1. ขอบข าย - fic.nfi.or.thfic.nfi.or.th/law/upload/file1/th_478.pdf · ฐานข...

ฐานขอมูลสถาบันอาหาร

มาตรฐานผลิตภัณฑวิธีวิเคราะหอาหารทางจุลชีววิทยาสํ าหรับอาหารกระปอง (มอก. 335 เลม 1-2523) 1/24

มาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมวธิีวิเคราะหอาหารทางจุลชีววิทยาอาหารกระปอง

(มอก.335 เลม 1-2523)

1. ขอบขาย1.1 มาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมนี้กํ าหนด วิธีวิเคราะหอาหารทางจุลชีววิทยาสํ าหรับ

อาหารกระปองที่แบงตามความเปนกรด-ดาง เปน 3 ประเภท ดังนี้(1) อาหารที่มีความเปนกรดตํ่ า (low acid food)(2) อาหารที่มีความเปนกรด (acid food)(3) อาหารที่มีความเปนกรดสูง (high acid food)

2. บทนิยามความหมายของคํ าที่ใชในมาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมนี้ มีดังตอไปนี้2.1 อาหารกระปอง หมายถึง ผลิตภัณฑตามมาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมของอาหาร

กระปองนั้น ๆ โดยจะตองผานกรรมวิธีใชความริ้น เพื่อทํ าลายหรือยับยั้งการขยายพันธุของจุลินทรีย

2.2 อาหารที่มีความเปนกรดตํ่ า หมายถึง อาหารที่มีความเปนกรดดาง สูงกวา 4.5 เชน ปลาทูนากระปอง ปลาซารดีนกระปอง เปนตน

2.3 อาหารทีม่ีความเปนกรด หมายถึง อาหารที่มีความเปนกรด-ดาง ระหวาง 3.7 ถึง 4.5 เชน สับปะรดกระปอง ล้ินจี่กระปอง เงาะกระปอง เปนตน

2.4 อาหารทีม่ีความเปนกรดสูง หมายถึง อาหารที่มีความเปนกรด-ดาง ตํ่ ากวา 3.7 เชน นํ้ าสับปะรดกระปอง เปนตน

3. เครื่องมือและอุปกรณเครือ่งมือและอุปกรณที่ใชในการวิเคราะห มีดังตอไปนี้3.1 ตูเพาะเชื้อ (incubator)3.2 เครื่องฆาเชื้อความรอนแหง (hot air sterilizer)3.3 หมอนึ่งอัด (autoclave)3.4 เครื่องอังนํ้ า (water bath)3.5 เครื่องนับโคโลนี (colony counter)



3.6 กลองจุลทรรศน (microscope) กระจกสไลด (slide) และกระจกปด (coverslip)3.7 เครื่องวัดความเปนกรด-ดาง (pH meter)

3.8 เครื่องชั่ง3.9 เครื่องกรองจุลินทรีย (micro filter)3.10 ตะเกียง (burner)

3.11 เครื่องเปดกระปองที่สามารถลนไฟฆาเชื้อได3.12 แผนแกวแบบโฮเวริดสํ าหรับนับเชื้อรา (Howard mold counting chamber)3.13 ภาชนะเพื่อช่ังตัวอยางอาหาร

3.14 หลอดทดลองหรือขวดแกวที่มีจุกสํ าลีหรือฝาเกลียว3.15 หลอดทดลองขนาด 13 มิลลิเมตร x 125 มิลลิเมตร และ 16 มิลลิเมตร x 150 มิลลิเมตร3.16 หลอดแกวเล็ก (Durham tube) ขนาด 10 มิลลิเมตร x 75 มิลลิเมตร3.17 เครื่องตีปน (blender)3.18 ปเปตที่มีจุกสํ าลีอยูดานในตอนปลายที่จะดูด (pipette, cotton-plugged)3.19 จานเพาะเชื้อ (petri dish) ขนาดเสนผานศูนยกลาง 90 มิลลิเมตร หรือ 100 มิลลิเมตร3.20 ขวดสํ าหรับใสสารละลายเพื่อเจือจาง (dilution bottle)3.21 ขวดแกว (flask)

หมายเหตุ : ขอ 3.13 ถึง 3.19 ตองทํ าใหปราศจากเชื้อ

4. สารละลายเพื่อเจือจาง อาหารเลี้ยงเชื้อ และวิธีเตรียม4.1 สารละลายเพื่อเจือจาง (dilution blanks)

4.1.1 สารละลายเพื่อเจือจางธรรมดา (dilution blanks, plain) ตวงนํ้ ากลั่นปริมาณมากพอทีภ่ายหลังจากการฆาเชื้อแลวจะเหลือปริมาตร 90 ลูกบาศกเซนติเมตร ใสในขวดแกวทนความรอน ปดดวยจุกหรือฝาเกลียว นํ าไปฆาเชื้อในหมอนึ่งอัด อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสคาล (15 ปอนดตอตารางนิ้ว) นาน 20 นาที

4.1.2 สารละลายเพื่อเจือจางที่ใสทราย (dilution blands with sand) เตรยีมเชนเดียวกับขอ 4.1.1 แตใสทรายบริสุทธิ์ประมาณ 10 กรัม ในแตละขวดกอนฆาเชื้อ

4.1.3 สารละลายเปปโตนรอยละ 0.1 ของนํ้ าหนักเพื่อเจือจาง (peptone dilution blanks 0.1%)ช่ังเปปโตนหนัก 1 กรัม ใสในนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร แลวนํ าสารละลายนี้มาเตรียมเชนเดียวกับขอ 4.1.1

4.1.4 สารละลายฟอสเฟตบฟัเฟอรเพื่อเจือจาง (phosphate buffered dilution blanks)



(1) สารละลายที่เก็บไวใช (stock solution)ช่ังโมโนโปตัสเซียมฟอสเฟต (monopotassium phosphate) หนัก 34 กรัม ละลายในนํ้ ากลั่น 500 ลูกบาศกเซนติเมตร ปรับใหมีความเปนกรด-ดาง 7.2 ดวยสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซดความเขมขน 1 โมลตอลูกบาศกเดซิเมตร แลวเติมนํ้ ากลั่นใหไดปริมมาตรครบ 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

(2) สารละลายเพื่อเจือจาง (dilution blanks)ดดูสารละลายที่เก็บไวใช (ขอ 1) ดวยปเปตมา 1.25 ลูกบาศกเซนติเมตร ใสขวดแกวปริมาตร เติมนํ้ ากลั่นใหครบ 1 ลูกบาศกเดซิเมตร แลวนํ าสารละลายนี้มาเตรียมเชนเดียวกับขอ 4.1.1

4.1.5 สารละลายเกลือเพื่อเจือจาง (saline dilution blanks)ช่ังโซเดียมคลอไรดหนกั 8.5 กรัม ใสในนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร แลวนํ าสารละลายนี้มาเตรียมไวเชนเดียวกับขอ 4.1.1

4.2 อาหารเลี้ยงเชื้อและวิธีเตรียม4.2.1 คุกมีตมีเดียม (cooked meat medium)

หวัใจววับด หรือเนื้อลูกวัวบด (ปราศจากไขมัน) 1 000 กรัมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซดความเขมขน 0.05 โมลตอลูกบาศกเดซิเมตรจํ านวน 1 ลูกบาศกเดซิเมตรนวิเตรียนตบรอทหมายเลข 2 บีฟเอกซแตรกต (beef extract) 10 กรัม เปปโตน (peptone) 10 กรัม โซเดียมคลอไรด (sodium chloride) 5 กรัมละลายสวนผสมทั้งหมดลงในนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร ตมใหเดือด 10 นาที กรอง ปรับใหมีความเปนกรด - ดาง ประมาณ 7.5

ตมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด 1 ลูกบาศกเดซิเมตร ใหเดือดแลวเติมหัวใจวัวบดหรือเนือ้ลูกววับด คนใหเขากันตมใหเดือดนาน 20 นาที คนบอย ๆ ระหวางตม ตักสวนเปนไขมนัออก ปรับความเปนกรด-ดาง ใหไดประมาณ 7.5 กรองดวยผาโปรงสํ าหรับดูดซึมหรือผามสัลิน บีบเอานํ้ าออกแผเนื้อลงบนกระดาษกรองเพื่อทํ าใหแหงพอหมาด ๆ ที่อุณหภูมิไมเกิน 50 องศาเซลเซียส แบงเนื้อใสในหลอดทดลองใหมีปริมาณของเนื้อสูง 2.5 เซนติเมตร เติมนวิเตรียนตบรอทหมายเลข 2 ใหสูงประมาณ 4 เซนติเมตร ปดฝาฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสคาล นาน 20 นาที4.2.2 เซเลไนตซีสตีนบรอท (selenite cystine broth)

ทริปโตน (tryptone) 5 กรัม



แลกโตส (lactose) 4 กรัม ไดโซเดียมฟอสเฟต (disodium phosphate) 10 กรัม โซเดียมแอซดิเซเลไนต (sodium acid selenite) 4 กรัม แอล-ซีสตีน (L-cystine) 0.01 กรัม นํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดละลายในนํ้ ากลั่นตมใหเดือด เทใสหลอดทดลองที่ปราศจากเชื้อใหมีความสงูอยางนอย 5 เซนติเมตร ปดจุก (ควรมีความเปนกรด - ดาง สุดทายประมาณ 7.0) ควรใชอาหารเลี้ยงเชื้อนี้ใหหมดภายในวันที่เตรียม4.2.3 เดกซโตรสทรปโตนบรอมครีซอลเพอรเพิลบรอท (dextrose trytone bromeresol

purple broth)ทริปโตน หรือทริปติเคส (trypticase) 10 กรัมเดกซโตรส (dextrose) 5 กรัมบรอมครีซอลเพอรเพิล (bromcresol purple) 0.04 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่นคนใหละลาย แบงใสหลอดทดลองขนาด 16 มิลลิเมตร x 150 มลิลิเมตร หลอดละประมาณ 10 ลูกบาศกเซนติเมตร ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียสความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาที (ควรมีความเปนกรด-ดางสุดทาย ประมาณ 6.8)4.2.4 เตตระไทโอเนตบรอท (tetrathionate broth)

โพลิเปปโตน (polypeptone) 5 กรัมไบลซอลต (bile salts) 1 กรัมคัลเซียมคารบอเนต (calcium carbonate) 10 กรัมโซเดียมไทโอซัลเฟต (sodium thiosulphate) 30 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดละลายในนํ้ ากลั่น ตมใหเดือด ทํ าใหเย็นลงจนอุณหภูมิตํ่ ากวา 45 องศาเซลเซียสแลวเติมสารละลายไอโอดีน 20 ลูกบาศกเซนติเมตร (ละลายไอโอดีน 6 กรัม โปตัสเซียมไอโอไดด 5 กรัม ในนํ้ ากลั่น 20 ลูกบาศกเซนติเมตร) เขยาใหเขากัน หามนํ าไปตมอีก แลวแบงใสหลอดทดลองที่ฆาเชื้อแลวหลอดละ 10 ลูกบาศกเซนติเมตร ควรใชอาหารเลี้ยงเชื้อนี้ใหหมดภายในวันที่เตรียม4.2.5 ทริปโตนกลูโคสเอกซแตรกตซอลตบรอท (tryptone glucose extract salt broth)

ทริปโตนหรือทริปติเคส 5 กรัมกลูโคส (glucose) 1 กรัม



ยีสตเอกซแตรกต (yeast extract) 2.5 กรัมโซเดียมคลอไรด 6.5 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

ละลายสวนผสมทั้งหมดในนํ้ ากลั่น แบงใสหลอดทดลองหลอดละ 8 ถึง 10 ลูกบาศกเซนตเิมตร ปดจุกฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาลนาน 15 นาที (ควรมีความเปนกรด - ดาง สุดทายประมาณ 7.0)4.2.6 ทริเปลซูการไอรออนอะการ (triple sugar iron agar)

บีฟเอกซแตรกต 3 กรัมยีสตเอกซแตรกต 3 กรัมเปปโตน 15 กรัมโปรตีโอสเปปโตน 5 กรัมแลกโตส 10 กรัมซักคาโรส (saccharose) 10 กรัมเดกซโตรส 1 กรัมไอรออน (II) ซัลเฟต (iron (II) sulphate) 0.2 กรัมโซเดียมคลอไรด 5 กรัมโซเดียมไทโอซัลเฟต 0.3 กรัมอะการ 12 กรัมฟนอลเรด 0.024 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แบงใสหลอดทดลองขนาด 16 มิลลิเมตร x 150 มลิลิเมตร หลอดละ 1 ใน 3 ของหลอด ปดจุกฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาที (ควรมีความเปนกรด - ดางสุดทายประมาณ 7.4) วางหลอดใหเอียง (slant) จนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัว เพื่อเก็บไวใชตอไป4.2.7 ทริปโตนบรอทรอยละ 1 (tryptone btoyh 1%)

ทริปโตน 1 กรัมนํ้ ากลั่น 100 ลูกบาศกเซนติเมตร

นํ าทรปิโตนใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แบงใสหลอดทดลองหลอดละ 8 ถึง 10 ลูกบาศกเซนตเิมตร ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 10.43 กิโลปาสคาล นาน 15 นาที4.2.8 เทลลูไรตไกลซีนอะการ (tellurite glycine agar)

ทริปโตนหรือทริปติเคส 1.0 กรัม



ยีสตเอกซแตรกต 0.5 กรัมแมนนิตอล (mannitol) 0.5 กรัมไดโปตัสเซียมฟอสเฟต (dipotassium phosphate) 0.5 กรัมลิเทียมคลอไรต (lithium chloride) 0.5 กรัมไกลซีน (glycine) 1.0 กรัมอะการ 2.0 กรัมนํ้ ากลั่น 100 ลูกบาศกเซนติเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสคาล นาน 15 นาที (ควรมีความเปนกรด - ดางสุดทายประมาณ 7.2) ทํ าใหเย็นประมาณ 45 องศาเซลเซียส เติมสารละลายโปตัสเซียมเทลลูไรตรอยละ 1 ในนํ้ ากลั่นที่ปราศจากเชื้อ 2 ลูกบาศกเซนติเมตร จะไดความเขมขนของสารละลายโปตัสเซียมเทลลไูรตรอยละ 0.02 เทใสจานเพาะเชื้อจานละประมาณ 20 ลูกบาศกเซนตเิมตร วางไวใหผิวหนาแหงกอนใช4.2.9 นวิเตรียนตอะการ (nutrient agar)

บีฟเอกซแตรกต 3 กรัมเปปโตน 5 กรัมอะการ 15 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แบงใสหลอดทดลอง ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาที (ควรมคีวามเปนกรด-ดาง สุดทายประมาณ 6.8) วางหลอดใหเอียงจนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตวั เพื่อเก็บไวใชตอไป4.2.10 บริลลิแอนตกรีนแลกโตสไบลบรอทรอยละ 2 (brilliant green lactose bile broth

2%)เปปโตน 10 กรัมแลกโตส 10 กรัมออกซกอลล (oxgall) 20 กรัมบริลลิแอนดกรีน (brilliant green) 0.013 3 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

ละลายเปปโตนและแลกโตสในนํ้ ากลั่นประมาณ 500 ลูกบาศกเซนติเมตร ละลาย ออกซกอลลในนํ้ ากลั่น 200 ลูกบาศกเซนติเมตร สารละลายนี้ควรมีความเปนกรด - ดาง อยูในระหวาง 7.0 ถึง 7.5 ผสมสารละลายทั้ง 2 เขาดวยกัน แลวเติมนํ้ ากลั่นใหมีปริมาตร



ประมาณ 975 ลูกบาศกเซนติเมตร ปรับใหมีความเปนกรด - ดางประมาณ 7.4 ใส บริลลิแอนตกรีน แลวเติมนํ้ ากลั่นใหครบ 1 ลูกบาศกเดซิเมตร แบงสารละลาย 10 ลูกบาศกเซนติเมตร ใสหลอดทดลองขนาด 16 มิลลิเมตร x 150 มลิลิเมตร ซ่ึงมีหลอดแกวเล็กควํ ่าอยูภายใน ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาที4.2.11 บริลลิแอนตกรีนอะการ (brilliant green agar)

