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第二军医大学 博士学位论文 重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及体内药物动力学-药 效学研究 姓名:李晶 申请学位级别:博士 专业:肿瘤学 指导教师:郭亚军 20090601

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第二军医大学

博士学位论文

重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及体内药物动力学-药

效学研究

姓名:李晶

申请学位级别:博士

专业:肿瘤学

指导教师:郭亚军

20090601

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及体内药物动力学一药效学研究

摘要

为了克服鼠源性单克隆抗体应用于人体时所出现的严重过敏反应,人源化抗体应

运而生,并很快成为十余年来国内外生物医学研究的重大热点之一。注射用重组抗

CD3人源化单克隆抗体Hul2F6m是抗体药物国家工程研究中心研制的一类新生物制

品,实验发现它竞争抑制OKT3、SK7及UCHTl等CD3单抗与抗原的结合并具有与

OKT3相似的激活及抑制T细胞的功能,提示hul2F6m有可能作为免疫抑制剂应用

于急性移植排斥反应的治疗。本课题研究以hul2F6m作为受试药物,在体外分别进

行了抗体Fab部分及Fc部分药效学研究,并在肾移植患者体内进行了单次给药的药

物动力学及药效学研究。该课题研究中建立的血清hul2F6m浓度检测方法,符合临

床药物动力学研究的要求;在研究剂量范围内,静脉滴注hul2F6m呈线性药物动力

学规律,各组肾移植患者静脉给予hul2F6m后即刻血药浓度达到峰值,药物半衰期

为5.5.6天。外周血T淋巴细胞亚群CD2、CD3、CD4、CD8阳性细胞与血清Hul2F6m

浓度呈负相关,给药后即刻外周血T淋巴细胞亚群CD2、CD3、CD4、CD8阳性细

胞比例迅速下降,并在给药后6h左右达到最低值,而以CD3阳性细胞比例下降最为

明显,显示hul2F6m通过与CD3抗原的结合发挥药理作用,维持CD3抗原饱和的

药物浓度约为1000ng/mL。研究提示hul2F6m有望成为一种抗排异能力强、免疫原

性和毒副作用小的有效免疫抑制剂用于急性移植排斥反应的治疗。本文分五个部分对

课题研究进行总结,包括CD3e·5融合蛋白的构建/表达及血药浓度测定方法学研究、

体外药效学研究、肾移植患者单次给药的药物动力学研究、单次给药的药物动力学.

药效学研究及体内免疫原性研究。

【关键词】重组抗CD3人源化单克隆抗体(hul2F6m),药物动力学,药效学,

肾移植,酶联免疫吸附法,流式细胞术

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第二军医大学博士学位论文

Abstract

To reduce the immunogenicity of murine monoclonal antibodies in humans,

humanized antibodies have been developed during the past ten years.Hu l 2F6m is a

humanized anti—human CD3 mAb as a new biologic agent(Categary I)produced by

Shanghai National Engineering Research Centerfo,.Antibody Medicine.It competes

、Ⅳith other several anti-CD3 mAbs(OKT3,SK7 or UCHT 1)for binding to human T

cells and possesses potent T cell activation and suppression properties in vitro similar

to OKT3.This indicates hul 2F6m may be used as an immunosuppressive agent for

treatment of acute allografi rejection..In this study we investigated the in vitro

pharmacodynamics(PD),in vivo pharmacokinetics-pharmacodynamics(PK/PD)in

kidney transplatation volunteers in an open—label dose escalation study.The specific

method has been developed to determine the serum concentration of hul 2F6m.The

pharmacokinetic behaviors of Hu l 2F6m in kidney transplatation volunteers complied

with linear kinetics within the examined dose range.The concentration—effect plot

between serum concentration of hul2F6m and corresponding percentage of

lymphocyte subsets(CD2+,CD3+,CD4+and CD8+proportion)showed a significantly

negative correlation.Six hours after Hul2F6m infusion,the serum concentration of

hul2F6m to 1 000 ng·mL一,while the proportion of CD3+T cells decreased less than

10 percent of the baseline.The serum hul2F6m concentration of 1000 ng‘mL‘1 seems

to be the cutoff point of CD3+saturation.The result from trial suggests that hu l2F6m

may be an effective immunosuppressive agent with less immunogenicity and toxicity

for acute rejection of solid organ.

【KEY WORDS】anti—CD3 mAb,pharmacokinetic,pharmacodynamic,

kidney transplanta“on,enzyme-linked immunosorbent assay,flow cytometry

.2.

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及体内药物动力学一药效学研究

中英文缩略语对照表

3p97

Prac‘ical Phannac。kine‘icProgram药物动力学应用软件97版约韧动力字应用软件 版

Version 97

⋯,、 area under the plasmaAUC

concentration time

CHO cell Chinese hamster ovary cell

Cls/F apparent clearance

Cmax maximum concentration

C—T Concentration.time CHIVe

CV% coefficient of variability

浓度时间曲线下面积

中国仓鼠卵巢细胞

表观清除率

峰浓度

药物浓度.时间曲线

变异系数

ELISA enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附法

FDA

FCM

GCP

PD

PK

RSD

SD

SFDA

乃/2

A文Ⅸ

Vd/F

Food and Drug Administration 美国食品药品监督管理局

flow cytometry 流式细胞术

Good Clinical Practice 药品临床试验管理规范

pharmacodynamic 药物动力学

pharmacokinetic 药效动力学

relative standard deviation 相对标准偏差

standard deviation 标准偏差

State Food and Drug Administration 国家食品药品监督管理局

half-life time

peaktime

半衰期

达峰时间

apparent volume ofdistribution 表观分布容积

-3-

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独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工

作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经

发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡

献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责

任。

学位论文作者签名: El期: 年月 日

学位论文版权使用授权声明

本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定,第二

军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子

版,允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全

文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位

论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复

制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)

学位论文作者签名: 导师签名:

日期: 年 月 日 日期: 年 月 E1

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第二军医大学博士学位论文

.▲上.—J一

刖吾

器官移植取得成功的一大障碍是宿主对移植物产生免疫排斥反应。目前,以环

孢霉素A为代表的联合免疫抑制治疗方法,虽然明显地提高了各类移植器官手术后

第1年的成活率,但是急性排异反应的发生率并未见有明显地减少。尽管大剂量类

固醇激素冲击疗法,可以逆转部分。肾移植患者的急性排异反应,但是仍有不少的患

者因其急性排异反应为血管性排异而对激素冲击疗法不敏感。此时,只有应用针对

淋巴细胞的生物制剂,如抗CD3的单抗才能控制并逆转排异反应,取得较好的治疗

效果。

CD3分子是广泛分布于人成熟T淋巴细胞表面的膜抗原,它与T细胞表面膜受

体TCR形成复合体,在细胞内信息传递过程中起着重要的作用。已有的研究表明抗

人T细胞CD3的单抗具有激活和抑制T细胞的双向功能,它在抗肿瘤、抗多种器

官移植排斥反应及再生障碍贫血的治疗中已显示出广阔的应用前景。

OKT3是由美国Ortho药物公司生产的抗人CD3的单抗,它对预防和治疗器官

移植免疫排斥反应有良好的效果,因此成为第一个被美国FDA批准投放市场的单克

隆抗体。1986年,OKT3被批准用于治疗抗类固醇的急性移植’肾排斥反应,1993年

又被FDA批准用于逆转心脏移植和肝移植排斥反应【l'2】。但OKT3在临床上的广

泛使用却受到了两个因素的制约,即人抗鼠抗体反应(Human anti.mouse antibody

response,HAMA)和细胞因子释放综合症(Cytokine release syndrome,CRS)。

首先,OKT3作为鼠源性单抗应用于人体时可引起人抗鼠抗体(HAMA)免疫

应答,HAMA可加快血清中鼠源抗体的清除,阻断单抗的治疗效果,严重时还可引

发变态反应危及生命【3,4J。使用人源抗体或人源化抗体是克服HAMA反应的两种可

能的方法,由于通过杂交瘤技术难以获得特异性强、亲和力高的人源抗体,鼠源抗

体的人源化改造成为主要途径。进行抗体人源化有两个基本原则:l、保持原鼠源抗

体的亲和力和特异性;2、大大降低鼠源抗体的免疫原性。最早的人源化抗体是将鼠

单抗的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体,由于这两部分在空间结构上相对独

立,其抗原亲和力保持得很好,同时免疫原性也得到了下降。但由于嵌合抗体上还

保留着鼠可变区,应用于临床应用时仍可能发生强烈的HAMA反应【51。为了降低单

抗可变区部分的鼠源性,研究者们希望迸一步将鼠源抗体可变区中相对保守的框架

区(Frame Region,FR)换成人的FR,仅仅保留抗原结合部位即互补决定区

.4.

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及体内药物动力学一药效学研究

(Complementary determining region,CDR),使它的免疫原性降到最小。在后来的

实验中,人们发现起支架作用的FR不仅维持着CDR的空间构象,有时还直接参与

抗原抗体的相互结合。因此,单纯的CDR移植往往降低甚至丧失了原抗体的亲和

力,只有将人FR中某些重要残基回复突变成鼠源残基才能恢复抗体的活性【6'7】。

首剂效应(First dose effect)是CD3单抗临床应用中的另一突出问题[8,91,即

患者在首次注射抗体不久后机体外周血中出现多种炎性细胞因子(IL.2、TNF.0c、

IFN.0c、IFN.诹GM.CSF等),并由此产生应用OKT3时最常见的细胞因子释放综

合症(CRS),这些症状包括发热、寒颤、头痛、呕吐、腹泻等,在某些严重情况下,

还会诱发肺水肿、支气管痉挛甚至死亡。研究发现,CRS主要是通过OKT3交联T

细胞(通过抗体的F(ab’)2部分)和FcR细胞(通过抗体的Fc段)导致两者均被激

活而释放各种细胞因子引发的【10,11】。OKT3的F(ab’)2片段由于没有Fc段而丧失了与

FcR结合的能力,不能交联激活T细胞与FcR细胞,因而毒副作用也大大下降【l引。

但是,F(ab’)2片断在血中的半衰期较短,其大量生产也存在一定的困难,更重要的

是,在制备过程中一旦混入了少量完整抗体就会协同激活T细胞而发生CRS,这些

性质都使它不适宜用于临床治疗【13,14】。对CD3单抗进行的人源化改造虽然基本解决

了抗体免疫原性的问题,但CRS的问题并没有得到解决,因为人源抗体同样能有效

激活T细胞。研究发现,抗体恒定区CH2的前部(234到238位氨基酸)在抗体与

Fc受体(FcRI与FcRII)的结合中起重要作用【15-19】。突变分析证实如将人源抗体IgGl

恒定区234和235位的Leucine.Leucine突变为Alanine.Alanine,将大大减弱抗体Fc

段与FcR细胞的结合,使CD3抗体对T细胞的激活作用明显下降,这己在动物实

验和临床实验中获得了证实【20之31。

作为免疫抑制作用最强的生物制剂,CD3单抗的疗效已在急性抗排异冲击疗

法、治疗移植物抗宿主反应及器官移植前的预防性脱敏中得到充分的证实,克服鼠

源性和首剂效应成为其临床广泛应用的关键。抗体药物国家工程研究中心利用自身

在单克隆抗体研究方面的优势,构建了恒定区特定位点突变的人源化抗CD3单克隆

抗体Hul2F6m,它对T细胞的激活作用明显减弱而保留了与OKT3相似的亲和力和

调变功能,本课题主要是对该抗体进行体外药效学及体内药代动力学.药效学研究,

希望能为我国器官移植患者提供一种抗排异能力强、免疫原性和毒副作用小的有效

免疫抑制剂。

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第二军医大学博士学位论文

参考文献【l】Darby CR,Moore RH,Shrestha B,Lord RJ,Jurewicz AJ,Gri币n PJ,Salaman JR. Reduced

dose OKT3 prophylaxis in sensitised kidney recipients.Transpl Int,1 996,9(6):565-9.

【2】Abramowicz D,Norman DJ,Vereerstraeten只Goldman M,De Pauw L,Vanherweghem儿,

Kinnaen R Kahana L,Stuart FP Jr,Thistlethwaite JR Jr’Shield CF,Monaco A,Wu SC,Haverty

TP.OKT3 prophylaxis in renal grafts with prolonged cold ischemia times:association with

improvement in long-term survival.Kidney Int,1 996,49(3):768·72.

f3】Jaffers GJ,Fuller TC,Cosimi AB,Russell PS,Winn HJ,Colvin RB.Monoclonal antibody

therapy.Anti··idiotypic and non--anti·-idiotypic antibodies to OKT3 arising despite intense

immunosuppression.Transplantation,1 986,4 1(5):572—8

【4】Norman DJ,Shield CF 3rd,Henell KR,Kimball J,Barry JM,BenneU WM,Leone M.

Effectiveness of a second course of OKT3 monoclonal anti.T cell antibody for treatment of renal

allografl rejection.Transplantation,1988,46(4):523-9.

【5】Adair JR.Engineering antibodies for therapy.1mmunoiog ReK I 992,1 30:5—40

【6】Kettleborough CA,Saldanha J,Heath VJ,Morrison CJ,Bendig MM.Humanization of a mouse

monoclonal antibody by CDR·grafting:the importance of framework residues on loop

conformation.Protein Eng,1 99 1,4(7):773-83

【7】Kolbinger F,Saldanha J,Hardman N,Bendig MM.Humanization of a mouse anti.human lgE

antibody:a potential therapeutic for lgE-mediated allergies.Protein Eng,1993,6(8):971-80.

【8】Abramowicz D,Schandene L,Goldman M,Crusiaux A,Vereerstraeten P’De Pauw L,Wybran J,

Kinnaert E Dupont E,Toussaint C. Release of tumor necrosis factor,interleukin.2.and

gamma-interferon in serum after injection of OKT3 monoclonai antibody in kidney transplant

recipients.Transplantation,1 989,47(4):606—8.

【9】Gaston RS,Deierhoi MH,Patterson T,Prasthofer E,Julian BA,Barber WH,Laskow DA,

Diethelm AG,Curtis JJ.OKT3 first-dose reaction:association with T cell subsets and cytokine

release.Kidney Int.1991 Jan;39(1):141—8.

【1 0】Krutmann J,Kirnbauer心Kock A,Schwarz T,Schopf E,May LT’Sehgal PB,Luger TA.

Cross-linking Fc receptors on monocytes triggers IL-6 production.Role in anti-CD3.induced T

cell activation.J Immun01.1 990.145(5):1 337—42

[1l】Thistlethwaite JR Jr,Stuart JK,Mayes JT,Gaber AO,Woodle S,Buckingham MR'Stuart FP.

Complications and monitoring ofOKT3 therapy.Am J Kidney Dis,1988,11(2):l 12-9

【l 2】Woodle ES,Thistlethwaite JR,Ghobrial IA,Jolliffe LK,Stuart FP,Bluestone JA.OKT3 F(ab。12

fragments—retention of the immunosuppressiVe properties of whole antibody with marked

reduction in T cell activation and lymphokine release.Transplantation,1 99 1,52(2):354—60

【1 3】Hirsch&Bluestone JA,DeNenno L,Gress RE.Anti-CD3 F(ab’)2 fragments are immuno—

suppressive in vivo without evoking either the strong humoral response or morbidity associated

with whole mAb.Transplantation.1990 Jun;49(6):ll l 7—23

【1 4】van Seventer GA,KuoperS KC,Van Lier RA,de Groot ER,Aarden LA,Melief CJ.Mechanism

.6.

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及体内药物动力学一药效学研究

of inhibition and induction of cytolytic activity in cytotoxic T lymphocytes by CD3 monoclonal

antibodies.J lmmun01.1 987 Oct 1 5;1 39(8):2545—50.

【l 5】0110 R,Rougeon F.Gene conversion and polymorphism:generation of mouse immuno-globulin

gamma 2a chain alleles by differential gene conversion by gamma 2b chain gene.Cell,1 983,

32(2):5 1 5—23

[1 6】Woof JM,Nik Jaafar MI,Jefferis&Burton DR.The monocyte binding domain(s)on human

immunoglobulin G Mol lmmunol,1 984,2 1(6):523-7

[】7】Gergely J,Sarmay G The two binding-site models of human JgG binding Fc gamma receptors.

FASEB J,1 990,4(1 5):3275-83

【1 8】Duncan A心Woof JM,Partridge LJ,Burton D凡Winter Q Localization of the binding site for

the human hiigh-affinity Fc receptor on lgG.Nature,1 988,332(6 1 64):563-4

【1 9】Jefferis R,Lund J,Pound J.Molecular definition of interaction sites on human IgG for Fc

receptors(huFc gamma R).Mol lmmunol,1 990,27(1 2):l 237-40

【20】Xu D,Alegre ML,Varga SS,Rothermel AL,Collins AM,Pulito VL,Hanna LS,Dolan KP,

Parren PW,Bluestone JA,Jolliffe LK,Zivin RA.In vitro characterization of five humanized

OKT3 effector function variant antibodies.Cell Immunol,2000,200(1):1 6.26

【2 l】Alegre ML,Peterson LJ,Xu D,Sattar HA,Jeyarajah DR,Kowaikowski K Thistlethwaite IR,

Zivin RA,Jolliffe L,Bluestone JA.A non.activating”humanized”anti.CD3 monoclonal antibody

retains immunosuppressive properties in vivo.Transplantation,1 994,57(1 1):1 537—43

[22】Woodle ES,Xu D,Zivin RA,Auger J,Charette J,O’Laughlin氏Peace D,Jollife LK,Haverty L

Bluestone JA,Thistlethwaite JR Jr.Phase I trial of a humanized,Fc receptor nonbinding OKT3

antibody,huOKT3 gammal(Ala-Ala)in the treatment of acute renal allografl

rejection.Transplantation.1 999 Sep l 5;68(5):608-1 6

【23】Woodle ES,Bluestone JA,Zivin RA,Jolli脆Lk Auger J,Xu D,Thistlethwaite JR.Humanized,

nonmitogenic OKT3 antibody,huOKT3 gamma(Ala-Ala):initial clinical experience.Transplant

Proe,l 998,30(4):l 369·70

.7-

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第二军医大学博士学位论文

伦理学要求

本研究中受试药物重组抗CD3人源化单克隆抗体于2007年通过国家食品药品

监督管理局(SFDA)的批准,批件号为2007L01967,可以进行I~II期临床试验。

临床适应证是肾移植术后急性排斥反应的预防和治疗。此I期临床试验包括肾移植

患者的剂量递增单次给药耐受性试验、剂量递增单次给药药物动力学研究及药效学

研究。该研究方案和知情同意书均已经通过临床试验机构(浙江大学医学院第一医

院)伦理委员会审批。本试验的操作严格遵守赫尔辛基宣言和国家药品临床试验管

理规范(GCP)。

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

第一部分 CD3王:6融合蛋白的构建和表达以及ELISA法测

定人血清中hul2F6m抗体浓度方法的建立

摘要

本试验自行构建、表达了CD3l;6融合蛋白,并用此蛋白建立了酶联免疫吸

附法(ELISA法)测定人血清中hul2F6m抗体浓度。该方法特异性强,灵敏度高、

准确度和精密度良好,足以满足药代动力学研究的要求。

一、CD3e6融合蛋白的构建和表达

为探讨重组抗CD3人源化单克隆抗体hul2F6m在体内的吸收、分布、代谢

等的规律,我们进行了该单抗的I期临床药物代谢动力学研究。在该部分研究中,

受试者血清药物浓度的检测是核心工作,因此我们建立了检测该单抗的ELISA

方法。该单抗结合的靶位位于CD3的£链,但是单独表达£链无法形成正确的

空间结构而不能与抗体结合,因此,我们表达了CD3£6两条链的融合蛋白。即

将人CD3c基因的3’端通过Linker与人CD36基因的5’相连,构建成CD3£6融

合基因,利用pET22表达载体进行表达。

(一)材料

菌株

TG.1由本所保存。

BL21由本所保存。

载体

pET22·Invitrogen公司产品。

pGEM-T:Promega公司产品。

引物

引物1.4:由上海生工生物工程有限公司合成。

Primerl:

5’A圣GCTTCACCATGACAGTGCTGGCGCCA

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第二军医大学博士学位论文

Primer2:

5’

蕤鐾零鸳霉警爹譬§茹艘篓鹞誉毪鸟墨鬟爹TT§驾》:嘲GTccTTcTTAGcGTcGTcAGcTGAccccACTCTTGCCCTCAGGTAC

Primer3:

5’

羧瀚落翰泓警哟辆群端嗵獭避蝴《鳓鹾鬻嗡饼渗懿满蹲簪Ic蕊凌TTcAAGATACCTATAGAG

Pfimer4:5’CTCGAGATCCAGCTCCACACAGCTCTG

Primerl中,CATATG为NdeI的酶切位点;

Primer2中,骖TTCTTTGCATCGTCCT凰辱阐为部分Linker序列。Primer3中,

⋯h⋯⋯⋯一⋯’”{ ‘7⋯⋯⋯一:一:F”’≈⋯/ _⋯’v卅一一,”⋯⋯⋯v,⋯⋯⋯4∽⋯一7 %7,,⋯“删”节々≈辨%%i穆 .

