基因工程基因工程Gene EngineeringGene Engineering

彭银祥等编彭银祥等编著

华中科技大学出版社华中科技大学出版社 20082008 年年 22 月第二次印刷月第二次印刷

第第 22 章 基因工程的分子生物章 基因工程的分子生物学基础学基础

Basic Molecular Biology of Basic Molecular Biology of Gene EngineeringGene Engineering

高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材

2-2

2.1 核酸的结构与功能

2-3

2.1.1 遗传物质与 DNA 和 RNA

1 ） DNA 是主要遗传物质作为遗传物质的 DNA 主要特性： 1 ）储存遗传信息； 2 ）将遗传信息传递给子代； 3 ）物理和化学性质稳定； 4 ）具有遗传变异特性。2 ） RNA 也是遗传物质在某些病毒中，它的核酸只有 RNA ，如逆转录病毒，类病毒。

2-4

1. 染色质与 DNA （ Chromosome and DN

A ）

2.1.2 DNA 的结构与功能

2-5

染色质 (Chromatin): 指间期细胞核内由 DNA 、组蛋白、非组蛋白及少量 RNA 组成的线性复合结构 , 是间期细胞遗传物质存在的形式。◆染色体 (chromosome): 指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中 ,

由染色质聚缩而成的棒状结构。◆染色体与染色质比较●没有差异，●构型不同，●是在细胞周期不同阶段的不同表现形式。

2-6

• H2A H2B H3 H4各2 分子～ 200bp DNA H1

•核酸酶处理核小体产生含 146bp核心颗粒。

• 146bp围绕核心颗粒形成 1.8圈，每圈约80bp

2-7

Ø10-11 nm

2-8

30nm 纤维

2-9

染色质的高级结构 DNA containing genes is tightly packed into chromosomes

2-10

2 DNA 的结构与功能

核酸的化学组成

Glycosidic (glycoside, glycosylic)

bond ( 糖苷键 )

Ribose or 2’-deoxyribose

Bases

phosphate

Adenosine 5’-triphosphateAdenosine 5’-triphosphate ，， ATP

Phosphate ester bond

2-11

Bicyclic 嘌呤碱Purines:

Thymine (T) is a 5-methyluracil (U)

（ 1 ）碱基 (Bases)

Monocyclic 嘧啶碱pyrimidine:

2-12

（ 2 ）核苷 (Nucleoside)

Glycosidic (glycoside, glycosylic) bond ( 糖苷键 )

R Ribose or 2’-deoxyribose

2-13

(3) 核苷酸 （ Nucleotide)

2-14

BASES NUCLEOSIDES NUCLEOTIDES

Adenine (A)

Adenosine Adenosine 5’-triphosphate (ATP)

Deoxyadenosine

Deoxyadenosine 5’-triphosphate (dATP)

Guanine (G)

Guanosine Guanosine 5’-triphosphate (GTP)

Deoxyguanosine

Deoxy-guanosine 5’-triphosphate (dGTP)

Cytosine (C)

Cytidine Cytidine 5’-triphosphate (CTP)

Deoxycytidine Deoxy-cytidine 5’-triphosphate (dCTP)

Uracil (U) Uridine Uridine 5’-triphosphate (UTP)

Thymine (T)

Thymidine/

Deoxythymidie

Thymidine/deoxythymidie

5’-triphosphate (dTTP)

2-15

核酸的共价结构共价结构主要指的是一级结构一级结构：分子内核苷酸的排列顺序。

DNA 的以及结构与功能（核酸的共价结构）

DNA 的主要功能：1 遗传信息的储存：分子内核苷酸的排列顺序储存遗传信息。

2 DNA 复制、转录的模板： DNA→DNA 、DNA→RNA

2-16

DNA 的一级结构

3’-5’ Phosphodiester bridge or

3’-5’ phosphodiester bond

2-17

• 主要功能主要功能： DNA 信息分子中核苷酸的排列顺序储存着特定的遗传信息。

1 、一类信息是负责编码细胞内组成型蛋白质氨基酸序列的信息。

2 、另一类是负责编码一大类重要的调控蛋白以及决定基因表达的开启或关闭的序列元件，即负责基因表达的调节控制。这部分 DNA 在细胞的不同周期、个体的发育不同阶段、不同组织器官及不同的环境使基因选择性表达。

2-18

DNA 的共价结构共价结构主要指双螺旋结构。

DNA 的二级结构与功能

• 双螺旋结构的主要功能： 1 、确立了 DNA 存在的形式，

2 、对维持遗传物质的稳定性具有重要意义；

2-19

DNA 的二级结构：是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。

基本特点：

（ 1 ）主链：是由两条反向平行的脱氧核苷酸链盘绕所形成的； DNA 分子中的脱氧核糖与磷酸交替连接并排列在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧；

