1, gÉnkÖnyvtÁrak alkalmazÁsa 2, expressziÓs rendszerek 3, fehÉrje interakciÓn alapulÓ

1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA

2, EXPRESSZIÓS RENDSZEREK

3, FEHÉRJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK

4, IN VITRO MUTAGENEZIS

Buday László

GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSABuday László

Teljes DNS kivonat:pl. teljes genomiális DNS vagy

teljes cDNS adott szövetből

Specifikus amplifikáció (DNS klónozás)

Specifikus kimutatás

PCR alapú in vitroDNS klónozásSejt alapú klónozás Molekuláris hibridizáció

1. megfelelő gazdasejt2. vektor3. A klónozni kívánt génligálása a vektorba, majd a gazdasejt transzfekciója

1. Termostabil DNS Polimeráz

2. A klónozni kívánt DNSszakasz legalább részlegesismerete -- oligonukleotidok

1. Jelzett DNS vagy RNS próba

2. Eljárás, mellyel kimu-tatjuk a próbát kötőgéneket

EGY GÉN PLAZMID VEKTORBA VALÓ KLÓNOZÁSÁNAK ÁLTALÁNOS MENETE I.

Molecular Cell Biology,Lodish, 1995American Scientific Books

EGY GÉN PLAZMID VEKTORBA VALÓ KLÓNOZÁSÁNAK ÁLTALÁNOS MENETE II.


E. coli PLAZMIDOK HASZNÁLATÁNAK KORLÁTAI

1, Rövid DNS szakaszok befogadására alkalmasak(maguk a plazmidok 3-10 kb nagyságúak)

2, E. coli transzformációjának rossz hatásfoka (elektroporáció, hő-sokkolás, stb. – fizikális behatások)

3, Maximum néhány száz egyedi E. coli kolónia vizsgálhatóegy 10 cm-es petri csészében

Ha pl. az emberi genomot (3 x 109 bp) szeretnénk E.coli-bankifejezni, ez lehetetlen lenne.

Megoldás másik vektor λ –bakteriofág használata

A LAMBDA-BAKTERIOFÁG SZERKEZETE

Fertőzésnél a fág az E.coli felszínén található receptorhoz kötődikés a baktériumba lövi a DNS-ét.


A λ-FÁG SZERKEZETE II.

(kb. 60 gént kódol)

Fej Nyak Lítikus funkció

Tetszőleges génrekicserélhető fágDNS darab (kb. 20-25 kbnagyságú gént lehet ideklónozni)

Az itt kódolt gének nem nélkülözhetetlenek afág-fertőzéshez

MIÉRT ELŐNYÖS TEHÁT A λ-FÁG A PLAZMIDDAL SZEMBEN?

1, Nagyobb DNS darabot lehet bele klónozni2, Receptorhoz kötődve a baktérium felszínén kb. 1000x jobb hatásfokkal juttatja be a DNS-t az E.coli-ba, mint azplazmiddal történő transzformáció esetén történik

Eukarióta sejtek genomját tipikusan olyan restrikciós enzimmelemésztik meg, mely 4-bázispár hosszú DNS szekvenciát ismer fel.Ilyen a Sau3A vagy MboI, melyek 44=256 bázispáronként hasítanak. Ezek a fragmentek túl kicsik lennének, ezért részleges emésztés történik,pl. alacsony enzim koncentrációval és rövid emésztési idővel.Így kb. 20 kb DNS fragmentek jönnek létre (ezek a fágba illeszthetőek).

HUMÁN GENOM: 3 x 109 bp

20 kb (2 x 104 bp)

1,5 x 105 darab rekombináns fág

Ezek összességét nevezzük GÉNKÖNYVTÁRNAK

Sajnos a 1,5 x 105 db DNS-ben átfedő szekvenciák is vannak, ezértkb. 106 rekombináns fág szükséges ahhoz, hogy a teljes humángenom 90-95%-os valószínűséggel reprezentálva legyen.

A lambda-fággal való munka során nagyon kis méretű ún. plakkokat lehet az E-coli réteget tartalmazó petri csészében felismerni: azaz egy petri csészében kb. 5 x 104 plakkot lehet vizsgálni

Tehát 20-30 petri csészében lehet a teljes emberi genomot vizsgálni

Érdekesség: ha sikerülne a humán genomot recombináns plazmidbanelőállítani (106 db plazmid), akkor a genom vizsgálatához5000 petri csésze kellene (kb. 200 E. coli kolóniát lehetegy petri csészén vizsgálni).