霾磊GeeAAAAAGGAe{融TGeA灸AGA戮穗(;ACGA芏GC 为.CAAGAAGGACGGQ'AGq{⋯.,i,£r,,, ^,’ ,,⋯÷4,,t ,7~Ⅳ 。,,滋

Linker序列;

Primer4中,CTCGAG为XhoI的酶切位点。

工具酶

限制性内切酶:Promega公司。

T4 DNA连接酶:美国Gibco BRL公司。

Taq DNA聚合酶:美国Gibco BRL公司

试剂盒

Wizard PCR Preps DNAPurification System:Promega公司。

小量质粒抽提纯化试剂盒及胶回收试剂盒:上海华舜生物工程公司。

RT-PCR试剂盒购自Invitrogen公司。

细菌培养及其它试剂

胰蛋白胨,酵母提取物,琼脂粉为英国OXOID公司产品;

琼脂糖及其他相关试剂购自实生公司;

淋巴细胞分离液:鼎国生物技术发展公司产品;

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

Trizol reagent,购自美国Invitrogen公司。

主要仪器设备

PCR仪:Eppendorf公司。

复同FR.980生物电泳图像分析系统:上海复日生物实验技术研制所。

UV-2401PC紫外分光光度计:SHIMADZU。

SDS.PAGE:Amersham Pharmacia(mini Hoefer)

Akta Explore:Amersham Pharmacia

细菌培养摇床:上海离心机械研究所产品。

(二)方法

外周血淋巴细胞(PBL)的分离及mRNA抽提

一 无菌采集静脉血,注入含有肝素20U/mL的无菌15mL离心管中,轻轻混匀。

- 在超净工作台中用无菌吸管加入等体积PBS溶液,使血液稀释以提高分离效

果。

一取15mL离心管,每管加入6mL室温的100%淋巴细胞分离液。然后倾斜离

心管,沿管壁缓慢加入稀释后的抗凝外周血6mL/管。动作轻柔,以防破坏

界面。 .

-20"C,8009离心30min。将刹车关闭,自然降速。管内分为三层,从上至下

依次为血浆层、细胞分层液、红细胞及粒细胞层。血浆层与细胞分层液交界

处毛玻璃样的白色层即为淋巴及单核细胞层。

- 用吸管轻轻插入毛玻璃样层,缓慢吸出外周血单个核细胞,放入另一15mL

离心管中。

_将吸出的离心管中细胞加入PBS稀释后离心,2009,离心5min,共洗2遍。

取l×107细胞,2009离心10min,弃上清。抽提步骤按照Trizol试剂盒说明

进行。

CD3£6融合蛋白基因的构建

一分别以外周血单个核细胞的mRNA为模板,引物l,2及引物3,4反转录

PCR扩增得到CD3e及6基因,同时引入Linker序列和酶切位点:

反应体系总量为50m:

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第二军医大学博士学位论文

1 O X One—step PCR buffer 5ul

25mM MgCl2 10ul,

l0mM dNTP Mixture 5ul,

10uM的上下游引物各lul,

RNase Inhibitor(40u/u1)1 ul,

AMV-Optimized Taq(5U/u1)l ul,

总RNA模板2ul,

RNase free dH20 25ul,

在DEPC处理过的PCR-eppendorf管(TaKaRa Biocatalog)qb进行反应。

反应条件为:

逆转录步骤50℃,30m;

在首次循环前模板预变性95*(2,15m;

变性95℃,40s;

退火54℃,40s;

延伸72℃,75s;

共反应30个循环,在术次循环后,样品仍需72℃继续延伸10min以补平末

端,4℃保存。

·2%琼脂糖凝胶电泳分析,回收目的片段:

将目的条带从琼脂糖中切下(尽量薄),置于lml离心管中

加入500ul溶解液,置于50℃水浴中,至琼脂块完全融化

将溶液移入吸附柱中,10000rpm离心lmin

加入500ul清洗液,10000rpm离心lmin

重复上步

将吸附柱放入新的lml离心管中,加入50ul洗脱液,静止lmin后离心lmin

_ 以扩增获得的CD3e及6链为模板,引物1,4 overlapping PCR扩增得到

CD3e5融合基因。

PCR采用热启动在冰上将下列物质加于0.2ml Eppendorf管中。

反应体系总量为50山:

10×PCR bufier 5ul

dNTP lul

.12.

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

引物sense 5ul

引物antisense 5ul

Taq DNA聚合酶1ul

模板各lul

ddH20 33ul

反应条件为:

94℃5min

94℃40sec

55℃ lmin

共反应30个循环,在末次循环后,样品仍需72。C继续延伸10min以补平末

端,4。C保存。

_2%琼脂糖凝胶电泳分析,回收目的片段:同前

_CD3£6融合蛋白的表达及纯化

感受态细菌的制备

挑取TG.1单菌落于5 ml LB培养基,37℃振荡培养过夜;

按1:100将上步菌液接种到LB液体培养基,37。C振荡培养约3 h,OD值

为0.3.0.6时停止培养;

菌液加入1.5 ml Eppendorf管,1.5 ml/管,离心,1000rpm,1min,弃上清;

加入冰预冷的100 mM CaCl2溶液,200 gl/管,冰浴30 min;

离心1000 rpm,lmin,弃上清,加入冰预冷的100 mM CaCl2溶液,100 lxl/

管;

冰浴1 h以上,备用。

克隆载体构建

分别取DNA回收试剂盒回收CD3£6片段3.0ul、线性化pGEM.T 1.0ul,2x

连接缓冲液5.0 ulT4 DNA连接酶1.0ul。

J6℃连接过仅。

Eppendorf管,加入DNA连接物2 ul、感受态细菌100 ul,冰浴1 h;

42℃热休克3 min,冰浴2 rain:

加液体LB培养基200 ul,37℃振荡培养45 min;

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第二军医大学博士学位论文

取100 ul涂布于含100 ug/ml氨苄青霉素的LB固体培养基;

37℃倒置培养过夜。

重组质粒的提取

挑取数个转化的单菌落,每个菌落分别接种于5ml含50ug/ml的抗生素LB

培养基,37℃振荡培养过夜;

离心收获细菌,10000rpm,lmim

质粒提取试剂盒提取质粒;

重组质粒的酶切鉴定

取Ependorf管,依次加入约5 ul 10x酶切缓冲液、2 ug质粒、l ul酶l、两

种限制性内切酶各l ul,以灭菌去离子水补充至50¨l;

37℃,酶切反应lh;

1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

阳性克隆送上海英俊生物有限公司进行序列测定

一表达载体的构建

将测序正确的质粒用及pET22载体分别用NdeI及XhoI双酶切

1.5%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带

将目的片段连入表达载体:

反应体系:

胶回收目的片段3ul

线性化pET22b+lul

2x bu髓r 5ul

T4连接酶lul

Final volume 1 0ul

16℃连接过夜

转化表达菌株大肠杆菌BL2 1

酶切鉴定正确后转化感受态BL21宿主菌,1PTG诱导表达,超声碎菌后,

Western blotting鉴定。

鉴定J下确的工程菌大量诱导表达,经镍柱亲和层析,分子筛等层析步骤获

得纯度大于90%的CD3£6融合蛋白。

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学厦其体内药物动力学-茹效学研克

(三)结果

cD3曲基因的构建

采用引物1、2,反转录PCR获得CD38链基因。并在cD3e基因5’端引入

Ndel的酶切位点。在3’端引入Linker序列.

以下为cD3s链序列,网为起始密码子。CATATGGGTTCTGGCACAGATGGTAATGAAGm风GTGGTATTACACAGACACCATATAAAGTCTCCATCTCTGGAACCACAGTAATATTGACATGCCCTCAGTATCCTGGA

TCTGAAATACTATGGCAACACAATGATAAAAACATAGGCGGTGATGAGGATGATAAA

AACATAGGCAGTGATGAGGATCACCTGTCACTGAAGGAATTTTCAGAATTGGAGCAA

AGTGGTTATTATGTCTGCTACCCCAGAGGAAGCAAACCAGAAGATGCGAACTTTTAT

CTCTACCTGAGGGCAAGAGTGGGGTCAGCTGACGACGCTAAGAAGGAI:SCAGCCAAA

jA∈:A:GA:G?AAj:jA置:

采用引物3、4,反转录PCR获得CD38链基因(22-101 AA),并在CD35

基因5’端引入Linker序列。在3’端引入Xhol的酶切位点.

以下为CD38链序列

e:^:C:AiiAjG:A:0二=:C融?lo^^o‘弘r1:,j 110CCAA0^■:=j:G:’≈::?TCAAG

ATACCTATAGAGGAACTTGAGGACAGAGTGTTTGTGAATTGCAATACCAGCATCACA

TGGGTAGAGGGAACGGTGGGAACACTGCTCTCAGACATTACAAGACTGGACCTGGGA

AAACGCATCCTGGACCCACGAGGAATATATAGGTGTAATGGGACAGATATATACAAG

GACAAAG。AATCTACCGTGCAAGTTCATTATCGAATGTGCCAGAGCTGTGTGGAGCTG

GATCTCGAG

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全长序列

CATATGGGTTCTGGCACAGATGGTAATGAAGAA匝事GTGGTATTACACAGACACCA

TATA酏GTCTCCATCTCTGGAACCACAGTAATATTGACATGCCCTCAGTATCCTGGA

TCTGAAATACTATGGCAACACAATGATAAAAACATAGGCGGTGATGAGGATGATAAA

AACATAGGCAGTGATGAGGATCACCTGTCACTGAAGGAATTTTCAGAATTGGAGCAA

AGTGGTTATTATGTCTGCTACCCCAGAGGAAGCAAACCAGAAGATGCGAACTTTTAT

CTCTACCTCAGGGCAAGAGTGGGGTCAGCTGACGACGCTAAGAAGGA卜一:, 一’“

一|I i—AT二|I j。|-‘_=。

r.、。。÷÷一? j一 [TCAAGATACCTATA

GAGGAACTTGAGGACAGAGTGTTTGTGAATTGCAATACCAGCATCACATGGGTAGAG

GGAACGGTGGGAACACTGCTCTCAGACATTACAAGACTGGACCTGGGAAAACGCATC

CTGGACCCACGAGGAATATATAGGTGTAATGGGACAGATATATACAAGGACAAAGAA

TCTACCGTGCAAGTTCATTATCGAATGTGCCAGAGCTGTGTGGAGCTGGATCTCGAG

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.17.

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表达载体pET22

17MorTj越《

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Mu{uple e;onl‘礓sI£蹬

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测序正确的质粒及pET22载体分别用NdeI及XhoI双酶切后,将目的片段

连接入线性化的载体,构建成表达载体pET22b(+)一CD3e5。

19.

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Wcstcmblotting及SDS-PAGE鉴定结果

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二、ELISA法测定人血清中hul2F6m抗体浓度方法的

建立

(一)检测原理:

人CD3£6包被于酶标板,可以俘获待检样品中的抗CD3单克隆抗体,加入

HRP标记的抗人IgG抗体,可与俘获的CD3单克隆抗体特异结合。再加入HRP

底物后,显色反应与俘获的抗CD3单克隆抗体成正相关,因此可用于检测样品

中抗CD3单克隆抗体Hul2F6m的含量。

(二)材料和试剂:

一人CD3£6,抗体药物国家工程研究中心;

-HRP标记的抗人IgG多抗;

一重组抗CD3人源化单克隆抗体hul2F6m;

-牛血清白蛋白,上海生工生物工程技术有限公司;

●磷酸盐缓冲液PBS,pH=7.2;

-洗涤液:含0.1%Tween20的PBS,pH=7.2;

-HRP底物TMB:分A、B液,用前等体积混合,避光放置;

■终止液:2N H2S04:

■酶标板:NUNC。

(三)检测方法:

一CD3£6稀释至lp,g/ml,包被酶标板,1009l/孔,37。C2小时或4"C过夜;

一 弃去孔中液体,在吸水纸上拍干,用洗涤液沈板3次,每次均在吸水纸上拍

干:

一3%牛血清白蛋白(PBS溶解),封闭酶标板,加满孔(约3509l/孑L),37*(22

小时或4。C过夜;

一 弃去孔中液体,在吸水纸上拍干,用洗涤液洗板3次,每次均在吸水纸上拍

干;

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·稀释抗CD3人源化单克隆抗体标准品,至500ng/ml,并2倍比序列稀释,

12个浓度梯度,至终浓度为0.24ng/ml;

· 适当稀释待检测样品至终浓度为20ng/ml左右;

一将稀释好的标准品序列及待检测样品加入酶标板,l001.tl/.孑L,并设置复孔,

37℃2小时;

●弃去孔中液体,在吸水纸上拍干,用洗涤液沈板3次,每次均在吸水纸上拍

干;

●HRP标记的抗人IgG多抗,用PBS按1:1000稀释后,加入酶标板,100I.tl/

孔, 37℃45分钟;

一 弃去孔中液体,在吸水纸上拍干,用洗涤液洗板3次,每次均在吸水纸上拍

干;

●加入新鲜配制的HRP底物TMB,looI_tl/:fL, 室温避光反应5.10分钟;

_加入终止液,100山/孔;

_ 酶标仪读取吸光值,检测波长450nm,参比波长630nm。

(四)结果分析:

以标准品浓度为横坐标(对数刻度),吸光值为纵坐标拟合标准曲线,采用

四参数Logistic回归,方程形式为

Y=(Al_A2)/n+(x/xo)’j+/12

上式中A1(最大吸光值):为S一形曲线最大值。A2(最小吸光值):S一形曲

线最小值。X0(50%响应值的对应的浓度):即S一形曲线中点。P(斜率):吸光

值(OD)随抗CD3人源化单克隆抗体浓度变化的变化率。用被测定未知样品同时

设置的标准曲线,计算样品中抗CD3人源化单克隆抗体的浓度,经稀释倍数校正

后求得样品中的浓度。

(五)结果

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1、 典型结果

表1.1 ELISA法测定抗CD3人源化单克隆抗体标准曲线举例

浓度(I_tg/m1)吸光值

孔1 孔2 均数

500 0.869 0.84 1 0.855

250 0.855 0.832 0.844

125 0.838 0.828 0.833

62.5 0.798 0.808 0.803

3 1.25 0.759 0.738 0.749

15.63 0.589 0.612 0.601

7.8 1 0.438 0.457 0.448

3.9 l 0.263 0.304 0.284

1.95 0.169 O.154 0.162

0.98 0.132 0.138 0.135

0.49 0.113 0.126 O.120

0.24 0.114 0.111 0.113

oo

Concentration(ng/m1)

图1.1 ELISA法测定hul2F6m标准曲线

.23.

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Dose Response Analysis for Datal—B:

Model:Logistic

Parameter Value Error

Chi^2 9.98085E.5

Initial(A1)O.1 041 5 0.00709

Final(A2)O.85264 0.00637

EC50 (x0) 9.1 1909 0.29716

Power(p)1.4153 0.06057

2、 方法学验证

标准曲线各参数的稳定性:

不同日间的5次试验,分别验证了同间标准曲线各参数的稳定性。

表1.2标准曲线各参数的比较

实验号 Initial(A I) Final(A2) IC50(x0)Power(p)

X士SD 0.1 1 3+0.007 0.905+0.05 1 8.885+0.253 1.479士0.039

RSD% 5.766 5.671 2.853 2.627

.24.