（ 2 ）碱基对：两条链上的碱基之间通过氢键结合形成碱基对，它们之间的规律是嘌呤与嘌呤配对；嘧啶与嘧啶配对。

（ 3 ）大沟是双螺旋与双螺旋之间形成的沟，小沟是双螺旋的互补链之间形成的沟。

（ 4 ）结构参数：螺旋直径 2nm, 每圈含 10bp, 螺距 3.4nm ，相邻碱基对的平面距离 0.34nm 。

DNA 的二级结构与功能

2-20

Watson & Crick 模型 1 右手双螺旋： 2 碱基配对： A T,G C 3 螺旋参数：碱基堆积距离0.34nm, 夹角 36, 旋转一周3.4nm ，含有 10nt, 平均直径 2nm 。 4 大沟和小沟：大沟宽2.2nm小沟宽 1.2nm 。5 维持稳定性：（ 1 ）氢键 G C （ 2 ）碱基堆积力 （ 3 ）正负电荷的作用（ 4 ）其它作用因素

2-21

DNA 二级结构的其他形式

• DNADNA 的几种构型：通常情况下的几种构型：通常情况下 DNADNA 的二级结构分的二级结构分为两大类：为两大类：

• 右手螺旋：右手螺旋： A-DNA and B-DNAA-DNA and B-DNA• 左手螺旋：左手螺旋： Z-DNAZ-DNA• DNADNA 的水溶液通常为的水溶液通常为 B-DNAB-DNA ，另外 ，另外 A-TA-T 丰富的丰富的

DNADNA 片段常呈现片段常呈现 B-DNAB-DNA ；；• DNADNA 的双链中一条被相应的双链中一条被相应 RNARNA 链所替换，就会形链所替换，就会形

成成 A-DNAA-DNA 。如，在杂交分子或。如，在杂交分子或 DNADNA 处于转录状态处于转录状态时；时；

• BB 型 型 DNADNA 中的多聚中的多聚 G-CG-C 区易形成左手螺旋区易形成左手螺旋 DNA,DNA,即即 ZZ 型型 DNA DNA

2-22

DNA 的几种构型

双螺旋 碱基倾角 碱基距离 螺旋直径 每轮碱基数 螺旋方向

B-DNA 1 0.34 2.37 10.4 右手

A-DNA 19 0.23 2.55 11 右手

Z-DNA 9 0.38 1.84 12 左手

2-23

(3) DNA 的三级结构与意义

DNA的三级结构：是指 DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构，成为超螺旋结构（ superhelix or super coil) 。

2-24

三级结构的意义•盘绕、压缩后对维持 DNA的稳定性有意义。•影响 DNA的解链过程，从而影响与其他大分子如酶，蛋白质等的结合。

2-25

• 核酸组成： A 、 G 、 U 、 C• RNA 单链线型分子，自身形成二级或三级结构。除

tRNA 外，几乎都与蛋白质结合。• 功能：信息分子，功能分子。• 重要功能：① 参与蛋白质合成； ② 具有生物催化剂的功能； ③ RNA 转录后的剪接与加工； ④ 参与基因的表达调控； ⑤ 与生物体的进化有关；

2.1.3 RNA 的二级结构与功能

2-26

Phosphodiester bonds in RNA

H H

OH

H

O

-O-P-O-CH2

O

O-BASE5’

3’

1’ß

2’

H H

OH

H

O

-O-P-O-CH2

O

O-BASE5’

3’

1’ß

2’

-O-P-O-CH2

H H

OH OH

H

OO

O-BASE5’

3’

1’ß

2’

5’

3’

3’-5’ Phosphodiester bridge or

3’-5’ phosphodiester bond

2-27

细胞内 RNA 的分布

• 成熟的 RNA 主要分布在细胞质中。• 主要分为三大类：转运 RNA （ tRNA ）；信

使 RNA （ mRNA ）；核蛋白体RNA （ rRNA ）。

• 细胞核内的 RNA （ nRNA ），另一部分是核内小 RNA （ snRNA ）核不均一RNA （ hnRNA ），转移－信使RNA （ tmRNA ） siRNA ， micRNA 。

2-28

RNA 的分类概述1 、 mRNA 的结构• mRNA 存在于细胞质，总量不到细胞总 RNA

的 5 ％；• 真核细胞 mRNA 是单顺反子 (monocistron) ；• 原核细胞是多顺反子 (poly-cistron) ；

m7G5’ppp5’Nm(Nm)

AUG

UGAUAAUAG AAUAAA

(A)nAAOH3’poly A3’ 非编码区5’ 非编码区5’ 帽

子编码区

2-29

● 原核生物 mRNA

5’ 端 300nt±前导序列 (A/G-------------AUG)

S.D 序列 ---------------------AUG

poly-cistron

9Nt 最佳富含 A,U,

Shine-Dalgarno 序列 (S.D) GGAGG

→ G 突变，翻译能力

2-30

● 真核生物 单顺反子

5’ m7Gppp--- -----CCACC-----A-3---A1U2G3G4—

前导序列

核糖体小亚基扫描AUG 的信号序列

至关准确翻译

2-31

● tRNA phe, 77Nt 构成的三叶草型 (1964 Holly R.)

