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FERNANDO CHAVES SERVICIO DE MICROBIOLOGÍA

HOSPITAL 12 DE OCTUBRE

LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE LA TUBERCULOSIS: PRESENTE Y FUTURO

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Reactivación endógena de una infección latente versus infección reciente

Reactivación endógena de una infección latente versus infección reciente

Se suponía que en los países desarrollados la mayoría de los casos nuevos de tuberculosis se producían como resultado de reactivación endógena, solo un 10% eran resultado de transmisión reciente

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Contribución de las técnicas moleculares al estudio de la transmisión de la

tuberculosis

Capacidad de discriminar entre aislados clínicos de Mycobacterium tuberculosis: “huella de ADN” o “genotipo”

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Métodos de tipificación de M. tuberculosisMétodos de tipificación de M. tuberculosis

Bacteriófagos Caracterización enzimática en biovariedades Tipificación molecular (1990- )

— IS6110— IS1081— MPTR— PGRS— DR— MIRU

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NEJM 2003; 349: 1149-56

Métodos de tipificación molecular de M. tuberculosis complexMÉTODO DE RFLP-IS6110

1º Cultivo de Mtbc

(~3-6 semanas)

2º Extracción y purificación del ADN

3º Digestión con pvuII y electroforesis

4ºTransferencia del ADN (Southern Blot)

5º Hibridación con sonda complementaria a IS6110 y autoradiografia

(~1 semana)

VENTAJAS:

-Técnica de “referencia”

-Mayor discriminación

LIMITACIONES:

-Poca discriminación con 5 bandas

-Comparación diferentes bases de datos

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Huellas de ADN con IS6110 (patrones RFLP) de aislados clínicos de M. tuberculosis de Madrid

M M MJ J

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Dendograma y patrones RFLP de aislados clínicos de Mycobacterium tuberculosis multirresistentes

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“Spoligotyping”

NEJM 2003; 349: 1149-56

MÉTODO DE SPOLIGOTYPING

1º Cultivo de Mtbc

(~3-6 semanas)

(posibilidad de realizar a partir de una muestra clínica)

2º Extracción del ADN

(pequeña cantidad de ADN)

3º Amplificación por PCR

4º Hibridación en membrana (incluye 43 sondas) y autoradiografia

(~3 días) VENTAJAS:

- rapidez

-interpretación y comparación de resultados

LIMITACIONES:

-menor discriminación

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Spoligotyping de aislados clínicos de M. tuberculosis complex

10Resultados de la tipificación molecular mediante RFLP-IS6110 y spoligotyping

J. of Internal Med. 2001; 249: 1-26

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CONTRIBUCIÓN DE LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR AL ESTUDIO DE LA TRANSMISIÓN DE LA TUBERCULOSIS

El método molecular más utilizado: RFLP con

IS6110. Las técnicas moleculares identifican transmisión

Casos no relacionados epidemiológicamente --> cepas de Mtbc

con diferente patrón de ADN

Casos relacionados --> cepas con idéntico patrón de ADN

Estudios poblacionales: Casos con el mismo patrón --> casos en clusters -->

interpretación: “transmisión reciente”

Casos con patrón único --> “reactivación de infección antigua”

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¿Que ha aportado la epidemiología molecular en estos últimos años?

1) Transmisión de la TB

2) Manejo clínico

3) Virulencia y transmisibilidad

4) Evaluación de los Programas de control de la enfermedad

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1) Transmisión de la TB Confirmar brotes sospechados en los estudios

epidemiológicos Cuantificar el número de casos en clusters, que

pudieran ser atribuidos a “transmisión reciente”, en un área determinada

Identificar “nuevas rutas” de transmisión de la TB y casos no sospechados en los estudios epidemiológicos

Identificar grupos de riesgo implicados en la transmisíon

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CiudadFrecuencia de cluster

Número de casos

Duraciónestudio

Métodosmoleculares

Porcentaje de casoscon RFLP realizada

Los Angeles 59 % 162 2 añosIS6110PGRS

Información nodisponible

Amsterdam 47 % 459 2,5 añosIS6110PGRS

90

Baltimore 46 % 182 2,5 añosIS6110PGRS 91

Madrid 42,5 % 233 3 añosIS6110

Spoligotyping63

SanFrancisco

40 % 473 2 años IS6110 80,8

Zaragoza 39,4 % 226 1 añoIS6110

83,1

Sevilla 38 % 176 3 añosIS6110 Información no

disponible

Nueva York 37,5 % 108 4 añosIS6110

DR83,1

París 35,7 % 282 1 añoIS6110

DR94,6

Barcelona 46 % 165 2 añosIS6110PGRS 92

COMPARACIÓN DEL DISEÑO Y PRINCIPALES RESULTADOS EN DIFERENTES ESTUDIOS DE EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR REALIZADOS EN

GRANDES CIUDADES

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Algunas “rutas de transmisión”

TB en hospitales: cepas sensibles y multirresistentes: en pacientes VIH + y -

TB en prisiones, y entre población penitenciaria y general

TB en personas sin hogar Transmisión entre diferentes paises y continentes TB: contacto esporádico en lugares de ocio,

receptores de transplante, sala de autopsia, cabina de avión,...

