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02 El Genoma Humano

Dr. Alfonso C. Martínez-Conde Ibáñez

Genética Molecular Humana

Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid. © Prohibida la copia total o parcial

Genética Molecular Humana

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Facultad de Medicina

Universidad Complutense de Madrid. Curso 2018 - 2019

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Concepto de Genoma. El genoma es el conjunto del material genético de una célula, unindividuo o una especie.

El genoma humano ( genoma de especie ) está constituido por el genoma nuclear oDNA de los 24 cromosomas nucleares ( ubicados en el núcleo celular ) y el genomamitocondrial o DNA del cromosoma mitocondrial.


Los 24 cromosomas nucleares son 24 moléculas lineales de DNA que se ordenan porsu tamaño, del 1 al 22 ( cromosomas no sexuales o autosomas ). Se denominan con unnúmero que corresponde con su posición en dicho orden. Los cromosomas sexualeshumanos se denominan X e Y. El cromosoma mitocondrial MT es circular.

El genoma humano ( genoma de especie ) está constituido por el DNA de los 24 cromosomasnucleares ( ubicados en el núcleo celular ) y un cromosoma mitocondrial

Tamaño y peso del genoma humano


Una célula diploide humana contiene 46 cromosomas nucleares y dependiendo del tipo celular,desde unos miles a medio millón de copias del pequeño cromosoma mitocondrial.

La célula haploide humana tiene aproximadamente 3.109 bp. La célula diploide tieneaproximadamente 6.109 bp.

Con pequeñas diferencias para una célula de hombre o de mujer, una célula diploide humanacontiene aproximadamente 6.6 pg de DNA (http://www.fasebj.org/cgi/reprint/05-3904fjev1.pdf ), Enla práctica se obtiene entre 5 y 6 µg de DNA por cada millón de células humanas.

Cada uno de los 24 cromosomas nucleares humanos se puede estudiar en Metafaseporque es cuando el cromosoma se encuentra mas condensado. En esta fase cadacromosoma está formado por 2 cromátidas.

CROMÁTIDA

Brazo q( grande )

Decimos que las células sexuales espermatozoides y oocitos son haploides porque sonportadoras de un único juego de 23 cromosomas nucleares: 22 + X o 22 + Y.Decimos que las células somáticas son diploides porque poseen 2 juegos decromosomas nucleares (23 + 23) es decir, 46 cromosomas: 44 + XX o 44 + XY.


Cromosoma en Metafase( dos cromátidas )

CENTRÓMERO

Cromátida

Brazo p( pequeño )

Cada cromosoma tiene dos brazos denominados p y q

Go

G2M

cromosomas homologos

Los Cromosomas durante las diferentes fases del ciclo celular y el

periodo G0 de células en quiescencia y senescencia


GoG1S

Esta molécula de DNA se condensa o empaqueta. Este alto grado de empaquetamientose puede cuantificar. El DNA se empaqueta entre 10.000 y 50.000 veces; es decir, lamolécula se dispone de tal forma que entre ambos extremos la distancia se reducehasta 50.000 veces..

Desde el punto de vista de la Genética Molecular, los cromosomas nucleares en losperiodos G0 y G1 son moléculas de DNA. Esta molécula es extraordinariamente larga. Alo largo de esta molécula se disponen los genes de ese cromosoma.

condensación


X 10.000

descondensación

molécula lineal de dsDNADoble hélice

d d

10.000

G1 o G0 Metafase

Los genes se disponen a lo largo de cada cromosoma

Gen a Gen b Gen c Gen d

Cromosoma en periodos G1 o G0

molécula lineal dedsDNA

Doble hélice


Cromosoma en Metafase

Gen a

Gen b

Gen c

Gen d

Los cromosomas tienen dirección:

Desde el telómero del brazo p hasta el extremo del brazo q

Los pares de bases del cromosoma se numeran desde el extremo del brazo p hasta el extremo del brazo q



molécula lineal dedsDNA

Doble hélice

Dirección de la numeración de las bases



Cromosoma en Metafase

Gen a

Gen b

Gen c

Gen d

Dirección de la numeración de las bases

Gen DNA

Recordemos que en el proceso de síntesis de RNA o transcripción, se utiliza comomolde una molécula de DNA, pero más concretamente una de las 2 cadenas.

Dirección del Gen

Cada gen tiene una dirección determinada en el cromosoma

Símbolo del lugar y dirección de la transcripción de un gen


Transcripción

Gen DNA

mRNA5´P 3´OH

Dirección del mRNA

De las dos cadenas del dsDNA una de ellas se denomina cadena codificadora y laotra se denomina cadena molde.