โพลิเปปโตนหรือโปรตีโอสเปปโตนหมายเลข 3(polypeptone or proteose peptone) 10 กรัมโซเดียมคลอไรด 5 กรัมยีสตเอกซแตรกต 3 กรัมแลกโตส 10 กรัมซักคาโรส 10 กรัมฟนอลเรด 0.08 กรัมบริลลิแอนตกรีน 0.012 5 กรัมอะการ 20 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แบงใสหลอดทดลองหรือขวดแกว ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาที (ควรมคีวามเปนกรด - ดางสุดทายประมาณ 6.9) ทํ าใหมีอุณหภูมิประมาณ 45 องศาเซลเซยีส เทใสจานเพาะเชื้อจานละประมาณ 20 ลูกบาศกเซนติเมตร วางไวใหผิวหนาแหงกอนใช4.2.12 บฟีฮารตอินฟวชันมีเดียม (beef heart infusion medium)

เปปโตน 10 กรัมโซเดียมคลอไรด 5 กรัมหวัใจวัว (ปราศจากไขมัน) 500 กรัม

น ําหวัใจววัมาบด เติมนํ้ ากลั่นลงไป 1 ลูกบาศกเดซิเมตร เก็บไวในตูเย็นหนึ่งคืน ตมใหเดอืด นาน 15 นาที หรือผานไอนํ้ า 30 นาที แยกเอาสวนที่เปนเนื้อและเปนนํ้ าออกจากกันโดยกรองผานผาหนา ๆ 2 คร้ัง เติมเปปโตนและโซเดียมคลอไรดลงในสวนที่เปนนํ้ า เติมนํ้ าจนมีปริมาตรครบ 1 ลูกบาศกเดซิเมตร ปรับใหมีความเปนกรด - ดาง 7.6 ดวยสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซดความเขมขน 1 โมลตอลูกบาศกเดซิเมตร ตมใหเดือดนาน 15 ถึง 20 นาที หรือผานไอนํ้ า 30 นาที



แบงสวนที่เปนเนื้อลงในหลอดทดลองขนาด 16 มิลลิเมตร x 150 มิลลิเมตร ใหมีปริมาณของเนื้อสูง 2 เซนตเิมตร แลวเติมสวนที่เปนนํ้ าลงไปครึ่งหลอด ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 20 นาที ถาไมใชอาหารเลี้ยงเชื้อในวันที่เตรียม กอน

4.2.13 บิสมัทซัลไฟตอะการ (bismuth sulphite agar)บีฟเอกซแตรกต 5 กรัมเปปโตน 10 กรัมแลกโตส 10 กรัมออกซกอลล (oxgall) 20 กรัมบริลลิแอนตกรีน (brilliant green) 0.013 3 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดละลายในนํ้ ากลั่น ตมใหละลายแลวใหเดือดตอไปอีก 1 นาที คนอยางสมํ ่าเสมอเพื่อกันไมใหไหม (ควรมีความเปนกรด - ดางสุดทายประมาณ 7.7) ทํ าใหเยน็ประมาณ 45 องศาเซลเซียส เขยาเบา ๆ แลวเทใสจานเพาะเชื้อจานละประมาณ 20 ลูกบาศกเซนติเมตร วางไวใหผิวหนาแหงกอนใช4.2.14 บัฟเฟอรอะไซดกลูโคสกลีเซอรอลบรอท (buffered azide glucose glycerol

broth)ทริปโตสหรือโพลิเปปโตน 20 กรัมกลูโคส 5 กรัมไดโปตัสเซียมฟอสเฟต 4 กรัมโมโนโปตัสเซียมฟอสเฟต(monopotassium phosphate) 1.5 กรัมโซเดียมคลอไรด 5 กรัมโซเดียมอะไซด (sodium azide) 0.5 กรัมกลีเซอรอล (glycerol) 5 ลูกบาศกเซนติเมตรบอรมครีซอลเพอรพริล 0.015 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

ใสกลีเซอรอลลงในนํ้ ากลั่นเขยาใหเขากัน เติมสวนผสมที่เหลือลงไปอุนใหละลาย แบงใสหลอดทดลองหลอดละ 8 ถึง 10 ลูกบาศกเซนติเมตร ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 117 องศาเซลเซียส ความดัน 69 กิโลปาสคาล นาน 15 นาที (ควรมีความเปนกรด-ดาง สุดทาย ประมาณ 6.9)4.2.15 เบรนฮารตอินฟวชันบรอท (brain heart infusion broth)

นํ้ าซุปจากสมองลูกวัว



(calf brain, infusion from) 200 กรัมนาซุปจากหัวใจวัว(beef heart, infusion from) 250 กรัมโปรตีโอสเปปโตน 10 กรัมเดกซโตรส 2 กรัมโซเดียมคลอไรด 5 กรัมไดโซเดียมฟอสเฟต 2.5 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหเดือด แบงใสหลอดทดลองหรือขวดแกว ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสคาล นาน 15 นาท ี(ควรมีความเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 7.4)หมายเหตุ 1. วธีิเตรยีมนํ้ าซุปจากสมองลูกวัว นํ าสมองลูกวัวที่บดละเอียดแลว 200 กรัม

ใสนํ ้ากลั่น 200 ลูกบาศกเดซิเมตร ตมใหเดือดประมาณ 30 นาทีกรองใหใส แลวนํ านํ้ าซุปทั้งหมดมาใช

2. วธีิเตรยีมนํ ้าซุปจากหัวใจวัว นํ าหัวใจวัวที่บดละเอียดแลว 250 กรัม ใสนํ้ ากล่ัน 250 ลูกบาศกเดซิเมตร ตมใหเดือดประมาณ 30 นาที นํ านํ้ าซุปทั้งหมดมาใช

3. ถาไมใชอาหารเลี้ยงเชื้อในวันที่เตรียม กอนนํ าไปใชจะตองตมไลอากาศออกทีอุ่ณหภูมิ 100 องศาเซลเซียสประมาณ 3 นาที แลวทํ าใหเย็นทันที

4.2.16 โปเตโตเดซโตรสอะการ (potato dextrose agar)เดกซโตรส 20 กรัมอะการ 15 กรัมนํ้ าซุปจากมันฝรั่ง(potato, infusion from) 200 กรัมนํ้ ากลั่น 800 ลูกบาศกเซนติเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แบงใสหลอดแกวหรือขวดแกว ปดจุก ฆาเชือ้ในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121-องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสคาล นาน 15 นาที (ควรมคีวามเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 5.6) เมื่อจะใชตองปรับใหมีความเปนกรด-ดาง ประมาณ 3.5 ดวยกรดตารตาริก 0.696 โมลตอลูกบาศกเดซิเมตร (รอยละ 10 )ที่ปราศจากเชื้อหมายเหต : วธีิเตรียมนํ้ าซุปจากมันฝรั่ง

น ํามนัฝร่ังที่หั่นแลว 200 กรัม ใสนํ้ ากลั่น 500 ลูกบาศกเซนติเมตร ตมใหเดือด ประมาณ 15 นาที หรือจนกระทั่งออนนุม กรองผานผาฝาย



4.2.17 เพลตเคานตอะการ (plate count agar)ทริปโตน 5 กรัมยีสตเอกซแตรกต 2.5 กรัมเดกซโตรส 1 กรัมอะการ 15 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลายหมดแบงใสหลอดทดลองหรือขวดแกว ปดจกุ ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาท ี(ควรมีความเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 7.0)7.2.18 แมนนิตอลซอลตเอกโยลกอะการ 1 กรัม