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CiudadSexo

(varón)Edad

Infecciónpor VIH

Uso dedrogas

Lugar denacimiento

Sin hogar Alcoholismo

Los Angeles SI SI NO SI SI SI SI

Amsterdam NO SI SI* SI SI SI SI

Baltimore NO SI NO SI NO SI SI

Madrid NO SI NO SI NO NO NO

SanFrancisco

SI SI SI -- SI -- --

Zaragoza NO SI NO NO NO -- NO

Sevilla -- SI SI -- -- -- --

Nueva York NO SI SI NO SI NO NO

París SI NO NO -- NO SI SI

Barcelona NO NO NO SI SI NO NO

FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS A LA PERTENENCIA A CLUSTERS EN DIFERENTES ESTUDIOS REALIZADOS EN CIUDADES DE PAÍSES

DESARROLLADOS

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Interpretación de los resultados de la epidemiología molecular en los estudios poblacionales

Duración del estudio Técnica molecular utilizada e interpretación del

resultado Edad de la población Proporción de casos de TB incluidos en el estudio

molecular

Incidencia de TB en la población de estudio Estabilidad de los patrones de ADN y evidencia de

reactivación después de varias décadas de la infección inicial (JID 2003; 188: 1032-1039)

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Factores que dificultan el control de la transmisión de la tuberculosis

Un alto porcentaje de casos se producen como resultado de un contacto esporádico con un caso de TB (lugares de ocio, trabajo, etc. )

La transmisión ocurre probablemente antes del tratamiento antituberculoso— “retraso en el diagnóstico y tratamiento”

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¿QUÉ APORTA EL ESTUDIO MOLECULAR A LA EPIDEMIOLOGÍA CLÁSICA?

Identifica casos agrupados que no se pensaba que pudieran pertenecer a la misma cadena de transmisión.

Permite responder más adecuadamente a la pregunta de cuántos casos se deben a reactivación y cuántos a infección reciente.

Permite identificar patrones de transmisión en distintos subgrupos poblacionales y los lugares en que ésta se produce.

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“Las técnicas moleculares no vienen a sustituir a la

epidemiología clásica”

Epidemiología convencional

+

Técnicas moleculares

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2) Manejo clínico Diferenciar recaída de reinfección:

— Reinfección exógena por una cepa S o R— Reinfección exógena en pacientes inmunodeprimidos

en pacientes VIH + por cepas de Mtb R en pacientes en prisión y VIH + por cepas de Mtb S

— Reinfección exógena en estudios poblacionales: población inmunodeprimida e inmunocompetente Reinfección exógena en un área con moderada incidencia de TB

(Las Palmas de Gran Canaria). 1991-1996: 8/18 (AJRCCM 2001; 163: 717-20)

Reinfección exógena en un área con alta incidencia de TB (Sudafrica) 1992-1998: 12/16 (NEJM 1999; 341: 1174-79)

Implicaciones clínicas y epidemiológicas ante la posibilidad de reinfección exógena

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2) Manejo clínico Casos de TB falsos-positivos

— errores con la muestra / contaminaciones en el “laboratorio”

— algunos estudios han detectado hasta un 4%— ¿en que casos se sospecha un falso positivo de TB?

un único cultivo + (escaso) repetidas baciloscopias negativas cuadro clínico no compatible con TB

— La deteccion de la “huella de ADN” de este aislado confirmaba la sospecha de falso-positivo

— Consecuencias clínicas, epidemiológicas y económicas

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3) Virulencia y transmisibilidad de Mtbc ¿las cepas de Mtbc son igualmente de virulentas? Transmisión de algunas cepas “hipervirulentas”:

— transmisión de la cepa MTB-S (CDC1551): produjo un gran número de casos los lipidos de la pared micobacteriana producían una mayor

respuesta de citoquinas mayor patogenicidad en el modelo de ratón

— Cepa 210 de Mtb (derivada de la familia Beijing): cepa diseminada en diferentes lugares de EEUU crece más rapidamente en el modelo del macrófago humano

— Emergencia de una cepa de la familia Beijing en la Isla de Gran Canaria (AJRCCM 2001; 164: 1165-70)

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3) Virulencia y transmisibilidad de Mtbc

Transmisión de cepas resistentes: resistencia y patogenicidad— Tema controvertido— Transmisión en EEUU (Nueva York) de la cepa

multirresistente “W” (1990-93)— Transmisión en España de una cepa de M. bovis

multirresistente— Mutaciones en el gen katG (posición 315) (INH-R) y virulencia

de Mtbc: asociación con alta R a INH, multirresistencia y transmisión

– JID 2000; 182: 1788-90

– Infect. Immun. 2002; 70: 4955-60

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3) Virulencia y transmisibilidad de Mtbc

Persistencia de una cepa de MTBC multiR (“W”) en Nueva York (1990-1993 y 1993-1999)

— Los casos del 2º periodo eran menos probable ser VIH, nacidos en EEUU, “sin hogar”, antecedentes de carcel, y tener conexiones epidemiológicas.

— Los casos del 2º periodo probablemente representen reactivaciones en individuos infectados durante el periodo de brote.

JID 2003; 188: 356-63

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4) Evaluación de los Programas de control de la enfermedad

Estudio poblacional de epi molecular en San Francisco para evaluar la eficacia de las medidas tomadas para el control de la TB (1991-1997) tras la intensificación de las medidas preventivas: tasa de TB de 51,2 a 29.8 casos/100.000 proporción de casos en “clusters” en general

de casos en clusters en personas nacidas en EEUU de casos en clusters en VIH +

% de pacientes en cluster como indicador

Ann Intern Med 1999; 130: 971-8

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Retos para el futuro Desarrollar estrategias que Integren la

epidemiología molecular en los Programas de prevención y control de la enfermedad— identificar grupos de riesgo— mejorar los estudios de contactos— identificar puntos débiles en los programas de

control— evaluación de los programas

Técnicas moleculares más rápidas y fácilmente comparables por los distintos laboratorios