La dirección del RNA nos permite discernir una cadena de la otra. La cadena molde esaquella que sirve de molde para la síntesis del RNA y por lo tanto es complementaria ala molécula de RNA y de sentido contrario (antisense)

La cadena cadena codificadora tiene la misma secuencia que el RNA si se cambia Tpor U. La cadena codificadora (+) o sense es la que se representa bio-informáticamente y sudirección o sentido es también la dirección o sentido del gen dentro del cromosoma.


5´

5´

3´ 5´

3´

3´Cadena codificadora

RNA

( + ) o sense

( + ) o sense

Cadena molde ( - ) o antisense

La cadena codificadora y el RNA transcrito serán identicas en secuencia de bases, sisustituimos T por U.

A T C G G G T A A T C C C A A A T C C G C G A

T A G C C C A T T A G G G T T T A G G C G C T 5´

3´5´

3´

Codificadora (+)

Molde (-)


A U C G G G U A A U C C C A A A U C C G C G A 3´5´ RNA (+)

Los genes se disponen a lo largo de cada cromosoma, pero en cada una de las dos cadenas del cromosoma pueden encontrarse cadenas codificadoras y cadenas molde de diferentes genes.



Genes dispuestos con la misma o diferente Orientación a lo largo del cromosoma

a b c d

5´ 3´

p q

Dirección del Cromosoma0M 1M

gen a gen b gen c gen d


5´3´

0M 1M

315.

742

321.

491

482.

367

512.

344

En el ejemplo, las bp del cromosoma o del contig se numeran desde 0M hasta 1M, los genes b y c se disponen con diferente Orientación en el cromosoma (minus y plus respectivamente).

El gen b (orientación minus) se encuentra entre los pares de bases 315.742 y 321.491El gen c (orientación plus) se encuentra entre los pares de bases 482.367 y 512.344

5´GGGCCCGTCACCTGGTTTAAA 3´

5´TTTAAACCAGGTGACGGGCCC 3´

5´ 3´

3´ 5´

Ejemplo de un mismo gen en orientación plus (+) y minus (-)

PL

US

(+)

RNA5´ 3´

Dirección del Dirección del


5´GGGCCCGTCACCTGGTTTAAA 3´

5´TTTAAACCAGGTGACGGGCCC 3´5´ 3´

3´ 5´M

INU

S (-)

RNA

3´ 5´

Dirección delCromosoma

Dirección delCromosoma

5´

5´

3´

3´

gen a gen b gen c gen d

Dirección del Cromosoma0M 1M

0M 1M


gen a gen b gen c gen dCadena (+)

RNA (+)

Esto significa que dentro del cromosoma, o de un contig o de un clon, el gen va a tener ORIENTACIÓN plus o minus. Sin embargo su cadena codificadora siempre es sense (+) por definición; porque tiene la misma dirección que el transcrito.

Son raras las ocasiones en las que existen genes incluidos en el interior de otros genes. Un ejemplo sería el caso de estos genes:

Genes dentro de genes

El gen NF1 de la Neurofibromatosis tipo 1 contiene en el interior de su intrón 26, tres genes con orientación contraria (EVI2B, OMG y EVI2A) y un pseudogen (AK3P1) con su misma orientación.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&cmd=retrieve&dopt=full_report&list_uids=4763



El gen RB1 de la proteína del Retinoblastoma contiene en su interior un gen con orientación contraria (LPAR6).


Las técnicas de bandeo han permitido dividir cada cromosoma en unidades discretas denominadas bandas. La tinción G (Giemsa) permite obtener dos tipos de bandas que alternan a lo largo del cromosoma; son las bandas claras (ricas en C y G) y las bandas oscuras (ricas en A y T). Existen varias técnicas de tinción. Dependiendo del material biológico utilizado y la calidad de la preparacion se obtiene un número mayor o menor de bandas

Desde el punto de vista de la Genética Molecular, cada cromosoma en periodos Go / G1 es una sola molécula deDNA (una cromátida). Esta molécula es extraordinariamente larga. A lo largo de esta molécula se disponen losgenes de ese cromosoma.


Las bandas se denominan con el número de cromosoma, seguido de la abreviatura del brazo ( p o q ).

A continuación sigue un número que indica la banda. Empezando la numeración desde el centrómero hacia el extremo del brazo correspondiente.

Por ejemplo: 1p33

Las bandas pueden resolverse en sub-bandas.

