基因工程Gene Engineering

彭银祥等编著

华中科技大学出版社 2008 年 2 月第二次印刷

第 1 章 绪论Introduction

高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材

1-2

基因工程的概念• 基因工程（ Gene manipulation, recombinant DNA

technology, Genetic engineering ）将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内进行复制、转录和翻译表达的操作叫做基因工程。

• 包括：基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞中的保持、复制、转录和翻译表达等全过程。

• 遗传工程的概念有广义和狭义之分 传统遗传操作——杂交技术 现代遗传操作——基因工程• 基因工程的理论基础 基于遗传学和分子生物学的发展

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• 1.1 基因工程的发展历史• 1.1.1 基因工程的理论基础• DNA 作为遗传物质的证据1 1928 年， F. Griffith 的转化实验。 1944 年， Oswald Avery 报道转化的物质是 DNA 。2 1952 年， A. Hershey & M. Chase 的噬菌体标记实

验。• RNA 是遗传物质的证明 1955 年， H. Fraenkel Conrat & B. Singer 证明了

TMV 是 RNA 病毒，它是一种遗传物质。

1-4

1944 O. Avery, C. MacLeod, M. McCarty

Reported that they had purified the transforming

principal in Griffith's experiment and that it was DNA.

Oswald Theodore Avery

1-5

1952 A. Hershey & M. ChaseUsed phages in which the protein was labeled with35S and the DNA with 32P for the final proof thatDNA is the molecule of heredity.

Martha Chase (1930-2003)

Alfred Hershey(1908-1997)

1-6

1950 年 Erwin Chargaff 提出了 Chargaff 规则T=A C=G

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X~ray photograph of DNA with high quality ( 核塘与磷酸连接成的扭曲绳子，每一节上都有配对的碱基 )

1951. King’s Lab. London University UK

unflattering portrayal of Franklin in his account of the discovery of DNA's structure, entitled "The Double Helix," depicts Franklin as an underling of Maurice Wilkins, when in fact Wilkins and Franklin were peers in the Randall laboratory.

Maurice Wilkins & Rosalind Franklin (37y)

1-8

1953 年， Watson & Crick 提出了 DNA 双螺旋结构模型。

DNA 的成分：磷酸、戊糖、四种碱基。

Erwin Chargaff rule

M. Wilkins & R. Franklin

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1957 年， Meselson-Stahl 的半保留复制证明了这一学说的正确。

• 遗传物质的结构与传递规律（遗传信息流）

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遗传密码的破译 1965 年， Nirenberg P. Leder 利用核糖体结合实验，完

成了 mRNA 上编码 20 种氨基酸的三联密码子遗传密码的破译工作。破译了全部 64 个密码。 Shared the 1968 Nobel Prize for Physiology or Medicine

Marshall Nirenberg

1-11

1956 年， Korngberg 从 E. coli 中分离纯化了 DNA 聚合酶 I 这是能在试管中合成 DNA 的第 一 个 核 酸 酶 。 The Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1959

1.1.2 基因工程的技术源泉

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1.1.2 基因工程的技术源泉• 限制性内切酶的发现

Werner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith

（ a ）细菌限制修饰系统的发现， W. Arber 于 1962-1968 年发现， 1968 年分离到 I 型限制酶。（ b ）限制酶 HindII 的发现， H ． O ． Smith 和 Wilox 于1970 年首次从流感嗜血杆菌（ H. influenzae ）中发现并分离到 HindII 限制酶。 （ c ） D. Nathans （ 1971 年）用 HindII 绘制 SV40 限制图谱和转录图谱。

1-13

1.1.2 基因工程的技术源泉

• DNA 连接酶是 1967 年• Gellert M (NIH ， Maryland) ,

• Olivera B.M.(Stanford school of Medicine, CA) Weiss B.( Harvard Medical School)

• 三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA 链上切口的酶，借助 ATP 或 NAD 水解提供的能量催化 DNA 链的 5'-P 与另一DNA 链的 3'-OH 生成磷酸二酯键。

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1.1.2 基因工程的技术源泉• 1972 年，斯坦福大学 P. Berg 小组完成了首次体

外重组实验。在 PNAS 发表了题为“将新的遗传信息插入 SV40 病毒 DNA 的生物化学方法：含有噬菌体基因和 E.coli 半乳糖操纵子的环状 SV40

DNA” 。

Paul Berg

（用 DNA 末端转移酶，而非限制性内切酶）

1980 年 Nobel 化学奖

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2. Boyer-Cohen 实验1973 年斯坦福大学的 S. Cohen 小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌 R6-5 质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒 pSC101 连接成重组质粒，具有双重抗药性。

后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同 pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的 mRNA 。这是第一次成功的基因克隆实验。

1-16

Boyer-CohenBoyer-Cohen实验实验

1-17

S. Cohen 1986 Nobel 生理或医学奖

1-18

• 1972 Paul Berg & Herb Boyer Produced the first recombinant DNA molecules.