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oo

图1.2标准曲线的稳定性比较

方法的回收率:

按照制备标准曲线的方法制成正常人血清内含l、10和100ng.mL。1(低、中和高)

三个浓度的重组抗CD3人源化单克隆抗体Hul2F6m的质控(QC)样品,并按上述

方法进行测定,重复5次(2复孔),由同时测定的标准曲线回归方程计算出的浓度

为hul2F6m的检出量。

表1.3 hul2F6m浓度检测方法回收率测定结果分析

加入量 竺竺兰!竺竺!: 一X士sD RsD%

(rig.mL‘1)TEST 1 TEST2 TEST3 TEST4 TEST5

1 1.OO 1.04 1.03 1.00 1.03 1.02+0.019 1.83

1 0 9.94 9.66 l 0.33 1 0.22 l O.32 l 0.09-a:0.289 2.87

100 99.43 97.66 103.22 99.62 98.80 99.75+2.088 2.09

方法的特异性:

按照制备标准曲线的方法制成10ng.mLJ的hul2F6m,并使其中分别含有50%

(V/V)的人血清、食蟹猴血清及小鼠(Balb/c)血清,按同样的方法进行测定,重

复2次,由标准曲线回归方程计算出的浓度为Hul2F6m的检出量。

选用丙种球蛋白、抗CD25单克隆抗体等进行交叉反应试验。按同样的方法进行

测定,设鼍2复孔,由标准曲线回归方程计算出的浓度为hul2F6m的检出量。

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实验结果表明不同种属动物血清、或10ng·mL。丙种球蛋白、抗CD25人源化单

克隆抗体对测定的回收率和准确度无明显影响。

表1.4 hul2F6m浓度检测方法特异性测定结果分析

干扰物加 入 量竺竺兰!!兰竺!! 一X士sD RSD%

(ng.mLl)TESTl TEST2

人血清 9.95 1 0.03 9.99+0.057 0.57

鼠血清 9.83 10.28 10.06-4-0.318 3.16

猴血清 1 0 9.84 9.95 9.90-a:0.078 0.79

丙种球蛋白 10.06 10.05 10.06+0.007 0.07

抗CD25单抗 10.06 lO.15 10.11+0.064 0.63

iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii

方法的精密度:

按照制备校正曲线的方法制成低、中、高三个浓度的hul2F6m,并按同样的方法

进行测定,由标准曲线回归方程计算出的浓度为hul2F6m的检出量。

曲线内差异:同一标准曲线,同一样品,测定5复孔。

曲线间差异:同一样品,不同标准曲线,测定5次。

表1.5 hul2F6m浓度检测方法精密度测定结果分析

⋯ 板g,j误差(n=5) 板l’uJ误差(n=5):玎【1,—J\、。量——, .1、 检出量(ng·mL。1) 检出量(ng·mL。)(ng。mL 1) RSD(%) RSD(%)

X士SD X士SD

l 1.0 1+0.064 6.32 1.00+0.062 6.1 5

10 9.97+0.302 3.03 10.21+0.424 4.16

100 99.38+6.052 6.09 102.33士3.725 3.64

上述结果表明:ELISA法测定hui2F6m,在浓度l-100ng.mLJ范围内,测定的。

标准曲线标准曲线内重现性良好,相对标准偏差波动在3.03.6.32%之间。

方法的灵敏度:

按照制备标准曲线的方法制成浓度为lng.mL。1的hul2F6m单克隆抗体,并按同

样的方法进行测定,重复5次,用同时测定的标准曲线回归方程计算出的浓度为

.26.

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

hul2F6m的检出量。

最低定量限定义为平均回收率大于70%的最低要求,而且CV(%)小于20%的

浓度。lng·mL。1已可以满足临床前药物代谢动力学浓度检测的需要,同时符合最低定

量限的定义,故将lng·mL。定为该法检测的最低定量限。

表1.6 hul2F6m浓度检测方法灵敏度测定结果分析

加入量 检出量 一RSD 回收率

.11-1)(ng-ml"i) x士SD(ngml (%) (%)· (%) (%)

0.97

1.04

1 1.0l 1.014-0.027 2.66 101.4

1.03

1.02

宣iiiii宣iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii

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第二军医大学博士学位论文

第二部分Hu 12F6m体外药效学研究

一、 研究目的

通过比较研究重组抗CD3人源化单克隆抗体(recombinant humanized—anti-C—D3monoclonal antibody,rh anti—CD3 mab,hul2F6m)、OKT3与靶抗原CD3结合的特异

性及亲和力,与膜CD3抗原部分阳性的人外周血单个核细胞(peripheral PBMC)结

合后产生的效应(T淋巴细胞增殖效应、CD3抗原的调变和对混合淋巴细胞反应的影

响)以及Fc段的亲和力,诱导PBMC分泌细胞因子的效应等,评价hul2F6m的体

外药效学及可能的副作用。

二、实验设计

OKT3对预防和治疗器官移植免疫排斥反应有良好的效果,因此成为第一个被美

国FDA批准投放市场的单克隆抗体。1986年,OKT3被批准用于治疗类固醇无效的

急性移植肾排斥反应,1993年又被FDA批准用于逆转心脏移植和肝移植排斥反应。

但OKT3在临床上的广泛使用却受到了两个因素的制约,即HAMA和CRS。通过对

抗人CD3单克隆抗体的人源化改造及恒定区的部分氨基酸突变,旨在完好保留抗

CD3单克隆抗体特异性和亲和力的同时,减少抗CD3单克隆抗体的副作用。我们通

过下列研究,比较了hul2F6m、0KT3与靶抗原CD3结合的特异性及亲和力,与膜

CD3抗原部分阳性的人外周血单个核细胞(PBMC)结合后产生的效应(T淋巴细胞

增殖效应、CD3抗原的调变和对混合淋巴细胞反应的影响)以及Fc段的亲和力,诱

导PBMC分泌细胞因子的效应等。根据文献,OKT3单抗除与人、黑猩猩的CD3抗

原结合外,不和其它任何种属来源的抗原结合,因此我们无法选用体内动物模型验证

该抗体的疗效。根据该产品的作用机理,设计了以下的一系列体外实验:

hul2F6m中Fab部分效应研究:

。hul2F6m与PBMC表面CD3的相对亲和力;

hul2F6m对PBMC表面CD3的抗原调变作用;

hul2F6m对混合淋巴细胞反应的抑制作用。

hul2F6m中Fc部分效应研究:

hul2F6m中Fc段与细胞表面Fc受体(&Receptor,FcR)的相对亲和力;

.2R.

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hul2F6m诱导的PBMC的增殖效应;

hul2F6m诱导PBMC分泌细胞因子的效应。

三、实验结果

(一)hul2F6m中Fab部分效应研究

1、hul2F6m与PBMC表面CD3的相对亲和力

(1)原理

人外周血单个核部分细胞(T淋巴细胞)膜表面表达CD3,抗CD3单克隆抗体

可与其结合。荧光标记抗体与细胞结合的量效曲线应为“S”形,即随着标记抗体浓度

的增加,荧光强度也逐渐增加,直至达到饱和;此时的EC50可代表该抗体与CD3的

结合活性,在靶细胞相同的情况下,EC50值越小,抗体与CD3的亲和力就越强,即

抗体的活性越好。若存在未标记抗体对标记抗体的竞争,在荧光标记抗体浓度固定(结

合曲线的亚饱和点)的条件下,随着加入的未标记抗体浓度的增加,细胞结合的荧光

标记抗体量逐渐减少,因此量效曲线呈反“S”形或“乙”字形;在靶细胞和标记抗体相

同的条件下,EC50值越小,则说明加入的未标记抗体与标记抗体竞争的能力越强,与

CD3的亲和力越强,即抗体的活性越好。重组抗CD3人源化单克隆抗体与OKT3在

相同条件下,与相同的荧光标记抗体竞争结合,比较其EC50值,通过已知的OKT3

鼠源单抗的亲和常数,可以通过计算获得重组抗CD3人源化单克隆抗体的亲和常数。

(2)材料和方法

实验材料

_ 台式离心机Eppendorf公司产品

- 生物安全柜 台湾造鑫公司产品

一细胞培养箱美国Revco,Asheville,N,C产品

- 流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司FACScan。

_培养瓶、离心管、移液管、移液器、无菌吸嘴

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箜三兰垦查堂堡主兰堡垒查一 细胞培养试剂小牛血清为杭州四季青生物工程研究所产品;RPMI.1640培养基

和DMEM培养基为GIBCO公司产品。

-磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)及含l%小牛血清的PBS(PBSS)。

一 检测细胞:活化的人PBMC,健康志愿者外周肝素抗凝血,经淋巴细胞分离液分

离,PHA(599/m1)及IL-2(100U/m1)刺激活化后获得。

● 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的hul2F6m,本室透析法标记获得。

实验方法

_OKT3单抗,用PBSS稀释至20099/ml,注意每次稀释倍数不超过10倍,NA.等

体积299/ml的FITC-hul2F6m(PBSS稀释)。

_hul2F6m用PBSS稀释至20099/ml,注意每次稀释倍数不超过10倍,加入等体

积299/ml的FITC—hul2F6m(PBSS稀释)。

_然后分别在离心管中用lgg/ml的FITC—hul2F6m(PBSS稀释)连续2倍比稀释

OKT3或hul2F6m的稀释液,此时形成了一系列含有lgg/ml的FITC.hul2F6m

的未标记OKT3及hul2F6m的梯度稀释液。

· 取新鲜分离获得并经PHA及IL.2刺激活化的PBMC,计数,加入PBSS调整细

胞密度至2x106/ml,然后将细胞悬液分至流式专用管中,O.1ml/管。

●2009离心5分钟弃上清。

一将OKT3及hul2F6m的序列稀释液加入上步流式管中,0.1ml/管,每一浓度设2

复管,PBSS为空白对照,加入11.tg/ml FITC-hul2F6m的细胞悬液为阴性对照,

加入lpg/ml FITC标记的同型抗体为阳性对照,而后每管加入5山PE.CD5。冰浴

避光45分钟。

_PBSS洗涤细胞两次,2009离心5分钟,重悬于3009L PBSS中。

_ 上机检测,PE.CD5阳性细胞圈门,分析选中细胞FITC荧光强度,计算荧光强度

的几何均数。

(3)结果

采用分析软件Origin6.0拟合标准曲线:横坐标为OKT3或hul2F6m的浓度,纵

坐标为FITC荧光强度几何均数的平均数,曲线为反“S”形,因此选用4参数方程

回归模型。

该软件给出的回归方程为:

.30-

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y_-(.4--n)/ll+(x/oDi-t-B

根据该方程,X=+∞时,Y=B,即最高限;当X=0时,Y=A,即最低限;而当

X=C时,Y=(A+B)/2,即半数有效。因此C的数值即为半数有效浓度(EC50)。

比活性(%)=参比品EC50(gg/mL)

待测品EC50(gg/mL)×100

我们用PBMC分别检测了OKT3及hul2F6m与荧光标记OKT3竞争细胞表面

CD3的能力,并重复了3次,3次的结果列于下表,经配对student.f检验,hul2F6m

的相对亲和力(与FITC.OKT3竞争结合PBMC表面CD3的EC50值)与OKT3没有

显著差别(p=0.9358),故认为二者的亲和力基本一致。

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表2.1 hul2F6m与OKT3相对亲和力测定结果总结

实验次数EC50(rtg/m1) 相对亲和力(%)

OKT3 hul2F6m

1 11.83

2 12.22

3 11.32

i±SD 11.794-0.45

11.2l

12.10

11.96

11.76±0.48

105.5

101.0

94.6

100.3

注:帕刈’来和力为OKT3竞争结合实验EC50值对hul2F6m的自分比。

表2.2 hul2F6m与OKT3相对亲和力测定结果举例

![III蔓曼曼曼曼曼曼曼!!!曼曼!曼曼曼!曼曼!!!!曼!!曼曼曼曼曼曼!!曼曼曼!曼曼曼曼!曼曼曼!!曼曼!!曼曼曼曼曼曼曼!!!!皇曼曼曼!!鼍

浓度荧光强度几何均数

(p,g/m1)OKT3 hul2F6m

复孔1 复孔2 均数 复孔1 复孔2 均数

500.OO 3.76

250.00 4.27

125.00 5.32

62.50 6.89

31.25 9.96

15.63 12.24

7.8l 16.14

3.9l 17。61

1.95 20.24

O.98 21.41

0.49 22.6l

0.24 23.00

O.12 24.41

O.06 23.59

PC 2.94

NC 28.62

.32-

3.90

4.46

5.35

7.22

9.57

12.25

15.37

17.60

20.52

22.09

24.03

24.10

23.56

24.19

3.02

3.83

4.37

5.34

7.06

9.77

12.25

15.76

17.6l

20.38

21.75

23.32

23.55

23.99

23.89

2.98

3.75

4.04

4.94

6.55

8.87

11.86

16.09

20.59

23.05

23.43

24.88

25.64

25.80

25.68

2.94

3.72

4.16

4.87

6.55

9.24

12.68

17.03

20.84

22.78

24.59

25.1l

24.38

25.95

25.30

3.02

3.74

4.10

4.91

6.55

9.06

12.27

16.56

20.72

22.92

24.01

25.00

25.01

25.88

25.49

2.98

26.35 27.49 28.62 26.35 27.49

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Concentration(ug.mL。’)

图2.1:hul2F6m与OKT3相对亲和力测定量效曲线

经计算,该次试验0KT3的回归方程为:

Y=(24.44426—2.683 15)/【I+(X/11.83387)o‘80705】+2.68315

hul2F6m的回归方程为:

Y=(25.64571—3.46298)/【I+(X/11.21306)1.1017]+3.46298

根据文献报道【11,OKT3的亲和常数(如)为1.2X 109M~,即相当于Kd为0.83 nM。

根据文献121报道的计算方法,我们以OKT3为参比品,计算出受试的重组抗CD3人

源化单克隆抗体的亲和常数,公式为:

【X】-[R】=(1/Kx)一(1/KR)

其中,[X】为受试品的竞争抑制曲线的EC50浓度,【R】为同等条件下参比品的

EC50浓度;Kx为受试品的亲和常数,‰则为已知的参比品亲和常数。

在本试验中,受试品EC50浓度平均值为11.761.tg/mL,参比品OKT3的EC50浓度平

均值为11.79Bg/mL,两者之差直为0.031.tg/mL,按该单克隆抗体的分子量150kDa计

算,相当于0.20nM;因此,根据上述试验,受试品抗体中心研制的重组抗CD3人源

化单克隆抗体与外周血单个核细胞表达的CD3抗原的亲和常数Kd约为1.03nM,即

’Michael S.Cole,Claudio Anasetti,and J.Yun Tso.Human lgG2 Variants ofChimeric Nonmitogenic to T Cells.J

Immunoi.1997.159:361 3-362I.2

Berzofsky JA and Berkower IJ.1984.Fundamental Immunology.In Paul WE ed.Raven New York,PP.595-644

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心约为0.96×109M~,可认为两者的抗原亲和力基本相同。

(4)讨论

hul2F6m与FITC.OKT3竞争结合PBMC表面CD3的实验结果表明,hul2F6m

与美国Otho公司上市产品OKT3具有相近的亲和力,即经人源化改造后的抗CD3单

克隆抗体完好保存了与CD3抗原结合的特异性和亲和力。

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2、hul2F6m对PBMC表面CD3的抗原调变作用

(1)原理

OKT3发挥免疫抑制作用的重要机制为具有调节靶细胞表面CD3分子的能力。

将抗CD3单克隆抗体进行人源化改造后是否仍保留了原抗体调变CD3分子的能力,

将直接关系到人源化单抗药效的发挥,因此我们必须检测hul2F6m对CD3的抗原调

变作用。

OKT3或hul2F6m对CD3发生抗原调变作用后,靶细胞表面CD3荧光染色的强

度会下降。通过检测OKT3或hul2F6m作用前后靶细胞表面CD3荧光染色强度的变

化,可反应出抗体对CD3的抗原调变作用。

(2)材料和方法

实验材料

一淋巴细胞分离液。

一肝素。

一细胞培养试剂,小牛血清,杭州四季青生物工程研究所产品;RPMll640培养基,

GIBCO公司产品。

一磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)及含1%小牛血清的PBS(PBSS)。

一hul2F6m,抗体中心研制。

_OKT3单抗:购自美国Ortho Biotech公司。

一健康志愿者新鲜外周静脉血。

实验方法

一取肝素抗凝静脉血5~10ml,用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离PBMC,经

无血清的RPMI一1640洗涤3次,2009×5min。

一计数,并用含20%NCS的RPMI.1640完全培养液调整细胞密度至1.0X 106/ml,

加入96孔细胞培养板中,lOOpl/孑L。

一用含20%NCS的RPMI-1640完全培养液将OKT3及hul2F6m分别稀释至299/ml,

并10倍比序列稀释,至2x 10一ng/ml。

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·于96孔细胞培养板中各孔加入上述序列稀释的OKT3及hul2F6m培养液各

1001xl,设置3复孔,阴性对照孔加入1001.tl含20%NCS的RPMI.1640培养液,

每个样本设3个复孔,后续测定结果取平均值。

一 用上述不同稀释度的抗体与人PBMC相混合后37。C温a育24h,收获细胞洗涤后按

以下方法染色。

一Da:加入FITC conjugated goat anti—human(or mouse)IgG(H+L)于40C孵育45min。

·Db:相应的分别加入过量的OKT3或hul2F6m纯化抗体(101.tg/m1)T"4℃孵育

45min,用2%FCS—PBS洗涤细胞2遍,再加入FITC.goat anti.human(or mouse)

IgG(H+L)于4"C孵育45min。

一 以上各组样品染色结束后,用2%FCS.PBS洗涤细胞2遍,流式细胞仪检测并计

算细胞荧光强度。

(3)结果

CD3调变%=Control cells MCDb———mAb-treated cells MCDb

Control cells MCDb—control cells MCDa×100%

以上公式中,MC代表细胞平均荧光强度(mean channel fluorescence ofstained cells),

其中的Da和Db分别表示细胞染色的方法。Control cells表示未经抗体处理的PBMC。

表2.3 hul2F6m与OKT3对CD3抗原调变结果汇总表

浓度 !兰!竺竺兰竺!兰: 均数 竺!三三!竺竺竺兰竺!兰: 均数(ng/m1)孑L 1 孑L 2 孑L 3 孑L 1 孑L 2 孑L 3

1000 95 89 92 92.0 87 93 96 92.0

100 84 76 88 82.7 85 80 79 81.3

10 79 70 73 74.0 72 68 77 72.3

1 .52 ,46 .55 51.0 54 57 48 53.0

0.1 37 28 33 32.7 25 34 29 29.3

—36.