1p


Por ejemplo, la bamda 1q32 tiene varias sub-bandas:

1q32.1 / 1q32.2 / 1q32.3

1q

Desde el punto de vista de laGenética Molecular, cadacromosoma en periodos Go / G1 esuna sola molécula de DNA (unacromátida). Esta molécula esextraordinariamente larga. A lolargo de esta molécula se disponenlos genes de ese cromosoma.

Chromosome # Genes 2001 # of Bases

Chromosome 1 2968 279 million bases












# Genes 2014 # Genes 2017

3958 5.078

2787 3.862

2203 2.971

1702 2.441

1892 2.578

2302 3.000

2146 2.774

1534 2.152

1742 2.262

1607 2.174

2364 2.920

1950 2.521












Chromosome X 1184 163 million bases

Chromosome Y 231 51 million bases

32040 3254 million bases

Chromosome size source: International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409:860-921(2001).Gene count source: Wellcome Trust. Unveiling your genome. Wellcome News Supplement Q1:13-23(2001).

16569 bp

993 1.381

1655 2.055

1428 1.814

1535 1.920

2010 2.432

657 988

2188 2.481

1014 1.349

584 756

956 1.172

1805 2.158

458 577

41470 53816

El Proyecto Genoma HumanoEl Proyecto Genoma Humano consistió en la secuenciación de todo el DNA del genoma humano; esto es, la descripción, base a base, de las 3.231 millones de bp del genoma humano.

En el año 2000 finalizó el borrador de la secuencia del Genoma y fue publicada en Febrero de 2001.

http://www.nature.com/nature/journ


Un primer hito fue la culminación de la secuencia del cromosoma 22, publicada en Diciembre de 1999.

En el año 2003 se ha dado por concluido oficialmente el Proyecto Genoma Humano

http://www.nature.com/nature/journal/v409/n6822/full/409860a0.html

Extracción

Se usaron diferentes fuentesesperma, líneas celulares, sangre

DNA Genómico

¿Cómo se realizó?


DNA Genómico

El DNA fue digerido con enzimas de restricción ( MboI, EcoRI, ....)

Fragmentos de gran tamaño (100 a 500 kb)

Fragmentos de gran tamaño (100 a 500 kb)

BAC (Cromosoma artificial Bacteriano)Inserción (clonación)

inserto


CLON

Dig

estió

n co

n H

indI

IIfragmentos pequeños

inserto

vector

fragmentos pequeños

vector útil para la clonación y la posterior secuenciación

Clonación


El proyecto Genoma Humano ha permitido el ensamblamiento de las secuencias realizadas por multitud de investigadores y organismos que han secuenciado segmentos de DNA o de RNA de muy diferentes tamaños.

La secuencia de cada cromosoma humano se ha obtenido mediante la unión de secuencias de diferente tamaño que solapan. Esto permite construir grandes secuencias denominadas contigs (contiguous sequences).

componente

componente

componente

switch point


componente

contig

switch point

Los contig utilizan un formato de Accesion Number : NT_123456

Los cromosomas completos utilizan un formato de Accesion Number : NC_123456

Cuando se pueden ordenar los contig consecutivamentepero falta información, la estructura se llama scaffold(andamiaje). Cuando se completa pero existen huecos ofalta información, se puede denominar secuencia delcromosoma ensamblado (Chromosome assembly).Cuando se tiene toda la información se puede llamarcromosoma.1p

CONTIGs


1q

CONTIGs

MAP VIEWER del NCBI :

El Genoma Humano en la versión GRCh38 de 2013/12/17

Se denomina Primary Assembly (ensamblaje) al ensamblaje de cromosomas ensamblados más otra información adicional referente a secuencias todavía no localizadas. Sin embargo, el conjunto de las secuencias representa el genoma haploide humano sin redundancias.

El último Assembly publicado era el GRCh38 p.10


Fue precedida de un buen número de versiones: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/organism/9606/all/