(manntiol salt egg yolk agar)บีฟเอกซแตรกต 1 กรัมโปรตีโอสเปปโตน หรือ โพลิเปปโตน 10 กรัมโซเดียมคลอไรด 75 กรัมด-ีแมนนิตอล (d-mannitol) 10 กรัมฟนอลเรต 0.025 กรัมอะการ 15 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แลวใหเดือดตอไปอีก 1 นาที แบงใสหลอดทดลองหรือขวดแกวปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดนั 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาที (ควรมีความเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 7.4) ทํ าใหอุณหภูมิลดลงจนเหลือประมาณ 45 องศาเซลเซียส แลวเติมไขแดงดิบที่ปราศจากเชื้อ รอยละ 3 ของปริมาตร เขยาใหเขากัน เทใสจานเพาะเชื้อ วางไวใหผิวหนาแหงกอนใช4.2.19 มอลตอะกา (malt agar)

มอลตเอกซแตรกต 30 กรัมอะการ 15 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แบงใสหลอดทดลองหรือขวดแกว ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสคาล นาน 15 นาท ี (ควรมคีวามเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 5.5) เมื่อจะใชตองปรับใหมีความเปนกรด-ดางประมาณ 3.5 ดวยกรดแลกติก 1.132 โมลตอลูกบาศกเดซิเมตร (รอยละ 10) ที่ปราศจากเชื้อ



4.2.20 ยูเรียบรอท (ures broth)ยีสตเอกซแตรกต 0.1 กรัมโมโนโปตัสเซียมฟอสเฟต 9.1 กรัมไดโซเดียมฟอสเฟต 9.5 กรัมยูเรีย 20 กรัมฟนอลเรด 0.01 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

นํ าสวนผสมทั้งหมดละลายในนํ้ ากลั่น ทํ าใหปราศจากเชื้อโดยผานเครื่องกรองจุลินทรีย แบงใสหลอดทดลองขนาด 13 มิลลิเมตร x 125 มิลลิเมตร ที่ปราศจากเชื้อ หลอดละ 3 ลูกบาศกเซนติเมตร (ควรมีความเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 6.8)4.2.21 ลีวายนอีเอ็มบีอะการ (Levine eosin methylene blue agar or Levine EMB agar)

เปปโตน 10 กรัมแลกโตส 10 กรัมไดโปตัสเซียมฟอสเฟต 2 กรัมอะการ 15 กรัมอีโอซิน วาย (eosin Y) 10 กรัมเมทิลีนบลู (methylene blue) 0.4 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แบงใสหลอดทดลองหรือขวดแกว ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาท ี (ควรมคีวามเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 7.1) เทใสจานเพาะเชื้อจานละประมาณ 20 ลูกบาศกเซนติเมตร วางไวใหผิวหนาแหงกอนใช4.2.22 ลอริลทริปโตสบรอท (lauryl tryptose broth)

ทริปโตส (tryptose) 20.0 กรัมแลกโตส 5.0 กรัมไดโปตัสเซียมฟอสเฟต 2.75 กรัมโมโนโปตัสเซียมฟอสเฟต 2.75 กรัมโซเดียมคลอไรด 5.00 กรัมโซเดียมลอริลซัลเฟต (sodium lauryl sulphate) 0.1 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

ละลายสวนผสมทั้งหมดในนํ้ ากลั่น แบงใสหลอดทดลองขนาด 16 มิลลิเมตร x 150 มลิลิเมตร ซ่ึงมีหลอดแกวเล็กควํ่ าอยูภายใน หลอดละ 10 ลูกบาศกเซนติเมตร ปดจุก ฆาเชื้อ



ในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาที (ควรมคีวามเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 6.8)4.2.23 แลกโตสบรอท (lactose broth)

บีฟเอกซแตรกต 3 กรัมเปปโตน 5 กรัมแลกโตส 5 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดละลายในนํ้ ากลั่น แบงใสขวดแกวขวดละ 80 ลูกบาศกเซนติเมตร ปดจกุ ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาท ี(ควรมีความเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 6.9)4.2.24 ไลซีนไอรออนอะการ (lysine iron agar)

เปปโตน 5 กรัมยีสตเอกซแตรกต 3 กรัมเดกซโตรส 1 กรัมแอล-ไลซีน (L-lysine) 10 กรัมไอรออน (III) อัมโมเนียมซิเตรต(iron (III)ammonium citrate) 0.5 กรัมโซเดียมไทโอซัลเฟต 0.04 กรัมบรอมครีซอลเพอรเพิล 0.02 กรัมอะการ 14.5 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แบงใสหลอดทดลองขนาด 13 มิลลิเมตร x125 มลิลิเมตรหลอดละ 4 ลูกบาศกเซนติเมตร ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาลนาน 15 นาที (ควรมีความเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 6.7) วางหลอดใหเอียงจนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัวเพื่อเก็บไวใชตอไป4.2.25 เอสเอสอะการ (S.S. agar)

บีฟเอกซแตรกต 5 กรัมโปรตีโอสเปปโตน หรือโพลิเปปโตน 5 กรัมแลกโตส 10 กรัมไบลซอลต 8.5 กรัมโซเดียมซิเตรต (sodium citrate) 8.5 กรัมโซเดียมไทโอซัลเฟต 8.5 กรัม



ไอรออน (III) ซิเตรต (iron (III) citrate) 1 กรัมบริลลิแอนตกรีน 0.0000 33 กรัมนิวตรัลเรด (neutral red) 0.025 กรัมอะการ 13.5 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แลวใหเดือดตอไปอีก 1 นาที (ควรมีความเปนกรด-ดาง สุดทายประมาณ 7.0) ทิ้งใหเย็นประมาณ 45 องศาเซลเซียส เทใสจานเพาะเชือ้จานละประมาณ 20 ลูกบาศกเซนติเมตร วางไวใหผิวหนาแหงกอนใช4.2.26 เอนโดอะการ (endo agar)

เปปโตน 10 กรัมแลกโตส 10 กรัมไดโปตัสเซียมฟอสเฟต 3.5 กรัมอะการ 15 กรัมโซเดียมซัลไฟต (sodium sulphite) 2.5 กรัมเบสิกฟุคซิน (basic fuchsin) 0.5 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แบงใสหลอดทดลองหรือขวดแกว ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาที (ควรมความเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 7.5) เทใสจานเพาะเชื้อจานละประมาณ 20 ลูกบาศกเซนติเมตร วางไวใหผิวหนาแหงกอนใชหมายเหตุ : ถาใชหมดในวันที่เตรียมไมตองฆาเชื้อในหมอนึ่งอัด

4.2.27 แอซิดบรอท (acid broth)โปรตีโอสเปปโตน 5 กรัมยีสตเอกซแตรกต 5 กรัมเดกซโตรส 5 กรัมไดโปตัสเซียมฟอสเฟต 4 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตร

น ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แบงใสหลอดทดลองขนาด 16 มิลลิเมตร x 150 มลิลิเมตร หลอดละ 12 ถึง 15 ลูกบาศกเซนติเมตร ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาที (ควรมีความเปนกรด-ดางสุดทาย 5.0)



4.2.28 ออเรนจเซรุมบรอท (orange serum broth)ทริปโตนหรือทริปติเคส 10 กรัมยีสตเอกซแตรกต 3 กรัมเดกซโตรส 4 กรัมไดโปตัสเซียมฟอสเฟต 3 กรัมออเรนจเซรุม 200 ลูกบาศกเซนติเมตรนํ้ ากลั่น 800 ลูกบาศกเซนติเมตร

นํ าสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ละลายใหเขาดวยกัน แบงใสหลอดทดลองขนาด 16 มิลลิเมตร x 150 มลิลิเมตร ซ่ึงมีหลอดแกวเล็กควํ่ าอยูภายใน ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาที (ควรมีความเปนกรด-ดางสุดทายประมาณ 5.5)หมายเหตุ : วธีิเตรียมออเรนจเซรุม

ตมนํ้ าสมที่คั้นใหม ๆ 1 ลูกบาศกเดซิเมตร ที่อุณหภูมิ 93 องศาเซลเซียส เติมสารชวยในการกรอง (filter aid) 30 กรัม คนใหทั่ว กรองผานกระดาษกรองหยาบ ซ่ึงมีสารชวยในการกรองอยูดวย โดยใชเครื่องดูดชวย ทิ้งสิ่งกรอง 2 ถึง 3 ลูกบาศกเซนติเมตรแรกที่กรองได