They Shared the 1980 Nobel Prize in Chemistry "for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA",

Herb Boyer

1.1.2 基因工程的技术源泉

1-19

1975. Howard Temin (41y)David Baltimore (37y)

H. Temin & D. Baltimore 从 Rous 肉瘤中发现了反转录酶（ reverse transcriptase ）（引发癌症的内因）某些 RNA 病毒能够以自身作为模板合成 RNA 。如， R17, f2, MS2 和 Q 等。

1.1.2 基因工程的技术源泉

1-20

• 基因的概念及其发展(1) 早期的基因概念

– 是存在于 DNA 上并承载遗传信息的核苷酸序列；是染色体上呈现行排列的遗传物质的最小单位；是携带遗传信息的结构单位和控制遗传性状的功能单位。

– 随着分子生物学研究的深入，人们对基因的认识不断提高，发现了“等位基因”，“移动基因（ movable

gene) - 转座子（ transponsable element)” ，“断裂基因” （ Split gene, interrupted gene) ，“重叠基因” （ Overlapping

gene) ， “假基因” （ pseudo gene) 。– 是转录的功能单位，是编码一种可扩散产物的一段

DNA 序列，其产物可以是蛋白质或 RNA 。因此，一个完整的基因有编码区和调控区两部分组成。

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Francois Jacob (44y)

Jacques Monod (55y)

(French)

提出了乳糖操纵子学说 Lac. Operon Theory （ 1961 ）

The Nobel Prize in Physiology or Medicine

1965

Concept of mRNA

•基因调控理论的突破

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(2)调控基因概念的发展

“Lactose operation theory” 提出后，相继出现了结构基因，启动基因、操纵基因、调节基因等概念。

把参与基因表达调控的基因分为两类：一类是通过基因转录和表达的产物，反式作用因子

（ trans-acting factor)

另一类是起调控作用的 DNA 序列，顺式作用元件（ cis-acting elements)

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（ 3 ）现代的基因概念 ：含特定信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。

基因可以分为：（ 1 ）能够编码多肽链一级结构的基因，如，结构

基因；（ 2 ）能转录成 RNA但不能翻译的基因，如， tRNA 基因；

（ 3 ）有功能意义，但根本不转录的基因，如，顺式作用元件；

真核的结构基因是指能够产生多肽链的一段 DNA 分子，由 4 个部分组成，即：前导区、尾部区、间隔区（内含子）、编码区（外显子）。

1-24

The Nobel Prize in Chemistry 1980

Walter Gilbert 1932 - Biological Laboratories Cambridge, MA,

“for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids in 1975-1977"

Frederick Sanger 1918 - MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, Great Britain

1.1.2 基因工程的技术源泉

1-25

• 1985 Kary B. Mullis Published a paper describing the polymerase chain reaction (PCR), the most sensitive assay for DNA yet devised

The Nobel Prize in Chemistry 1993 "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"

1.1.2 基因工程的技术源泉

1-26

• 1996 Patrick O. Brown, Professor of Stanford University presented the 'gene chip' containing 6116 different gene specific sequences of the yeast genome. This is of great benefit in mapping the genomes.

1.1.2 基因工程的技术源泉

1-27

"for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA“(2006)

Andrew Z. Fire Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA

Craig C. Mello University of Massachusetts Medical School

1.1.2 基因工程的技术源泉

1-28

1.2 基因工程的研究内容• 1.2.1 基因工程的概念• 1.2.2 基因工程的研究内容

基础研究

克隆载体研究

受体系统研究

目的基因研究

生物基因组学研究

生物信息学研究

应用研究

基因工程

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特点：1 可以根据人们的意愿在 DNA 水平上进行事先设计和操作；

2 离体情况下，在分子水平上进行基因的重组操作；3 在细胞水平上进行重组体的表达，这种表达可以在动物、植物细胞和微生物之间进行。

1.2.3 1.2.3 基因工程的特点与基本流程基因工程的特点与基本流程

1-30

2. 目的基因和载体 DNA 的准备

基因工程的基本流程（主要操作内容）1. 目的基因的获取（制

备）从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR 扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA 片断。