● Nt 多被甲基化修饰 , （含有稀有碱基组成的核苷，如：假尿嘧啶核苷（），二氢尿苷（ D ），肌苷（ I ）等）

2 tRNA 的结构

● tRNA 由 74 － 95个核苷酸组成，通常为 76个；● tRNA 含量较多，约占总细胞总 RNA 的 15％；

● 5 arms & 4 loops

2-32

• 1 、含有稀有碱基和稀有核苷酸，达核苷酸总量的 5 － 20％；

• 2 、 3’端含有一个 CCA 序列，是所有 tRNA 接受氨基酰化的位置，它是 tRNA 合成后加上的；

• 3 、所有的 tRNA 分子形成三叶草的二级结构和 L

型构象；• 4 、 tRNA 分子有 5个臂和 4个环；

tRNA 的二级结构特征

2-33

---aa accept arm ;

loading aa at 3’ end

---DHU loop;

contact with AARS

---anti-codon loop;

34th is wobble base

---TΨC loop;

contact with 5s rRNA

---extra loop;

classification marker ?

I type ; 3-5 Nt 3/4 tRNA

II type ; 13-21 Nt

2-34

3. rRNA 的结构• rRNA 是所有 RNA 中含量最多的一类，占细胞总 RNA 的

80％以上；与蛋白质结合存在。• 核糖体由 RNA 和蛋白组成，真核细胞中 1 ： 1 ，原核细胞

中 2 ： 1 。• rRNA 中修饰碱基比 tRNA少，甲基化约占 2 ％。不同生

物来源的 rRNA （类 16s ， 23s ）一级结构的某些区域具有高度的序列同源性。

• rRNA 分子内有大量的茎环结构，使其具有多种构象，二级结构十分复杂。

• rRNA 的结构在蛋白质合成中，随着mRNA 和 tRNA 的结合及亚基蛋白分子的组装将发生改变， rRNA 的二级结构始终处于动态的变化中。

2-35

● 在原核生物 23s, 16s, 5s / 在真核生物 28s-5.8s, 18s, 5s● 富含甲基化 (m2U, m3A, m3U, m2

6A( 二甲基 )…)

2-36

Two-dimensional gel electrophoresis of proteins （蛋白二维电泳）

(a) E. coil 30S subunits

(b) E. coil 50S subunits.

Kaltschmidt & Wittmann PNAS 67 (1970) f. 1-2, pp. 1277-78.)

21proteins

31proteins

2-37

● 5s RNA 与 TΨC loop of tRNA部分同源，并可配对

● In Prok. 5s RNA 121nt 与 23s rRNA 组成大亚基

16s rRNA 的 3’端富含 CCUCCU保守序列，它与 mRNA 的 5’端的前导序列富含 GGAGG 的SD 互补

● In Prok. 16s RNA 1542nt 与大亚基组成核糖体

2-38

● 在真核生物3’-end of 18s rRNA 与原核生物高度相似 ,

但无与 S.D.seq. 互补的保守序列

在 mRNA 的 AUG 上游存在 CCACC 核糖体扫描序列成为核糖体识别第一个 AUG 的信号

AMEAMECCUGCGGUUGGAUGACCUCCUU

AMEAMECCUGCGGAAGGAUGAUUA

16SBacterial

18srRNAMammalian

高度相似

Shine-Dalgarno seq. (S.D seq) GGAGG

2-39

● 在真核生物

大亚基由 28s rRNA 4718nt , 5.8s rRNA

158nt 5s rRNA 120nt 与 45 种蛋白构成；

小亚基由 18s rRNA 1874nt rRNA 与 30 种蛋白构成。

特点：修饰碱基比 tRNA少；

二级结构复杂；

5sRNA 一级结构序列比其它 rRNA保守性高 ;