4.2.29 ไอรออนซัลไฟตอะการ (iron sulphite agar)ทริปโตนหรือทริปติเคส 10 กรัมโซเดียมซัลไฟต (sodium sulphite) 0.5 กรัมไอรออนซิเตรต (iron citrate) 0.5 กรัมอะการ 12.0 กรัมนํ้ ากลั่น 1 ลูกบาศกเดซิเมตรน ําสวนผสมทั้งหมดใสในนํ้ ากลั่น ตมใหละลาย แบงใสหลอดทดลอง หลอดละประมาณ 15 ลูกบาศกเซนติเมตร ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดอุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 103.4 กิโลปาสกาล นาน 15 นาทีหมายเหตุ : อาหารเลี้ยงเชื้อนี้เก็บไวใชไดไมเกิน 7 วัน

5. การตรวจสอบลักษณะทั่วไปของตัวอยาง5.1 ใชจํ านวนตัวอยางตามที่ไดระบุไวในแตละมาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมอาหาร

กระปองนั้น ๆ (ไมนอยกวา 8 กระปอง)5.2 ตรวจลักษณะภายนอกของกระปอง กอนจะลอกฉลากใหบันทึกรายละเอียดบนฉลากไว

กอนพรอมทั้งทํ าเครื่องหมายไวบนกระปอง



5.3 ตรวจสอบความผิดปกติภายนอกของกระปอง เชน บวม บุบ เปนสนิท เปนตน (ถากระปองบวมไม

ตองอบและไมตองวิเคราะหถือวาไมเปนไปตามมาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมนี้)5.4 เกบ็ตวัอยางไวที่อุณหภูมิหอง 2 กระปอง5.5 น ําตวัอยางผลิตภัณฑที่เหลือ ซ่ึงผานการตรวจขอ 5.3 เขาอบเพาะเชื้อดังนี้

5.5.1 อาหารที่มีความเปนกรดตํ่ า ใหนํ าตัวอยางสวนหนึ่งมาอบที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 14 ถึง 30 วัน และสวนที่เหลืออบที่อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 ถึง 10 วัน

5.5.2 อาหารทีม่ีความเปนกรด และกรดสูง ใหนํ าตัวอยางมาอบที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 14 วัน

หมายเหตุ : ตวัอยางที่อบแตละอุณหภูมิตองไมนอยวา 3 กระปอง5.6 ในกรณทีีก่ระปองบวม หรือมีลักษณะผิดปกติเกิดขึ้นระหวางการอบเพาะเชื้อ ไมตองนํ ามา

วเิคราะห (ถือวาไมเปนไปตามมาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมนี้)5.7 หลังจากอบจนครบตามกํ าหนดแลว ใหทํ าการตรวจสอบดังนี้

5.7.1 ลางตัวอยางใหสะอาดดวยสบูและนํ้ า เช็ดใหแหงดวยผาสะอาด เช็ดฝากระปองดานที่ไมมีรหัสใหทั่วดวยเอทานอลแลวลนดวยเปลวไฟจากตะเกียง ใชเครื่องเปดกระปองที่ลนไฟรอนจัดเพื่อฆาเชื้อ เปดกระปองออกใหกวางพอที่จะนํ าอาหารออกมาวิเคราะหได ถาเปนของเหลว ใหเจาะรูโดยมีขนาดเสนผานศูนยกลางประมาณ 1 ถึง 2 เซนติเมตร

5.7.2 ดลัูกษณะอาหารทั่วไปภายหลังการอบ ดังนี้(1) สี(2) กล่ิน(3) ลักษณะอาหาร(4) ความเปนกรด-ดางถาอาหารมีลักษณะดังกลาวขางตนเปลี่ยนไปจากเดิมจนผิดปกติอยางเห็นไดชัด ใหถือวาผลิตภัณฑอาหารกระปองทั้งหมดไมเปนไปตามมาตรฐานผลิตภัณฑ อุตสาหกรรมนี้

5.8 ถาอาหารผานการตรวจสอบตาม ขอ5.7 แลวไมผิดปกติ ใหน ําไปวิเคราะหทางจุลินทรีย ตอไป



6. การเตรียมตัวอยางที่ใชในการวิเคราะห6.1 ใชเครื่องมือที่เหมาะสมซึ่งผานการฆาเชื้อแลว แบงตัวอยางปริมาณพอควรจากสวนกลาง

ของกระปองใสลงในหลอดแกวหรือขวดแกวปราศจากเชื้อ แลวเก็บในตูเย็นที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เพื่อใชในการวิเคราะหซ้ํ าหรือทดสอบพิษซึ่งอาจมีในอาหารนั้น สวนที่เหลือใชสํ าหรับวิเคราะหจุลินทรีย ตัวอยางที่ใชในการวิเคราะหตองนํ ามาจากสวนกลางของกระปองทุกครั้ง ในกรณีที่อาหารกระปองไมเปนเนื้อเดียวกันใหใชเครื่องตีปน กอนนํ าไปวิเคราะห

7. วิธีวิเคราะห7.1 อาหารที่มีความเปนกรดตํ่ า ใหวิเคราะหดังนี้

7.1.1 จ ํานวนจุลินทรยีทั้งหมด (total plate count)7.1.1.1 ช่ังตวัอยางจากกระปอง 10 กรัม หรือดูดตัวอยางจากกระปองดวยปเปตมา 10

ลูกบาศกเซนติเมตร ใสในขวดที่มีสารละลายเพื่อเจือจาง 90 ลูกบาศกเซนตเิมตร ผสมใหเขากัน จะไดความเขมขน 1 ตอ 10 หรือใหเจือจางตอไปจนกวาจะอานจํ านวนจุลินทรียได 30 ถึง 300 โคโลนี

7.1.1.2 ใชปเปตดูดสารละลายตัวอยาง จากขอ 7.1.1.1 ที่มีความเขมขนตาง ๆ 1 ลูกบาศกเซนติเมตร ใสลงในจานเพาะเชื้อ ความเขมขนละ 2 จาน สํ าหรับของเหลวใหใชปเปตดดูโดยตรงจากตัวอยางมา 1 ลูกบาศกเซนติเมตร ใสในจานเพาะเชื้อ 2 จานดวย

7.1.1.3 เทอาหารเลี้ยงเชื้อเพลตเคานตอะการ ที่หลอมเหลวแลวมีอุณหภูมิประมาณ 45 องศาเซลเซียส ลงในจานเพาะเชื้อ จานละประมาณ 10 ถึง 15 ลูกบาศกเซนติเมตรผสมใหเขากัน

7.1.1.4 ตั้งทิ้งไวใหแข็ง กลับจานเพาะเชื้อ แลวนํ าไปอบเพาะเชื้อ (incubate) ที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ช่ัวโมง

7.1.1.5 นบัจํ านวนโคโลนีในจานเพาะเชื้อซ่ึงมีปริมาณ 30 ถึง 300 โคโลนี หาคาเฉลี่ย แลวคํ านวณเปนจํ านวนโคโลนีตอกรัมหรือลูกบาศกเซนติเมตร

7.1.2 โคลิฟอรม (coliform)7.1.2.1 ทดสอบขั้นแรก (presumptive test)

(1) น ําตวัอยางประมาณ 1 กรัม หรือ 1 ลูกบาศกเซนติเมตร มาเพาะ (inculate) ลงในหลอดที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อบริลลิแอนตกรีนแลกโตสไบลบรอทรอยละ 2 หรือ ลอริลทริปโตสบรอท จํ านวน 2 หลอด



(2) อบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส เมื่อครบ 24 ช่ัวโมง และ 48 ช่ัวโมง ถามีกาซเกิดขึ้นนํ าไปทดสอบตอตามขอ 7.1.2.2

7.1.2.2 ทดสอบขั้นสมบูรณ (completed test)(1) น ําหลอดที่มีกาซจากขอ 7.1.2.1 (2) มาเขยาเบา ๆ แลวใชที่เขี่ยเชื้อ (loop)

ซ่ึงผานการฆาเชื้อแลวจุมลงในอาหารเลี้ยงเชื้อในหลอดที่มีกาซ นํ าไปขีดเปนเสน ๆ (streak) บนผวิหนาของอาหารเลี้ยงเชื้อเอนโดอะการหรือลีวายนอีเอ็มบีอะการ ในลักษณะที่จะใหโคโลนีแยกจากกันหลังการอบเพาะเชื้อ