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Concentration(ng.mL。’)

图2.2 hul2F6m与OKT3对CD3抗原调变结果量效曲线

结果显示,hul2F6m与OKT3具有相似的调变外周血单个核细胞表面CD3的能

力,二者相比无统计学意义差别(p-o.3862)。

(4)讨论

hul2F6m与OKT3均可诱导PBMC表面CD3分子调变,而且hul2F6m与美国

Othro公司上市产品OKT3诱导PBMC表面CD3发生抗原调变的效应相近,即经人

源化改造后的抗CD3单克隆抗体具有与OKT3相近的诱导靶抗原产生抗原调变的功

能。

3、hul2F6m对混合淋巴细胞反应的影响

(1)原理

混合淋巴细胞培养(Mixed Lymphocyte Culture,MLC)或称混合淋巴细胞反应

(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR)是来源于两个个体的淋巴细胞在体外混合培养

时,由于细胞表面HLA.II类抗原中的DR和DP抗原不同,可相互刺激对方淋巴细

胞转化(称为双向MLC),并产生多种淋巴因子,促进NK、CTL、LAK等杀伤细胞

活性。若将刺激的一方淋巴细胞先用丝裂霉素C(Mitomycine C)或放射线照射处理,

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使该细胞失去增殖能力,但仍保持刺激对方淋巴细胞增殖能力的试验称为单向MLC:

如不加上述处理,则双方互相刺激,称为双向MLC。MLC反应可通过3H.TdR掺入

率或形态学检测法以及MTT法检测反应细胞的增殖能力。在淋巴细胞相互刺激转化

的过程中,MHC.抗原与TCR的相互作用提供了T细胞活化的第一信号,若在反应

体系中加入抗CD3单抗,则可阻断TCR与CD3的信号传导,从而抑制MLR。

(2)材料和方法

实验材料

- 玻璃纤维滤膜及负压抽滤装置,闪烁液及液闪计数仪。

_ 台式离心机Eppendorf公司产品

_生物安全柜 台湾造鑫公司产品

_细胞培养箱美国Revco产品

- 流式细胞仪美国Becton Dickinson公司FACScan。

一培养瓶、离心管、移液管、移液器、无菌吸嘴。

-3H.TdR:中科院上海原子核研究所产品,比放射活性30Ci/mmol,放射性浓度

lmCi/mL。

-淋巴细胞分离液

■肝素

- 细胞培养试剂,小牛血清,杭州四季青生物工程研究所产品;RPMll640培养基,

GIBCO公司产品。

- 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)及含1%小牛血清的PBS(PBSS)。

●健康志愿者新鲜外周静脉血。

实验方法

-分别取两位健康志愿者(A、B)肝素抗凝静脉血10mL,淋巴细胞分层液密度梯

度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),无血清RPMll640洗涤3次,每次

1000rpm离心10min。

-计数,并用含20%FCS的RPMIl640完全培养液调整细胞浓度至2.0x105/mL。

_hul2F6m及OKT3,分别用含20%FCS的RPMIl640完全培养液稀释至

4000ng/mL;

·用含20%FCS的RPMll640完全培养液分别稀释hul2F6m及OKT3,至浓度为

.3R.

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20000、2000、200、20、2及0.2ng/mL(注意:样品在后续步骤中加入等体积的

细胞悬液中时还要稀释l倍,故终浓度分别为10000、1000、100、10、l及

0.1ng/mL)。

-B两个不同个体的淋巴细胞悬液,检测双向MLR,于96孔细胞培养板中各孔加

入两种细胞悬液各509L,最弱反应对照(min)N入同一个体的单个核细胞1009L。

-将hul2F6m及OKT3稀释液加入上述96孔细胞培养板,100pL/孑l,,最强反应对

照(max)孔(分别为含每组两种不同的淋巴细胞的孔)加入含20%FCS的

RPMll640完全培养液,1009L/孔,最弱反应对照也加入含20%FCS的RPMll640

完全培养液,1009L/孑L,设置3个复孔,37"(2,5%C02温箱培养6d。

● 终止培养前16h每孔加入0.5Ci 3H.TdR。

-用细胞收集器将细胞吸附在玻璃纤维滤纸片上,用生理盐水充分洗涤,洗去游离

的3H.TdR;将滤纸片烘干后,用镊子按其顺序分别依次放入盛有闪烁液的塑料

管内;D闪烁仪自动测定样品1min。

(3)结果

计算刺激指数(Stimulator Index,SI)-

SI=(加入样品混合淋巴细胞反应cpm均值一最弱反应对照管cpm均值)/(最强

反应对照管epm均值一最弱反应对照管epm均值)。

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第二军医大学博士学位论文

表2.4 hul2F6m与OKT3抑制MLR结果汇总表

hul2F6m OKT3

浓度(ng/m1)]雨i丽———————————1i而i—————————一SI(%) Sl(%)

掺入量(cpm) 掺入量(cpm)

|0A、 2766士424| 2766士424|’

/(B) 2810士225 / 2810士225 /

10000 4908士205 5.3-4-0.5 4513士307 4.3土0.8

1000 6866士388 10.2士1.0 6173-4-3lO 8.5土0.8

1 00 l 2663士336 24.7士0.8 ll 692士838 22.2+2.1

10 19807士1233 42.5+3.1 18074土570 38.2士1.4

1 34371士1429 78.8-+3.6 3 l 840士1406 72.5-4-3.5

0.1 4 1 569士903 96.8-4-2.3 39 1 99+1 603 90.9-a:4.0

最强对照42846士1838 100 42846士1838 100

零C

.Q七o△2△C.Q=盆t-

Concentration(ng.mL‘1)

图2.3 hul2F6m与OKT3抑制MLR结果量效曲线

..以上结果显示,hul2F6m及OKT3均可明显抑制MLR,且两者的抑制作用相似,

各浓度的抑制率均无统计学意义差别(p>O.05)。

..40..

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重组抗e1)3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

(4)讨论

hul2F6m与OKT3均可抑制MLR,而且hul2F6m与美国Otho公司上市产品OKT3

抑制MLR的效应相近,即经人源化改造后的抗CD3单克隆抗体具有与OKT3相近的

抑制MLR的功能。

.41-

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(二)hul2F6m中Fc部分效应研究

1、hul2F6m中Fc段与U937细胞表面FcR的相对亲和力

(1)原理

首剂效应(First dose effect)是CD3单抗临床应用中的一个突出问题,研究发现,

CRS主要是通过OKT3交联T细胞(通过抗体的F(ab’)2部分)和FcR细胞(通过抗

体的Fc段)导致两者均被激活而释放各种细胞因子引发的。抗体恒定区CH2的6i『部

(234到238位氨基酸)在抗体与Fc受体(FcRI与Fc对I)的结合中起重要作用。突

变分析证实如将人源抗体IgGl恒定区234和235位的Leu.Leu突变为Ala-Ala,将大

大减弱抗体Fc段与FcR细胞的结合,使CD3抗体对T细胞的激活作用明显下降,

这已在动物实验和临床实验中获得了证实。上海张江生物技术有限公司制备的

hul2F6m将恒定区中Leu-Leu突变为Ala.Ala,我们需要检测该突变是否显著降低了

Fc段与其受体结合的亲和力。

人白血病细胞系U937表面表达人FcRI,人IgGl与小鼠IgG2a以高亲和力与人

FcRI结合。荧光标记的小鼠IgG2a与U937结合的量效曲线应为“S”形,即随着标记

抗体浓度的增加,荧光强度也逐渐增加,直至达到饱和;若反应体系中存在未标记抗

体对标记抗体的竞争,在荧光标记抗体浓度固定(结合曲线的亚饱和点)的条件下,

随着加入的未标记抗体浓度的增加,细胞结合的荧光标记抗体量逐渐减少,因此量效

曲线呈反“S”形或“乙”字形;在靶细胞和标记抗体相同的条件下,EC50值越小,则说

明加入的未标记抗体与标记抗体竞争的能力越强,与FcRI的亲和力越强。

(2)材料和方法

实验材料

一 台式离心机Eppendorf公司产品

· 生物安全柜台湾造鑫公司产品

- 细胞培养箱美国Revco,Asheville,N,C产品

- 流式细胞仪美国Becton Dickinson公司FACScan。

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一培养瓶、离心管、移液管、移液器、无菌吸嘴

·细胞培养试剂小牛血清为杭州四季青生物工程研究所产品;RPMI.1640培养基

为GIBCO公司产品。

●磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)及含1%小牛血清的PBS(PBSS)。

·检测细胞:人白血病细胞系U937,我室保存,传代培养于含10小牛血清的

RPMI.1640培养基,培养基中加入500U/ml的人IFN—Y,可以提高U937细胞表

面FcRI的表达。

-异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠IgG2a同型对照,BD公司产品。

实验方法

_OKT3单抗,用PBSS稀释至20肛g/mL,注意每次稀释倍数不超过10倍,加入等

体积29tg/ml的FITC.IgG2a(PBSS稀释)。

_hul2F6m用PBSS稀释至20肛g/mL,注意每次稀释倍数不超过10倍,加入等体

积2I-tg/ml的FITC—IgG2a(PBSS稀释)。

_ 然后分别在离心管中用l¨g/ml的FITC—IgG2a(PBSS稀释)连续4倍比稀释OKT3

或hul2F6m的稀释液,共6个浓度梯度,此时形成了一系列含有lgtg/ml的

FITC.IgG2a的未标记OKT3及hul2F6m的梯度稀释液。

_取对数生长期U937细胞,计数,加入PBSS调整细胞密度至2x106/ml,然后将

细胞悬液分至流式专用管中,0.1ml/管。

-2009离心5分钟弃上清。

·将OKT3及hul2F6m的序列稀释液加入上步流式管中,O.1ml/管,每一浓度设2

复管,PBSS为空白对照(类似于最强竞争样品,即细胞表面无荧光分子),加入

llttg/ml FITC—IgG2a的细胞悬液为阴性对照(类似于最弱竞争样品),冰浴避光

45分钟。

一PBSS洗涤细胞两次,2009离心5分钟,重悬于3001.tLPBSS中。

一上机检测,计算荧光强度的几何均数。

(3)结果

计算竞争率(Inhibition proportion):

竞争率=(样品荧光强度一最弱竞争样品荧光强度)/(最强竞争样品荧光强度一最弱竞

争样品荧光强度)。

.43-

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表2.5 hul2F6m与OKT3竞争结合FcRI结果汇总表

浓度 !兰!兰竺兰!兰! 均数 竺!三!!竺兰兰兰!兰! 均数

(ng/m1)孑L 1 孑L 2 孑乙1 孑L 2

10000.0 11.7 13.4 12.6 87.2 83.4 85.3

2500.0 22.3 20.7 21.5 90.1 89.7 89.9

625.0 52.4 55.1 53.8 93.4 94.8 94.1

156.3 81.5 78.8 80.2 96.7 95.5 96.1

39.1 95.4 92.7 94.1 97.2 95.8 96.5

9.8 97.2 96.7 97.0 95.6 97.9 96.8

Concentration(ng.mL。)

图2.4 hul2F6m与OKT3竞争结合FcRI结果量效曲线(木p<0.05)

结果显示hul2F6m与小鼠IgG2a竞争结合FcRI的能力显著下降,较高的4个浓

度下的竞争率与OKT3相比均有统计学意义差别(p<0.05)。

(4)讨论

OKT3可明显与IgG2a竞争结合U937细胞表面FcRI,而hul2F6m与IgG2a竞争

结合U937细胞表面FcRI的能力显著下降,即经人源化改造及恒定区突变后的抗CD3

单克隆抗体与IgG2a竞争结合U937细胞表面FcRI的能力显著下降。

.44.

一零一co—co

cIoJQ

coIl—D—cc—

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2、hul2F6m诱导的PBMC的增殖效应

(1)原理

刺激淋巴细胞增殖的物质可分为两大类:①非特异性刺激物:如植物血凝素

(phytohemagglutinin,PHA)、刀豆蛋白A(concanavalinA,ConA)、美洲商陆(pokeweed

mitogen,PWM)、佛波酯(PMA)等促有丝分裂原;能产生A蛋白的葡萄球菌(SAC)、

EB病毒、链球菌溶血毒素S、细菌脂多糖(LPS)等微生物及其代谢产物;胃蛋白酶、

胰蛋白酶等蛋白物质;抗CD3、抗CD2、抗IgM等细胞表面标志的抗体以及某些淋

巴因子等;②特异性刺激物:主要是特异性抗原物质,包括各种可溶性抗原和细胞表

面抗原。淋巴细胞受特异性抗原或丝裂原刺激后,在转化为淋巴母细胞的过程中,

DNA的合成明显增加。且其转化程度与DNA的合成呈J下相关,此时若将合成DNA

的前体物质胸腺嘧啶核苷用放射性核素(3H.TdR)标记,加入到培养体系中,即被

转化的淋巴细胞摄取而掺入DNA分子内。培养终止后,测定淋巴细胞内掺入的

3H.TdR的放射量,就能判断淋巴细胞的转化程度。

首剂效应即患者在首次注射抗体不久后机体外周血中出现多种炎性细胞因子

(IL.2、TNF一0【、IFN.0【、IFN.Y及GM.CSF等),并由此产生应用OKT3时最常见的

细胞因子释放综合症(CRS),这些症状包括发热、寒颤、头痛、呕吐、腹泻等,在

某些严重情况下,还会诱发肺水肿、支气管痉挛甚至死亡。研究发现,CRS主要是

通过OKT3交联T细胞(通过抗体的F(ab’)2部分)和FcR细胞(通过抗体的Fc段)

导致两者均被激活而释放各种细胞因子引发的。突变分析证实将人源抗体IgGl恒定

区234和235位的Leucine.Leucine突变为Alanine-Alanine,可大大减弱抗体Fc段与

FcR细胞的结合,与FcRI亲和力的下降能否使CD3抗体交联激活T细胞的效应明显

下降,将直接影响CD3抗体的首剂效应。

(2)材料和方法

实验材料

●玻璃纤维滤膜及负压抽滤装置,闪烁液及液闪计数仪。

● 台式离心机Eppendorf公司产品。

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第二军医大学博士学位论文

一生物安全柜台湾造鑫公司产品。

-细胞培养箱美国Revco产品。

_培养瓶、离心管、移液管、移液器、无菌吸嘴。

一3H.TdR:中科院上海原子核研究所产品,比放射活性30Ci/mmol,放射性浓度

1 mCi/mL。

-淋巴细胞分离液。

●肝素。

_ 细胞培养试剂,小牛血清,杭州四季青生物工程研究所产品;RPMll640培养基,

GIBCO公司产品。。

一磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)及含l%小牛血清的PBS(PBSS)。

一hul2F6m,抗体中心研制。

●OKT3单抗:购自美国Ortho Biotech公司。

●健康志愿者新鲜外周静脉血。

实验方法

- 取肝素抗凝静脉血5~1 0ml,用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离PBMC,经

无血清的RPMI-1640洗涤3次,2009×5min。

_计数,并用含20%NCS的RPMI.1640完全培养液调整细胞密度至1.0X 106/ml。

-用含20%NCS的RPMI.1640完全培养液将OKT3及hul2F6m分别稀释至

2000ng/ml,并10倍比序列稀释,至2X 10。3n∥ml。

_于96孔细胞培养板中各孔加入上述序列稀释的OKT3及hul2F6m培养液各

1009l,设置3复孔,空白对照孔加入1009l含20%NCS的RPMI.1640培养液。

一每孔加入1009l上述PBMC细胞悬液,然后将96孔板加盖,置37。C,5%C02

细胞培养箱培养3天。

-每孔加入lgCi的3H.TdR,继续培养16小时,用细胞收集器将细胞吸附在玻璃

纤维滤纸上,用生理盐水充分洗涤,洗去游离的3H.TdR。

●滴加5%三氯醋酸1-2m!固定细胞,滴加无水乙醇脱水、脱色。

_将滤纸片烘干后,用镊子按其顺序分别依次放入盛有4ml闪烁液的塑料管内。

·p.闪烁仪自动测定样品lmin,取6份测定值的平均值。

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

(3)结果

计算OKT3、hul2F6m及阴性对照的cpm均值。

表2.6 hul2F6m与OKT3活化PBMC结果汇总表

浓度!兰!!:!竺 均值±竺(ng/m1)孑L 1 孑L 2 孑L 3 孑L 1 孔2 孑L 3

均值

1000 42317 44765 45617 44233 13 105 11583 11980 12223

100 47912 50168 48850 48977 6713 5586 6132 6144

10 46248 44915 45616 45593 3594 3116 3209 3306

l 42894 43520 4210l 42838 2519 2376 2401 2432

O.1 35128 31574 33169 33290 1985 2027 1856 1956

0.01 8852 8917 9125 8965 2104 1885 1927 1972

0.001 2102 1759 1813 1891 1971 2004 1867 1947

Concentration(ng.mL’1)

图2.5 hul2F6m与OKT3活化PBMC量效曲线(木p<0.05)

,●

结果显示hul2F6m刺激PBMC转化的效应显著下降,除最低浓度点外,与OKT3

相比均有统计学意义差别(p<0.05)。

.47-

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第二军医大学博士学位论文

(4)讨论

hul2F6m与OKT3相比,刺激PBMC转化的效应大大减弱,即恒定区突变的人

源化抗CD3单克隆抗体刺激淋巴细胞发生转化的功能与原鼠源性单抗相比显著降

低。因此,张江生物技术有限公司研制的人源化抗CD3单克隆抗体恒定区234和235

位的Leucine.Leucine突变为Alanine.Alanine,大大减弱抗体Fc段与FcR细胞的结合,

并使CD3抗体交联激活T细胞的效应明显下降,这提供了该CD3抗体首剂效应减低

的理论与实际依据。

3、hul2F6m诱导PBMC分泌细胞因子的效应

(1)原理

首剂效应即患者在首次注射抗体不久后机体外周血中出现多种炎性细胞因子

(IL.2、TNF.0c、IFN.0【、IFN一诹GM.CSF等),并由此产生应用OKT3时最常见的

细胞因子释放综合症(CRS),这些症状包括发热、寒颤、头痛、呕吐、腹泻等,在

某些严重情况下,还会诱发肺水肿、支气管痉挛甚至死亡。研究发现,CRS主要是

通过OKT3交联T细胞(通过抗体的F(ab’)2部分)和FcR细胞(通过抗体的Fc段)

导致两者均被激活而释放各种细胞因子引发的。突变分析证实将人源抗体IgGl恒定

区234和235位的Leucine.Leucine突变为Alanine.Alanine,可大大减弱抗体Fc段与

FcR细胞的结合,与FcRI亲和力的下降能否使CD3抗体对T细胞的激活并导致的炎

性细胞因子的分泌明显下降,将直接影响CD3抗体的首剂效应。

(2)实验材料

_ 台式离心机Eppendorf公司产品。

_ 生物安全柜 台湾造鑫公司产品。

曩细胞培养箱美国Revco产品。

_培养瓶、离心管、移液管、移液器、无菌吸嘴。

_淋巴细胞分离液。

■肝素。

-细胞培养试剂,小牛血清,杭州四季青生物工程研究所产品;RPMll640培养基,

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

GIBCO公司产品。

-磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)及含l%小牛血清的PBS(PBSS)。

●hul2F6m,抗体中心研制。

_ OKT3单抗:购自美国Ortho Biotech公司。

_TNF-0c ELISA检测试剂盒(R&D Systems);IL.10 ELISA检测试剂盒(Endogen,

Cambridge,MA);IFN一,、/ELISA检测试剂盒(Endogen,Cambridge,MA)。

-健康志愿者新鲜外周静脉血。

(3)实验方法

·取肝素抗凝静脉血5~10ml,用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离PBMC,经

无血清的RPMI.1640洗涤3次,2009X 5min。

-计数,并用含20%NCS的RPMI.1640完全培养液调整细胞密度至1.0×106/ml。

_ 用含20%NCS的RPMI.1640完全培养液将OKT3及hul2F6m分别稀释至

2000ng/ml,并lO倍比序列稀释,至0.2ng/ml。

一 于96孔细胞培养板中各孔加入上述序列稀释的OKT3及hul2F6m培养液各

1009l,设置9复孔,阴性对照孔加入1009l含20%NCS的RPMI.1640培养液。

● 每孔加入1009l上述PBMC细胞悬液,然后将96孔板加盖,置37℃,5%C02

细胞培养箱培养。

一培养24小时后,取其中3复孔上清,测定上清中TNF.0c浓度。

_培养72小时后,取另外6复孔上清,分别测定上清中IL.10及IFN.侬度。

一下图为检测上清时酶标板中样品的排列顺序。

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第二军医天学博士学位话主

2 3 4 5 6 7 8 9 10 ll 12

{露l≈

2.509 2457 1.158 1.186 1.167

o||||o o||一 ||||||||||||||||

0.041

0 0381 358 1 384 1142 1.156 l 179

0 0460 738 0 754 1 395 l_432 l 417

0.0390.399 0.372 0.795 0.762 0 779

0.0440.207 0204 0.532 0 558 0.538

n0420123 0118 0.372 0 356 0 349

0 075 0.079 0.189 0.176 0.198

1 0_|034 0.037 0.049 0.045 0 042

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

O

TNF Concentration(pg.mL‘1)

图2.7 hul2F6m与OKT3诱导PBMC分泌TNF.0【{佥测标准曲线

线性回归方程为:Y=一2.54438+O.98775x

r=n99954

表2.8 hul2F6m与OKT3诱导PBMC分泌IL.10检测结果(直接检测上清)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

2.738 2.814 1.035 1.097 1.112 0.035

1.452 1.489 1.106 1.128 1.154 0.037

0.775 0.761 1.295 1.32l 1.336 0.034

0.429 0.446 0.689 0.712 0.697 0.039

0.218 0.223 0.574 0.551 0.602 0.032

0.113 0.120 0.326 0.301 O.31l 0.036

0.077 0.081 0.186 0.171 O.176

0.031 0.034 0.037 0。042 0.039

.5l一

誊∞coD

Jeo#ao

A

B

C

D

E

F

G

H

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IL.1 0 Concentration(pg.mL’11

图2.8 hul2F6m与OKT3诱导PBMC分泌IL.10检测标准曲线

线性回归方程为:Y=-2.22147+n99325x

,.=n99915

.52.