rRNA 的构象处于不断的动态变化中；

2-40

● More hairpin structue

2-41

• 真核细胞核内特有 snRNA, 存在于细胞核内或核质及核仁中，在基因转录加工过程中具有重要作用；

• snRNA 含有 70 － 300nt ，不是任何 RNA 前体；• snRNA 有 20 多种其中 13 中富含 U ，占分子内

的 35％。 U1 ， U2 ， U3 在真核细胞转录中对 hnRNA 的加工是必需的；

• snRNA 通常是与蛋白质结合形成核蛋白体（ snRNP ）复合物发挥作用；

4. snRNA

2-42

• 核仁小分子 RNA广泛分布于酵母和真核细胞的核仁区；

• 哺乳动物细胞的 snoRNA 以 U命名，酵母的以 snR命名

• 根据结构比较，将其分为两类：① boxC/D 型： 5’端含有 boxC(UGAUGA) 序列， 3’端有 boxD (CUGA), 在 boxD 上游有 8 － 14nt 与 rRNA 内的保守核心序列互补；② boxH/ACA 型：其 3’端第三个核苷酸上游有一个保守的 ACA 或类似序列AGA ， AUA 。整个分子形成两个发卡结构中间是保守的 boxH(ANANNA) 的铰链区。

5. snoRNA ( small nucleolar RNA ）

2-43

• 功能：1. 作为 rRNA 前体加工复合体的重要组分，

参与 rRNA 前体的加工。2. 参与 rRNA2’-O- 核糖的甲基化修饰。3. 参与部分 snRNA tRNA 的甲基化修饰。4.boxH/ACA 型能指导 rRNA 中的嘧啶向假尿嘧啶的转换。

2-44

• 近年来发现的一类非编码 RNA 。• 不具有 ORF 。• 功能：主要参与胚胎发育、肿瘤形成和抑

制、细胞生长和分化、染色体失活等。

6. 非编码 RNA

2-45

1 核酸的一般理化性质

核酸具有较强的酸性；

核酸是线性大分子，粘度较大；

在机械力的作用下，易断裂；

核酸的光吸收在 A260 处最大，可用该性质进行核酸定量分析及测定 A260/ A280 的比值确定核酸的纯度。

2.1.4 核酸的理化性质及其应用

2-46

2 DNA 分子变性 ( DNA denaturation )

● D.S. DNA S.S. DNA

( 加温 , 极端 pH, 尿素 , 酰胺 )

2-47

引起 DNA 变性的主要因素：① 加温；② 极端的 pH 值； pH=12, 碱基的酮式 烯醇式 pH=2-3, 碱基上的氨基发生质子化 主要影响氢键的形成。③ 有机溶剂、尿素、酰胺等； 它们与 DNA 分子的碱基形成氢键。使 DNA

保持单链状态。

2-48

变性过程表现在以下变化 ① S.S. DNA- 溶液的粘度降低

D.S DNA S.S DNA 粘度降低 ？高分子溶液 〉普通溶液线状分子 〉不规则线团 〉球形分子D.S. DNA 钢性较强，结构较为舒展的 双螺旋； S.S. DNA 没有氢键的支撑； 由螺旋结构向折叠和线团结构转变

② S.S.DNA 沉降速度加快

2-49

③ S.S.DNA 分子的 A 260 nm UV 值上升 ( Hyperchromicity )

当 SSDNA相互靠近在一起时两条链内的碱基淬

灭了一些光吸收。两条链分开时淬灭消失。

2-50

1.24

Concentration 50μg/ml

Opetical Density

D.S DNA A260 = 1

S.S DNA A260 = 1.37

dNTPs A260 = 1.60

= OD增加值的中点温度 ( 一般为 85-95 )℃

Tm ( 解链温度 ) : 在一定温度范围内，紫外光吸收值增加达到最大增加值的 50%的温度叫做 DNA的解链温度（ Tm）。

2-51

    增色效应的跳跃现象

高分子量的 DNA 分子在热变性过程中 , 富含 AT 区域首先发生 变性 , 然后逐步扩展 , 表现增色效应的跳跃现象 , 使变形过程加快 .

rich AT rich AT

2-52

● 影响 Tm值的因素

☆ 在 A, T, C, G 随机分布的情况下

☆ GC% 含量相同的情况下

GC%愈高 → Tm值愈大 GC%愈低 → Tm 值愈小

AT 形成变性核心，变性加快， Tm 值小

碱基排列对 Tm值具有明显影响（除变性核心外） （碱基堆积力的差异 ）

Tm = 69.3 + 0.41×(G+C)%

2-53

Tm ↑

当 Na+浓度低

屏蔽作用小 斥力加强 Tm ↓

Tm

OD

A260 0.01M 0.1M 1.0M

Na+

当 Na+浓度高 屏蔽作用大 斥力减弱

熵值 ( S)△ 上升

碱基溶解性降低疏水作用力增加

☆ 盐离子浓度的影响

2-54

pH ~ 12 酮基 → 烯醇基

pH ~ 2-3 NH2 → NH2+ ( 质子化 )