(2) อบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ช่ัวโมง ตรวจดูโคโลนทีีม่ีลักษณะเฉพาะของโคลิฟอรมในอาหารเลี้ยงเชื้อเอนโดอะการ จะมลัีกษณะสีแดงและโคโลนีเฉพาะของโคลิฟอรม ในอาหารเลี้ยงเชื้อลีวายอีเอม็บอีะการ จะมีลักษณะเปนสีเขม อาจเปนสีแดงเขมหรือมวงเขมก็ได

(3) ถายโคโลนทีีม่ีลักษณะเฉพาะจากขอ 7.1.2.2 (2) ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อบริลลิแอนตกรีนแลกโตสไบลบรอทรอยละ 2 หรือลอริลทริปโตสบรอท และบนอาหารเลี้ยงเชื้อนวิเตรียนตอะการ

(4) อบเพาะเชื้อที่ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียสนาน 24 ช่ัวโมง ดูการเกิดกาซในหลอดที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อบริลลิแอนตกรีนแลกโตสไบลบรอทหรือลอริลทริปโตสบริท ถามีกาซเกิดขึ้นใหนํ าเชื้อที่ขึ้นในอาหารเลี้ยงเชื้อนิวเตรียนตอะการ ไปยอมสีดวยวิธีกรัมสเตน (gram stain) ดูดวยกลองจุลทรรศน ถามีเชื้อซ่ึงเปนกรัมลบ (gram negative) มรูีปรางเปนแทงสั้น ๆ ไมมีสปอรแสดงวาเปนบักเตรีชนิดโคลิฟอรม

7.1.3 แฟลตซาวร (flat sour) ชนิดเทอรโมฟลิก (thermophilic) และชนิดมีโซฟลิก (mesophilic)น ําตวัอยาง 2 กรัม หรือ 2 ลูกบาศกเซนติเมตร เพาะลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเดกซโตรสทริปโตนบรอมครีซอลเพอรเพิลบรอท จํ านวน 4 หลอด และในอาหารเลี้ยงเชื้อเดกซโตรสทริปโตนบรอมครีซอลเพอรเพิลอีก 4 จาน อบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 และ 55 องศาเซลเซียส อยางละ 2 หลอด และ 2 จาน เปนเวลา 48 ช่ัวโมง ถามเีชื้อพวกแฟลตซาวร จะทํ าใหเกิดกรดขึ้น ซ่ึงจะเปลี่ยนสีของอาหารเลี้ยงเชื้อจากสีมวงเปนสีเหลือง

7.1.4 เทอรโมฟลิกแอนแอโรบส (thermophilic anaerobes)7.1.4.1 น ําตวัอยางประมาณ 2 กรัม หรือ 2 ลูกบาศกเซนติเมตร เพาะลงในอาหารเลี้ยง

เชื้อบฟีฮารตอินฟวชันมีเดียมหรือคุกมีตมีเดยีม ซ่ึงไดตมไลอากาศออกและทํ า



ใหเย็นแลวจํ านวน 4 หลอด แบงไปตมที่ 80 องศาเซลเซียส 20 นาที 2 หลอด ทํ าใหเย็นแลวเทพาราฟนหรืออะการที่ปราศจากเชื้อทับผิวหนาอาหารในหลอดทั้ง 4 หรือจะใสในแอนแอโรบิกจาร (anaerobic jar) ก็ได

7.1.4.2 อบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส นาน 48 ถึง 72 ช่ัวโมง ถามีกาซเกิดขึน้นํ าไปยอมสีดวยวิธีกรัมสเตน ถามีเชื้อซ่ึงเปนกรัมบวก (gram positive) มีรูปรางเปนแทง มีสปอรอยูปลายหรือคอนไปทางปลายแสดงวาเปนเชื้อพวกเทอรโมฟลิกแอนแอโรบส

7.1.5 พิวทริแฟกตีฟแอนแอโรปส (putrefactive anaerobes)วเิคราะหเชนเดียวกับขอ 7.1.4 แตอบเพาะเชื้อที่ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส 72 ถึง 96 ช่ัวโมง

7.1.6 ซัลไฟดสปอยเลจ (sulphide spoilage)น ําตวัอยางประมาณ 1 กรัม หรือ 1 ลูกบาศกเซนติเมตร เพาะลงในหลอดที่มีอาหารเล้ียงเชื้อไอรออนซลัไฟดอะการซ่ึงหลอมเหลว และทํ าใหเย็นที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส ผสมใหเขากันทิ้งไวใหแข็ง แลวนํ าไปอบที่อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียสนาน 24 ถึง 48 ช่ัวโมง นํ ามาตรวจดูอาหารเลี้ยงเชื้อ ถาโคโลนีเปนสีดํ าแสดงวาเปนบกัเตรีพวกซัลไฟดสปอยเลจ

7.1.7 สตาฟโลคอกคัส (Staphlococcus)7.1.7.1 หยดตวัอยางประมาณ 0.1 ลูกบาศกเซนติเมตร ลงบนผิวหนาของอาหารเลี้ยง

เชือ้แมนนิตอลลซอลตเอกโยลกอะการและเทลลูไรตไกลซีนอะการอยางละ 2 จาน ใชแทงแกวปลายงอเกลี่ย (spread) ไปใหทั่วผิวหนา

7.1.7.2 อบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส 24 ถึง 48 ช่ัวโมง ตรวจดูถามีโคโลนีเปนสีเหลืองรอบ ๆ โคโลนีมีลักษณะขุนบนอาหารเลี้ยงเชื้อแมนนิตอลตซอลตเอกโยลกอะการหรือโคโลนีเปนสีดํ าบนอาหารเลี้ยงเชื้อเทลลูไรตไกลซีนอะการ ใหนํ าไปยอมสีดวยวิธีกรัมสเตน แลวตรวจดูดวยกลองจุลทรรศน ถาพบวาติดสีกรัมบวก มีลักษณะกลม อยูรวมกันเปนกลุมคลายพวงองุน แสดงวาเปนบักเตรีชนิดสตาฟโลคอกคัส

7.1.7.3 นํ าโคโลนีซ่ึงมีลักษระเฉพาะตามขอ 7.1.7.2 เพาะลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ เบรนฮารตอินฟวชันบรอท นํ าไปอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส 24 ช่ัวโมง แลวตรวจดูโคอะกูเลส (coagulase) ตอไปการทดสอบโคอะกูเลสละลายโคอะกูเลสปลาสมา (coagulase plasma) ขนาด 100 มิลลิกรัมในนํ้ ากล่ัน 3 ลูกบาศกเซนติเมตร ใชปเปตดูดปลาสมา 0.5 ลูกบาศกเซนติเมตรใส



ลงในหลอดแกวเล็ก ๆ เติมเชื้อที่เพาะในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เพาะในอาหารเลี้ยงเชือ้เบรนฮารตอินฟวชันบรอทจากขอ 7.1.7.3 ลงไป 2 หยด อบเพาะเชื้อที่ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส ตรวจดูการแข็งตัวของปลาสมาทุก ๆ ช่ัวโมง เปนเวลา 3 ช่ัวโมง ถ ามีการแข็งตัวของปลาสมาเกิดขึ้นแสดงว ามีบัก เตรีชนิด สตาฟโลค็อกคัสที่อาจทํ าใหอาหารเปนพิษได

7.1.8 ซาลโมเนลลา (Salmonella)7.1.8.1 ช่ังตัวอยาง 20 กรัมใสลงในแลกโตสบรอท ผสมใหเขากัน อบเพาะเชื้อที่ 35

ถึง 37 องศาเซลเซียสนาน 24 ช่ัวโมง7.1.8.2 ใชปเปตดูดตัวอยางจากขอ 7.1.8.1 จํ านวน 1 ลูกบาศกเซนติเมตร ใสลงใน

เซเลไนตซีสตีนบรอทหรือเตตระไทโอเนตบรอท อบเพาะเชื้อที่ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียสนาน 24 ช่ัวโมง