将目的基因的 DNA 片断和所用的载体用相应的内切酶切割，回收相应的线性DNA 以备连接。

1-31

3. 重组体的制备

将目的基因的 DNA 片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。

4. 重组体的转化 将重组体（连接产物）通过一定的方法将重组体（连接产物）通过一定的方法转转

入入适当的受体细胞中。适当的受体细胞中。

1-32

5. 克隆鉴定通过一定方法挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。

6. 目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。

1-33

基因工程的基本流程（主要操作内容）

1-34

1-35

1.2.4 与基因工程相关的学科和技术

• 分子生物学 Molecular Biology

• 生物化学 Biochemistry

• 分子遗传学 Molecular Genetics

• 发酵工程 Technology of Fermentation

• 细胞培养技术 Technology of Cell Cultivation

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1.3.1 基因工程在工业领域的应用

3. 能源开发与利用

1.3 基因工程的应用

克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。

1. 酿酒与食品工业用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。2. 污水处理与环保用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。

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Biotechnology is not new. Cheese, bread and yoghurt are products of biotechnology and have been known for centuries.

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1.3 基因工程的应用

• 抗虫基因（杀虫结晶蛋白基因）• 抗病基因• 抗非生物胁迫基因• 改良作物品质的基因

1.3.2 基因工程与农业

目的： 是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。

（ 1 ）转基因植物 (transgenic plants)

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’83 ’84 ‘85 ‘86 ’87 ‘88 ‘89 ‘90 ’91 ‘92 ‘93 ‘94 ‘95 ‘96 ‘97 ‘98 ’99 ’00 ‘01 ‘02

Firsttransgenic

plant

Delay-ripening tomatoCommercialized in the

US

Firstfieldtests6/92

Herbicide resistant, insect resistant plants commercialized

GM maize approved by EU

First Bt corn plants 6/90

Rotting resistant tomato approved by FDA

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• Today, DNA technology is quickly replacing traditional plant-breeding programs

Genetically Modified (GM) Foods

– In 2002, roughly half of the American crops of soybeans and corn were genetically modified in some way

1-42

• Corn has been genetically modified to resist insect infestation

• This corn has been damaged by the European corn borer

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• “Golden rice” has been genetically modified to contain beta-carotene

– Our bodies use beta-carotene to make vitamin A

1-44

Some Examples of Current Transgenic PlantsRoundup Ready™ Soybeans

Herbicides such as RoundupTM and Liberty LinkTM are able to kill a wide range of weeds. Development of herbicide resistant crops allows the elimination of surrounding weeds without harm to the crops.

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Increase Yields

Crops can be modified to optimize growth conditions: improve nitrogen assimilation, increase oxygen absorption, efficient photosynthetic pathway, and increase starch biosynthesis.

Transgenic plant modified to have

increase yield

Unmodified control plant

1-46

Insect Resistance

Various insect resistant crops have been produced. Most of these make use of the Cry gene in the bacteria Bacillus thuringiensis (Bt); this gene directs the production of a protein that causes paralysis and death to many insects.

Corn hybrid with a Bt gene

Corn hybrid susceptible to European corn

borer

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Normal rice“Golden” riceGolden Rice

Transgenic technology produced a type of rice that accumulates beta-carotene in rice grains. Once inside the body, beta-carotene is converted to vitamin A.

More than 120 million children in the world suffers from vitamin A deficiency. Golden Rice has the potential to help prevent the 1 to 2 million deaths each year caused by a deficiency in this vitamin.

1-48

Papaya infected with the papaya ringspot virus

Virus resistance gene introduced

Virus Resistant Crops

1-49

The Freedom II squash has a modified coat protein that confer resistance to zucchini yellows mosaic virus and watermelon mosaic virus II.Scientists are now trying to develop crops with as many as five virus resistance genes

1-50

Edible vaccines produced by transgenic plants are attractive for many reasons. The cost associated with the production of the vaccine is low, especially since the vaccine can be ingested directly, and vaccine production can be rapidly up scaled should the need arises. Edible vaccine is likely to reach more individuals in developing countries.

The first human clinical trial took place in 1997. Vaccine against the toxin from the bacteria E.coli was produced in potato. Ingestion of this transgenic potato resulted in satisfactory vaccinations and no adverse effects.