改变氢键的形成与结合力

☆极端 pH 条件的影响

一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素

均将使 Tm 值降低

2-55

3 DNA 复性与杂交 (anneal or renaturation

and hybridization )

D.S DNA S.S DNA 变性 ▲

▼ 复性

复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞

2-56

DNA复性的必要条件：

①、一定的离子强度

Na+可以中和磷酸基团的负电荷产生的排斥力

②、较高的温度

维持合适的温度是必须的，温度太低，易产生错配，太高难以形成氢键。

2-57

影响 DNA复性过程的因素：

① 阳离子浓度 0.15 ~ 0.5 M Na+ 可消除 polydNt 间的静电斥力② 复性反应的温度 Tm - 25 (60-65 ) ℃ ℃

以消除 S.S. DNA 分子内的部分二级结构

③ S.S. DNA 分子的长度S.S. DNA愈长→ 分子扩散愈慢→ 复性愈慢S.S. DNA愈短→ 分子扩散愈快→ 复性愈快

2-58

影响 DNA 复性过程的因素：

⑤ DNA 分子中 , dNt 的排列状况 (随机排列 , 重复排列 )

④ S.S, DNA 的初始浓度 C0

同一种 DNA 分子浓度越高，复性越快。

DNA 的复杂性，简单分子易复性，复杂分子复性难

2-59

2.2 基因与基因组 ( gene and genome)

基因的三个基本特性 1 基因可以自我复制； 2 基因决定遗传性状； 3 基因可以发生突变；基因的分类 1 结构基因； 2 调控基因； 3 转录具有功能的 RNA 基因

• 2.2.1 基因的结构

2-60

原核基因与真核基因的主要区别

多顺反子； 单顺反子；原核基因 真核基因

结构基因是连续的； 结构基因是不连续的，被内含子所分割；

相似功能的结构基因的表达受一个操纵子的调控； 结构基因的表达受一个启动子

的调控；

结构基因一边转录一边翻译；

结构基因转录产物为初始转录产物，需经过剪接、加工才能翻译；

调控基因结构复杂，包括启动子、上有调控序列，增强子和沉默子等调控元件；

调控基因结构简单，包括启动子和调控序列等简单调控元件；

2-61

原核基因结构示意图

TTGACA TATAAT 基因 3基因 1 基因2

启动子区域

转录终点

转录起点

SD 序列

-35 -10

2-62

真核基因结构示意图

增强子

GCGC-CAAT-TATA -ATG AATAAA

翻译起始

转录起始

TATA 盒CAAT 盒

GC盒

内含子外显子 2 加 Poly(A)尾信号

切离加尾外显子1

外显子3

启动子

2-63

•原核和真核基因的基本组成 启动子、结构基因、调控序列

• （ 1 ）启动子 是一段能与 RNA聚合酶和转录因子结合并决定基因转录的 DNA序列。

2-64

启动子区域 -10~-35 region

在原核生物，核心启动子 -10~-35区之间大约 16-19 bp 。如果间隔区 <15bp or >20bp ，启动子的活性就会降低。

2-65

启动子区域 promoter region

Melting region is located between -9 ~ +13

共同的序列

TATA (Pribnow) box

-35 region

TTGACA

-10 region

TATAAT

15-20bp

Sextama box

2-66

连接序列

pre-mRNA 内含子的结构特点

5’---exon--- GU--------intron--------AG ------exon----3’

• （ 2 ）内含子与外显子

2-67

5’---E1---AAUAGGUGA--------I1-----UACAGGUUG---E2--

---E2--CUCAGGUACA-------I2-------UCAGGUUG---E3--

---E3-------CCAGUAA---------I3-----UACAGGAA------E4--

---E4-------AUGGUAA--------14-------AAAGGU--------E5--

---E5-------GAGGUAUAU----I5-------CCAGCAA------E6--

---E6-----GCAGGUAUGG---I6-------GCAGCUU-----E7---3’

● Intron 与 Exon 的连接处 存在部分同源的 consensus seq.

Ovalbumin mRNA (6 Intron, 7 Exon)

Chambon rule

2-68

是指基因结构中能够促进转录终止的 DNA序列。

• （ 2 ）终止子

在原核生物 基因末端终止子 ρ -dependent terminator

基因内在终止子 ρ -independent terminator

在真核生物

转录终止子的 DNA 序列不清楚。？

2-69

Palindromic sequence is consisted of 7-20nt reverse broken sequence. that forms self-complementary region with a stem-loop or hairpin secondary structure.

G/C rich region that form hairpins of varying lengths in RNA.

G/C rich hairpin are followed by a run of U residues in RNA there are a run of adenylates (As) in the template strand that are transcribed into uridylates (Us) at the 3’end of stem-loop of the RNA.