7.1.8.3 ใชทีเ่ขี่ยเชื้อจุมอาหารเลี้ยงเชื้อจากขอ 7.1.8.2 แลวขีดเปนเสน ๆ บนผิวหนาที่แหงแลวของอาหารเลี้ยงเชื้อเอสเอสอะการ และอาหารเลี้ยงเชื้อบิสมัทซัลไฟตอ ะก า ร ห รื ออ าหาร เ ลี้ ย ง เ ชื้ อเ อส เ อสอะก าร แ ละอาหาร เ ลี้ ย ง เ ชื้ อ บริลลิแอนตกรีนอะการ ในลักษณะที่จะใหโคโลนีแยกจากกันหลังการอบเพาะเชื้อ นํ าไปอบเพาะเชื้อที่ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียสนาน 24 ถึง 48 ช่ัวโมง ตรวจดูโลโลนีไมมีสีบนอาหารเลี้ยงเชื้อเอสเอสอะการหรือโคโลนีมีสีดํ าหรือสีเขียวบนอาหารเลี้ยงเชื้อบิทมัทซับไฟตอะการและโคโลนีมีสีแดงหรือสีชมพูบนอาหารเลี้ยงเชื้อบริลลิแอนตกรีนอะการ ซ่ึงเปนลักษณะเฉพาะของ ซาลโมเนลลา

7.1.8.4 นํ าเชื้อที่มีลักษณะของซาลโมเนลลาที่บริสุทธิ์แลวมาตรวจสอบเพื่อยืนยันในอาหารเลี้ยงเชื้อ 4 ชนิดดังนี้(1) เพาะเชื้อลงในทริเปลชูการไอรออนอะการโดยขีดบนอาหารเลี้ยงเชื้อและ

แทง (stab) ลงในอาหารเลี้ยงเชื้ออบเพาะเชื้อที่ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียสนาน 24 ช่ังโมง ถามีซาลโมเนลลา จะทํ าใหสวนบนของอาหารเลี้ยงเชื้อเปนสีแดง สวนภายในอาหารเลี้ยงเชื้อเปนสีเหลือง อาจเปนสีดํ าถาเปนชนิดที่สรางไฮโดรเจนซัลไฟต และมักจะมีกาซดูไดจากรอยแยกของอาหารเลี้ยงเชื้อ

(2) เพาะเชื้อลงในไลซีนไอรออนอะการ โดยทํ าเชนเดียวกับขอ 7.1.8.4 (1) ถามีซาลโมเนลลาอาหารเลี้ยงเชื้อจะเปนสีมวงอยางเดิมหลังจาก 24ช่ัวโมงแลวอาจมีสีดํ าบางถาสรางไฮโดรเจนซัลไฟดและอาจมีกาซดวย ดูไดจากรอยแยกของอาหารเลี้ยงเชื้อ



(3) เพาะเชื้อลงในยูเรียบรอท อบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ช่ัวโมง ถาเปนซาลโมเนลลาจะไมเปลี่ยนสีอาหารเลี้ยงเชื้อ (คอยสังเกตดูสีของอาหารเลี้ยงเชื้อ ถามีการเปลี่ยนสีระหวางการอบแสดงวาไมใชซาลโมเนลลา)

(4) เพาะเชื้อลงในทริปโตนบรอทรอยละ 1 อบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ช่ัวโมง แลวเติมโคแวกสรีเอเจนต (Kovac's reagent) ลงไป ถาเปนซาลโมเนลลาจะเกิดปฏิกิริยาอินโดล (indole) ลบ (negative) จะไมเปลี่ยนสีของโคแวกสรีเอเจนต

7.1.8.5 นํ าเชื้อที่ผานการตรวจสอบตามขอ 7.1.8.4 ไปทดสอบการจับตัวเปนกอน (agglutination) กบัโพลีวาเลนตโอ (polyvalent O) และโพลีวาเลนต เอช. แอนติเซรา (polyvalent H. antisera) ถาใหผลบวกแสดงวาเปนซาลโมเนลลา

7.1.9 สเตรปโตคอกคัส (Streptococcus)น ําตวัอยางประมาณ 2 กรัม หรือ 2 ลูกบาศกเซนติเมตร มาเพาะลงในอาหารเลี้ยงเชื้อบัฟเฟอรอะไซดกลูโคสกลีเซอรอลบรอท แลวอบเพาะเชื้อที่ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ช่ัวโมง ถามีสีเหลืองเกิดขึ้น ถายเชื้อลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ ทริปโตนกลูโคสเอกแตรกตซอลตบรอท อบเพาะเชื้อที่ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ช่ัวโมง ถาขุนนํ าไปยอมสีดวยวิธีกรัมสเตน ดูดวยกลองจุลทรรศน ถาพบบักเตรีซ่ึงเปนกรัมบวก มีรูปรางกลม แสดงวามีบักเตรีพวกเอนเทอโรคอกไค (enterococci)

7.2 อาหารที่มีความเปนกรด ใหวิเคราะหดังนี้7.2.1 จ ํานวนจุลินทรยีทั้งหมด

วธีิวเิคราะหเชนเดียวกับการวิเคราะหอาหารกระปองที่มีความเปนกรดตํ่ า7.2.2 โคลิฟอรม วธีิวเิคราะหเชนเดียวกับการวิเคราะหอาหารกระปองที่มีความเปนกรด

ตํ่ า7.2.3 แฟลตซาวร

น ําตวัอยางประมาณ 2 กรัมหรือ 2 ลูกบาศกเซนติเมตร เพาะลงในอาหารเลี้ยงเชื้อแอซิดบรอทหรือออเรนจเซรุมบรอทจํ านวน 4 หลอด อบเพาะเชื้อที่ 35 ถึง 37 และ 55 องศาเซลเซียส อยางละ 2 หลอด เปนเวลา 48 ช่ัวโมง ถามีบักเตรีพวกแฟลตซาวร อาหารเลี้ยงเชื้อจะขุน ทดสอบใหแนใจโดยถายเชื้อ (subculture) ลงในอาหารเพาะเชื้อชนิดเดิมแลวอบเพาะเชื้อเชนเดียวกัน ถาอาหารเลี้ยงเชื้อขุนแสดงวามีบักเตรีชนิดแฟลตซาวร

7.2.4 อะซิดูริกสปอยเลจบักเตรี (aciduric spoilage bacteria)



น ําตวัอยางประมาณ 1 กรัม หรือ 1 ลูกบาศกเซนติเมตรมาเพาะลงในอาหารเลี้ยงเชื้อออเรนจเซรุมบรอท จํ านวน 2 หลอด อบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียสเปนเวลา 48 ช่ัวโมง ตรวจดูกาซทุก 24 ช่ัวโมง ถาพบวาขุนและมีกาซเกิดขึ้นแสดงวาเปนบักเตรีชนิดอะซิดูริกสปอยเลจ

7.2.5 ยีสตและรา7.2.5.1 วธีิเพาะเชื้อ

วเิคราะหเชนเดียวกับการวิเคราะหหาจํ านวนจุลินทรยีทั้งหมด (ขอ 7.1.1) ของอาหารที่มีความเปนกรดตํ่ า แตอาหารเลี้ยงเชื้อใชมอลตอะการหรือโปเตโตเดกซโตรสอะการที่ปรับความเปนกรด-ดาง เปน 3.5 แลว และอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 ถึง 37 องศาเซลเซียส นาน 3 ถึง 5 วัน แลวนับจํ านวนโคโลนีของยสีตและรา คิดเปนจํ านวนโคโลนีตอกรัมหรือลูกบาศกเซนติเมตร

7.2.5.2 วิธีใชกลองจุลทรรศนการนับจํ านวนเชื้อราโดยวิธีโฮเวิรด(1) ท ําความสะอาดแผนแกว โฮเวิรด (Howard chamber) และกระจกปดดวย

กรดไฮโดรคลอริก (strong hydrochloric acid) หรือสารละลายอิ่มตัวของโซเดียมไฮโดรเจนคารบอเนต (saturated solution of sodium hidrogen carbonate) แลวเช็ดใหเแหง