1-51

Vol. 19, No. 3 Feb. 1, 1999

1-52

世界各国转基因作物大田释放情况（ 1987.1-1998.4）

转基因作物特性 批准项数 所占比例

抗除草剂 1297 29.6%

抗虫 1046 23.8%

产品质量高 886 20.2%

抗病毒 436 9.9%

农学性状好 211 4.8%

抗真菌 208 4.7%

其它 303 6.9%

1-53

中国已经批准进入大田的转基因植物（ 1998.3 ）

转基因植物 特性 申请单位 获批准数

马铃薯 抗病毒 中科院 4

抗病 中国农科院 1

抗逆 北京大学 1

高营养品质 北京大学 1

水稻 抗虫 中科院 1

抗病毒 北京大学 2

抗病 农科院 2

抗除草剂 水稻所 1

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棉花 抗虫 中科院农科院

美国孟山都公司

9

玉米 抗虫 美国孟山都公司等 3

大豆 抗除草剂 农科院 1

小麦 抗除草剂 北京农林科学院 1

高营养品质 北京农林科学院 1

番茄 抗病 北京大学 1

耐储存 中科院华中农大

3

甜椒 抗病 北京大学 1

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辣椒 抗病毒 中科院 1

烟草 抗病毒 北京大学 2

抗虫 中科院北京大学

2

番木瓜 抗病毒 中国热带作物 1

广藿香 抗病 农业科学学院 1

矮牵牛 改变花色 北京大学 1

杨树 抗虫 中科院 1

微生物 提高固氮效率 中科院农科院华中农大广东微生物所

6

1-56

• 20世纪 60年代研究单细胞受精卵。• 1980 Gordon克隆的胸苷激酶基因注射到小鼠受精卵，产生的小鼠叫做转基因小鼠（ transgenic mice）

• 1982 Palmitter将大鼠 GH基因注射到小鼠受精卵，产生大 1-1倍的“超级小鼠”（ super mice）

（ 2 ）转基因动物 ( transgenic animals)

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An Example

This image shows a transgenic mouse (right) with a normal littermate (left). The giant mouse developed from a fertilized egg transformed with a recombinant DNA molecule containing:

•the structural gene for human growth hormone

•a strong mouse gene promoter

The levels of growth hormone in the serum of some of the transgenic mice were several hundred times higher than in control mice.

1-58

• 1998 年 2月，上海医学遗传研究所与复旦大学遗传所合作，获得了转人凝血因子 IX的转基因山羊；

• 1999 年 8月，中科院动物所成功的克隆了解毒酶基因。

1-59

• While transgenic plants are used today as commercial products, transgenic whole animals are currently only in the testing phase

Farm Animals and “Pharm” Animals

• These transgenic sheep carry a gene for a human blood protein– This protein may help

in the treatment of cystic fibrosis

1-60

转基因动物的研究方向

•显微注射技术•基因打靶•逆转录病毒载体技术•转基因动物乳腺反应器制药业的兴起

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• Microinjection

DNA can be conducted into a cell by:

• Gene gun

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1.3 基因工程的应用1.3.3 基因工程在医药领域中的应用

1. 用转基因植物或动物生产药物2. 用微生物生产药物

大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等

3. 设计高效高特异性的生物制剂应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂

1-63

6. 法医鉴定

7. 基因治疗

5. 基因诊断

将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。

基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。

（仍在探索阶段）

制造新型疫苗（如 HIV 、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、 SARS ）

4. 研制疫苗

1-64

1976年， 27岁的风险投资人 Robert Swanson 与University of California的教授 Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为 Genentech （ Genetic Engineering Technology）。

第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！

In 1976, a 27-year-old venture capitalist call-ed Robert Swanson had a discussion over a few beers with a University of California professor, Herb Royer. The discussion centred on the commercial potential of gene manipulation and the founding of the company of Genetic Engineering Technology (genentech).