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

表2.9 hul2F6m与OKT3诱导PBMC分泌IFN.Yj佥测结果(上清稀释10倍后检测)

l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

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0.682 0.651 1.516 1.472 1.480 0.094

0.384 0.371 1.064 1.112 1.093 0.095

0.247 0.254 0.792 0.737 0.728 0.098

O.182 0.175 O.112 0.096 0.105 0.102

O.136 O.140 0.098 0.103 O.100

0.098 0.095 0.097 0.092 0.099

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图2.9 hul2F6m与OKT3诱导PBMC分泌IFN-Y检测标准曲线

线性回归方程为:Y=-2.50226+O.94017x

,=D.99986

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第二军医大学博士学位论丈

表2.10 OKT3及hul2F6m刺激PBMC分泌TNF-O【、IL-10及IFN一偌果汇总表

浓度TNF’仪(pg/m1)IL-10(pg/m1) IFN-丫(pg/m1)

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Antibody Concentration(ng.mL。1)

图2.10 OKT3及hul2F6m诱导PBMC分泌TNF·0【量效曲线(¨p<0.01)

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

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图2.11 OKT3及hul2F6m诱导PBMC分泌IL.10量效曲线(宰拳p<0.01)

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Antibody Concentration(ng.mL。)

图2.12 OKT3及hul2F6m诱导PBMC分泌IFN-值效曲线(古女p<o.01)

经student-t检验,hul2F6m激活PBMC并释放TNF.0【,IL一10及IFN一借炎性细

胞因子的效应较OKT3显著下降(p<0.01)。

(5)讨论

hul2F6m与OKT3相比,激活PBMC并释放炎性细胞因子的效应显著减弱,即

-55.

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第二军医大学博士学位论文

恒定区突变的人源化抗CD3单克隆抗体激活淋巴细胞并释放炎性细胞因子(TNF.0【,

IL.10及IFNq)与原鼠源性单抗相比显著降低。因此,人源化抗CD3单克隆抗体

hul2F6m恒定区234和235位的Leu.Leu突变为Ala.Ala,大大减弱抗体Fc段与FcR

细胞的结合,并使CD3抗体交联激活T细胞并释放炎性细胞因子(TNF.0c,IL.10及

IFN.Y)的效应明显下降。

4、 实验结果总结

hul2F6m与外周血单个核细胞表达的CD3抗原的亲和常数(心)约为O.96×

109M一,文献报道OKT3的亲和常数为1.2×109M一,两者的抗原亲和力基本相同;

hul2F6m与OKT3具有相似的调变外周血单个核细胞表面CD3的能力,二者相比无

统计学意义差别(p>0.05);hul2F6m及OKT3均可明显抑制MLR,且两者的抑制作

用相似,各浓度的抑制率均无统计学意义差别(p>0.05);hul2F6m与小鼠IgG2a竞

争结合FcRI的能力显著下降,与OKT3相比均有统计学意义差别(p<0.05);hul2F6m

刺激PBMC转化的效应显著下降,与OKT3相比均有统计学意义差别(p<0.05);

hul2F6m激活PBMC并释放TNF一0c,IL.10及IFN.借炎性细胞因子的效应较OKT3

显著下降(p<0.01)。

四、结论

hul2F6m与美国Othro Biotech公司上市产品(鼠源OKT3单抗)具有相同的亲

和力,即经人源化改造后的抗CD3单克隆抗体完好保存了与CD3抗原结合的特异性

和亲和力;hul2F6m与OKT3均可诱导PBMC表面CD3分子调变,且诱导PBMC

表面CD3发生抗原调变的效应无统计学差异,即经人源化改造后的抗CD3单克隆抗

体具有与OKT3相近的诱导靶抗原产生抗原调变的功能;hul2F6m与OKT3均可抑

制混合淋巴细胞反应(MLR),与OKT3抑制MLR的效应相近,即经人源化改造后

的抗CD3单克隆抗体具有与OKT3相近的抑制~A.rT。R的功能;OKT3可明显与IgG2a

竞争结合U937细胞表面FeRI,而hul2F6m与IgG2a竞争结合U937细胞表面FcRI

的能力显著下降,即经人源化改造及恒定区突变后的抗CD3单克隆抗体与IgG2a竞

争结合U937细胞表面FeRI的能力显著下降;hul2F6m与OKT3相比,刺激PBMC

转化的效应大大减弱,即恒定区突变的人源化抗CD3单克隆抗体刺激淋巴细胞发生

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

转化的功能与原鼠源性单抗相比显著降低;hul2F6m恒定区234和235位的Leu.Leu

突变为Ala-Ala,大大减弱抗体Fc段与FcR细胞的结合,并使CD3抗体交联激活T

细胞的效应明显下降,这提供了该CD3抗体首剂效应减低的理论与实际依据;

hul2F6m与OKT3相比,激活PBMC并释放炎性细胞因子的效应显著减弱,即恒定

区突变的人源化抗CD3单克隆抗体激活淋巴细胞并释放炎性细胞因子(TNF.0【,IL.10

及IFN-7)与原鼠源性单抗相比显著降低。

hul2F6m在完好保持了OKT3的特异性和亲和力及其抑制免疫效应的各种功能

的同时,显著的降低了Fc段与FcRI结合的亲和力,降低了由于细胞因子释放而导致

首剂效应的可能,并在体外得到了证实。

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第三部分 肾移植患者单次给予hu 12F6m药动学研究

一、试验目的

研究hul2F6m在接受肾移植患者体内的药物代谢动力学特点及药物效应

动力学,初步评价该药的生物利用度等情况,简单了解应用hul2F6m而产生

的抗hul2F6m抗体的情况,为进一步临床研究的给药方案提供依据。

二、受试者选择

(一)入选标准

一年龄18-60周岁,男女均可;

●首次接受同种异体肾移植;

一无食物、药物过敏史;

-受试者自愿签署知情同意书。

(二)排除标准

一 曾接受过同种异体肾移植的患者;

- 同时接受多个器官联合移植的患者;

_ 任何曾经或正在使用OKT3、赛尼哌、ALG、ATG等的患者;

- 孕妇、哺乳期妇女及不愿在应用研究药物期间采用适当避孕方法的妇女;

_过去5年中有恶性肿瘤病史者:

_肝炎患者和肝炎病毒携带者;

一伴发其它严重活动性感染者;

● 患有严重的心脏疾病伴心功能不全者;

- 患有严重消化道疾病和严重腹泻者;

·任何类型的精神病病患者;

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一 自细胞数低于3×IOYL,血红蛋白低于59/dL者。

三、剂量选择

本试验参考国外相关文献,初始剂量定为2.5mg,最大剂量为lOmg,静

脉滴注。受试者按参加试验顺序分别分为2.5mg、5mg、lOmg三个剂量组,每

组例数分别为9、9、9例,考虑到脱失因素,每组入选例数为10例。

四、受试药物与给药方法

●受试药物:重组抗CD3人源化单克隆抗体注射液(hul2F6m);

·本药物为无色液体,西林瓶包装,5mg/瓶,2—8℃保存;

-批号:20070901,有效期至:2010年8月;

一给药时间:接受肾移植手术后7-14天;

· 使用方法:用lml生理盐水溶解本品,溶液应清亮、无颗粒、沉淀及异

物,再稀释于lOOml生理盐水中,立即静脉滴注,30分钟内注毕,本制

剂勿与其他药物混合注射;

一 为减少首剂反应,在本品使用lj{『静注甲基强的松龙40mg;

■不得冰冻;

-单次静脉滴注,专人操作。

五、三联用药原则

本试验选用首次接收肾移植的患者作为研究对象,患者在整个试验过程

中接收三联免疫抑制剂基础治疗,三联药物组合选择为“环孢素(或他克莫

司)+麦考霉酚酸酯+皮质类固醇激素”。

六、血样采取和样品处理

静滴药物前,静滴药物后0小时、0.5小时、2、6、12、24、36小时,2、

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3、5、7、10、14、21、28、35、49天各取血2mL,分装到两管,其中0.5ml

装入抗凝管,用于淋巴细胞亚型测定;1.5ml装入非抗凝管中,自然凝固后

取血清放置于--200C环境下保存待测。

七、观察项目及频度

(一)血清hul2F6m浓度测定

静滴药物前,静滴药物后0小时、0.5小时、2、6、12、24、36小时,2、

3、5、7、10、14、21、28、35、49天各取血2mL,分离血清,采用ELISA

测定法测试血清中hul2F6m的浓度。

(二)血清抗hul2F6m抗体的测定

用药后第0、14、28、49天用放射免疫法,将少量抗原滴于平板上以低

灵敏度法检测试验受试者血清,检查抗hul2F6m抗体的发生率:如有抗

hul2F6m抗体产生,再用高灵敏度免疫检测方法,检测中和抗体。

八、统计学方法

统计受试者入选数量,脱落和剔除病例情况,对人口统计学及其他

基线特征的描述性统计分析。

治疗前后比较:试验数据均采用均数±标准差(x±s)表示,受试

者给药前和给药后24小时的各项检测指标采用配对f检验和方差分析,比较

给药前后各项指标的变化是否具有显著性意义。

由每个受试者的各时间点的血药浓度分别绘出血浓.时间曲线(CT

曲线);根据测定所得的血药浓度,采用3P97实用药代动力学统计软

件计算药物在体内动态变化的药代动力学参数。

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第二军医大学博士学位论文

(二)单次静脉滴注肾移植患者hul2F6m后浓度一时间曲线

见图3.1~图3.2

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图3.1(A)单次静脉滴注给予肾移植患者hul2F6m 2.5mg的浓度一时间曲线

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

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图3.1(B)单次静脉滴注给予肾移植患者hul2F6m 5mg的浓度一时间曲线

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图3.1(C)单次静脉滴注给予肾移植患者hul2F6m lOmg的浓度一时间曲线

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重组抗CI)3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学~药效学研究

c-T曲线

I,nC-T曲线

图3.2单次用药组肾移植患者浓度一时间总曲线(n:9/组,mean+_SD)

(三)肾移植患者单次静滴不同剂量hul2F6m的药动学参数

根据不同剂量组浓度一时问数据,我们分别采用.3p87软件、以及利用非房室模

型统计矩原理和Excel2000软件计算hul2F6m在肾移植患者的药代动力学参数。

不同剂量组的药代动力学参数计算结果采用均数±标准差(i±SD)表示;

组间药代动力学参数比较采用单因素ANOVA和Student’S t test进行统计分析。

肾移植患者单次静脉滴注2.5,5和10mghul2F6m的药动学参数见表3.4~表3.6。

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第二军医大学博士学位论文

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..,肾移植患者单次静脉滴注2.5mg,5mg和1 0mg hul2F6m,AUC(o-672h)并']]Cm默

均与剂量呈线性关系,相关系数R在0.99以上,具有线性药动学特征。

肾移植患者单次静脉滴注2.5mg,5mg和10mg hul2F6m后,滴注结束时即

达到峰值,峰浓度分别为550.4+1 13.2 ng·mL~,1215.3士213.4 ng·mL‘1和

2542.4士126.9 ng·mL~。半衰期tl/2随着剂量增加存在延长的趋势,分别为132.1士

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

10.8h,132.6士12.Oh和144.14-14.9h:曲线下面积AUC《o。1呈比例增加,与剂量

成正比,分别为67175.44-10738.5ng·h·mL~,158523.34-14301.2 ng·h·mL。和

349490.3+50912.3 ng·h·mL~。随着剂量增加清除率CL/F有下降的趋势,分别为

0.038+7.5E一03L·h"1.kg~,0.032+2.7E一03L·h-I-kg。1和0.0294-3.8E.03 L.h1.kg~。表观

分布容积Vd不随着剂量的增加而改变,分别为6.384-1.47 ml·kg一,

6.034-0.8 1 m1.kg’1和6.5 1 4-0.76m1.kg一。

十、讨论及结论

在本研究中,ELISA法测定血清中hul2F6m浓度的结果表明,单次静脉滴

注2.5mg,5mg和10mg hul2F6m后,滴注结束时即达到峰值,峰浓度Cmax分

别为550.44-1 13.2 ng·mL~,1215.3+213.4 ng·mL。和2542.44-126.9 ng·mL~ug·mL~。

随着给药剂量的增大,药物在人体的停留时间明显延长,2.5mg,5mg和10mg

组受试者的血药物浓度分别在给药后第28天、35天和49天以后基本检测不到。

肾移植患者单次静脉滴注2.5mg,5mg和10mg 12F6m,过程具有线性药动

学特征,AUC(o。1和Cm默均与剂量呈线性关系。单次静脉滴注2.5mg,5mg和1 0mg

12F6m的半衰期tl/2随着剂量增加存在不断延长的趋势,分别为132.1士10.8h,

132.6-a:12.Oh和144.1士14.9h;曲线下面积AUCfo。,呈比例增加,与剂量成正比,

分别为 67175.4+10738.5ng—h mL~, 158523.3+14301.2 ng—h mLq 和

349490.3士50912.3 ng—h mL一。随着剂量增加清除率CL/F有下降的趋势,分别为

0.0384-7.5E.03L·h"1.kg"1,0.0324-2.7E.03L·h"1.kg。。和0.0294-3.8E.03 L·h-Lkg~。表观

分布容积Vd不随着剂量的增加而改变,分别为6.384-1.47 ml·kg一,

6.03士0.81ml·kg‘1和6.51+0.76ml·kg-1。

CD3分子是膜相关抗原,与可溶性抗原相比,可以通过靶向介导的特异性

过程抗原内化极大的提高抗体hul2F6m的清除率。也就是说,hul2F6rn的总清

除率包括通过特异性饱和抗原相关途径和通过网状内皮系统介导的非特异性线

性清除途径(见图3.3)。一般情况下,前者的特异性途径表现为非线性药物动力

学,而后者的非特异性途径表现为线性。由于本研究中hul2F6m的给药剂量较

低,其消除以网状内皮系统介导的非特异性线性清除途径为主,而CD3抗原介

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第二军医太擘博士学位论乏

导的非线性药代动力学为辅,最终表现为线性药动学特征。

据上市产品调查显示,就完整的抗体而言,鼠源单抗较嵌含或人源化单抗的

半衰期要短:鼠源(2_3天)<嵌合(8-lO天)<人源化(20-23天)。鼠源IgG之

所以快速清除主要归因于其不能与网状内皮系统吞噬细胞表面的FcRrI结合,而

人源化抗体与FcRn亲和力最高,相应地,其半衰期也最长。hul2F6m是人源化

单抗.但其19G1恒定区234和235位的Leucine-Leueine突变为Alanine-Alanine-

大大减弱了抗体Fc段与FcRn的结合,其半衰期(5 5-6天)也较通常的人源化

抗体半衰期短,而与嵌合单抗的半衰期接近。

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图3.4膜抗原介导的单克隆抗体的体内消除机制(CLn。-=cL麟+cLTI咐.)