EGYÉB VEKTOROK

Vektor típusa DNS hossza (kb)--------------------------------------------------------------------------------

Plazmid 5-15

λ-bakteriofág 10-25

Cosmid 30-45

P1 bakteriofág vektor 70-100

BAC (bacterial arteficial chromosome) max. 300

YAC (yeast arteficial chromosome) 200-2000

A DNS maximális hossza, amit a vektorokba lehet klónozni.

cDNS KÖNYVTÁR

-- míg egy állat vagy ember összes sejtmaggal rendelkező sejtjeugyanazzal a génállománnyal rendelkezik, addig a különbözőtipusú sejtek, illetve szövetek eltérő fehérje-mintázatot expresszálnak

-- pl. ALBUMIN-t csak májsejtek termelnek, így albumint kódoló mRNScsak májsejtekben szintetizálódik

-- ha izoláljuk az adott sejttípusban megtalálható összes mRNS-t, majdezekről REVERZ TRANSZKRIPTÁZ segítségével COMPLEMENTÁRISDNS-t (cDNS) készítünk és az összes cDNS-t plazmidba vagy fágbaklónozzuk, akkor ún. cDNS KÖNYVTÁRHOZ jutunk

Fontos: a génkönyvtár azonos minden ember minden sejtmaggal rendelkező sejtjében (ezért gyakran vérsejtekből készítik), míg a cDNS könyvtár sejttől, szövettől függően eltérő!!!

cDNS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK MENETE

Human Molecular GeneticsStrachan & Read, 1999BIOS Scientific Publisher Ltd.

EGY ADOTT GÉN KIVÁLASZTÁSA GÉN- VAGY cDNS KÖNYVTÁRBÓLHIBRIDIZÁCIÓVAL TÖRTÉNIK

Dupla szálú DNS

DNS megolvasztása

Egyszálú DNS

Filterhez kötés

Jelölés jelzett DNS próbával

Hibridizált DNS

Nem kötődőDNS próbák

kimosásaAutoradiográfia

HIBRIDIZÁCIÓS PRÓBÁK FAJTÁI


A HIBRIDIZÁCIÓRA ALKALMAS PRÓBÁK JELÖLÉSE

Lehet: 1, Izotóppal jelölni (3H, 32P, 33P, 35S)

2, Nem izotópos jelölés

a, fluoreszcens festékekb, biotin-straptavidinc, digoxigenin (specifikus ellenanyag van ellene)

A JELÖLÉSE MÓDJA (in vitro) SZERINT LEHET:

1, DNS jelölés „nick” transzláció segítségével2, DNS jelölés random primerek segítségével3, Jelölés PCR segitségével4, DNS végének jelölése

DNS JELÖLÉS RANDOM PRIMEREK SEGÍTSÉGÉVEL

Random primer: minden lehetséges variációja a hexanukleotidnak


EGY GÉN AZONONOSÍTÁSÁNAK ÁLTALÁNOS MENETE GÉN- VAGY cDNS KÖNYVTÁRBÓL


A NUKLEINSAVAK HIBRIDIZÁCIÓJÁNAK OPTIMALIZÁLÁSA

A hibridizáció hatásfoka függ: a denaturáló hőmérséklettőla só koncentrációtól (NaCl)a próba/nukleinsav aránytóla próba és DNS komplementaritásától


A HIBRIDIZÁCIÓ HŰSÉGE (HYBRIDIZATION STRINGENCY)

Ha csökkentjük a hibridizáció hőmérsékletét, illetve emeljük aa hibridizáció reakcióelegyében NaCl koncentrációját, akkor csökkentjük a hibridizáció hűségét:

a próba és a kihalászott nukleinsav szekvenciája nem lesz teljesen komplementer

ez nagyon fontos megfigyelés, mely alapja lehet homológ gének, illetve új géncsaládok azonosításának, klónozásának

ISMERT NUKLEINSAV HIBRIDIZÁCIÓS TECHNIKÁK

ELJÁRÁS NEVE A KIMUTATANDÓ NUKLEINSAV----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Dot-blot DNS, RNS minta, egy helyre felcsöppentve a membránra

Southern-blot Gyakran genomiális DNS, gélelektoforézissel elválasztva, membránhoz kötve

Northern-blot Teljes sejt-RNS vagy mRNS, gélelektroforézisselelválasztva, membránhoz kötve

Koromoszóma Gyakran metafázisos kormoszómák (DNS), in situ hibridizáció tárgylemezen

Szöveti in situ Tárgylemezen fixált sejtek RNS-ehibridizáció

REVERZ NUKLEINSAV HIBRIDIZÁCIÓS TECHNIKÁK

ELJÁRÁS NEVE A KIMUTATANDÓ NUKLEINSAV----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Reverz Dot-blot oligonukleotidok egy helyre felcsöppentve a membránon

DNS microarray (DNS chip) DNS klónok robot segítségével rögzítvetárgylemezekre

Oligonukleotid microarray oligonukleotidok robot segítségével rögzítvetárgylemezekre

SOUTHERN ÉS NORTHERN BLOT ELVE


PÉLDA A NORTHERN-BLOT ELJÁRÁSRA


1, gÉnkÖnyvtÁrak alkalmazÁsa 2, expressziÓs rendszerek 3, fehÉrje interakciÓn alapulÓ

Documents