GenticaIntroduccin

EL NCLEO CELULAR

El ncleo: centro de control de la clulaGeneralmente es el organelo ms conspicuo.

Consta de: La envoltura nuclear. La cromatina El nuclolo.

Envoltura nuclear Es una membrana doble que rodea

al ncleo. La membrana nuclear tiene poros

por donde pasan algunas molculas desde el ncleo al citoplasma y viceversa.

Los poros nucleares son estructuras complejas que contienen por lo menos ocho subunidades proteicas con un canal pequeo en el centro.

Permite el intercambio selectivo de materiales

El agua, los iones y las molculas pequeas como el ATP pueden pasar libremente por el canal central del poro, pero ste regula el paso de molculas mayores, en especial de protenas y de ARN.

Los poros ayudan a controlar el flujo de informacin de y desde el ADN.

Envoltura nuclear

CromatinaAdems, est un material llamado cromatina, que est formada por ADN y proteinas histonas y no histonas.

En la divisin nuclear, la cromatina toma la forma de cromosoma.

Cromatina

En el interior del ncleo encontramos una estructura de forma irregular llamada nuclolo. Aqu se forma y se almacena el ARNr.

Nuclolo

cidos nucleicos

ADN

El ADN de los cromosomas se compone de dos cadenas enrolladas una a la otra en una doble hlice.

Los azcares y fosfatos que unen un nucletido al siguiente forman el esqueleto en cada lado de la doble hlice.

En tanto que las bases de cada cadena se aparean en el centro de la hlice.

Solo pares especficos de bases, llamados pares de bases complementarias, se pueden unir en la hlice mediante enlaces de hidrgeno: adenina con timina y guanina con citosina.

COMPOSICIN DEL ADN

Bases Nitrogenadas

Adenina Guanina Timina Citosina

MOLCULA DE ADN

REPLICACIN

La divisin celular requiere de la duplicacin del material gentico

mitosis

mitosis

meiosis

Mecanismo general

Cada hebra sirve como molde para replicar la complementaria

AGCGATTAGGGGCGTAGATCGAATGAGTAGAT

Propiedades

Semiconservativa: cada nueva molcula esta formada por una hebra parental y una recin sintetizada

Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de inicio denominado origen de replicacin

A cada lado de la burbuja de replicacin se forma una horquilla de replicacin

Unisentido. Direccin de la sntesis: 5 3

Semidiscontinua: Una de las hebras no puede ser sintetizada de continuo Consecuencia de la direccionalidad

Replicacin en procariotas

Mecanismo Inicio

Reconocimiento de orgenes de replicacin. Separacin de hebras. Posicionamiento de maquinaria enzimtica.

Elongacin

Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicacin. semiconservativa, semidiscontinua, bidireccional, uni lectura .

Terminacin

Reconocimiento de seales de terminacin. Desensamble de replisomas.

ADN polimerasas: Pol I Pol II Pol III (replicasa) Pol IV y V

Necesitan 3 OH libre

Maquinaria enzimtica ADN polimerasas: Sntesis de ADN Primasas: Generacin 3OH libres Ligasas: Unin los fragmentos de Okazaki Helicasas: Separacin de hebras Topoisomerasas: Mantenimiento del grado

de superenrollamiento SSBs: Mantenimiento de simples hebras

Inicio

Reconocimiento del origen y apertura de las hebras

Elongacin

Replisoma

Terminacin

Replicacin en eucariotas

Los mecanismos son similares Ms de un origen de replicacin por cromosoma Es ms complejo

Proteins Functions

RPA PCNA RFC Pol /primase Pol / FENI DNA2 DNA ligase I Mcm2-7

Single-stranded DNA binding; stimulates DNA polymerases; facilitates helicase loading

Stimulates DNA polymerases and RFC ATPase DNA-dependent ATPase; primer-template DNA binding;

stimulates DNA polymerases; PCNA loading RNA-DNA primer synthesis DNA polymerase; 3'-5' exonuclease Nuclease for removal of DNA/RNA primers Nuclease for removal of DNA/RNA primers Ligation of DNA DNA helicase; primosome assembly, licensing factor

ADN polimerasas

Ocurre durante la fase S Una nica vez por ciclo celular

Horquilla eucariota

Telmeros

Telomerasa

Enzima capaz de resolver el problema de acortamiento de los extremos

Ribonucleoprotena

Mantenimiento de la informacin hereditaria

Errores durante la replicacin: Las ADN polimerasas no son 100% fieles Los errores son reparados en un alto porcentaje

de las veces Cuando los errores escapan los mecanismos de

reparacin ocurren cambios en la secuencia del ADN: Mutaciones

Las mutaciones tambin pueden ocurrir por fenmenos post replicacin (mutgenos fsicos, qumicos, etc.)