①①ρρindependent terminatorindependent terminator

2-70

Palindromic sequence that forms a stem-loop or hairpin secondary structure or other features.  

No G/C rare in palindrom but form loose hairpin in RNA

palindromic sequence are not followed by poly A/T in DNA

Rho factor be needed for termination

②②ρρdependent terminatordependent terminator

2-71

2.2.2 基因组（ Genome ）

• C 值：以一个基因组中的 DNA 含量来表示基因组的大小，称为该生物体的 C 值。

• C 值悖理（ C value paradox ）： C 值与物种进化程度之间不具有严格的对应关系，这种现象称为 C 值悖理

• 基因组：是指单倍体细胞中全套染色体中所有基因的总和。

2-72

1 、原核生物基因组

• E.coli 基因组大小 4639kb, 含 4288 个基因；• 基因组小切没有核膜，与 RNA 和蛋白质形成拟核；基因组通常为环状 DNA ；

• 功能相关的基因通常串联在一起，受一个操纵子的调控并转录在一个 mRNA 分子中，为多顺反子；

• DNA 分子中大部分序列用于编码蛋白质；非编码序列所占比例很少；

• 只有一个复制起点；

（ 1 ）原核生物基因组结构与功能特点

2-73

• 除了基因组染色体外，还有称为基因组染色体的遗传物质。如质粒，线粒体和叶绿体 DNA。

（ 2 ）质粒 （ plasmid ) 1 ）结合型质粒和非结合型质粒 基因工程中使用的是非结合型质粒 。

2 ）严谨型质粒和松弛型质粒。基因工程中多使用的是松弛型质粒 。

3 ）质粒的不相容性：具有相同复制起始位点和骨架的两种质粒不能共存于同一个宿主细胞的现象称为质粒的不相容性。

2-74

2 、真核生物基因组（ 1 ）真核生物基因组结构与功能特点• 真核生物基因组 DNA与蛋白质结合形成染色质，存在与细

胞核内；• 真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，具有多个复制起点，复制子相对较小；

• 真核生物基因由一个结构基因和相关调控序列组成，转录产物为单顺反子；

• 非编码序列远远大于编码序列约占 90%以上，存在较多的重复序列；

• 真核基因多为断裂基因，编码区被内含子所分割；• 功能相关的基因构成基因家族，通常串联在一起形成基因簇，但转录是分别转录；

• 基因组中存在一些可移动的元件，称为转座子。

2-75

（ 2 ）真核生物基因组的特征性结构

• 根据真核基因组的重复序列出现的频率将基因组DNA序列分为三类：

• 第一类：单拷贝序列 长度 750-2000bp, 结构基因基本上属于这一类；• 第二类：中度重复序列 在基因中的重复次数在 10-10000之间， rDNA、转录 tRNA和某些结构基因的 DNA属于这一类；

• 第三类：高度重复序列• 重复次数大于 10000以上，主要分布在异染色质区，着丝粒端粒处，此外，还有卫星 DNA和反向重复序列。

1 ）重复序列

2-76

• 分布 成串排列在一起；分散在同一个染色体不同位置；不同的染色体。

2 ）基因家族：真核基因组中许多相关的基因常按功能成套组合，被称为基因家族

3 ） DNA中的甲基化：真核基因组中普遍存在。多发生在 CpG岛处，位于基因调节区 5’端附近。认为甲基化程度与基因表达调控有关。

4 ）自私 DNA：真核基因组中大量非编码序列，只是自身复制，对生物体无明显影响。目前认为只有一小部分与调控有关，绝大部分功能不清楚。5 ）端粒：真核基因组 DNA末端的一种特殊结构，是一段 DNA与蛋白质形成的一种复合体，称为端粒。与 DNA末端复制有关。

