Técnicas de análisis de células tumorales

circulantes (CTCs)

Dr. Javier Sastre

Servicio de Oncología Médica

HC San Carlos (Madrid)

Carcinogénesis, metástasis y CTCs

Potenciales aplicaciones de la determinación de CTCs

Bettegowda, Sci Transl Med, 2014

Diaz & Bardelli, JCO, 2014Heitzer, Clinical Chem, 2015

∗ Las CTCs son muy escasas en el torrente circulatorio general del paciente

Retos del aislamiento de CTCs

general del paciente

∗ No hay un único marcador fiable y eficiente para distinguir las CTCs de las células sanguíneas

∗ Se precisan métodos de concentración, purificación e identificación como CTC

∗ Diferencias en las propiedades biológicas con respecto a las células hematopoyéticas� Expresión de proteínas de membrana celular

Principios básicos de la metodología de recolección de CTCs

� Expresión de proteínas de membrana celular� Diferencias en viabilidad � Diferencias en capacidad invasiva

∗ Diferencias en las propiedades físicas con respecto a las células hematopoyéticas� Tamaño� Densidad� Carga eléctrica� Deformabilidad

Métodos de aislamiento de CTCs

Métodos de aislamiento de CTCs

C. Costa et al. Sensors 2014

M. Tellez et al. Clinical chemistry 2016

Anti-EpCAMFerrofluid

Metodología analíticaExtracción inmunomagnética y análisis

citométrico

Leucocito

CD45

Anti -CD45

NucleusDAPI

Célula Epitelial

EpCAM

NucleusDAPI

CK

Anti-CK 8,18 y19

Veridex CellSearchÚnico método aprobado por la F.D.A.

Tubo con preservante

celular

Análisis

Molecular

Extracción Extracción inmunomagnéticainmunomagnética y análisis y análisis citométricocitométrico

Analizador CellTracks Cuantificación

Interpretación clínica

Artefacto

Célula tumoral CD45 Control CK-PE DAPI

Leucocito

CTCs enumeration as prognostic and

predictive factor in predictive factor in CRC: prospective

studies

Supervivencia global según CTC basal

Supervivencia global según evolución de CTC

287 Pacientes estadio I-IV potencialmente curables239 Pacientes estadio I-III

Extracción PREOPERATORIA de CTCs (Veridex)

Conclusiones:

Correlación con estadio: 5% est I, 9% est II-III, 18% est IV.No correlación con variables clínico-patológicas

Factor pronóstico independiente para SG y SLE(HR: 5.5, 95% IC 2.3-13.6) con CTCs > 1, junto con edad > 65 años y N+.

Se precisan estudios de validación externos

∗ Escaso número de células aisladas (dependencia de EpCAM)

� Infraexpresado en “células sueltas” hasta 10 veces menos

�Pérdida de expresión en EMT

�Sobrexpresado en enfermedad inflamatoria intestinal

Limitaciones del Veridex CellSearch

�Sobrexpresado en enfermedad inflamatoria intestinal

∗ Imposibilidad para la caracterización molecular de las CTCsaisladas (pérdida de información valiosa predictiva dada la heterogeneidad de los tumores)

∗ Por lo tanto, se precisan métodos de aislamiento que permitan mayor cuantificación de CTCs (células diferenciadas, células progenitoras y células en transición epitelio-mesénquima), independientes de EpCAM, y que mantengan las células viables para su posterior caracterización molecular

Ventajas adicionales a la enumeración

Métodos basados en el tamaño de las células

M. Tellez et al. Clinical chemistry 2016 A. Lee et al Ann Chem 2014

Métodos basados en las propiedades eléctricas

M. Tellez et al. Clinical chemistry 2016

DEPArray

Métodos basados en características inmunológicas

Nano-Velcro

Isoflux: Metodología analítica

∗ La mayoría de los estudios son preclínicos o se limitan a evaluar la capacidad de aislamiento y enumeración de las CTCs

∗ Hay pocos datos comparativos frente a Veridex CellSearch

Limitaciones de las técnicas alternativas al Veridex CellSearch

∗ Hay pocos datos comparativos frente a Veridex CellSearch∗ Escasos estudios prospectivos con aplicabilidad clínica para

conocer su valor pronóstico, predictivo ni los niveles de corte de cada técnica para dichos parámetros en cada situación clínica

∗ Se precisa una estandarización de la metodología y validación entre diferentes laboratorios para un reconocimiento universal de la metodología

52 pacientes con CRC estadios II-IVEnriquecimiento de CTCs mediante centrifugación por gradiente Enriquecimiento de CTCs mediante centrifugación por gradiente de densidad usando una solución de ficol.Depleción de leucocitos mediante Human Dynabeads CD45 kitEnriquecimiento de CTCs mediante “quantum-dot-labelled immunoassay method” de desarrollo propio.

Análisis de mutaciones: KRAS (12 y 13), BRAF (V600E), CD 133 (rs3130 y rs 2286455) y PLS3 (rs6643869) en CTCs y los correspondiente tumores primarios colónicos.

88.5% de correspondencia entre ambos

∗ La enumeración y caracterización de CTCs tiene importantes potenciales beneficios para los pacientes con cáncer.

∗ Existen numerosos métodos de detección basados en

CONCLUSIONES

∗ Existen numerosos métodos de detección basados en propiedades físicas e inmunológicas de las CTCs en desarrollo.

∗ Veridex CellSearch es el único aprobado por la FDA para su aplicación en la clínica pero presenta importante limitaciones.

∗ Es preciso consensuar y estandarizar nuevos métodos de detección que permitan nuevas aportaciones, especialmente en el terreno de la caracterización molecular de las CTCs, y demostrar su impacto en la actividad clínica mediante estudios prospectivos multicéntricos.