Mecanismos de reparacin Las propias replicasas son capaces de

reparar sus errores durante la elongacin: actividad correctora de prueba (proofreading) Implica una actividad exonucleasa 3 5

Mecanismos de reparacin

Replicacin de ADN in-vitro: PCR Permite la amplificacin de un fragmento de ADN de inters Algunas aplicaciones:

Clonado acelular de molculas de ADN Deteccin de secuencias sin purificacin previa Anlisis de expresin gnica Secuenciacin de cidos nucleicos Amplificacin de ADN para su posterior clonacin celular Aplicaciones en medicina:

Diagnostico de enfermedades hereditarias/infecciosas Diagnstico parental (amniocentesis, vellosidades corinicas) Tipado de tejidos para transplantes Deteccin de clulas tumorales Estudios de asociacin genotipo-fenotipo

Tcnicas forenses: huellas genticas (Identificacin de polimorfismos) Identificacin individual Tests de paternidad

Filogenia Anlisis de gentica poblacional

Reaccin de replicacin in-vitro: Molde ADN polimerasa: Taq polimerasa (termoestable) Cebadores:

3 OH libre Definen la regin a amplificar

dNTPs (A, C, G, T) Condiciones para el funcionamiento de la

enzima: Buffer Mg++ (cofactor de la enzima)

Procedimiento Desnaturalizacin

del ADN (94C) Agregado e

hibridacin de los cebadores (50C-65C dependiendo de los cebadores)

Elongacin (72C) Repeticin de estas

etapas (25-35 ciclos)

Luego de terminados los ciclos se obtienen millones de molculas de la regin blanco

La hace una tcnica extremadamente sensible Ventaja: se puede amplificar ADN partiendo de

muy poco material Desventaja: Contaminaciones

Variantes del mtodo rt- PCR:

Se usa una transcriptasa reversa para pasar una muestra de ARN a ADN obteniendose ADN copia (ADNc)

Se realiza un PCR para amplificar el ADNc de inters

Estudios de expresin gnica Clonado de genes eucariotas (eliminacin de

intrones)

PCR cuantitativo (real time PCR, qPCR): Se diferencia en que en cada ciclo de

amplificacin se cuantifica la cantidad de ADN obtenida

Permite inferir la cantidad de molculas de molde que exista originalmente en la muestra: Cuantificacin de la expresin gnica Cuantificacin de microorganismos

Secuenciacin de ADN Mtodo de Sanger (nobel en 1980) Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs) para

terminar una reaccin de sntesis de ADN in-vitro

Realizando 4 reacciones independientes (una para cada base) se puede inferir la secuencia original

Secuenciacin automtica Sigue el mismo principio A diferencia del mtodo anterior cada ddNTP se

marca con una molecula fluorescente diferente Esto permite realizar una unica reaccion en la

cual estan presentes los 4 ddNTPs marcados Los fragmentos obtenidos se separan por

electroforesis capilar La deteccin se realiza en un punto fijo al final de

la corrida

Secuenciacin de genomas Cada reaccin de secuencia es capaz de

leer unas 500 pb Como se obtuvo la secuencia continua del

conjunto de los cromosomas humanos? Cada cromosoma tiene en promedio

150Mb (genoma completo 109)

Construccin de biblioteca de ADN genmico fragmentado al azar

Lectura de secuencias individuales Las secuencias individuales son solapadas y

ensambladas (contigs) Para asegurarse de que todas las secuencias

estn representadas se leen unas 10 veces la cantidad de bases del genoma

La velocidad de produccin de las secuencias ha ido en aumento.

Recientemente se dio un salto en este sentido con el desarrollo de los secuenciadores de prxima generacin

No usan terminacin de cadena

Se coloca una base cada vez y se detecta cual fue incorporada a cada molcula que se esta secuenciando

Producen en una nica reaccin de secuencia mil lones de lecturas de fragmentos diferentes (paralelizacin)

108 1010 bases por corrida (menos de 1 da)

De esta forma se secuencio el genoma entero de Watson en menos de 1 mes a un bajo costo