2-77

2.3 中心法则与基因表达调控

DNA RNA Protein

复制

逆转录

转录 翻译生物性状

2-78

2.3.1 中心法则与生物信息的传递

1. DNA 分子复制 这是一个在 DNA聚合酶催化下完成的 DNA链的合成过程。

DNA RNA Protein

复制

逆转录

转录 翻译生物性状

2-79

2-80

（ 1 ） RNA 的转录 转录就是以 DNA 为模板通过 RNA 聚合酶合成 RNA 的过程。

转录的基本过程包括：起始、延伸和终止。

2. RNA 的转录和加工

ATACGCGATT ATGTATGCGCTAA TAC

启动子 终止子转录区

RNA

DNA

转录 反义链

GCGATT ATG

转录起点

翻译起点

2-81

2-82

（ 2 ） RNA 的加工 原核细胞的结构基因转录出来的 mRNA 不需要加工直接就可以用作翻译的模板；

真核细胞的绝大多数的结构基因转录出来的 mRNA 需要进行一系列的加工，才可以用作翻译的模板；

加工过程包括： 5’加帽 m7G 、 3’加

Poly(A)n尾和内含子的剪接，部分核苷酸的修饰，如甲基化等。

2-83

2-84

3 翻译—蛋白质的生物合成

• 翻译过程是以 mRNA 为模板，通过 tRNA携带的氨基酸，在核糖体上按 mRNA 的遗传信息合成蛋白质的过程。

•原核生物与真核生物细胞中蛋白质的合成有哪些不同？

2-85

遗传密码

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2-87

翻译过程是以 mRNA 为模板，通过 tRNA 携带的氨基酸，在核糖体上按 mRNA 的遗传信息合成蛋白质的过程。

1 ）以 mRNA 为模板，起始密码是什么？ AUG/GUG/ UUG; 终止密码子 UAA/UAG/UGA 。

2 ） tRNA 是怎么与氨基酸结合的？ 在氨酰 tRNA合成酶的作用下 tRNA 与氨基酸结合。

2-88

• 核糖体如何与 mRNA结合的？• 核糖体通过蛋白因子与 mRNA结合， tRNA携带氨基酸结合到mRNA的起始密码子，形成起始复合物。

• tRNAfMet进入核糖体的 P 位点，其余的氨酰 tRNA只能进入核糖体的 A 位点。

• 真核生物

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　大肠杆菌起始复合物的形成

(2)tRNAfMet-30S起始复合物

的形成 :fMet-tRNAfMet 结合

IF2和 GTPIF2促使 fMet-tRNAfMet与 mRNA-30S亚基复合物结合后， GTP水解， IF2解离。

(1)mRNA－ 30s复合物的形成：核糖体 30S小亚基附着于mRNA起始信号部位，此前 IF1和 IF3与游离的小亚基结合，阻止与大亚基的结合。

(3)70S起始复合物的形成：50s大亚基与 tRNAfMet-30S起始复合物结合后， IF1和IF3从复合体解偶联，

mRNA 与 16 小亚基的 rRNA3’ 互补结合

2-90

真核细胞翻译起始复合物的形成

40S 小亚基 -eIF3+ eIF4C

43S- Met-tRNAiMet-

GTP

80S-Met-tRNAiMet-

mRNA

Met-tRNAiMet+GTP+eIF2

Met-tRNAiMet-eIF2-GTP

+60S

GDP-Pi

-eIF3

+eIF4D

eIF5

48S- Met-tRNAiMet-mRNA-GTP-IF1-IF3-

IF2

+mRNA, ATP

ADP+Pi

+eIF1,eIF4A,4B +cap binding factors

活化 80S 起始复合物

CoeIF2

2-9140S

P AEAUG NNN

60S

Met

mRNA5’ 3’

AUG NNN

Complex of cap proteins and other factors at 5’ end of mRNA

图 18-11 Simplified diagram of initiation in eukaryotes. Note that several eukaryote initiation factors besides elF2 are involved. tRNA-Meti, initiating RNA.eIF2 is the eukaryotic initiation factor corresponding to IF2 in prokaryotes.

GDP+Piinitiation factors are released

5’

40S

P AE

IF3

60S subunit

mRNA3’

Complex moves along mRNA until it reachsthe first AUG

AUG NNNeIF2

GTP

Met

40S ribosomal subunitmRNA

GTP

Met-tRNAiMet

Met

Cap proteins & other initiation factors

+ +eIF2

2-92

翻译的延伸

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翻译终止

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(a) RF-1 含有三肽结构 Pro-Ala-Thr. ( 脯 aa 丙aa 苏 aa ）第一个氨基酸 Pro 能够与 A 环上的 H 相互作用 , 但不与 G 环上的H2N- 相互作用。而第三个 Thr 既能够与 A相互作用 , 又能与 G 相互作用 . 因此 , 这个三肽可使 RF-1 结合到 UAG (or UAA), 而不能结合 UGA 。

2-95

(b) RF-2 含有三肽结构 Ser-Pro-Phe. ( 丝 aa 脯 aa苯丙 aa ）

第一个氨基酸 Ser, 像 Thr, 能够与 A 又能与 G相互作用 . 但第三个Phe 能够与 A 环上的 H相互作用 , 但不与 G 环上的 H2N- 相互作用。因此 , 这个三肽可使 RF-2 结合到 UGA (or UAA), 而不能结合 UAG 。

2-96

释放因子• 原核的翻译终止有 3 个因子调控 :

