· miszczuk. andrea. boaglio. flavia. roma. marcelo . toledo. prof. mary vore. graduate center for...
TRANSCRIPT
Rol de la ubiquitinización en la falla secretora bi liar asociada a la endocitosis de transporadores hepatocelulares inducida por estróge nos
La colestasis funcional es una alteración en la capacidad de los transportadores del hepatocito que afecta la formación de la bilis. Dicha anomalía es causa de varias enfermedades hepáticas, entre ellas la producida por el metabolito estrogénico estradiol 17ß-D-glucurónido en mujeres embarazadas susceptibles, quienes tienen un elevado riesgo de mortalidad fetal por esta causa.
Nuestro grupo fue pionero en establecer que el principal mecanismo que lleva a esta alteración funcional es la internalización endocítica de los transportadores canaliculares responsables de la formación de la bilis, lo cual conduciría a su posterior degradación lisosomal. Los mecanismos que gobiernan la endocitosis son hasta el momento desconocidos, aunque demostramos que son regulados por varias rutas de señalización transduccional.
El objetivo de este proyecto es indagar si la ubiquitinización de cadena corta de los transportadores, una modificación de tipo postraduccional regulada por señalización que favorece la endocitosis y la posterior degradación lisosomal de los mismos, es la mediadora de las alteraciones inducidas por el estrógeno.
Para llevar adelante este objetivo, se realizarán estudios "in vitro" de la funcionalidad y localización subcelular de los trasportadores en condiciones de inhibición farmacológica del proceso de ubiquitinización, o el eventual "knockdown" (siRNA) de enzimas claves de este proceso. Se utilizará para ello un modelo hepatocelular polarizado y estable de función secretora biliar, como es el de "hepatocitos cultivados en sándwich de colágeno". Haremos uso de metodologías tales como inmunoprecipitación seguida de inmmunoblotting (para estudio de los cambios en el grado de ubiquitinización de los transportadores), inmunofluorescencia seguida de microscopía confocal (para estudios de localización subcelular de los mismos) y análisis en tiempo real por microscopía de fluorescencia del transporte de sustratos fluorescentes (para estudios de actividad funcional de los transportadores relevantes).
Creemos que este estudio abrirá la puerta para numerosas estrategias terapéuticas superadoras de las hasta hoy existentes, muy limitadas en diversidad y empíricas en su empleo.
Instituto de Fisiología Experimental( CONICET-UNR)
Área FisiologíaFacultad de Cs. Bioq. y Farm.Universidad Nacional de Rosario
www.ifise.gov.ar
Las temáticas de investigación que se abordan en el Área Fisiología - IFISE están incluidas en el campo de la investigación biomédica básica con especial énfasis en Fisiología y Fisiopatología, y abarcan desde estudios in vivo hasta estudios celulares y moleculares, utilizando modelos y técnicas de actualidad.
Los estrógenos producen numerosasalteraciones en la capacidad del hígadopara producir bilis (colestasis).
El estradiol 17ß-D-glucurónido (E217G) es un metabolito endógeno del estradiol que produce colestasis aguda en animales de experimentación y ha sido involucrado como agente causal de la colestasis del embarazo en humanos.
Nuestros modelos de trabajo:cultivo de hepatocitos en sándwich
Control E217G
Alteración en el transporte apical de sustratos fluorescentes
Actina Bsep Merge
Control
Actina Bsep Merge
E217G
Inmunolocalización de transportadoresen cultivo en sándwich (microscopía láser confocal)
Endocitosis del transportador apical de sales biliares Bsep(flechas)
Actina
Radixina
PDZK1/Hax1 E217G
Ubiquitina
Posibles blancos de acción del estrógeno que llevan a la endocitosis de transportadores: ubiquitinización, proteínas de andamiaje, anclaje al
citoesqueleto de actina.
FernandoCrocenzi Cecilia
Basiglio GiselMiszczuk
AndreaBoaglio
FlaviaToledoMarcelo
Roma
Prof. Mary Vore
Graduate Center for ToxicologyUniversity of Kentucky, USA
Prof. Juan Francisco Medina
Centro de Investigación Médica AplicadaUniversidad de Navarra, EspañaColaboración Internacional