grnulos de PHA se observan de color gris o negro y las clulas vegetativas rosadas

CUANTIFICACION DE BIOMASA1. Centrifugar el caldo cultivado (3000 rpm por 30 minutos)

20CUANTIFICACION DE BIOMASA2.Lavar el paquete celular por dos veces (agregar solucin salina y centrifugar)

CUANTIFICACION DE BIOMASA3.Deshidratar (70C hasta peso constante) y pesar

CUANTIFICACION DE PHA1.Agregar 1 mL de hipoclorito de sodio 5 % a la biomasa deshidratada

CUANTIFICACION DE PHA2. Mezclar durante 2 horas y luego agregar 1 mL de cloroformo. Inmediatamente se forman dos fases. Centrifugar (2000 rpm x 5 minutos)

CUANTIFICACION DE PHA3. Se visualizan mejor las dos fases. Con una pipeta Pasteur extraer el cloroformo con el polmero (fase inferior) y depositarlo en tubos de vidrio. Evaporar el cloroformo ( estufa 24 horas)

CUANTIFICACION DE PHA4. Remover el polmero con ayuda de un ansa

CUANTIFICACION DE PHA4. Extraer el polmero PHA y pesarCalcular el Y p/x (Rendimiento de biomasa en producto)

Verificacin de la naturaleza del PHADigestin con cido sulfrico y corrida espectral con pico mximo a 235 nm

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIN !BACTERIAS HALOFILAS

PHA sintetizado por bacterias halfilas

Cupriavidus necator

Cupriavidus necator

Cupriavidus necator: No fermenta la lactosa en Mac Conkey

Cupriavidus necator: No forma fluoresceina en agar King B

Cupriavidus necator: Oxidasa positivo

Cupriavidus necator: Fructosa como fuente de carbono

Cupriavidus necator:Alimentacin

Cupriavidus necator: Deteccin de grnulos de PHAs

Cupriavidus necator

Cupriavidus necator

Gracias por su atencin