– RF1 识别 UAA和 UAG– RF2 识别 UAA 和 UGA– RF3 是 GTP-结合蛋白帮助 RF1和 RF2 结合到核糖体

• 真核生物有 2 释放因子 :– eRF1 识别 3 个终止密码子– eRF3 是一个核糖体依赖的 GTP酶，帮助eRF1 释放合成的多肽。

2-97

2.3.2 基因的表达与调控基因表达与调控主要在以下几个方面：（ 1 ）转录水平上的调控（ 2 ） mRNA加工成熟水平上的调控（ 3 ）翻译水平上的调控

1.原核生物基因的表达调控（ 1 ）乳糖操纵子

2-98

2.真核生物基因的表达调控（ 1 ）组成型表达（ 2 ）适应性表达 表达调控发生在一下水平： 转录前水平（ DNA水平） 转录水平 - 顺式作用元件、反式作用因子 转录后水平 - 剪接、 翻译水平 -5‘’和 3‘’ UTR的调控以及优势密码子的利用率等

翻译后水平 - 新生肽链的剪切、折叠和氨基酸的修饰等过程。

2-99

2.4 自然界的基因转移和重组2.4.1 接合作用 细菌之间通过菌毛相互接触时，质粒就可以从一个细胞转移到另一个细胞，这种类型的 DNA 转移称为接合作用。

可接合质粒如 F 因子 (F factor)

质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链 DNA分子

2-100

2.4.2 转化及转导 转化：通过自动获取或认为地供给外源 DNA ，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。

转导：当病毒从被感染的细胞释放出来再次感染另一细胞时，发生在供体和受体之间的 DNA 转移及基因的重组方式称为转导。

DNA

R 型 肺炎双球菌

S 型 肺炎双球菌

2-101

2.4.2 转化及转导 转导：当病毒从被感染的细胞释放出来再次感染另一细胞时，发生在供体和受体之间的 DNA 转移及基因的重组方式称为转导。

2-102

2.4.3 转座 由插入序列和转座子介导的基因 转移和重排称为转座。

1 插入序列转座 IS 长度 750 -1500bp 的 DNA片段，两侧有 9-

41bp 的两个反向重复序列和中间一段转座酶编码序列。两端有 4-12bp 的正向重复序列。

2-103

转座方式有两种：（ 1 ）插入型转座（非复制型转座）（ 2 ）复制性转座2 转座子转座• 转座子 (transposon 或 transposable element) 是基因组内相对独立的、可移动序列，它们可以从基因组的一个部位直接转移到另一个部位，这个过程称为转座（ transposition ）。

• 转座子每次移动时携带着转座必需的基因一起在基因组内跃迁，所以转座子又称跳跃基因（ jumping gene ）。

2-104

复合型转座子

• 一些转座子除了具有与转座有关的功能外，还携带药物抗性（或其他）标志，这些转座子被命名为 Tn 。

• 复合型转座子（ composite transposons ）的中心区携带药物抗性标志，两侧为由 IS 元件组成的臂。

2-105

2-106

2.4.4 基因重组

1 位点特异性重组（ site spedific recombination )

由整合酶催化两个 DNA 序列的特异位点之间发生的重组（整合）称为位点特异性重组

2 同源重组（ homologous recombination)

是两条具有同源序列的 DNA 靠近时所发生的DNA 的交换。

同源重组需要一些重组蛋白和酶，如 Rec A 、 B 、C 、 D 及 DNA 连接酶等。

2-107

Holliday模型中，同源重组主要 4 个关键步骤

①两个同源染色体 DNA 排列整齐②一个 DNA 的一条链断裂、并与另一个

DNA 对应的链连接，形成 Holliday 中间体③通过分支移动产生异源双链 DNA

④Holliday 中间体切开并修复，形成两个双链重组体 DNA ，分别为：片段重组体 (patch recombinant)

拼接重组体 (splice recombinant)

2-108

片段重组体 （见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本 DNA 。

拼接重组体（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本 DNA 。

2-109

内切酶

(recBCD)

DNA侵扰(recA)

分支迁移 (recA)

内切酶(recBCD)

DNA 连接酶

5´ 3´

5´3´5´

3´

5´3´

5´ 3´

5´ 3´

5´3´

5´3´

5´ 3´

5´ 3´

5´3´5´3´

5´3´

5´ 3´

3´ 3´

5´3´

5´3´

3´5´

5´ 3´

5´3´

5´3´

Holiday 中间体

5´ 3´

5´ 3´

5´3´

5´3´

2-110

Holiday 中间体

5´ 3´

5´ 3´

5´3´5´3´

5´3´

5´

5´5´

3´

3´

3´

5´ 5´

5´5´

3´

3´

3´

3´

5´ 5´

5´5´

3´

3´

3´

3´

5´5´

5´5´

3´

3´

3´

3´

5´ 5´

5´5´

3´

3´

3´

3´

内切酶(ruvC)内切酶

(ruvC)

DNA连接酶

DNA连接酶

片段重组

体拼接重组

体