Assembly GRCh38 p.10 : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.36/

chr total length GenBank Accession RefSeq Accession

1 249,250,621 CM000663.1 NC_000001.10

2 243,199,373 CM000664.1 NC_000002.11

3 198,022,430 CM000665.1 NC_000003.11

4 191,154,276 CM000666.1 NC_000004.11

5 180,915,260 CM000667.1 NC_000005.9

6 171,115,067 CM000668.1 NC_000006.11

7 159,138,663 CM000669.1 NC_000007.13

8 146,364,022 CM000670.1 NC_000008.10

9 141,213,431 CM000671.1 NC_000009.11

10 135,534,747 CM000672.1 NC_000010.10

El Genoma Humano en la versión GRCh37 de Agosto 2009


11 135,006,516 CM000673.1 NC_000011.9

12 133,851,895 CM000674.1 NC_000012.11

13 115,169,878 CM000675.1 NC_000013.10

14 107,349,540 CM000676.1 NC_000014.8

15 102,531,392 CM000677.1 NC_000015.9

16 90,354,753 CM000678.1 NC_000016.9

17 81,195,210 CM000679.1 NC_000017.10

18 78,077,248 CM000680.1 NC_000018.9

19 59,128,983 CM000681.1 NC_000019.9

20 63,025,520 CM000682.1 NC_000020.10

21 48,129,895 CM000683.1 NC_000021.8

22 51,304,566 CM000684.1 NC_000022.10

X 155,270,560 CM000685.1 NC_000023.10

Y 59,373,566 CM000686.1 NC_000024.9

El Genoma Humano en la versión GRCh38.p6 de 21 de Diciembre de 2015


Tomemos como ejemplo el cromosoma 1 . En 2009, en el caso del cromosoma 1, existían 19 contig, de ellos 2 no localizados (no posicionados).Falta una parte del cromosoma, como se puede observar en el gráfico del GRC


2009 2015

En 2015, en el caso del cromosoma 1, existen12 contig, de ellos 9 no localizados (noposicionados). Se ha producido unagrupamiento, por cierre de gaps, de los contiglocalizados que hace que su número se hayareducido de 17 a 3. Además han aparecido 7nuevos contig no localizados

Hay un total de 3380 genes (actualmente 3958) en este cromosoma y 6 (actualmente 18) no localizados

Symbol O

CALML6

LOC100287506

RNU5E

HTR6

SNIP1

HEYL

DMBX1

CYP4A11

L1TD1

TGFBR3

En el mapa del cromosoma 1 completo (sin utilizar el zoom) podemos ver ahora 20 genes, en su orden en el cromosoma, y a la derecha la orientación que tienen dentro del cromosoma.


TGFBR3

IGSF2

LOC100132999

TDRKH

NBPF18P

ATP8B2

RXFP4

MAEL

PRELP

RPL13AP11

OR14A2

EL DNA MITOCONDRIAL HUMANO Y SU EXPRESIÓN http:// www.lab314.com

La mitocondria tuvo en el pasado un interés restringido a los estudiosos de la citología, labioquímica metabólica y la bioenergética. Sin embargo, desde hace pocos años la mitocondriahumana se encuentra en un primer plano de la actualidad de las ciencias biomédicas. Estecambio radical se fundamenta en varios hechos :

1) El conocimiento de un numeroso grupo de enfermedades genéticas metabólicas, entre lascuales figuran más de medio centenar debidas a mutaciones puntuales consistentes en lasustitución de unas bases por otras, afectando a distintos genes del genoma mitocondrial. Aello hay que añadir los varios cientos de mutaciones no puntuales como son reordenacionesgenéticas del tipo de las delecciones o las inserciones de fragmentos de DNA de distintotamaño. Este aspecto de la mitocondria humana ha llamado la atención de los científicos


tamaño. Este aspecto de la mitocondria humana ha llamado la atención de los científicosinteresados en la terapia génica.

2) La utilidad del DNA mitocondrial como un marcador de gran fiabilidad en antropología molecularpara el estudio de la evolución humana, los flujos migratorios, etc. Utilidad que se extiende a laciencia forense, por su valor como marcador en la identificación de personas o elesclarecimiento de relaciones de parentesco.

3) La bioquímica metabólica ha acrecentado los conocimientos sobre el papel central de lamitocondria en el metabolismo celular. Al mismo tiempo se han clarificado definitivamente losaspectos bioenergéticos de la mitocondria en relación con el transporte de electrones, lafosforilación oxidativa y el necesario acoplamiento de ambos procesos.

4) Nuevos aspectos que prometen ser decisivos son su participación en el cáncer y lasenfermedades neurodegenerativas. Su interés creciente en oncología se debe a su papel centralen la apoptosis o suicidio celular, que impide en condiciones normales el desarrollo de tumores.

El genoma humano es el conjunto del DNA humano, conteniendo los genes. Dicho DNA estáorganizado en forma de cromosomas. Una célula somática típica tiene en su núcleo 46cromosomas. A este número ( 46 ) se llama número diploide de la especie humana.

Sin embargo, existe un cromosoma 47 en el genoma humano : es el pequeño cromosomamitocondrial. En el siguiente esquema podemos observar como en una célula somática típica elDNA se encuentra repartido en dos fracciones : Genoma Nuclear y Genoma Mitocondrial


¿Cuántos cromosomas mitocondriales o copias del DNA mitocondrial hay en una célula humana?