(2) วางกระจกปดลงบนแผนแกวโฮเวิรดทันทีโดยจับเฉพาะที่ขอบกระจกปด ถาทํ าความสะอาดอยางดี เมื่อกระจกปดสัมผัสกับแผนแกวจะเกิดเปน วงแหวน หรือแถบสีรุง (Newton rings) ซ่ึงจะเหน็อยูระหวางกระจกปดกบัแผนแกว

(3) นํ าแผนแกวโฮเวิรดพรอมกระจกปดวางบนแทน (stage) ของกลองจุลทรรศน แลวปรับแตละพื้นที่ที่มองเห็นใหเปน 1.5 ตารางมิลลิเมตร โดยปรับใหวงกลมที่เกิดขึ้น (field of view) อยูระหวางเสนคูขนานบนแผนแกวโฮเวิรด ซ่ึงจะมีเสนผานศูนยกลางของพื้นที่เทากับ 1.382 มิลลิเมตร เมื่อใชอายพีซ (eyepiece) ทีม่กีํ าลังขยาย 10 เทา และ เลนส อะโครมาติกออบเจกตีฟ (achromatic objective) ขนาด 16 มิลลิเมตร

(4) ยกกระจกปดขึ้น ใชสปาตูลา (spatula) หรือใบมีดตักตัวอยางที่ผสมเขากันดแีลวหยดลงตรงกลางแผนแกวโฮเวิรด แผใหกระจายออกไป แลวคอย ๆ วางกระจกปดทับ นํ าไปวางบนแทนของกลองจุลทรรศน คอย ๆ ปรับให



มีพื้นที่ตามขอ (3) (ในแตละพื้นที่จะมีตัวอยาง 0.000 15 ลูกบาศกเซนติเมตร)

(5) ตรวจเสนใยของราในแตละพื้นที่อยางนอย 25 พื้นที่ เมื่อพบเสนใยของรา ใหน ําความยาวของสวนเสนใยไมเกิน 3 เสนมาตอกัน ความยาวตองไมนอยกวา 1 ใน 6 ของเสนผานศูนยกลางของพื้นที่ ใหรายงานเปนบวก (positive) ถาไมเปนดังที่กลาวมานี้ใหรายงานเปนลบ (negative)

(6) ใหตรวจสอบซํ้ าโดยเตรียมแผนแกวโฮเวิรดดังกลาวขางตนอยางนอยอีกหนึ่งครั้ง

(7) น ําผลการตรวจสอบที่รายงานเปนบวกทั้งหมดมารวมกัน แลวคํ านวณเปนรอยละดังนี้ x = 100 y

z เมื่อ x คอื รอยละของจํ านวนที่เปนบวกตอจํ านวนพื้นที่ทั้งหมดที่ตรวจสอบ

y คอื จํ านวนพื้นที่ที่รายงานเปนบวกทั้งหมดz คอื จํ านวนพื้นที่ทั้งหมดที่ตรวจสอบไมนอยกวา 25

7.3 อาหารที่มีความเปนกรดสูง ใหวิเคราะหจุลินทรยีเชนเดียวกับขอ 7.2 การวิเคราะหอาหารกระปองที่มีความเปนกรด



ผนวก ก.วิธีใชแผนแกวแบบโฮเวิรด

(Howard counting chamber, modified type) การใชแผนแกวโฮเวริด ในการนับจุลินทรยีในอาหาร เชน เชื้อราในมะเขือเทศและผลิตภัณฑมะเขือเทศ เนยเหลว (butter) และครีม เปนตน จะตองใชกลองจุลทรรศน ทีอาชพีซและออบเจกตีฟทีใ่หกํ าลังขยายประมาณ 90 180 และ 500 เทา ก ําลังขยายหาไดจากคูของอายพีซและออบเจกตีฟ (ตารางที่ ก.1) ซ่ึงมีอยูในกลองจุลทรรศนทีท่ันสมัยอาจเปนแบบโมโนคูลา (monocular) หรือไบโนคูลา (binocular) กไ็ด และมีความยาวหลอดคงที่ (fixed tube length) ขนาดมาตรฐานยาว 160 มิลลิเมตรการใชแผนแกวโฮเวริด ในการตรวจสอบ ใหใชกลองจุลทรรศนที่มีกํ าลังขยายดังนี้

การตรวจขยุมรา (mold mycelia) ใชกํ าลังขยาย 40 เทาการนับจํ านวนรา ใชกํ าลังขยาย 100 เทาการตรวจดูยีสตและสปอร ใชกํ าลังขยายประมาณ 200 ถึง 430 เทาการตรวจดูบักเตรี ใชกํ าลังขยาย 500 เทาขึ้นไป

แตออบเจกตีฟแบบจุ มนํ้ ามัน (oil immersion objective) ขนาด 90 เทารวมกับ แอบเบ คอนเดนเซอร (Abbe condenser) และอายพืชขนาด 10 เทา โดยทั่วไปใชในการศึกษาและบงช้ีเฉพาะชนิดของ บกัเตรีแมวาระยะทํ างาน (working distance) ของออบเจกตีฟอันหลังจะสั้นมากในการนับควรใช เลวีเคานติงแชมเบอร (Levy counting chamber) กบัเพตรอฟฟฮอสเซอร บักเตรีเคานเตอร (Petroff Hausser bacteria counter) สํ าหรับนับจํ านวนทั้งยีสตและบักเตรีตามวิธีมาตรฐานแผนกลมโฮเวิรตอายพีซไมโครมิเตอร (Howard eyepiece micrometer) ตเีปนตารางจึงมีขนาดชอง ๆ ละ 1 ใน 6 เทาของเสนผานศูนยกลางของแผนอายพซี เพือ่สะดวกในการคาดคะเนความยาวของเสนใยของรา การทํ างานรวมกันของอายพีซ อายพีซไดอะเฟรมชนิดพิเศษ (special eyepiece diaphram) หรือ ดรอวทิวบเอกซเทนชัน (draw tube extension) กบัออบเจกตีฟที่มีก ําลังขยายตํ่ า ตองสามารถปรับพื้นที่ที่ปรากฏบนแผนสไลดใหได 1.5 ตารางมิลลิเมตร หรือปรับใหไดวงกลมที่มีขนาดเสนผานศูนยกลาง 1.382 มิลลิเมตร ถาใชออบเจกตีฟที่มีกํ าลังขยายสูง ตองมีระยะทํ างานมากพอหรือมีความลึกของโฟกัส (focus) พอที่จะปรับใหเห็นเสนใยซึ่งอยูตรงกลาง หรือดานบนของเคานติงแชมเบอร (counting chamber) โดยไมจํ าเปนตองหมุนหรือปรับปุมละเอียด (fine adjustment) และไมสัมผัสกระจกปด



แผนแกวโฮเวริดนี้มีผิวหนาเรียบ ขนาด 15 มิลลิเมตร x 20 มิลลิเมตร ไมมีตาราง มีแตเสนขนาน 2 เสนหางกัน 1.382 มิลลิเมตร ในการนับจํ านวนเชื้อรา เชน ผลิตภัณฑมะเขือเทศ ตัวอยางที่ใชไมตองเตรียมพิเศษ ยกเวนเมื่อตองการตรวจนับความสมํ่ าเสมอ (uniform count) ตองนํ าตัวอยางทีข่นมาก มาเจือจางจนไดปริมาณของแข็ง (total solid) รอยละ 8.37 ถึง 9.37 ถาใสเกินไปก็ทํ าใหขนขึ้นดวย กัม (gum) ทีส่ะอาดและปราศจากเชื้อรา ในการนับขยุมราในเนยเหลวใชเนยเหลว 1 กรัม ผสมสารละลายกมัที่รอน 7 ลูกบาศกเซนติเมตร (ใชสารละลายคารอบปนกัม (carob bean gum) รอยละ 0.75 ผสมกับฟอรมัลดีไฮดรอยละ 2) ถาเปนครีมนํ าไปกวนหรือเขยา (churned) ใหเปน เนยเหลว แลวตรวจนับจํ านวนเชื้อรา

1. ขอบข าย - fic.nfi.or.thfic.nfi.or.th/law/upload/file1/th_478.pdf · ฐานข...

Documents