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

第四部分肾移植患者单次给予hul2F6m体内药效学研究

一、摘要

本试验用流式细胞技术测定外周血T淋巴细胞亚群变化。肾移植患者给

药后外周血淋巴细胞CD2+、CD3+、CD4+及CD8+细胞比例与给药前相比,均

显著降低,与给药前相比,在静脉滴注结束时即有显著差异,在给药后6-24h

达到最低值,此后逐渐回升,在5d后逐渐回到基线水平,而其中以CD3+细

胞比例下降最为明显,低、中、高剂量组最低值分别为基线时的20.6%、7.8%

和3.2%,呈明显的剂量依赖性,CD3+细胞比例下降系该抗体的药效学效应

表现。

二、试验目的

研究hul2F6m在接受肾移植患者体内的药物效应动力学及其与药物浓度

的关系,初步评价该药的药效作用,为进一步临床研究的给药方案提供依据。

三、受试者选择

(一)入选标准

-年龄18—60周岁,男女均可;

-首次接受同种异体肾移植;

_无食物、药物过敏史;

_受试者自愿签署知情同意书。

(二)排除标准

- 曾接受过同种异体肾移植的患者;

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一 同时接受多个器官联合移植的患者;

一 任何曾经或J下在使用OKT3、赛尼哌、ALG、ATG等的患者;

- 孕妇、哺乳期妇女及不愿在应用研究药物期间采用适当避孕方法的妇

女;

●过去5年中有恶性肿瘤病史者;

●肝炎患者和肝炎病毒携带者;

●伴发其它严重活动性感染者;

_ 患有严重的心脏疾病伴心功能不全者;

● 患有严重消化道疾病和严重腹泻者;

●任何类型的精神病病患者;

一 白细胞数低于3×109/L,血红蛋白低于59/dL者。

四、剂量选择

本试验参考国外相关文献,初始剂量定为2.5mg,最大剂量为lOmg,静

脉滴注。受试者按参加试验顺序分别分为2.5mg、5mg、lOmg三个剂量组,每

组例数分别为9、9、9例,考虑到脱失因素,每组入选例数为lO例。

五、受试药物与给药方法

- 受试药物:重组抗CD3人源化单克隆抗体注射液(hul2F6m);

_本药物为无色液体,西林瓶包装,5mg/瓶,2—8℃保存;

一批号:20070901,有效期至:2010年8月:

_给药时间:接受肾移植手术后7—14天;

- 使用方法:用lml生理盐水溶解本品,溶液应清亮、无颗粒、沉淀及异

物,再稀释于lOOml生理盐水中,立即静脉滴注,30分钟内注毕,本制

剂勿与其他药物混合注射:

· 为减少首剂反应,在本品使用前静注甲基强的松龙40mg;

●不得冰冻;

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

-单次静脉滴注,专人操作。

六、三联用药原则

本试验选用首次接收肾移植的患者作为研究对象,患者在整个试验过程

中接收三联免疫抑制剂基础治疗,三联药物组合选择为“环孢素(或他克莫

司)+麦考霉酚酸酯+皮质类固醇激素”。

七、血样采取和样品处理

静滴药物前,静滴药物后0小时、0.5小时、2、6、12、24、36小时,2、

3、5、7、10、14、21、28、35、49天各取血2mL,分装到两管,其中0.5ml

装入抗凝管,用于淋巴细胞亚型测定;1.5ml装入非抗凝管中,自然凝固后

取血清放置于--200C环境下保存待测。

八、检测项目、频度及方法

(一)分析频度

1、 淋巴细胞亚型分析频度

静滴药物前,静滴药物后0小时、0.5小时、2、6、12、24、36小时,2、

3、5、7、10、14、21、28、35、49天采用流式细胞术检测白细胞亚型CD2、

CD3、CD4、CD8等的水平。

2、 细胞因子分析频度

静滴药物前,静滴药物后0小时、0.5小时、2、6、12、24、36小时及2

天采用酶联免疫吸附法检测IFN吖、TNF—a及IL·6的变化情况。

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第二军医大学博士学位论丈

(二)淋巴细胞亚型分析方法

采用直接荧光染色法检测受试动物外周血淋巴细胞群的变化。

1、 主要试剂

_流式专用样品管。

- 溶红细胞液:FACSTM Lysing Solution,Becton&Dickinson公司产品,用

前Mili.Q水10倍稀释,室温保存。

一PBS.pH7.2的磷酸盐缓冲生理盐水。

●PBSS:含1%小牛血清的PBS。

- FITC Mouse IgGl、IgG2a同型对照抗体:BD公司产品,浓度为10“g/ml。4

℃保存。

一 Monoclonal antibody

●mouse anti human CD2-PE(IgG0:BD公司产品,浓度1 0ug/ml,4"C保存。

_mouse anti human CD3-FITC(IgG0:BD公司产品,浓度10ug/ml,4。C保

存。

一mouse anti human CD3一PC(IgG0:BD公司产品,浓度10ug/ml,4℃保存。

-mouse anti human CD4一FITC(IgG0:BD公司产品,浓度10ug/ml,4"C保

存。

_mouse anti human CD8一PE(IgGl):BD公司产品,浓度10ug/ml,4"C保存。

(上述抗体均可与人的相应抗原交叉反应。)

2、 主要仪器

-流式细胞仪:FACScan配CellQuest分析软件,Beckton Diskson(San Jose,

CA)产品。

·低速离心机:Eppendorf公司产品

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

3、 检测方法

流式细胞术检测外周血中淋巴细胞变化

-人抗凝血509l与109l的荧光标记的抗体(IgGl,IgG2a同型对照抗体,

mouse anti human CD3-FITC(IgG 1),mouse anti human CD4一FITC(IgG 1),

mouse anti human CD8一FITC(IgG 1), mouse anti human

CD20.FITC(IgGl)),室温避光孵育30分钟;

-加入10倍稀释后的FACSTM Lysing Solution,2ml/管,旋涡混合器振荡

3秒后室温避光放置15min。

_20。C离心1200rpm,6min。

-用2ml PBSS洗涤1次,20℃离心1200rpm,6min。

-将细胞重悬在3009l PBSS中,用FACScan分析各份样品中阳性染色值。

●计算外周血中CD2、CD3、CD4、CD8阳性细胞百分数。

(三)细胞因子释放综合征的监测方法

采用酶联免疫法检测受试者外周血细胞因子的变化情况。

1、 主要试剂

Quantikine⑧Human IFN吖immunoassay (R&D,Cat No DIF50)

Quantikine⑧Human TNF-a/TNFSF 1A Immunoassay (R&D,Cat No DIF50

DTA00C)

Quantikine⑧Human IL一6 Immunoassay(R&D,Cat No DIF50 D6050)

2、 主要仪器

酶标仪(TECAN SPECTRA II)

3、 检测方法

按照试剂盒说明书进行。

.77.

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第二军医走学博士学谊论史

九、统计学方法

组『自J比较用t检验,与给药前比较用配对t检验。

十、结果

(一)单次静脉滴注给予肾移植患者不同剂量hul2F6m

后不同时间点淋巴细斑亚型分析图谱

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药控学厦其休内药物动力学喵效学研究

给曲后2】天

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图4.1 5mg剂量组患者给药前及给药后不同时间点CD2/CD3阳性细胞

百分比变化情况(编号:#11)

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重组抗CP3人泺化单克隆抗体体外药致擘覆其体内药物动力学一药效学研究

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分比变化情况(编号:#li)

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第=-T医大学博士学位论文

(五)单次静脉滴注给予肾移植患者不同剂量hul2F6m

后不同时间点T淋巴细胞亚群变化趋势

肾移植患者接受hul2F6m给药后,CD2、CD3、CD4、CD$阳性细胞

百分率均明显下降,尤以CD3+细胞下降最为明显,而且其下降幅度呈剂

量依赖性:即随着给药剂量的提高,CD3+细胞较基线值下降得幅度逐渐提

高.而达到最低值的时间相应提前。在2.5及5mg剂量组,大部分患者在

给药6小时后CD3+细胞达最低值,而高剂量组(10mg组)部分患者在静

脉滴注结束后即刻CD3+细胞即达壤低值,而且下降幅度也最大,几乎为

0%(见表4 6及图4 3、4.4)。

各组不同细胞亚群变化情况见图4 5~图4.8。

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图图4.310rag剂量组患者给药前(上)、给药后6小时(中)及给药后49天(下)

CD2/CD3阳性细胞百分比(患者编号:{f29)

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药兢学厦其体内药物动力学一药放学研究

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图4.4lOmg剂量组患者给药前(上)及给药后6小时(中)、给药后49天(下)

CD3/CD4/CD8阳性细胞百分比(患者编号:#29)

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第二军医大学博士学位论文

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图4.5 CD2+细胞百分数变化趋势

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重组抗C03人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

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图4.6 CD3+细胞百分数变化趋势图(A:0—49d:B;0-5d;C:0-24h)

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第二军医大学博士学位论文

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Time(hI

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图4.7 CD4+细胞百分数变化趋势

TimeIhl

图(上:0-49d:中:0-5d:下:0—24h)

^尊互;o+tao

一零lt=。u+.60

一墨百=。o毒oo

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

Time(hl

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图4.8 CD8+细胞百分数变化趋势

Timelh)

图(上:0-49d:中:O一5d;下:0-24h)

-99.

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一’‘百=。o+-ao

一零蔓io+80

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第二军医大学博士学位论文

(六)肾移植患者给予不同剂量hul2F6m后各T细胞亚

群达最低值时间、最低值及占基线值百分比

肾移植患者给予不同剂量hul2F6m后各T细胞亚群达最低值时间、最低值

及最低值占基线值的比例见表4—13。由表中可见,大部分剂量组T细胞亚群达

最低值的中位时间为6小时,随着给药剂量的增加,达最低值时间有提前的趋势。

而在各T细胞亚群中,以CD3+细胞受hul2F6m影响下降得幅度最大,高剂量组

最低值仅为基线值的3.2%,其次为CD4+细胞,而CD2+、CD8+细胞受影响较小一

些,这和CD2、CD3、CD4、CD8抗原在T细胞上的表达情况是一致的。

表4.13肾移植患者给予不同剂量12F6m后各T细胞亚群达最低值情况

T细胞 12F6m剂量 基线值 最低值 达最低值 最低值/基线值

Ⅱ群 (Mean±SD,%) (Mean±SD,%) 中位时间(h) (%)

CD2’ 2.5mg 68.19±8.96 29.36±11.53 6(2-24) 43.1%

bmg 67.98±4.70 19.62±7.85 6(2-24) 28.9%

lOmg 64.96±11.04 lO.69±8.17 12(2-48) 16.5%

CD3+ 2.5mg 62.46±11.43 12.86±6.2l 6(6-6) 20.6%

bmg 59.92±6.65 4.64±2.67 6(2-24) 7.7%

lOmg 60.49±10.58 1.96±2.98 6(0.5—36) 3.2%

CD4’ 2.5mg 34.49±5.04 5.74±2.98 6(2-24) 16.6%

bmg 35.59±6.39 3.28±2.26 6(2-12) 9.2%

lOmg 36.32±8.70 1.96±1.26 6(2-12) 5.4%

CD8+ 2.5rag 27.54±11.32 12.56±9.66 6(1-24) 45.6%

bmg 25.79±4.2l 4.80±2.37 2(1-12) 18.6%

lOmg 18.30±5.18 3.78±2.24 6(卜24) 20.7%

(七)肾移植患者给予不同剂量hul2F6m后各T细胞亚

群变化与血清hul2F6m浓度的关系

肾移植患者给予不同剂量hul2F6m后各T细胞哑群变化与血清hul2F6m关

系见表4.14及图4.9。

由以上图、表可见,各组。肾移植患者静脉给予12F6m后即刻血药浓度达到

峰值,外周血T淋巴细胞亚群CD2、CD3、CD4、CD8阳性细胞比例随即迅速下降,

并在给药后6h左右达到最低值,在最低值附近维持3-4天后逐渐回升,5d后逐

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渐回升至基线水平的一半,这与12F6m的半衰期约5.5—6d相一致。血药浓度与

CD2、CD3、CD4、0)8阳性细胞比例呈明显负相关(图4-5),维持CD3抗原饱和

的药物浓度约为1000ng/mL,与文献报道相一致。

表4.14肾移植患者给予不同剂量hul2F6m后各T细胞亚群达最低值情况及

与血药浓度关系

T细胞 Hul2F6m剂 达最低值 达最低值 最低值/基线值

Ⅱ群上王

中位时间(h) 平均浓度(ng/mL) (%)早.

CD2+ 2.5mg 6(2—24) 413.8±104.4 43.1%

bmg 6(2-24) 931.3±229.4 28.9%

lOmg 12(2-48) 1980.2±218.5 16.5%

CD3+ 2.5mg 6(6-6) 401.0±97.4 20.6%

bmg 6(2-24) 933.54-156.9 7.7%

lOmg 6(0.5-36) 2142.34-286.7 3.2%

CD4+ 2.5rag 6(2-24) 389.64-95.1 16.6%

bmg 6(2-12) 932.49±171.5 9.2%

lOmg 6(2-12) 2089.5±118.9 5.4%

CD8‘ 2.5mg 6(1-24) 410.3±96.5 45.6%

bmg 2(1-12) 987.3±234.6 18.6%

lOmg 6(1-24) 2184.6±158.9 20.7%

图4.9 CD3抗原饱和程度与hul2F6m浓度关系

oEbSC.Q

巴芑

8CotO

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第二军医大学博士学位论文

(八)肾移植患者给予不同剂量hu l 2F6m后细胞因子变

化情况

各剂量组所有受试者血清IFN吖、TNF—a及IL.6水平均低于试剂盒的检测限

(分别为15.6pg/ml,15.6pg/ml及3.12pg/m1),因此,所有受试者均未发生细胞

因子释放综合症。

十一、 讨论及结论

各组肾移植患者给药前外周血T淋巴细胞亚群比例(基线值)基本一致,无

统计学差异,给药后CD2、CD3、CD4、CD8阳性细胞数均显著下降,并呈剂量依

赖趋势,并在给药后6h左右达到最低值。其中以CD3阳性细胞下降最为明显,

给予hul2F6m 2.5、5及lOmg后,外周血CD3+细胞比例分别由给药前的62.46

±11.43、59.92±6.65和60.49±10.58降至12.86±6.21、4.64±2.67和1.96

±2.98,分别为基线值的20.6%、7.7%和3.2%,达到最低值中位时间均为给药后

6h。CD4阳性细胞下降程度与CD3阳性细胞相似,而CD2、CD8阳性细胞下降幅

度略小,高剂量组最低值分别为给药Ijif的16.5%和20.7%,这与不同T细胞亚群

表面抗原表达情况相一致,也J下是hul2F6m药效作用的表现。

从PK/PD关系来看,各组肾移植患者静脉给予12F6m后即刻血药浓度达到峰

值,外周血T淋巴细胞亚群CD2、CD3、CD4、CD8阳性细胞比例随即迅速下降,

并在给药后6h左右达到最低值,在最低值附近维持2—3天后逐渐回升,5d后逐

渐回升至基线水平的一半,这与12F6m的半衰期约5。5—6d相一致。血药浓度与

CD2、CD3、CD4、CD8阳性细胞比例呈明显负相关(图4-5),维持CD3抗原饱和

的药物浓度约为1000ng/mL,与文献报道相一致。

在hul2F6m的设计过程中,将Fc段的个别氨基酸进行了突变,显著降低了

Fc段与Fcl,R的亲和力,从而有效降低了该人源化单抗的补体激活能力和丝裂原

活性,降低了输注相关的毒性,进一步提高了抗体临床应用的安全性以及患者的

依从性。

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

第五部分 肾移植患者单次给予hul2F6m免疫原性研究

一、摘要

将鼠源抗体进行人源化改造的主要目的之一即为降低鼠源抗体的免疫原性,因此本

研究对肾移植患者单次给予hul2F6m免疫原性进行了重点关注,采用“抗体桥法”酶联

免疫吸附实验对肾移植患者单次给予hul2F6m后抗抗体产生及其中和活性进行了检测,

在27例受试者中共3例检测出抗抗体,均为一过性抗抗体,不具有中和活性。

二、血清中抗hul2F6m抗体的检测

(一)实验原理:

“抗体桥法”,即抗hul2F6m的抗体的两个抗原结合价可以分别与包被于酶标板上

的hul2F6m以及后加入的HRP标记的hul2F6m结合,加入HRP的显色底物,显色反

应的程度与待检样品中抗hul2F6m的抗体含量呈正相关。

(二)实验器材:

- 酶标板(NUNC)

一 可调移液器及相应吸嘴(Eppendorf)

一37*(2恒温箱

一 酶标仪(Spectra II,配套软件Select 2.2)及相应波长滤光片

(三)实验试剂:

一hul2F6m:

一兔抗hul2F6m的多克隆抗体(本室自制,hul2F6m免疫家兔,取抗血清经12F6m

亲和层析纯化获得一洗脱峰);

_HRP标记的hul2F6m(本室自制,Pierce公司HRP标记试剂盒标记hul2F6m并经

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第二军医大学博士学位论文

凝胶过滤层析纯化获得);

●牛血清白蛋白(上海生工生物工程有限公司);

一 吐温20:

一磷酸哉缓冲生理盐水(PBS);

_HRP显色底物溶液A及B和终止液(晶美生物工程有限公司)。

(四)实验步骤:

-用PBS将hul2F6m稀释至1099/ml,加入酶标板,lOOgl/孑L,置于37。C恒温箱2小

时或4"C过夜;

· 弃去孔中液体,在吸水纸上拍干,用含O.1%吐温20的PBS洗板3次,每次在吸水

纸上拍干;

-3%牛血清白蛋白(PBS稀释)加入酶标板,加满孔(约3509l/孑L),37"C恒温箱2

小时或4。C过夜;

●重复步骤2;

一用PBS将兔抗hul2F6m的多克隆抗体稀释至201.tg/ml,并以之为起始浓度,连续2

倍比稀释,至浓度为0.16pg/ml,上述稀释好的标准品、空白对照(PBS)及待检样

品(用PBS l:10稀释)加入酶标板,lOOI.tl/孔,设置2复孔,置37"C恒温箱2小

时;

_重复步骤2;

-HRP标记的hul2F6m 1:200稀释(PBS),加入酶标板,100“l/孔,置于37。C恒温箱

45分钟;

·重复步骤2;

一显色底物A与B等体积混匀,加入酶标板,100/.tl/孔,室温避光反应5.20分钟(根

据显色情况确定显色时间);

-‘终止液加入酶标板,50“l/孔,迅速混匀; 。

●酶标仪读取OD450nm,630nm为参考波长。

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(五)结果判断:

标准曲线,利用软件Select2.2作四参数回归拟合;

根据标准曲线计算达到相应效应时的OD值,以待检样品OD值小于ED20:一,

ED20.ED50:+,ED50.ED70:++,ED70.ED:100+++,大于EDl00:++++。

三、血清中抗hul2F6m中和抗体的检测

(一)实验原N.-

采用混合淋巴细胞反应法测定。

(--)实验器材及试剂:

一重组hul2F6m。

一兔抗hul2F6m的多克隆中和抗体(本室自制,hul2F6m免疫家兔,取抗血清经

hul2F6m亲和层析纯化获得一洗脱峰,再经rh anti—CD3 m Ab亲和层析纯化获得一

穿透峰)。

●玻璃纤维滤膜及负压抽滤装置,闪烁液及液闪计数仪。

一 台式离心机Eppendorf公司产品

一生物安全柜台湾造鑫公司产品

一细胞培养箱美国Revco产品

一培养瓶、离心管、移液管、移液器、无菌吸嘴。

一3H—TdR:中科院上海原子核研究所产品,比放射活性30Ci/mmol,放射性浓度

1mCi/mL。

一淋巴细胞分离液

_肝素钠注射液

一细胞培养试剂,小牛血清,杭州四季青生物工程研究所产品:RPMll640培养基,

GIBCO公司产品。

一磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。

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一健康志愿者新鲜外周静脉血。

(三)实验步骤:

一分别取两位健康志愿者(A、B)肝素抗凝静脉血10mL,淋巴细胞分层液密度梯度

离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),无血清RPMll640洗涤3次,每次1000rpm

离心10min。

_计数,并用含20%FCS的RPMll640完全培养液调整细胞浓度至2.0×105/mL。

一用含20%FCS的RPMll640完全培养液稀释12F6m,至浓度为4000ng/ml。

一用含20%FCS的RPMll640完全培养液稀释兔抗12F6m多克隆中和抗体至

1 001.tg/ml,并连续二倍比稀释至O.781.tg/ml,共8个浓度。

一用含20%FCS的RPMll640完全培养液稀释待检测血清5倍。

_96孔细胞培养板每孑L;bn入A、B两个不同个体的淋巴细胞悬液各50此,50山稀释

好的hul2F6m;标准曲线每孔加入509l稀释好的兔抗12F6m多克隆中和抗体;待

检测样品孔则每孔加入50山稀释好的待检样品;最强反应对照孑L;0n入淋巴细胞悬液

后直接加入1009l完全培养液,最弱反应对照孔每孔加入50pl稀释好的12F6m后

再加入50山完全培养液;各样品均设置3复孔。

-37℃,5%C02温箱培养6d。

_终止培养前16h每孔加入0.5Ci 3H—TdR。

●用细胞收集器将细胞吸附在玻璃纤维滤纸片上,用生理盐水充分洗涤,洗去游离的

3H.TdR;将滤纸片烘干后,用镊子按其顺序分别依次放入盛有闪烁液的塑料管内;

B闪烁仪自动测定样品1min。

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(四)结果计算:

计算刺激指数(Stimulator Index,SI):

SI=(加入样品混合淋巴细胞反应clam均值~最弱反应对照管cpm均值)/(最强反

应对照管cpm均值一最弱反应对照管cpm均值)。

标准曲线,利用软件Select2.2作四参数回归拟合,横坐标为中和抗体浓度,纵坐标

为SI;

根据标准曲线计算达到相应效应时的荧光强度几何均数,以待检样品荧光强度几何

均数小于ED20:一,ED20一ED50..+,ED50.ED70:++,ED70.ED:100+++,大

于EDl00:++++。

四、抗hul2F6m抗体、中和抗体检测结果

给药后,部分受试者(编号为#7,#8,#21)血清中出现抗hul2F6m抗体,随访监

测显示均仅为“一过性”抗抗体。经混合淋巴细胞培养分析表明,血清中的抗体均为非

中和性抗体。血清中抗12F6m抗体的滴度随给药剂量的减少呈增加趋势。结果如表5.1、

5.2所示:

表5.1血清抗抗体柃测阳性结果

“+”:检测结果为阳性;“一”:检测结果为阴性;“/”;未作检测或者标本缺失。

对上述3例肾移植受者进行中和抗体检测,结果均为“.一。

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表5.2血清中和抗体检测结果

注:只有当抗抗体检测为阳性时,才继续检测该血清样本的中和性抗体。

五、结论

在本研究的27例受试者中,有3例检出抗hul2F6m抗体,分别出现在给

药后14天和2l天,至给药49天结束,说明这些抗体均未一过性抗体,经进一

步检测,均为非中和抗体,说明本研究对于抗CD3单抗的人源化改造大大降低了

抗体的免疫原性,是一次成功的改造。

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学二药效学研究

小 结

作为免疫抑制作用最强的生物制剂,CD3单抗的疗效已得到了充分的证实,克

服鼠源性和首剂效应成为其临床广泛应用的关键。Hul2F6m是抗体药物国家研究中

心自主研制的抗人CD3的人源化单克隆抗体,实验发现它具有与OKT3相似的激活

和抑制T细胞的双向功能,因此我们对其进行了一系列体外及体内药效学及药代动力

学研究,希望能够将其应用于临床,为临床医生提供一个抗排异能力强、免疫原性和

毒副作用小的有效免疫抑制剂用于急性移植排斥反应的治疗。

为探讨重组抗CD3人源化单克隆抗体hul2F6m在体内的吸收、分布、代谢等

的规律,我们进行了该单抗的I期临床药物代谢动力学研究。在该部分研究中,受试

者血清药物浓度的检测是核心工作,因此我们建立了检测该单抗的ELISA方法。该

单抗结合的靶位位于CD3的£链,但是单独表达£链无法形成正确的空间结构而不

能与抗体结合,因此,我们表达了CD3e8两条链的融合蛋白。即将人CD3e基因的3’

端通过Linker与人CD3i5基因的5’相连,构建成CD3e6融合基因,利用pET22表达

载体进行表达。通过细菌发酵、纯化等一系列过程,我们得到了CD3e8融合蛋白,

并用此蛋白建立了酶联免疫吸附法(ELISA法)测定人血清中hul2F6m抗体浓度。该

方法特异性强,灵敏度高、准确度和精密度良好,足以满足药代动力学研究。

OKT3在临床上使用过程中主要受两个因素的制约,即人抗鼠抗体反应(Human

anti.mouse antibody response,HAMA)和细胞因子释放综合症(Cytokine release

syndrome,CRS)。因此,我们在设计人源化抗体hul2F6m时首先要解决的问题也就

是免疫原性和首剂效应,同时要保留其结合CD3抗原的药效学活性。为此,我们设

计了一系列体外试验来分别验证hul2F6m Fab端和Fc端的药效作用:比较了

Hul2F6m、OKT3与靶抗原CD3结合的特异性及亲和力,与膜CD3抗原部分阳性的

人外周血单个核细胞(PBMC)结合后产生的效应(T淋巴细胞增殖效应、CD3抗原

的调变和对混合淋巴细胞反应的影响)以及Fc与细胞表面Fc受体(一Fc.Receptor,FcR)

的亲和力,诱导PBMC分泌细胞因子的效应等。结果表明:受试品hul2F6m与外周

血单个核细胞表达的CD3抗原的亲和常数尉约为1.03nM,即屹约为0.96×109M~,

与OKT3没有显著差别(p=0.9358),即经人源化改造后的抗CD3单克隆抗体完好

保存了与CD3抗原结合的特异性和亲和力;hul2F6m与OKT3均可诱导PBMC表面

.109.

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CD3分子调变,而且两者诱导PBMC表面CD3发生抗原调变的效应相近,即经人源

化改造后的抗CD3单克隆抗体具有与OKT3相近的诱导靶抗原产生抗原调变的功能;

hul2F6m与OKT3均可抑制MLR,而且两者抑制MLR的效应相近,即经人源化改

造后的抗CD3单克隆抗体具有与OKT3相近的抑制MLR的功能;OKT3可明显与

IgG2a竞争结合U937细胞表面FcRI,而hul2F6m与IgG2a竞争结合U937细胞表面

FcRI的能力显著下降,即经人源化改造及恒定区突变后的抗CD3单克隆抗体与IgG2a

竞争结合U937细胞表面FcRI的能力显著下降;hul2F6m与OKT3相比,刺激PBMC

转化的效应大大减弱,即恒定区突变的人源化抗CD3单克隆抗体刺激淋巴细胞发生

转化的功能与原鼠源性单抗相比显著降低,也就是说,人源化抗CD3单克隆抗体

Hul2F6m恒定区234和235位的Leucine.Leucine突变为Alanine.Alanine,大大减弱

抗体Fc段与FoR细胞的结合,并使CD3抗体交联激活T细胞的效应明显下降,进

而使其释放炎性细胞因子(TNF.0c,IL.10及IFN吖)的效应明显下降,这提供了该

CD3抗体首剂效应减低的理论与实际依据。

总之,hul2F6m在完好保持了OKT3的特异性和亲和力及其抑制免疫效应的各

种功能的同时,显著的降低了Fc段与FcRI结合的亲和力,降低了由于细胞因子释放

而导致首剂效应的可能,这在本研究中得到了充分证实。

为了研究hul2F6m在接受肾移植患者体内的药物代谢动力学特点及药物效应动

力学,初步评价该药的生物利用度等情况,了解应用hul2F6m而产生的人抗人抗体

反应(Human anti.human antibody response,HAHA)的情况,为进一步临床研究的给

药方案提供依据,我们还进行了肾移植患者单次给予Hul2F6m 2.5、5及10mg以后

的体内药代动力学.药效学研究,即PK/PD研究。结果表明:肾移植患者单次静脉滴

注2.5mg,5mg和10mg Hul2F6m,过程具有线性药动学特征,AUC(o.1176h)和Cm戕均

与剂量呈线性关系。单次静脉滴注2.5mg,5mg和10mg Hul2F6m的半衰期tl/2随着

剂量增加存在不断延长的趋势,分别为132.1士lO.8h,132.6士12.0h和144.1士14.9h;

曲线下面积AUC(o.1176h).呈比例增加, 与剂量成正比, 分别为

65493.5士10703.8ng·h·mL~?1 57602.8士14290.4 ng。h·mL’1和348670.8士50434.8ng·h‘mL"1,

曲线下面积AUC(o栅)分别为2546士667 ug·h·mL一,9553士2899 ug·h·mLJ和43054士7665

ug·h·mL一。随着剂量增加清除率CL/F有下降的趋势,分别为0.038士7.5E.03L·h"l-kg~,

0.032士2.7E.03L·h-i.kg-1和0.029士3.8E一03 L·h-1.k91。表观分布容积Vd不随着剂量的增

加而改变,分别为6.38士1.47 ml·kg~,6.03士0.81ml·kg。和6.5l士0.76ml·kg~。

.110.

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

体内药效学方面,给药后CD2、CD3、CD4、C08阳性细胞数均显著下降,并呈剂

量依赖趋势,并在给药后6h左右达到最低值。其中以CD3阳性细胞下降最为明显,

给予hul2F6m 2.5、5、及lOmg后,外周血CD3+细胞比例分别由给药前的62。46±11.43、

59.92±6.65和60.49±lO.58降至12.86±6.2l、4.64±2.67和1.96±2.98,分别

为基线值的20.6%、7.7%和3.2%,达到最低值中位时间均为给药后6h。CD4阳性细胞

下降程度与CD3阳性细胞相似,而CD2、CD8阳性细胞下降幅度略小,高剂量组最低

值分别为给药前的16.5%和20.7%,这与不同T细胞亚群表面CD3抗原表达情况相一

致,也正是hul2F6m药效作用的表现。

从PI(/PD关系来看,各组肾移植患者静脉给予Hul2F6m后即刻血药浓度达到峰

值,外周血T淋巴细胞亚群CD2、CD3、CD4、CD8阳性细胞比例随即迅速下降,并在

给药后6h左右达到最低值,在最低值附近维持2—3天后逐渐回升,5d后逐渐回升至

基线水平的一半,这与Hul2F6m的半衰期约5.5-6d相一致。血药浓度与CD2、CD3、

CD4、CD8阳性细胞比例呈明显负相关(图4—9),维持CD3抗原饱和的药物浓度约为

l 000ng/mL,与文献报道相一致。

本研究对27例受试者静脉滴注Hul2F6m产生HAHA反应的情况进行了研究,首先

采用“抗体桥法”酶联免疫吸附实验对肾移植患者单次给予hul2F6m后抗抗体产生

情况进行检测,抗抗体阳性者再用混合淋巴细胞反应法对其是否为中和活性进行检

测,在27例受试者中共3例检测出抗抗体,均为一过性抗抗体,不具有中和活性。

综上所述,本研究提示hul2F6m有望成为一种抗排异能力强、免疫原性和毒副作

用小的有效免疫抑制剂用于急性移植排斥反应的治疗。

在我国,人源化抗体的研究起步较晚,目前主要集中在人源化抗体的设计及用原

核系统表达小分子抗体片段阶段。已经进入临床试验的则大多为仿制国外已上市产

品,本研究成功进行了一类新生物制品抗人CD3的人源化抗体I期临床研究,对今

后有治疗价值的新型人源化抗体的临床试验进行了一次有益的尝试。

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第二军医太学博士学位论文

综述抗CD3单克隆抗体(anti-CD3 Mab)研究概况

1.CD3分子与自身免疫

1.1 CI)3分子

白细胞分化抗原CD3,广泛分稚于人成熟T淋巴细胞表面。它在T细胞表面呈

组成性表达,但在其它组织细胞无表达。CD3分子与T细胞抗原受体(TCR)组成

TCPJCD3复合物。一个典型的TCR/CD3复合物包含一条TCRa链、一条TCR口链、

一条CD3 T链、一条CD3 6链、二条CD3 e链以及二条CD3‘链所组成。其中,TCR

“p链形成二聚体,CD3‘r/£、CD3 5麾及CD3以链均形成二聚体(下图所示)。

CD3分子与T细胞功能密切相关,负责在TCR识别抗原后将活化信号传导至细胞内,

从而檄活T淋巴细胞。由于TCR卵链均无细胞内信号传递功能区.因此其信号传

递功能完全依靠CD3分子。对遗传性免疫缺路病患者及人工突变小鼠的研究表明,

CD3分子的任何一条肚链出现功能缺失.均可造成严重的免疫缺陷。

卉r

1.2 T淋巴细胞与免疫应答

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

T淋巴细胞是特异性免疫应答反应最重要的功能细胞,在免疫识别、免疫反应启

动、效应阶段,以及免疫调节的过程中,无不起着重要的作用。在器官移植及自身免

疫性疾病的发病过程中,T细胞识别抗原和激活为效应细胞,是一个最为关键的环节。

先天无胸腺小鼠(体内T淋巴细胞无功能)的免疫力大大降低,对同种异体移植物不

产生排斥,甚至可接受异种移植物的存在。在临床上,采用抗人胸腺免疫球蛋白(简

称ATG,为兔血清来源的多克隆抗体)针对T细胞进行短暂性清除,可有效抑制一

般免疫抑制剂无法控制的急性排斥反应。T淋巴细胞在I型糖尿病发生发展过程中也

起着重要的作用。当机体因遗传变异、病毒感染等因素诱发机体免疫系统紊乱,自身

反应性T细胞的异常扩增,胰岛组织中出现大量淋巴单核细胞的浸润,同时对胰岛自

身抗原识别的缺失导致胰岛组织功能丧失,血糖持续性增高——I型糖尿病的发生。

鉴于CD3分子与T细胞功能密切相关,且该分子不表达于其它组织细胞,研究

人员设想,如果能够针对CD3分子,设计特异性的药物,仅抑制T细胞的活性,或

清除该群T细胞,则能够在器官移植或其它自身免疫性疾病中,特异性地抑制针对移

植物或自身抗原的免疫反应。单克隆抗体技术由于其高度的特异性和靶向性,很自然

地被列为首选方案。本文就抗CD3单克隆抗体的研究进展做一综述。

2.0KT3—第一个针对C03的鼠源单抗

OKT3单抗是第一个针对CD3的单克隆抗体,是一种识别人CD3£链的小鼠源性

单抗,于1986年即在美国获准上市,它不仅能阻碍T细胞识别抗原,抑制由抗原引

起的T细胞激活、增殖和杀伤作用,还可破坏己建立的T杀伤细胞系的功能,阻断

细胞介导的细胞毒作用。其适应症为肾移植术后抗急性排斥反应,以及心脏、肝脏移

植术后出现激素无法控制的急性排斥反应时的紧急处理。

2.1 OKT3治疗和预防移植肾捧斥的效果

2.1.1 OKT3治疗移植肾首次排斥的效果

Tesil 1】回顾102例首次出现排斥的受者,52例采用OKT3治疗,结果其2年移

植肾存活率比50例采用类固醇激素治疗的提高20%。其中39例尸肾移植采用

.,.,.OKT3.治疗,结果其2年移植肾存活率比38例尸肾移植采用类固醇激素治疗的提高·

32%。采用不同抗排斥疗法的两组的总的有症状CMV感染发生率均为22%。该作者

认为早期用OKT3治疗排斥可显著地改善2年移植物存活率,CMV感染率不增加,

但早用OKT3不阻止或减少再次排斥发生。

2.1.2 OKT3治疗移植肾血管性排斥的效果

.1 13.

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第二军医大学博士学位论文

Schroeder¨3将66例肾穿刺活检的肾移植受者,根据病理检查分为急性血管性排

斥+细胞性排斥组(N=29)和急性细胞性排斥组州=32)。两组均采用OKT3治疗,

结果,两组急性血管性排斥逆转率无显著差异(86%VS 91%),但急性血管性排斥组

的6个月和12个月的移植肾存活率明显低(64%VS 81%和58%VS 75%)。

2.1.3 OKT3治疗耐激素型急性捧斥(SR.AR)的效果

Petrie¨3治疗SR.AR 103例,OKT3剂量仍为5mg/d,共lO.14天。结果7例

移植肾丧失,96例肾功能改善,有效率93%,其6个月、1年和2年移植肾存活

率分别为81%、77%和76%,明显高于未接受OKT3治疗的患者(分别为59%、57

%和57%)。Norman⋯总结6个研究中心用OKT3治疗对激素/ATG无效的AR的

结果,其有效率达80%~96%。OKT3治疗SR-AR的长期疗效各家报道不一。Rowe¨1

报道OKT3治疗30例SR.AR,其逆转率仅40%,且长期效果不令人满意,OKT3

治疗后1年移植肾存活率仅42%,且无移植肾存活超过3年。而Kumano砸1等报道受

者1、3和7年存活率分别为94%、93%和90%,移植肾l、3和7年分别为75%、

67%和60%。

在OKT3治疗的受者中有33.3%的再次发生排斥,而再次发生的排斥反应约有

85%变为对类固醇激素治疗敏感。

2.1.4 0KT3预防性应用的效果

Normamnl报道一个随机、前瞻性的多中心研究,比较用OKT3四联序贯免疫抑制

方案和常规三联诱导治疗方案的疗效,结果,OKT3组(rl=215)的排斥发生率比常

规三联诱导治疗方案组(51%VS 66%)显著低,首次排斥发生时间明显延长(48天

VS 8天),平均每人的排斥发生次数也明显低(0182 VS 1.14),在第一次排斥发生

后,OKT3逆转了93%的曾接受0KT3诱导治疗的病人的排斥,并逆转了94%的接受

常规诱导治疗的病人的排斥。OKT3四联序贯疗法对长期疗效也有较好的影响,3年

移植肾存活率高(93%VS79%)哺3。近几年来,预防性使用0KT3的剂量,有数篇报

道主张采用低剂量,如0.5mg Bidxl0天∞3,或2mg qd E12天n0。,与5mg剂量组相

比可减!!>OKT3的副作用,且疗效无显著性差异。 .

2.2 OKT3的副作用及其防治

0KT3最常见的副作用是首剂综合征,可表现为寒颤、发热、恶心、呕吐、腹泻、

低血压等,少数可出现急性肺水肿,该综合征少数也可在第二、第三剂量注射后出现。

其发生原因主要与细胞因子的释放有关,与补体的激活也有一定关系∽1。据报道¨3

.114.