Dependiendo de la técnica utilizada existen importantes diferencias en la cuantificación. Podemos considerar como más exactas las valoraciones hechas mediante PCR cuantitativa.

Además, hay copias del DNA mitocondrial integradas en los cromosomas nucleares. Estas copias no funcionales se denominan numts (nuclear mitochondrial pseudogenes) y son frecuentemente causa de errores en la cuantificación de copias de mtDNA por célula. Como veremos a continuación el número de mtDNA varía mucho de unos tipos celulares a otros.

Los eritrocitos no contienen mitocondrias, lo cual condiciona su metabolismo extraordinariamente.

La mayoría de las células somáticas contienen entre 102 y 104 copias of mtDNA.


En células epiteliales hay unas 250 copias de mtDNA / célula repartidas entre unas 50 mitocondrias. Esto es, 5 copias de mtDNA por mitocondria. Esto es antes de la replicación del mtDNA; tras la replicación del mtDNA el número es de 10 mtDNA / mitocondria.

En higado existen 1,000 a 2,000 / hepatocito

En miocardio hay alrededor de 7,000 copias de mtDNA / nucleo diploide.

En músculo esquelético unas 4,000 copias de mtDNA / nucleo diploide.

En el caso de las células no somáticas o gametos se dan los casos extremos. Un deficit de mtDNA en oocitos humanos es causa de infertilidad femenina. Por el contrario, los espermatozoides han perdido copias de mtDNA durante el proceso de maduración y deben alcanzar número ínfimo de copias mtDNA para ser funcionales.

Los oocitos humanos contienen una media de 200,000 copias de mtDNA copies. Un incremento en el número de copias se correlaciona con un incremento de la fertilidad femenina.

Por contra, los espermatozoides humanos maduros contienen una media de 10.1 copias de mtDNA y sin embargo contienen una media de 22 – 75 mitocondrias por espermatozoide. Esto indica que en los espermatozoides hay mitocondrias que carecen de mtDNA y otros con un número muy bajo de copias de mtDNA.


Recordemos que el genotipo de un organismo, para un gen determinado, recibe la denominación de homocigoto o de heterocigoto según sean los alelos iguales o diferentes, en el caso del mtDNA denominamos homoplasmia a la existencia de homogeneidad en las copias de mtDNA y heteroplasmia a la existencia de dos o más poblaciones distintas de mtDNA en el mismo organismo.

Genoma Nuclear : Genoma nuclear o DNA de los 46 cromosomas nucleares. Los cromosomasson moléculas lineales de DNA, y entre todos suman un tamaño total de 6.000 millones de paresde bases ( GC y AT ) constituyendo la fracción del genoma mayoritaria. De tal forma que el tamañomedio de los cromosomas humanos es de unos 130 millones de pares de bases. El genomahumano tiene un número aproximado de 55.000 genes.

Genoma Mitocondrial : Genoma mitocondrial humano. Constituido por un solo cromosoma, quees una molécula circular de DNA de un tamaño de 16569 pares de bases ( 8000 veces menor queel cromosoma medio ). Este tamaño de 16569 bp corresponde al primer DNA que se secuenció yes el DNA "secuencia Cambridge". Otras variantes tienen distinto tamaño ; así el DNA mitocondrial"secuencia africana" tiene 16559, mientras la "secuencia sueca" tiene 16570 bp. En cuanto a sunúmero, hay que precisar que la mayoría de las células tienen varios cientos de mitocondrias.Además cada mitocondria tiene varias moléculas de DNA, con lo que el número de copias delcromosoma circular en cada célula es de varios miles.


cromosoma circular en cada célula es de varios miles.

En la molécula de DNA circular de mitocondria las dos cadenas complementarias tienen unaproporción de C y G muy dispar, y por ello tienen un peso molecular muy distinto. Para distinguirlashablamos de cadena H o pesada ( heavy ) y cadena L o ligera ( light ).Cadena LComposición en bases (total bases : 16569): 5122 A ; 5180 C ; 2171 G ; 4096 TPeso molecular : 5.060.609 daltonsCadena HComposición en bases (total bases : 16569): 4096 A ; 2171 C ; 5180 G ; 5122 TPeso molecular : 5.168.726 daltons

EP

P

I

V

F

Q SL

MTND6 MTND5MTND1

L

rRNA 16s

rRNA 12s

D loop

Cytb

GENES

22 tRNAs

LAB314.COM


G

QM H

S

KD

W

S

YCNA

MTND3

MTND4L

MTND4

R

ATPase 8

ATPase6 COIII

COII

COI

MTND2

13 mRNAs

2 rRNAs

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