1-65

Genentech 的骄人业绩

1976 Genentech创立1977 首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978 克隆了人胰岛素基因1979 克隆了人生长激素素基因1980 公司上市，募集 $ 35million

1982 第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给 Lilly公司）

1984 第一个 VIII 因子，转让给 Cutter Biological

1985 第一个自己生产的产品（人生长激素）1987 生产组织纤溶酶原激活剂（ TPA ）1990 生产 interferon 1

1990 与瑞士 Roche医药公司合并（ $ 2.1billion ）

1-66

美国已批准上市的基因工程药物（ 1997.7 ）

中文名称 商品名称 英文名缩写 开发公司

胰岛素 Humulin

Novolin

Humalog

Insulin

lispoinsulin

Lilly

Novo Nordisk

Lilly

人生长激素 Protropin

Humatrope

NutropinAQ

rhuGH Genentech

Lilly

Genentech

干扰素 IntronA

ReferonA

Avonix

Betaseron

Actimmune

Alferon-N

rhuIFNa2b

rhuIFNa2a

rhuIFNrhuIFN1b

rhuIFN1b

rhuIFNa3

Schering

Roche

Biogen

Chiron

Genentech

Interferon Science

1-67

白细胞介素 2 Proleukin rhuIL2 Chiron

粒细胞集落刺激因子

Neupogen rhuG-CSF Amgen

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

Leukine rhuGM-GSF Immunex

红细胞生成素 Epogen

Procrit

rhuEPO Amgen

Ortho

组织溶纤原激活剂

Activase rhuTPA Genentech

生长激素 Serostin somatotropin Serono

促生长素 Nutropin

Saizen

Genotropin

Norditropin

Bio-Tropin

somatopin Genentech

Serono

Pharma/Upjohn

Novo Nordisk

Biotech General

1-68

抗血友病因子VIII

Kogenate

Recombinate

Factor VIII Bayer

Baxter

葡萄脑苷脂酶 Cerezyme glucocerebrosidase

Genzyml

脱氧核糖核酸酶 Pulmozyme domase Genentech

乙型肝炎疫苗 RecombivaxHB

Engerix B

Comrax

Hepatitis B vaccine

Merck

Smith Kline

Merck

甲型肝炎疫苗 Havrix Hepatitis B vaccine

Smith Kline

1-69

体内用单克隆抗体

Reopro

Ortho OKT-3

Onco Scint CR/OV

Onco Scint OC103

Onco Scint CR103

Prostascint

MAB,blood clots

MAB,Kidney sup

MAB,diag inject

Centocor

Ortho Biotech

Cytogen

Cytogen

Cytogen

Cytogen

鼠单克隆抗体

Panorex Murine MAB Glaxo Welcome

1-70

中国已经批准上市的基因工程药物（ 1998.5 ）药品名缩写 开发生产公司 批准时间 适应症

rhuINFa1b( 外用）rhuINFa1b

rhuINFa2a

长春生研所上海生研所深圳兴科长春生研所长生药业三生药业

1989试1996正1996正1996正1997正1997正

病毒性角膜炎HBV,HCV

HBV,HCV

尖锐湿疣，疱疹等HBV,HCV

HBV,HCV

rhuIFNa2b 新大洲药业里亚哈尔华立达安科华新

1997正1996正1997正1997 试1997试

HBV,HCV

HBV,HCV

HBV,HCV

HBV,HCV

HBV,HCV

1-71

rhuINF 上海生研所

克隆

丽珠生物工程

1994试1995试1995试

类风湿类风湿类风湿

rhuIL2 长春生研所长春药业四环制药华新三生药业深圳兴科中华合通金丝利康利制药

1997正1997正1997正1997正1997正1997正1995试1995试1995试

癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗

1-72

rhuG-CSF 九源 1997试 化疗生白血病

rhuGM-CSF 特宝 1997试 化疗生白血病

rSK 医大实业 1996试 心梗溶栓

rhuEPO 华欣永铭维沃

1997试1997试

再生障碍性贫血再生障碍性贫血

bFGF （外用） 珠海东大 1996试 创伤，烧伤

1-73

• In 1982, the world’s first genetically engineered pharmaceutical product was produced

Making Humulin

– Humulin, human insulin, was produced by genetically modified bacteria

1-74

• DNA technology is also helping medical researchers develop vaccines

– A vaccine is a harmless variant or derivative of a pathogen

– Vaccines are used to prevent infectious diseases

1-75

医药

药物基因组学

人工设计 克隆 P450s

疾病的动物模型

治疗性小分子

植物

微生物

诊断用蛋白

治疗性蛋白

微生物 动物

疫苗

植物微生物

治疗性核酸

基因治疗基因修复反义药物

DNA 疫苗

诊断性核酸

遗传病传染病

赵亚华编著，分子生物学教程， 科学出版社， 2004.6杨汝德主编，基因工程，华南理工大学出版社 2003.8孙 明主编，基因工程 高等教育出版社 2006.5

主要参考书目录