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重组抗C03人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

低剂量OKT3组(0.5mg.Bid)的副反应发生分数及INF高峰值均显著低于常规剂量

组,且低剂量组没有诱导补体的激活。

为减少首剂综合征,除首剂量减量外,还可于首剂量前用MP、消炎痛、苯海拉

明等药。Bemelnan报道分次给予MP(首剂前6小时用MP250mg,l小时前再用MP

250mg)比单次用MP(首剂前6小时或l小时用MP500mg)的OKT3首剂综合征轻。

0KT3是一种强有力的免疫抑制剂。使用OKT3后,受者感染发生率随之增多,特

别是CMV感染。CMV病在预防性应用OKT3后,用OKT3治疗首次AR后及治疗SR—

AR后的发生率分别为15%、22%和53%。在OKT3治疗的受者中,预防性使用无环

鸟苷和丙氧鸟苷有助于减少CMV发生率和减轻CMV病的严重程度口1。另外值得注意

的是OKT3具有肾毒性,其发生原因也是与细胞因子的释放有关,且有剂量依赖性嗍。

3.鼠源抗体的人源化改造

由于鼠源抗体在应用于人体时会引起强烈的免疫反应,阻碍了鼠源OKT3单抗的

疗效。此外首剂效应(first dose reaction)也是临床应用该药物时的一种严重的毒副

反应【2】。该反应是由于鼠源抗体Fc段与人B淋巴细胞表面的Fc受体具有较高亲和力,

造成T、B细胞交联,相互刺激造成大量细胞因子释放造成,表现为首次或前几次给

药后患者发热、寒战、腹泻、呕吐、呼吸困难、低血压、心动过速等,严重时甚至会

危及生命。

随着人源化抗体技术的成熟,国外研究者对鼠源OKT3抗体进行了人源化改造【3】,

将其可变区中的抗原结合区(CDR区)序列移植到人抗体可变区的框架区中,使其

在保持原有特异性的同时,对人体的免疫原性大大降低,从而开发为理想的抗免疫排

斥药物。同时为防止首剂效应,还必须在该人源化抗体的Fc段加以突变,在不改变

其它功能的前提下,尽量减低其与Fc受体的亲和力。减低亲和力的方法包括:1)将

IgGl抗体重链的CH2区234-237号氨基酸加以突变;2)选用受体亲和力较低的IgG4

类型的抗体重链;3)选用受体亲和力较低的IgG2类型的抗体重链:上述3种方法均

有文献报道,包括美国芝加哥大学Bluestone JA课题组将IgGl重链234,235位的亮

氨酸均突变为丙氨酸(L234A,L235A)的rhOKT3_rl(Ala-Ala)H,以及采用IgG4重链

的rhOKT3∥51、Protein Design Labs公司采用IgG2重链的HUM291[61。

3.1 rhOKT3v(hla-hla)的临床研究总结

rhOKT3yl(Ala.Ala)是由鼠源单抗OKT3经基因工程改造得来的单克隆抗体,是将

OKT3的6个CDRs移植到人IgGl分子,并将其CH2区进行定点突变(将IgGl重链

.115.

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第二军医大学博士学位论文

234, 235位的亮氨酸均突变为丙氨酸),以改变其FcR结合活性。

1999年,美国芝加哥大学Bluestone JA课题组报道了rhOKT3YI(Ala-Ala)的I期

临床试验结果1111,用于急性排斥反应的治疗,共5例。肾移植及2例肾/胰联合移植患

者入选,从移植到急排的中位时间为15天,中位随访时问为12月(10—17个月)。给

予rhOKT3.rl(Ala.Ala)的剂量为每天5 mg或10mg,使rhOKT3YI(Ala.Ala)的药物浓度

达到1000ng/ml,平均给药时间为10.1±2.5天,平均剂量为76+_27 mg。其中5例急性

排斥反应得到有效抑制,1例急排复发。血清肌酐峰值出现在给予rhOKT3Yl(Ala.Ala)

的第一天,随后下降,达到基线的平均时间为4.1±2天。结果提示rhOKT3Yl(Ala.Ala)

可有效抑制急性排斥反应的发生,效果与鼠源抗体类似,患者及移植物存活率均为

100%,而首剂效应明显减轻,未检测到人抗鼠抗体反应(HAMA)。

2002年Bluestone课题组报道了使用rhOKT3_rl(Ala-Ala)治疗银屑病关节炎

(psoriatic arthritis)的临床I/II期试验的结剁12J,8名患者被分到4个剂量组,剂量

依次递加,溶解于25ml生理盐水中静脉注射:第一组2名患者(N01.2)起始剂量

为0.005mg,6天后提高至最高剂量为4.0mg:第二组2名患者(N03—4)起始剂量为

0.125mg,4天后提高至最高剂量为4.0mg;第三组3名患者(N05—7)起始剂量为1.0mg,

2天后提高至最高剂量为4.0mg;第四组1名患者(N08)起始剂量即为4.0mg,所

有患者在剂量增加4.0mg后都连续用药8—10天(4.0mg/天)。结果7名患者完成试验,

其中6名获得非常好的疗效,肿、痛的关节数大大降低。所有患者都未发生输注相关

的毒性反应,第6名患者有轻微的发烧,24小时后恢复;而起始剂量为4.0mg的第8

名患者出现严重不良反应,包括恶心、呕吐、高烧至40度,虽然24小时后恢复,但

该患者还是退出了试验。用ELISA方法检测给药30天及给药90天后抗抗体的产生

情况,结果有两名患者第30天抗体滴度高于空白10倍以上,但抗体的产生并未影响

rhOKT31,l(Ala-Ala)的疗效。

2005年,该课题组报道了使用rhOKT3),l(Ala.Ala)治疗I型糖尿病的I/II期临

床试验结果【I31。共有42名I型糖尿病患者入选试验,前12名患者用药剂量为:第1

天1.4299/kg;.第2天5.67}tg瓜g;第3天.11.399/kg;第4天22.6}Lg瓜g;第5—14天

45.499/kg。由于有中和抗体产生,后来剂量调整为第1天46099/m2;第2天91999/m2;

第3.12天1 8 1 899/m2。该临床试验结果提示这种人源化单克隆抗体可有效减轻患者症

状,降低胰岛素注射量,提示该抗体可抑制免疫系统对自身胰岛13.细胞的杀伤,可能

诱导免疫耐受。

.116.

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

与大多数抗体药物开发不同的是,在上述临床试验中所使用的重组人源化抗体是

在Bluestone课题组的实验室中制备,没有制药企业参与的迹象。这也许是该药物临

床研究推进缓慢的原因所在。

3.2 hOKT374的临床研究总结

另外一项Richards等(1998)进行的I期临床试验进行了受试药物hOKT374 50、

100、200、400、800、1600/ag六个剂量用于肿瘤治疗的摸索瞒1,共24名受试者,其

中50、100、200、400p.g剂量组共有6个受试者进行了多次给药试验(最多的为50p.g

组一个受试者接受了6个疗程共18次给药),常见的副作用为发热、头痛、恶心、低

血压、呼吸困难等,毒副作用随剂量增加,最大耐受剂量为80099。给药后l、2、4、

24、48小时检测了血清中TNF.a、IL.6、GM.CSF和slL.2R,结果GM.CSF和TNF.Q

在任何时间点均未测出,40099以上剂量组受试者给药2小时以后IL.6水平升高,24

小时后slL.2R达峰值。各剂量组CD25阳性淋巴细胞计数均升高。用ELISA方法检

测了抗抗体产生情况,5099剂量组有2例(2/6),200、400、800、160099剂量组

各有l例(1/3、1/3、1/4、1/5)有中和抗体产生,抗抗体产生与剂量相关性不明显。

总的抗抗体产生率(25%)大大低于鼠源单抗OKT3(100%)。

3.3 HUM291的临床研究总结

临床研究进展最快,最有希望上市的人源化抗CD3单抗是Protein Design Labs公

司的HUM291(通用名Visilizumab,商品名Nuvion)。该抗体可变区也来自OKT3单

抗,但其重链恒定区选择了人IgG2a链,其目的也是为了降低抗体与Fc受体的亲和

力,从而减轻细胞因子释放综合征的副作用。Norman等(1999)在活体供者来源的

肾移植患者进行了I期临床试验⋯1,共进行了受试药物HUM291 0.01599/kg、

0.15肛g/kg、0.0015 mg/kg、0.0045 mg/kg、0.015 mg/kg五个剂量的摸索,均为单次给

药,起效剂量为≥0.015mg/kg(0.1mg/70kg),给药后2“小时T细胞绝对数降至最

低点,48小时恢复至基线,随着剂量加大,T细胞绝对数最低点有下降趋势,恢复至

基线的时间也相应延长(8~10天)。主要的副作用包括头痛(73%)、寒战(53%)、

发热(47%)、恶心(47%)、呕吐(27%),是由于细胞因子的产生造成的(细胞

因子综合症),因此临床期间主要检测了细胞因子产生情况,包括TNF.0【、IFN.丫和

IL.6,采血点为给药后5 rain、30rain、2h、6h、24h、48h,在两个低剂量组,TNF一仅、

IFN-'t均检测不到,0.15IJtedkg组一个时间点可检测到IL一6。在≥0.015mg/kg剂量组,

.117.

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三种细胞因子都可检测到,为13~3122p∥ml,峰值均出现在给药6小时内,给药48

小时后基本检测不到,这与临床上细胞因子相关的副作用多发生在24~48小时之内相

一致。在给药第8、15、22和29天检测了抗抗体产生情况,均未检出。

Paul A.Carpenter等(2002~2003)进行了HUM291用于移植物抗宿主病(GVHD)

的I、II期临床试验n2。1引。I期临床试验n43共有17名糖皮质激素难治型的GVHD患者

入选,其中6人接受了多次给药,剂量分别为0.25或1.0mg/m2,分别在第1、3、5、

7、9、11、13天接受静脉注射给药,另外11名患者接受3.0mg/m2的单次给药。所有

患者对HUM291都能很好的耐受,未发生急性过敏反应。用药后GVHD症状都得到一

定改善。多次用药组1人完全应答(C飚),5人部分应答(PRs),用药后存活的中

位天数为87天;单次用药组6人完全应答(CRs),3人部分应答(PRs),用药后

存活的中位天数为359天(260-490天)。至用药第42天,未检测到抗抗体产生。II

期临床试验n副有44名糖皮质激素难治型的GVHD患者入选,在第180天的存活率为

32%:在第42天的完全反应率和总反应率分别为14%和32%;而在第42天存活的患

者中完全反应率和总反应率分别为27%和73%;与I期临床试验相比,用药后GVHD

症状的改善程度稍差。

另外,美国Protein Design Lab公司已完成其利用人源性抗体Nuvion(Visilizumab)

治疗结肠溃疡的I/II期临床试验n6_17|,J下在进行治疗结肠溃疡及克隆氏病的lI期临床

试验m1。

.118-

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

参考文献【l】Tesi·RT,et a1.OKT3 for primary therapy of the first rejection episode in kidney

transplants.Transplantation,1 993;55(5):1023"-'9

【2】Schroeder—TJ,et ai.The efficacy of OKT3 in vascular rejection.Transplantation,1 99 1;5 1

(2):312~5

【3】Petrie-JJ, et a1. Effect of OKT3 in steroid—resistant renal transplant rejection.

Transplantation,1995;59(3):347~52

【4】Norman—DJ,Transplant proc,1993;25(2,Suppl 1):1~3

【5】Rowe·PA,et a1.Long-ternl outcome of the use of OKT3 to treat steroid-resistant acute renal

aliografl rejection。Transpl—Int,1 994;7(4):278--。83

【6】Kumano-K,et a1.Long-term efficacy of OKT3 for steroid-resistant acute rejection in renal

transplant patients.Transplant proc,1 996;28:1 354~5

【7】Norman·DJ,et a1.Transplant proc,1993;55(1):45~50

【8】Abramowicz—D,et a1.The Long-Term Effects of Prophylactic Okt3 Monoclonal Antibody in

Cadaver Kidney Transplantation·A Single—Center,Prospective,Randomized Study.Transplant

proc,1992;54(3)433~7

【9】Parlevliet—KJ,et a1.Transpl·Int,1995;8(2):14l~6

(10】Norman—DJ,et a1.Transpl·Int,1994;7(5):356—61

【l l】Woodle ES,Danlin X,Zivin RA,et a1.Phase I trial of a humanized,Fc receptor nonbinding OKT3

antibody,huOKT3 gammal(Ala-Ala)in the treatment of acute renal allografi

rejection.Transplantation 1 999;68:608.

【1 2】Utset TO,Auger JA,Peace D,et a1.Modified anti—CD3 therapy in psoriatic arthritis:a phase I/II

clinical trial.J Rheumat01.2002 Sep;29(9):l907-1 3.

【13】Kevan C.Heroldl,Stephen E.Gitelman2,et ai.A Single Course of Anti-CD3 Monoclonal

Antibody hOKT3T1(Ala-AI曲Results in Improvement in C-Peptide Responses and Clinical

Parameters for at Least 2 Years afier Onset of Type l Diabetes Diabetes 54:l 763-1 769.2005

【1 4】Richards,J.,and Bluestone,J.A.Phase I Evaluation of Humanized OKT3:Toxicity and

lmmunomodulatory Effects ofhOKT394.CANCER RESEARCH 59,2096-2 1 0 1,May l,1999

【1 5】Douglas J.N,Flavio V,et ai.Phase I Trial of HUM29 1,A Humanized Anti—CD3

【1 6】Antibody,In Patients Receiving Renal Allografts From Living Donors.Transplantation 2000;70,

1707-1712.

【l 7】Frangoul HA,Lin MT,Carpenter P,et a1.Anti·CD3 antibody HUM29 1 induces peripheral T cell

apoptosis in patients with acute graft versus host disease(GVHD)following allogeneic

hematopoietic cell transplantation(HCT).Proc Am Soc Hematol 1 998;448a.

【1 8】Carpenter PA,Pavlovic S,Tso JY,et a1.Non-Fc receptorbinding humanized anti-CD3 antibodies

induce apoptosis of activated human T cells.dImmunoL 2000;1 65:6205—62 1 3.

【1 9】Carpenter PA,Appelbaum FR,Corey L,et a1.A humanized non·FcR·binding anti-CD3 antibody,

.119—

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第二军医大学博士学位论文

visilizumab,for treatment of steroid-refractory acute graft-versus—host disease.Blood.2002;99:

2712.2719.

【20】Carpenter PA,Lowder Z Johnston L,et a1.A Phase II Multicenter Study of Visilizumab,

Humanized Anti-CD3 Antibody,to Treat Steroid—Refractory Acute Graft-versus—Host Disease

Biology ofBlood and Marrow Transplantation l l:465-471(2005)

【2 1】Plevy S,Salzberg B,Van Assche G,Regueiro M,Sandborn W,Hanauer S,Targan S,Mayer L,

Mahadevan U,Lowder J:A humanized anti—CD3 monoclonal antibody,visi lizumab,for the

treatment of severe steroid refractory ulcerative colitits:results of a Phase I study.

Gastroenterology 2004,1 26:A579.

【22】Targan S,Salzberg B,Mayer L,Hommes D,Hanauer S,Mahadevan U,Reinisch W,Plevy S,

Dignass A.van AsscheGet a1.:A phase l·lI:multi—dose levels ofvisilizumab are well tolerated and

produce rapid and sustained improvement in ulcerative colitis patients refractory to treatment with

iV steroids(IVSRUC).Gastroenterology 2005,1 28:A493.

.120-

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及其体内药物动力学一药效学研究

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

李晶,女,1967年出生,博士研究生。被评为07年上海市优秀学科带头人,

承担国家863“疫苗与抗体"重大项目一项(项目编号:2006AA02A248,新型治疗

器官移植排斥及银屑病单抗药物的临床研究,1210万元)、上海市优秀学科带头人

项目一项(项目编号:07XDl421 l,新型抗EGFR人源化单抗的大规模细胞培养及工

艺研究,30万元)、上海市重大科技攻关项目一项(项目编号:074319108,抗CD25

抗体等药物的临床前研究,120万元)。获资助会额共计1360万元。

在读期间发表论文

Ying MA,Bi—tong LIN,Bei L1N,Sheng HOU,Wei-zhu QIAN,』ing L!,et a1.Pharmacokinetics

of CTLA4Ig fusion protein in healthy volunteers and patients with rheumatoid arthritis.Acta

Pharmacologica Sinica(2009)30:364-37 1(SCI,Impact Factor:1.677)

』i鸳必,Xinyan Li,Min Tan,et a1.Two doses of humanized anti—CD25 antibody in renal

transplantation:a preliminary comparative smdy MAbs(Landes Bioscience)2009,l(1):49·55

Xian—ping LI,:!i盟g L!,Heng YAN,et a1.Pharmacokinetic and pharmacodynamic study of

LFA3 lg fusion protein in healthy volunteers and patients with psoriasis.Acta Pharmacol Sin

2008;29(9):1 077-1 086(SCl,Impact Factor:1.677)

李佐刚,奎量,闻镍等。《重组人125I—CTLA4Ig在大鼠体内吸收、组织分布及排泄的药代

动力学研究》,药物分析杂志2007,27(7)949-952

李先平,李晶,王皓,郭弧军。《银屑病生物治疗研究进展》,中国医药生物技术2007,

2(3):207—2ll

苏颖杰,李品,姚明辉,贡沁燕。《重组人血小板生成冈子对辐射后C57小鼠及M07e细

胞的保护作用》,中国临床药理学与治疗学2007,12(1):66.71

林碧蓉,奎量,王皓。《重组人LFA3-lg融和蛋白体内外生物活性研究》,现代免疫学

2006,26(5):357-361

《生物制药学》(第二版),Gary Walsh著,宋海峰,奎量,等译。化学丁业出版社,北京,

2006,56万字。

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下一

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第二军医大学博士学位论文

致谢

本课题是在导师郭亚军教授的悉心指导下完成的,期间得到了导师组成员及全所

同志的大力支持和无私的帮助。在此一并表示衷心的感谢。

该研究工作得到了国家“973 99“863”计划、国家自然科学基金、上海市科委基

金的支持。此外,本研究是第二军医大学,抗体药物国家工程研究中心,上海市细胞

工程和单克隆抗体重点实验室的联合研究项目,非常感谢对方给予的鼎力支持。

该项研究的成果属于第二军医大学肿瘤研究所及其合作单位。本人承诺:该研

究一切相关资料(包括方法、数据、图象和图表)的使用和发表均通过本单位及导师

的同意。

一122.

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重组抗CD3人源化单克隆抗体体外药效学及体内药物动力学-

药效学研究作者: 李晶

学位授予单位: 第二军医大学

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本文链接:http://d.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1504378.aspx